Cours Adhesion

Adhésion & Biofilms
- L’étude des bactéries s’est souvent faîte dans les milieux de culture pour des
raisons de facilités d’étude et (physiologiques, génétiques) et d’observation.
- Cette approche néglige la réalité : les bactéries dans l’environnement naturel
se développent sous forme d’agrégat entre elles, en multicouches sur des
surfaces et en amas en suspension dans les interfaces gaz-liquides. Dans les
liquides, la plupart des bactéries sont dépourvues de toutes attaches
(bactéries planctoniques) car en suspension et animée par des mouvements
brownien liquidiens.
- Un écosystème est composé d’un communauté microbienne vivante dans un
environnement précis appelé « niche » avec des composés abiotiques physicochimiques (nutriments, température, pH, oxygène, etc..).
- La co-evolution et la coaggrégation bactérienne est la norme du vivant en
matière de biofilm avec des biofilms permettant à certaines bactéries assurent
la croissance d’autres bactéries par l’utilisation réciproque de métabolites
propres.
- Exemple :
II.Bases de l’adhésion - L’adhésion des micro-organismes sur une surface solide est un processus
s’effectuant en plusieurs étapes :
- Transport vers la surface, adhésion non spécifique puis spécifique ou adhésion
réversible puis irréversible.
1. Présentation : Adhésion non spécifique et spécifique :
Adhésion non spécifique :
- BUSSCHER et WEERKAMP (1987) ont définis des interactions non spécifiques
du aux charges ou à l’énergie de surface.
- Des liaisons non covalentes : interactions hydrophobes – forces
électrostatiques (faible dans l’eau à cause de la constante diélectrique faible).
- Des cations polyvalents augmentent l’adhésion (BUCHANAN 1978).
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Adhésion spécifique :
- L’adhésion est la première étape de la colonisation des bactéries gram
négatifs.
- Elle se fait par des organelles : pili (fimbriae) : structure protéique tubulaire
liée à la surface bactérienne et impliquée dans le processus d’attachement
aux surfaces ou aux cellules.
2. Adhésion non spécifique :
- Un pont intermoléculaire entre la bactérie et la cellule hôte par interaction
électrostatique à tous les deux.
- En raison des phospholipides de membrane de plasma, des acides
lipoteichoïques, des lipopolysaccharides, des résidus acides de sucre et
d'autres facteurs, la charge extérieure nette des deux bactéries et les
cellules épithéliales est négative, de ce fait entraînant une répulsion entre les
cellules.
- La répulsion électrostatique est fortement influencée par la concentration
ionique de la solution. (Plus la concentration ionique est haute, plus on diminue
la double couche électrique et on a moins de répulsion).
- Fimbriae sur la surface bactérienne sont suffisamment mince (3-10 µm
épais/0,3 à 2 µm long) pour que parallèle à la surface bactérienne elles
surmontent la répulsion électrostatique.
3. Adhésion spécifique :
- Composition : Les pili sont fins, sous la forme de tubes protéiques issue de la
membrane cytoplasmique et habituellement situé sur toutes les bactéries
gram négatifs, mais rarement chez les grams positifs.
- Il existe deux types de pili : les pili d’attachements courts (fimbriae) qui sont
nombreux.
- Les pilis long de conjugaison appelé aussi F ou pili sexuel (petit nombre). Le
pilus est tube creux composé de protéine appelée piline subdivisée en six à
sept protéines structurales distinctes.
- L’organisation structurale du P-pilus est représentée ci-dessous au chapitre
sur la fonction (Fig 1).
- A l’extrémité du tube, on a une structure adhésive ayant une forme
correspondant à un récepteur glycoprotéique ou glycolipidique de la cellule
hôte ou de l’environnement bactérien.
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- Fonction :
- Les pili courts d’attachement ou fimbriae sont des organelles d’adhésion pour
la colonisation des surfaces de l’environnement et la résistance aux flux. On
les nomme fimbriae « chaperones Usher » car ils sont couplés à un système de
protéines assurant l’expression d’un pore et la synthèse de protéines
polymérisées en cascade (adhésines).
