Aspect-biologique-de..
publicité
Assistance médicale à la procréation, Aspects biologiques Pr Clément Jimenez Service Biologie Reproduction CECOS CHU Bordeaux Institut des maladies neurodégénératives Université Bordeaux 2 CNRS UMR 5293 Introduction Rôle du biologiste en AMP Les bilans pour le diagnostic La discussion pour la prise de décision La mise en œuvre des techniques Le suivi Les pratiques de l’assistance médicale à la procréation Techniques d’AMP délicates supposent Collaboration équipe multidisciplinaire compétente et homogène La biologie de la reproduction caractérisée par le fait qu’elle a une double composante: analytique et thérapeutique. Le biologiste intervient dans les décisions thérapeutiques en collaboration avec l’ensemble des partenaires de l’AMP: gynécologues, urologues, généticiens, psychologues et les couples qu’il voit en consultation. Les techniques d’AMP On peut distinguer: Les techniques qui visent à optimiser une fécondation de gamètes qui se produira in vivo: sont concernées toutes les techniques aboutissant à l’insémination des spermatozoïdes Les techniques dont le but est la fécondation des gamètes en laboratoire. Il s’agit de la fécondation in vitro et de la fécondation in vitro avec micromanipulation. Ces dernières aboutissent au replacement des embryons dans l’utérus Un troisième volet concerne des techniques de cryoconservation succédant à une technique de congélation qui, actuellement est pratiquée en routine pour le sperme, les ovocytes, les tissus gonadiques(ovaires surtout) et les embryons. Principales techniques utilisées pour la préparation des spermatozoïdes Migration ascendante A partir de l’éjaculat On peut déposer délicatement 1 ml de milieu de culture sur 0,5 ml de sperme liquéfié 30 à 60 min de migration à 37°C sous 5% de CO2 Le surnageant est récupéré puis les spzs ayant migrés sont centrifugés pdt 10 min à 300 g dans du milieu de culture Le nombre de tubes utilisé dépend de la numération initiale du sperme Après élimination du plasma séminal 1 ml de sperme est mélangé à 4 ml de milieu de culture puis centrifugé pdt 10 min à 300 g afin d’éliminer le plasma séminal. Le surnageant est éliminé puis on dépose délicatement 1 ml de milieu de culture sur le culot de spzs. migration à 37 ° C sous 5 % de CO2 pdt 20 à 30 min. Le surnageant est est récupéré puis le comptage est réalisé Centrifugation sur gradient de densité Le percoll est constitué de particules colloidales de silice recouvertes de polivinylpyrrolidone Il permet de séparer les cellules sur la base de leur densité. La sélection sur Percoll a notamment permis la réalisation de FIV dans des indications masculines qui ne pouvaient pas être traitée jusqu’alors. Technique de préparation des spermatozoïdes sur Percoll 47% 95% Critères de choix de la technique de séparation des spermatozoïdes Le choix repose sur Efficacité sur le plan biologique Taux de récupération Pourcentage de spzs mobiles et normaux Efficacité sur le plan clinique Grossesses obtenues La sélection Sur la mobilité Migration ascendante + sur le plan qualitatif Sur la cytologie Centrifugation sur gradient de densité + Le rendement S’apprécie par le nombre de spzs mobiles sélectionnés par rapport au sperme initial Centrifugation sur gradient de densité + Stress oxydatif La centrifugation lavage des spzs augmente le tress oxydatif Production radicaux libre diminué dans la fraction haute densité d’un gradient Pouvoir fécondant Le gradient de densité utilisé en FIV a permis d’améliorer les taux de fécondation et les taux de grossesses par transfert. OAT + Supériorité du gradient de densité La centrifugation sur