- Il existe deux types selon leur longueur et les protéines chaperones du
périplasme bactérien intervenant dans leur synthèse : FGL (Boucle longue) et
FGS (Boucle courte).
- Les fimbriae de contact peuvent subir une dépolymérisation qui s’ensuit par
une néosynthèse possible de ces derniers. Les polymères protéiques sont des
homo ou des hétéropolymères linéaires pouvant faire appel à plusieurs
centaines de sous-unités.
- Les fimbriae sont assemblés à partir de protéines d’adhésines transportées au
travers de la membrane externe des bactéries Gram négatifs par un système
enzymatique « Sec-dépendant ».
Figure 1 – Organisation pili
- Les bactéries mobiles disposent de ces pili pour leur mobilité dépendante de
leur phénotype dans le biofilm au sein de systèmes de ciliatures très
différents :
o Ciliature monotriche pour un seul pili à un pôle.
o Ciliature péritriche pour une cellule bactérienne entourée de pili.
o Ciliature amphitriche pour une cellule bactérienne avec un pili à chaque
pôle opposé.
o Ciliature lophotriche pour une cellule bactérienne avec plusieurs pili sur un
même pôle.
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- Selon la structure le mouvement bactérien variera avec des mouvements du
pili nécessitant pour sa mise en fonction une énergie allant jusqu’à 1000
protons. Leur déplacement peut être ainsi rapide et brusque en milieu aqueux.
- Les pili sont assemblés à partir de protéines de pilines transportées au niveau
de la membrane cytoplasmique des bactéries Gram négatifs avec une
polymérisation des pilines constituant un pilus qui traverse la membrane
externe.
- Différents récepteurs pour l’adhésion sont sollicités par les protéines
d’adhésion des fimbriae ou pili. La spécificité est plus élevée dans le cas des
pili (un type de liaison à un récepteur le plus souvent) que dans le cas des
fimbriae (au moins deux types de liaison à plusieurs récepteurs).
- La liaison entre les micro-organismes et la surface cellulaire dans ce cas est
spécifiques et varie selon le tissu (épithélium urinaire, gastro-intestinal,
surfaces dentaires, coaggrégation inter-bactérienne).
- Elle limite aussi la colonisation à un tissu spécifique d’espèce (E. coli CFA/I et
de CFA/II sont limitées aux humains, E. coli K88 infectent des porcs E. coli
K99 sont limitées aux agneaux) (de GRAAF et al. 1994) (Figure 2).
Bacterie/Fimbriae
Recepteurs
Escherichia coli K88
β-D-Gal, fucose, GalNac, GlcNac, Galα(1-3)Gal,
Galactosylceramide
GalNacβ(1-4)Galβ(1-4)GlcCer,NeuGcα(2-3)Galβ(14)Glcβ(1-1)Cer
GalNac, GlcNac
Fucose, Glucose, Galactose, Mannose sur
oligosaccharides
GalNacβ(1-4)Galα(1-4)GlcCer, Gm2 ganglioside,
sialoglycoproteine
NeuAcα(2-3)Galβ(1-3)GalNAc
Galβ(1-3)GalNAc[73]
E. coli K99
E. coli F41
E. coli 987P
E. coli CFA
E. coli Sfa
S. typhimurium
Figure 2 – Récepteurs des adhésines fimbriales
- Plusieurs protéines de surface ont un rôle dans la capacité qu’ont les
staphylocoques à coloniser les tissus vivants. Des adhésines appartenant à la
famille MSCRAMM (Microbial Surface Components Recognizing Adhesive
Matrix Molecules) sont capables de se fixer à la matrice extracellulaire tout
en restant ancrées dans la paroi (peptidoglycane) avec des liaisons fortes
(covalentes) avec une thréonine terminale.
- La protéine A qui est une protéine MSCRAMM assure la fixation de
Staphylococcus aureus au facteur de Von Willebrand entraînant des lésions et
infections vasculaires (OTTO - 2009).