gradient de densité est supérieure aux autres préparations de sperme Méthode efficace, simple et réalisable sur la très grande majorité des spermes Le Percoll est interdit d’utilisation en AMP en France mais d’autres gradients comparables sont disponibles sur le marché et livrés prêts à l’emploi. La fécondation in vitro La FIV suppose: Une stimulation de l’ovulation Une ponction des ovocytes La préparation du sperme et des ovocytes La mise en contact des gamètes in vitro L’obtention d’embryons Le replacement de 1 à 3 embryons dans l’utérus par les voies naturelles La congélation des éventuels embryons supplémentaires LA FIV avec micromanipulation ICSI Révolutionne le pronostic de la stérilité masculine HISTORIQUE 1988 première naissance chez le lapin en ICSI 1990 première naissance chez le bovin 1992 première naissance chez l’homme 1994 première naissance chez la souris 1994 première naissance avec injection de spermatide chez la souris 1995 première naissance rapportée chez l’homme avec spermatide 1995 première naissance avec injection de spermatocyte secondaire chez la souris 1997 première naissance avec injection de spermatocyte primaire chez la souris Les indications de l’ICSI OAT SEVERE SPERME FRAIS Elles ne permettent pas de tenter une FIV conventionnelle L’ICSI d’emblée est proposée à partir de seuils très variables selon les équipes <200000 SPZ A mobilitétype a et b et normaux après préparation Tératozoospermie >90% ICSI avec sperme congelé Peut concerner les dons de sperme Mais surtout le sperme autoconservé provenant de l’éjaculat Pathologies du mouvement Appréciées par analyse du mouvement assisté par ordinateur DYSKINESIES FLAGELLAIRES SPZ GLISSANT ALH Autoimmunisation Si le taux d’ACAS est élevé Idéalement traité par l’ICSI Troubles de l’éjaculation Dans le cas où il n’est pas possible de recueillir suffisamment de Spermtozoïdes pour les autres techniques d’AMP Éjaculation rétrograde Neuropathie diabétique GLOBOZOOSPERMIE cas familiaux Mutation homozygote gène SPATA 16 ou NYD-SP12 décrite récemment dans une famille où tous les garçons ont une globozoospermie. GLOBOZOOSPERMIE KARTAGENER IMMOBILITE CILIAIRE SYNDROME DE KARTEGENER Azoospermie excrétoires Agénésie Obstructions post-infectieuses Echecs de vaso vasostomie Obstructions inexpliquées Ponction épididyme ou Testicule Azoospermie sécrétoire Ponction testiculaire avec congélation des spermatozoïdes si présents Couplée ou non à une ponction ovocytaire (synchrone ou asynchone) ICSI de deuxième intention Echec de fécondance ou paucifécondation Pronostic moins bon? La technique ICSI est réalisée Au microscope au Grossissement 400 COMPLEXE CUMULO OVOCYTAIRE APRES LA PONCTION OVARIENNE OVOCYTES APRES ELIMINATION DES CELLULES FOLLICULAIRES REALISATION DE L ’ICSI ICSI ZYGOTE NORMAL APRES FECONDATION CULTURE PROLONGEE •But: sélectionner les embryons et seulement sélectionner pas améliorer la qualité des embryons •Dans les années 90 Coculture •Cellules de rein de singe •Interdiction utilisation cellules animales •Utilisation cellules stromales et épithéliales endomètre autologue •Milieux synthétiques •Séquentiels Culture prolongée jusqu’à quel stade? Culture in vitro pendant 5 à 6 jours des embryons jusqu’au stade de blastocyste J2 Blastocyste J5 trophoblaste Bouton embryonnaire MCI L’activation du génome embryonnaire (AGE): C’est un transfert de la responsabilité: pg le contrôle du développement passe de l’information maternelle à l’embryon. 