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III. Relation entre Adhésion et Biofilms :
- Ces systèmes de croissance sont appelés les biofilms vis – à vis desquels un
nombre limité de moyens standardisés de protocole existe.
- La proportion de micro-organismes prélevés est ignorée car l’intensité de
l’adhésion d’un biofilm naturel est une grandeur inconnue qui dépend de
nombreux facteurs (EGINTON et al. 1998).
- Ces biofilms sont ensuite de différents types (environnement, industrie,
contexte clinique).
- Leur étude nécessite de faire appel à différentes disciplines (biologistes
cliniciens ou des sciences de la vie, des chimistes ou ingénieurs spécialistes
des surfaces, des mathématiciens et des physiciens sur la modélisation).
IV. Définition - Les biofilms sont des couches de micro-organismes associés à un type de
surface.
- Les biofilms sont constitués d’un seul type ou de plusieurs types de microorganismes (levures, bactéries, protozoaires ou des combinaisons de toutes
ces espèces).
- Il existe plusieurs définitions des biofilms.
- La plus adaptée est celle de CHARACKLIS (1989a) :
« Un biofilm est une communauté microbienne adhérant à une surface et
fréquemment incluse dans une matrice de polymères exocellulaires » Cette
matrice est aussi appelée « couche muqueuse ».
- Un biofilm est une structure fréquente, non obligatoire, qui a un âge et une
densité (non visible à sa limite inférieure 104 cellules/cm2 – visible à partir de
108 cellules /cm2).
- Les biofilms sont souvent hétérogènes (discontinus, microcolonies séparées
par des espaces inter-colonies laissant circuler les liquides librement) :
structure établie sans contrainte. On a aussi des biofilms homogènes
organisés par des champs de forces au niveau expérimental en laboratoire.
- La structure de ces biofilms dépend non seulement des micro-organismes,
mais aussi des molécules engagées dans leur formation. L’efficacité de ces
molécules pour former des biofilms dépend d’une concentration seuil
moléculaire obtenue à partir d’une certaine population bactérienne ayant
atteint une valeur suffisante (un quorum).
Le biofilm en « gruyère » de Pseudomonas aeruginosa est du à la présence
d’une molécule signal (homosérine lactone) (DAVIES et al. 1998).
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V. Critères - Trois critères influencent la formation d’un biofilm : le phénotype et le
métabolisme bactérien – le type et l’état de surface – l’environnement physicochimique et biologique.
les 3 critères –
Les micro-organismes (phénotype et métabolisme)
- Des modifications phénotypiques sont observées et sont à l’origine de la
formation de l’adhésion et des biofilms. Toutes les souches bactériennes n’ont
pas la même capacité à coloniser les surfaces et de grandes différences
existent au sein d’une même espèce bactérienne.
La nature et l’état de surface
- Les types de surfaces principalement sont solides (inorganiques : métal,
verres, plastiques / organiques : dentine, os, chitines, surface des plantes).
- Les zones de liaison et d’adhésion à ces surfaces sont soit directes ou
indirecte par l’intermédiaire de matrice gélatineuse, protéido-lipidoglucidique. Quelques exemples :
- Les zones de rétention peu accessible au nettoyage ou nettoyée.
CZERCHOWSK (1991) prouve que les coudes de tuyauteries, les canalisations,
les tapis de convoyeur, les joints sont en agro-alimentaire des zones de
rétention.
METTLER et CARPENTIER (1997) montre que dans les joints de circuit de
pasteurisation, la zone de contact joint-métal est contaminée par déduction
de l’activité de l’eau dans ces zones suite au chauffage et créant ainsi une
modification de la thermorésistance des bactéries.
SALVALT et al. (1995) montre que sur les surfaces des plumeuses à volailles
ou sur les chariots de transports des carcasses, L. monocytogenes persistent
après nettoyage.
- La diminution de la rugosité des surfaces et la diminution des altérations de
surface (corrosion, usure) diminue la formation des biofilms.
METTLER et CARPENTIER (1997) montre qu’il existe une combinaison entre les
paramètres Ra (rugosité moyenne) et RVK (profondeur de creux réduite) à une
longueur d’onde de 0,8 nm et une corrélation avec la contamination de surface
de revêtements de sol industriel.