40 20 L’AGE se met en place différemment selon les espèces souris Situation en France données ABM 2010 25,00% 20,00% 15,00% 10,00% 5,00% 0,00% FIV ICSI FIV +ICSI TEC Taux cumulé CP en France 2010 Donnée ABM 30,00% 25,00% 20,00% 15,00% 10,00% 5,00% 0,00% Nécessité d’établir avec le maximum d’acuité les facteurs prédictifs de grossesse et d’accouchement pour pouvoir adopter la meilleure stratégie de transfert Avant 40 ans, la qualité embryonnaire a une valeur prédictive plus forte que l’âge. Après 40 ans ce n’est plus vrai Cai QF et al HR 2010 Le don de gamètes Permet de suppléer l’absence ou la très sévère déficience de gamètes chez l’homme ou chez la femme. Le double don de gamètes est interdit. Seul le don d’embryon peut répondre aux situations de double stérilité définitive. Le don de sperme peut faire appel à l’insémination ou à la FIV, le don d’ovocyte nécessite obligatoirement la FIV et plutôt l’ICSI si don partagé. Biologiste dans le don Rôle essentiel encore au travers notamment de la cryoconservation (spermatozoïdes depuis longtemps et à présent ovocytes) Le recrutement des donneurs de sperme se fait presqu’exclusivement dans les CECOS Avec la vitrification ovocytaire, il apparaît possible de disposer de banques d’ovocytes qui permettront plus de souplesse et plus de facilités d’appariement. Dans ce domaine, les biologistes des CECOS ont le plus d’expérience Pratiques d’AMP, leurs indications médicales Techniques d’AMP indications IAC : avec sperme de conjoint -hypofertilité masculine, trouble de l’ovulation, troubles des rapports sexuels, insémination avec sperme auto-conservé pour traitement stérilisant, infécondité inexpliquée IAD : avec sperme de donneur -stérilité masculine -maladies graves et transmissibles FIV : fécondation in vitro -stérilité tubaire -hypofertilité masculine et féminine -échecs d’IAC Infécondité inexpliquée ICSI : FIV avec microinjection du spermatozoïde dans l’ovocyte -stérilité masculine -absence de fécondation en FIV FIVD : avec sperme de donneur -stérilité masculine associée à une indication de FIV -échecs d’IAD, FIV, ICSI FIVDO : avec ovocytes donnés et transfert d’embryon congelé -stérilité féminine par absence d’ovocytes, congénital ou acquise -échecs de FIV, avec ou sans ICSI Accueil d’embryon Double stérilité féminine et masculine par absence numérique ou fonctionnelle d’ovocytes et de spermatozoïdes Les résultats de l’ICSI TAUX DE GROSSESSE ÉQUIVALENT À LA FIV LE TAUX DE MALFORMATIONS ET D’ANOMALIES CHROMOSOMIQUES IDENTIQUE A CELUI DES ENFANTS ISSUS DE FIV MAIS SUPÉRIEUR À CELUI DES ENFANTS CONÇUS NATURELLEMENT. EN 2007 ENVIRON 7500 ENFANTS SONT NES GRACE A UNE ICSI EN FRANCE conclusion Les techniques d’AMP permettent d’apporter la solution à de nombreux couples qui souffrent de stérilité Les taux de succès se situent aux alentour de 19 % d’accouchement par ponction pour la FIV et de 20% pour l’ICSI. Le parcours des couples est difficile et souvent long et le succès n’est pas toujours au rendezvous (une chance sur cinq d’accoucher par ponction ). Techniques de congélation et de décongélation des embryons Pourquoi congeler les embryons? Les progrès de la FIV devenir des embryons surnuméraires Augmenter les taux cumulés de grossesse et d’accouchement à moindre coût et à moindre risque. Permettre de limiter le risque lié aux grossesses multiplesSET Différer le transfert HSO Dons divers Congélation en 2007 en France: données ABM Au 31 décembre 2007, 154822 étaient conservés 54122 embryons ont été congelés en 2007 14461 transferts pour 1858 (12,8%) accouchements et 2032 enfants nés vivants Historique congélation La congélation d’embryons de mammifères a été réalisée au début des années 70 avec des protocoles développés de manière empirique. 