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L’environnement physico-chimique et biologique
- La capacité de colonisation d’une surface par une bactérie peut être facilitée
par une autre bactérie.
Les listeria se développent beaucoup mieux en biofilms lorsqu’elles sont
associées à un Pseudomonas (SASAHARA et ZOTTOLA (1993) – BOURION et
CERF (1996)).
- L'affinité et la spécificité d'une adhésine pour son ligand ne sont pas
constantes, et peuvent varier en fonction de différents facteurs comme la
concentration locale en cations divalents (Ca++, Mn++, Mg++..) ou l'état
d'activation de la cellule.
- Les Surfaces modifiées par du poly-éthylène glycol (PEG) ou les groupements
Arg-Gly-Asp (RGD) modifie le degré d’adhésion.
VI. Formation du biofilm –
- Deux étapes : l’adhésion des micro-organismes et la colonisation.
- L’adhésion est un phénomène purement physico-chimique qui est suivi de
phénomènes biologiques.
- Le développement des phénomènes biologiques conduit à la colonisation de la
surface.
1. L’adhésion des micro-organismes :
- La première étape de la formation d’un biofilm est l’adsorption des molécules
en solution liquide ou sur surface inerte (phénomène rapide).
- Cette adsorption moléculaire modifie les propriétés physico-chimiques
(l’énergie de surface = degré d’hydrophobicité ou d’hydrophilie d’une surface)
de la l’extrême surface d’un corps matériel dense (matériau, support
biologique, etc…). On a la constitution d’un film.
- L’adsorption des molécules du milieu environnant est régie par des mêmes
forces qui concourent à l’attractivité et à la fixation des micro-organismes
décrites ci-après.
- Trois types d’interactions interviennent (BELLON-FONTAINE et al. (1990)) :
► Les forces attractives de Van der Waals.
► Les interactions électrostatiques
► Les interactions acido-basiques
METTLER et CARPENTIER (1998) ont montré en agro-alimentaire que des
surfaces juxtaposées, de nature différente, en contact avec les mêmes
souillures, le même biotope et les mêmes produits d’hygiène tendent à avoir la
même énergie de surface, autrement dit le même film.
Ces dernières impliquent des groupements donneurs et accepteurs d’électrons.
Les bactéries adhérentes sont phénotypiquement différentes des bactéries
en suspension par l’expression de gènes particuliers (COSTERSTON et al.
1995).
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- La deuxième étape de la formation d’un biofilm est plus lente et se
caractérise par l’adhésion des micro-organismes. Elle dépend fortement des
forces qui se développent lorsque les bactéries arrivent à proximité de la
surface de manière aléatoire selon le mouvement du fluide de transport (ordre
de distance du nanomètre ou de quelques dizaines de nanomètres).
2. La colonisation :
- Dès l’adhésion, les micro-organismes se multiplient et stimule la synthèse des
polyosides entrant dans la composition des polymères exocellulaires du
biofilm, dits exopolymères (COOKSEY - 1992).
- L’adhésion qui produit ces exopolymères aboutit à la formation d’une matrice
de substances polymériques exocellulaires ou extracellulaires (EPS).
- Présence de glycocalyx : artéfact ou réalité, mais zone riche en hydrate de
carbone à la surface cellulaire. Cette zone peut être visualisée grâce à
différents colorants ainsi que du fait de son affinité pour les lectines. Le
glycocalyx contient aussi des glycoprotéines, et des protéoglycanes ayant été
secrétés dans l'espace extracellulaire, puis adsorbés sur la surface cellulaire.
- Les micro-organismes sont interpénétrés dans cette matrice.
- La production d’exopolymères n’a lieu que si le micro-organisme possède
l’information génétique correspondante. Sans cela, il n’y a pas de formation de
microcolonies (ALLISON et SUTHERLAND 1987).
Pseudomonas aeruginosa active l’expression d’un gène promoteur algC dès que
son adhésion en biofilm est effectuée, aboutissant à la formation d’alginates
par la synthèse accrue de polyosides (DAVIS et al. 1993).