1971 Whittingham(PVP) souris -79°C 1972 Wilmut (DMSO, glycerol) souris -196°C 1972 Whittingham(DMSO)souris -196°C 1973 Wilmut(DMSO)bovins -196° La congélation d’embryons humains a suivie adaptée de ces protocoles. 1983 Trounson et Mohr(DMSO) -196°C grossesse mais pas d’accouchement 1984 Zeilmaker et al (DMSO) -196°C 1ère naissance 1985 Lassalle et al (propanediol)-196°C 1985 Cohen et al (DMSO/glycérol)-196°C ( blastocyste) Principes de cryobiologie conséquences du refroidissement sur la cellule Mort cellulaire principalement due: Formation de cristaux de glace intra cellulaire +++ Formation de cristaux de glace extra cellulaire conduisant à l’augmentation de l’osmolarité du milieu et à la déshydratation cellulaire Deux effets qui doivent être prévenus Contrôle Agents de la vitesse de descente en température cryoprotecteurs Illustration de l’effet des vitesses de refroidissement sur la formation des cristaux de glace intracellulaire -10°C -2°C -5°C refroidissement lent rapide Très rapide Les cryoprotecteurs Indispensables Utilisés processus de congélation lente vitrification Les cryoprotecteurs pénétrant la cellule de faible PM agissent en remplaçant sur le plan osmotique l’eau intracellulaire. L’action des cryoprotecteurs non pénétrants de faible PM est basée sur la déshydratation des cellules Les cryoprotecteurs non pénétrants doivent toujours être associés a des cryoprotecteurs pénétrants pour protéger la cellule Les cryoprotecteurs de haut PM modifient la forme et la taille des cristaux de glace. milieux cryoprotecteurs Solutions avec un cryoprotecteur pénétrant la cellule ou avec deux cryoprotecteurs l’un pénétrant et l’autre non pénétrant. Agents pénétrants la cellule : Éthylène glycol, DMSO, 1-2 propanediol, Glycérol, Butanediol Agents non pénétrants de faible PM : Galactose, Glucose, sucrose, trehalose Agents non pénétrants de haut PM : PVP et autres polymères Action de l’agent cryoprotecteur pénétrant CP eau Congélation lente maintien à température ambiante des embryons en contact avec le Cryoprotecteur pénétrant (1,5 M) jusqu’à l’équilibre. Première descente en température avec une pente de -1 à -2°C/min jusqu’à -7°C Amorce de la cristallisation extracellulaire (seeding) Descente en température avec une pente de 0,3°C/min jusqu’à -30,-35°C. Effet solution réduit la quantité d’eau intracellulaire et limite l’apparition de cristaux de glace intracellulaire Transfert dans LN2 Courbe de refroidissement Libération de la chaleur de fusion 20°C A C D 0°C surfusion -7°C B -30°C Point Eutectique Nacl -196°C temps seeding La température de surfusion d’une solution saline peut être très basse et être en dessous de -10. Plus la température de surfusion est basse et plus il y a de lyse cellulaire. whittingham 1977 (embryons souris 8cellules). Si la température de surfusion descend jusqu’à -12, aucun embryon n’est vivant à la décongélation. Il faut donc faire le seeding à -6,-7°C pour éviter l’effet délétère d’une réaction exothermique qui est d’autant plus importante que la cristallisation se fait à température très basse Congélation lente en propanediol/sucrose (Zygote-8cellules) (1) Protocole mis au point par Renard et al (1984) et développé chez l’homme par lassalle et al (1985) A subi peu de modifications Congélation lente en propanediol/sucrose (zygote/8 cellules) (2) Exposition aux cryoprotecteurs : deux étapes à température ambiante Propanediol 1,5 M dans milieu supplémenté par 20% HSA pendant 15 min Propanediol 1,5 M et 0,1 M sucrose pendant 5 min Conditionnement en paillette Programmation de la descente en température avec seeding décongélation Décongélation rapide Retrait du cryoprotecteur en 4 étapes de 5 min dans le milieu 20% albumine, sucrose 0,2 M et propanediol à concentration décroissante (1 M, 0,5 M, 0,25 M, 0 M). Quelles paillettes ? Les paillettes hautes sécurité peuvent être utilisées. Balaban et al fertil steril 2007 87 691-696 (étude randomisée prospective comparant les paillettes HS avec paillettes conventionnelles) Congélation Paillettes HS Paillettes conventionnelles E. Décongelés 517 505 Survie 95% G. clin/T 42.5% 31% Taux d’implantation 19,4% 11.4%* G. multiples/T 42% 17%* 86%* Congélation lente dans milieu glycérol/sucrose(blastocyste) (1) Avantages de la congélation au stade de blastocyste : Sélection des embryons par la culture prolongée Théoriquement, les blastocystes devraient mieux supporter la congélation du fait du haut rapport nucléocytoplasmique des blastomères et du nombre de cellules plus important qui permet d’espérer une survie de l’embryon en dépit de la lyse de certaines d’entre elles. Congélation lente dans milieu glycérol/sucrose( Blastocyste) (2) Les protocoles de congélation ont été simplifiés par rapport au protocole initial (Cohen et al 1985). 7 étapes pour la congélation 6 étapes pour la décongélation Réduction en deux étapes par Menezo et al 1992 Glycérol (5%) 10 min Glycérol (9%) et sucrose (0,2 M) 10 min Courbe de descente en température et seeding idem zygotes et embryons J2 J3 décongélation Après réchauffement rapide, élimination des cryoprotecteurs en deux étapes Solution 0,5 M sucrose (10 min) Solution 0,2 M sucrose (10 min) Congélation par vitrification Solidification sans formation de cristaux Concentrations élevées en cryoprotecteurs Refroidissement ultrarapide pour induire la formation d’un état vitreux intra- et extra cellulaire Réalisable sur zygotes, embryons au stade J2, J3, morula, blastocyste Milieux cryoprotecteurs utilisés pour la vitrification Agents pénétrants la cellule Éthylène glycol DMSO 1-2 propanediol Agents non pénétrants de faible PM Saccharose Tréhalose Polymères de haut PM Polyéthylène-glycol Ficoll Polyvinyl-pyrrolidone Exemple de protocole de vitrification en deux étapes Solution d’équilibre contenant 7,5% (V/V) ethylène glycol et 7,5% (V/V) DMSO. Exposition des embryons jusqu’à ce qu’ils récupèrent leur volume initial. Solution de vitrification 0,5 M sucrose avec 15% (V/V) ethylène glycol, 15% (V/V) DMSO. Exposition pour une courte période Vitesse de refroidissement très rapide nécessaire pour une bonne survie Les supports pour la vitrification Les systèmes utilisés (cryoloop, cryotop, cryoleaf, hemi straw)=Contact direct de la goutte contenant l’embryon avec l’azote liquide Problème de sécurité sanitaire ? Il existe des supports qui permettent d’éviter le contact direct avec l’azote liquide sans diminution de la survie embryonnaire.Vanderzwalmen et al Gynecol Obstet Fertil 2006 34 760-769 Décongélation Le réchauffement doit être ultra-rapide et se fait dans des solutions de sucrose de concentration décroissante Sucrose 1M (1min) Sucrose 0,5 M (3 min) Les résultats des techniques de congélation(1) Index de survie de l’embryon est le point essentiel 20 à 30% des embryons sont lysés dans les programmes de congélation actuels. Un embryon clivé précoce parfait après décongélation a autant de chance de s’implanter qu’un embryon frais de même aspect. Urman B et al fertil steril 2007 87:310-315. les embryons congelés ne sont pas forcément les plus évolutifs. Choix des meilleurs pour le transfert frais. Les embryons issus de cycles ayant permis une grossesse ont un potentiel implantatoire plus important. El-Toukhy T et al Hum Reprod 2003 18:1313-1318 Les résultats des techniques de congélation(2) Congélation lente Zygote - embryon