- La production en EPS des bactéries du biofilm est nettement supérieure à
celle des bactéries en suspension. Elle dépend des conditions
environnementales.
- Les microcolonies constituent un « tissu » avec des échanges entre bactéries
et entre strates. Un biofilm alimenté régulièrement de nutriments peut
atteindre son équilibre en quelques jours ou quelques mois. L’arrêt de la
multiplication bactérienne ne correspond pas à un arrêt de la formation du
biofilm.
VAN Der KOOIJ et al. (1994) montre que l’activité ATP est toujours présente
4 mois après l’arrêt de la multiplication bactérienne.
- La croissance de ce biofilm peut se faire sur des mois et des années.
- Tim TOLKER-NIELSEN et al. 2003 ont présenté quelques données
fascinantes décrivant le comportement multicellulaire impliqué dans la
formation des structures de champignons trouvées dans certaines conditions
de croissance pour les biofilms P. d'aeruginosa.
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- Il a prouvé que les tiges des champignons sont constituées par croissance
clonale d'une population distincte, tandis que les chapeaux des champignons
sont constitués par une sous population motile distincte qui migre vers le haut
de la tige.
- Les tiges des structures de champignon de biofilm ont été constituées par la
croissance clonale du mutant nonmotile de pilA. Les chapeaux des structures
de champignon de biofilm ont été constitués par le type-sauvage- qui a migré
vers le haut des tiges du mutant de pilA (Voir Figure 3 – Formation des
biofilms chez Escherichia coli).
Figure 3 – Formation du biofilm chez E. coli
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3. Dispersion/dissolution :
Certaines espèces de bactéries peuvent quitter activement un biofilm lors d’un
processus dit de dispersion ou dissolution. Ceci est lié à une rupture de la
liaison à la matrice extracellulaire environnante par l'action de médiateurs
tels les lyases de polysaccharide ou les enzymes associés à la surface
activateurs de la motilité.
Les cellules de biofilm reviennent à l'état planctonique.
Elle concerne au sein d’une espèce des microcolonies qui présente un
phénotype propre à dispersion.
Pradeep Singh a chez P. aeruginosa montré l’existence d’une micro-colonie avec
un phénotype augmenté de dispersion/dissolution.
Cette variante produisant plus de rhamnolipides, qui ajoutés à un biofilm de P.
aeruginosa incite sa dispersion/dissolution.
La dispersion est liée à l'induction des gènes impliqués dans la motilité des
flagelles et à la répression du gène pilA.
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VII. Régulation et Génétique des biofilms :
- Les bactéries adhérentes sont phénotypiquement différentes des bactéries
en suspension par l’expression de gènes particuliers (Costerston et al. 1995)
- La production d’exopolymères n’a lieu que si le micro-organisme possède
l’information génétique correspondante. Sans cela, il n’y a pas de formation de
microcolonies (ALLISON et SUTHERLAND (1987)).
- Pseudomonas aeruginosa active l’expression d’un gène promoteur algC dès que
son adhésion en biofilm est effectuée, aboutissant à la formation d’alginates
par la synthèse accrue de polyosides (DAVIS et al. (1993).
- Une mutation dans le gène de ndvB a rendu les biofilms P. aeruginosa plus
sensibles à certains antibiotiques (aminoglycosides tobramycine et la
gentamicine et le ciprofloxacin de fluoroquinolone comparés au type sauvage,
tout en n'affectant pas les populations planctoniques. Le gène ndvB est
exprimé seulement en communautés de biofilm où il est impliqué dans la
synthèse des glucanes cycliques periplasmiques capables de lier et de
séquestrer ces antibiotiques.
- Shirtliff a rapporté dans une analyse protéomique chez S. aureus que 20% du
protéome était différemment activé entre les phénotypes planctoniques et
ceux en biofilms.