clivé précoce idem. Senn A et al Fertil Steril 2000 74: 946-952 (étude prospective randomisée avec avantage au zygote en terme de taux cumulé d’accouchement ) Taux d’implantation meilleur avec blastocyste par rapport à embryon clivé précoce comme cela est noté avec les embryons frais Les résultats des techniques de congélation (3) vitrification Très bons taux de grossesse (près de 50%) sont rapportés avec des blastocystes sur une série de 2749 blastocystes avec un taux d’implantation de 34,5% Mukaida et al Fertil Steril 2005; 84 (suppl)(VP2, S 476) Pas de différence entre congélation lente et vitrification pour des blastocystes. Lieberman J et Tucker MJ Fertil steril, 2006, 86 (1) 20-26 Bons résultats avec les zygotes. Al Hassani S et al. Reprod Biomed Online 2007, 14:288-293. Les résultats des techniques de congélation (4) Vitrification Bons résultats avec des embryons clivés précoces. Rama Raju GA et al. Reprod.Biomed.Online 2005, 11: 434-437. Desai N et al, Reprod Biomed Online 2007 14: 208-213.Dans cette étude: 236 embryons Taux de survie de 85% Taux de grossesse de 44% Taux d’implantation de 20% Apport de la congélation embryonnaire en FIV (1) Les résultats devraient être exprimés en taux de grossesses et taux d’accouchement par TEC et par cycle de décongélation En taux d’implantation et d’enfant né par embryon transféré et par embryon décongelé Le bénéfice de la congélation ne peut être réellement évalué que des années après la ponction qui est à l’origine des embryons Apport de la congélation en FIV (2) Il faut prendre en compte l’ensemble des grossesses obtenues consécutivement à une ponction ovocytaire (embryons transférés immédiatement + ceux transférés après la décongélation). Possibilité de préserver le potentiel de reproduction chez des femmes âgées de plus de 35 ans qui ont la possibilité d’avoir un deuxième enfant grâce aux embryons congelés y compris à un moment où une insuffisance ovarienne a pu s’installer. Bénéfice de la congélation d’embryons en FIV sur une population de bon pronostic Femme de -35 ans avec au moins 3 embryons transférables et/ou congelables lors de la ponction. Du 1èr septembre 2001 au 31 aout 2005 2 embryons transférés Tentative terminée ( 1 accouchement ou à défaut embryons épuisés) Bénéfice de la congélation en FIV sur une population de bon pronostic 430 cycles avec embryons transférés et congelés Ponction initiale 205 naissances TEC 64 naissances Total 269 naissances 47,6% 62% 14,5% de naissances additionnelles grâce à la congélation. Bénéfice de la congélation d’embryons en FIV sur une population de bon pronostic avec SET Femme de moins de moins de 35 ans avec au moins 3 embryons transférables et ou congelables lors de la ponction. Du 1èr septembre 2005 au 31aout 2007 1 embryon transféré Tentative terminée ( un accouchement ou à défaut embryons congelés épuisés) Bénéfice de la congélation d’embryons en FIV sur une population de bon pronostic avec SET 190 cycles avec embryons transférés et congelés ponction initiale TEC total 69 naissances 36% 46 naissances 115 naissances 24 % naissances additionnelles. 60,5% Comment améliorer les résultats de la congélation? Sélection des embryons avant congélation Sélectionner après décongélation les embryons à fort potentiel évolutif par la culture Augmenter l’efficacité technique et essayer d’obtenir 100% de survie en améliorant les protocoles de congélation décongélation Améliorer l’embryon avant congélation (retrait du liquide du blastocèle. Vanderzwalmen P et al. Hum Reprod 2002 17:744-751) ou après décongélation (retrait des blastomères nécrotiques. Nagy et al fertil steril 2005 84:1606-1612)