- 20% du génome E. coli est exprimé différemment entre le phénotype biofilms
et planctonique
- Un pourcentage très petit de la population demeure viable en dépit de
l'exposition prolongée à l'antibiotique ou à son dosage accru. Ces cellules
s'appellent les "persisters" et elles ne confèrent aucune
résistance
héritable à la progéniture une fois que la pression sélective retirée.
- La physiologie exacte derrière le phénotype des « persister » est inconnue.
VIII. Régulation 1. notion de « quorum sensing » (QS) ou sensation de Quorum - La notion de « Quorum sensing » a commencée dans les années 60 avec l’étude
de la bactérie bioluminescente marine Vibrio fischeri capable en milieu liquide
de produire de la lumière à partir d’une certaine concentration d’une molécule
dite activatrice de la luminescence ou « autoinducteur » (NEALSON et al.
(1970) - EBERHARD (1972) - GREENBERG (1997))
- Le « Quorum sensing » est une modalité de communication chimique
intercellulaire bactérienne permettant à des micro-organismes d’une espèce
donnée de coordonner un comportement adaptatif aux variations des
conditions environnementales en fonction principalement quand une certaine
densité de micro-organisme est atteinte (« Quorum »).
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- Chez les Gram négatifs, cette communication est le fait d’une molécule
diffusible appelée homosérine lactone (HSL) qui s’accumule dans le milieu. Le
gradient de concentration de cette molécule de signalisation permet à une
cellule de sentir le nombre de bactéries.
- A forte concentration cette HSL se fixe sur un régulateur transcriptionnel et
modifie l'expression de gènes (induction/répression).
- De nombreuses adaptations des bactéries symbiotes et pathogènes sont liées
au QS et justifient sa caractérisation.
Chez B. melitensis, HSL (C12-HSL) a été caractérisée et deux régulateurs
transcriptionnels (BabR et VjbR) ont été clonés. C12-HSL possède un effet
inhibiteur sur la transcription de l'opéron virB, encodant la machinerie de
sécretion de type IV (virulence) (TAMINIAU. et al 2002).
- Les bactéries utilisent différents types de molécule de signalisation QS.
Les plus connues sont les N-acyl-L-homosérine lactones.
- Chez les Gram positifs, cette communication est le fait de molécules
peptidiques modifiés après la transcription et issus de précurseurs.
- Ces peptides sont habituellement sécrétés par les transporteurs ABC
(cassettes ATP-binding).
- L’interaction se fait soit avec des kinases portées par des récepteurs
membranaires pour une transduction du signal transmembranaire, soit par des
perméases oligopeptidiques transportées vers des récepteurs intracellulaires
au travers de la cellule.
- Ces systèmes agissent sur la virulence bactérienne (Staphylococcus aureus), la
sporulation (Bacillus subtilis), le transfert de plasmide (Enterococcus faecalis)
et la production de bactériocine (Lazazzera et Grossman (1998) -
Kleerebezem et al. (1997) – Kuipers et al. (1998) – Guo et al. 1999 – Muir et al.
(1999).
6. notion de « quorum quenching » (QQ) ou « quorum sensing inhibiteurs
(QSIs) ou auto inducteurs - Les bactéries deviennent résistantes aux Antibiotiques (ATB) ce qui pose des
problèmes sérieux dans le cas d’infections agressives et résistantes =
bactéries Multi-Drug Résistantes (MDR).
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- La recherche d’enzymes ou de molécules inactivant les auto-inducteurs (QQ)
est une alternative, d’actualité et prometteuse, parallèlement à la mise au
point de nouveaux antibiotiques.
- Les molécules les plus représentées sont les lactonases et AHL-acylases.
7. Importance des échanges acides nucléiques (eADN) -
Certaines bactéries libèrent des copies d’ADN dès l’induction du Quorum Sensing.
La lyse de bactéries dans le biofilm libère du matériel moléculaire extracellulaire.
L’ADN extracellulaire libéré est appelé eADN.
L’ADN extracellulaire forme un réseau filamenteux pour les biofilms en milieu
aquatique (Böckelmann et coll. 2006).
- Il permet les échanges inter bactériens de gènes (augmentation de la conjugaison
inter bactérienne) (Hausner & Wuertz 1999).
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