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Assistance a l'eclosion embryonnaire
Paul Cohen-Bacrie , M. Dumont , A. Lemeur , A. Hazout , François Olivennes et René Frydman
Ces dernières années deux techniques ont été proposées pour tenter d'augmenter le taux d'implantation des
embryons obtenus par fécondation in vitro. L'une de ces techniques est la culture prolongée d'embryons soit
sur tapis cellulaires soit en milieux simples, l'autre est l'éclosion assistée qui consiste à perforer la zone
pellucide des embryons précoces pour faciliter leur éclosion ultérieure.
In vivo, la perte de la zone pellucide par le blastocyste est un phénomène étroitement lié à l'implantation : si
cette étape du développement embryonnaire intervient en retard ou ne se fait pas, alors l'implantation
embryonnaire sera compromise. Le mécanisme d'éclosion de l'embryon n'est pas clair. La majorité des
informations sur l'éclosion des blastocystes a été obtenue à partir d'études in vitro car l'éclosion naturelle (in
vivo) est difficile à observer.
Eclosion spontanee de l'embryon
In vitro, l'expansion du blastocèle des embryons de mammifères s'accompagne d'un amincissement de la
zone pellucide (ZP) puis celle-ci se rompt : l'excroissance du trophectoderme apparaît à l'extérieur de la ZP
et l'éclosion se poursuit et s'achève par une large ouverture de la ZP.
Facteurs embryonnaires impliques dans la perte de la zone
pellucide in vitro
Les protéases :
Des études menées in vitro chez la souris ont montré que si l'on met des inhibiteurs de protéases dans le
milieu de culture des embryons ; on inhibe l'éclosion, puis PERONA et WASSARMAN ont montré que les
cellules du trophectoderme produisaient une protéine trypsine like qu'ils ont appelé " strypsin " (1) SWADA
et CollL ont également identifié une protéine trypsine like dans le milieu de culture de blastocystes éclos de
souris.
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La pression exercée par l'expansion du blastocyste et expression des " TEP " ( Trophectoderm Projections) :
En filmant le développement embryonnaire in vitro, COLL, a montré que chez la souris ; il y avait des cycles
de contraction et ré-expansion du blastocyste juste avant l'éclosion ; d'où l'idée que l'expansion du
blastocyste devait exercer une pression sur la ZP favorisant ainsi l'amincissement de la ZP et l'éclosion (2).
Chez 6 autres espèces : le cobaye, le hamster, le singe, les bovins, les équins et l'humain ; cette activité
cyclique s'accompagne de l'apparition des " TEP " ( projections cytoplasmiques émanant du trophectoderme
et qui traversent la zone pellucide). Les " TEP " qui apparaissent uniquement au stade blastocyste et dans
une région précise de l'embryon sont également soumis à des cycles rapides d'extension et de rétraction.
Leur présence in vivo a été montrée chez le cobaye et le hamster. Les " TEP " seraient impliqués dans un ou
plusieurs événements clés du développement précoce tels que : éclosion embryonnaire, attachement et/ou
implantation du blastocyste. (GONZALES et Coll, 1996 (3))
Intervention du milieu uterin dans la perte de la zone pellucide
Le milieu utérin n'est pas indispensable à l'éclosion proprement dite puisque la perte de la ZP peut se
produire dans un environnement extra-utérin ; que ce soit un vivo (oviducte de souris ; chambre antérieure de
l'œil ; grossesses extra-utérines chez la femme) ou in vitro.
Cependant il est probablement indispensable à une implantation réussie in utéro, c'est-à-dire à la survenue
d'une éclosion embryonnaire en phase avec un endomètre réceptif. En effet, chez la souris, Mc LAREN a
montré que l'environnement utérin pouvait avoir des conséquences sur le temps d'éclosion des embryons. Si
l'implantation embryonnaire est interrompue,par l'ovariectomie au jour 2 ou 3 de la gestation, ou par la
lactation ; autrement dit si l'embryon est soumis a un environnement hormonal " neutre " ou dominé par la
progestérone ; l'éclosion du blastocyste est différée de 24 heures et la ZP est retrouvée vide, non dissoute. Si
par ailleurs l'implantation est induite en injectant de petites quantités d'œstrogènes ; la lyse de la ZP
intervient dans les 18 heures qui suivent les injections. Ces expériences suggèrent donc que l'utérus produit
un facteur lytique oestrogéno - dépendant responsable de la lyse de la ZP.
Une étude plus récente de GONZALES et BAVISTER chez le hamster, comparant l'éclosion spontanée in
vivo et in vitro, montre également qu'in vivo il y a lyse complète de la ZP.
Toutes ces observations suggèrent que in vivo, deux mécanismes interviendraient dans la perte de la ZP :
- Un facteur lytique utérin hormono - dépendant.
- Un procédé actif d'éclosion engagé par le blastocyste indépendamment d'un stimulus hormonal.
eclosion " assistee " de l'embryon ou " assisted hatching " (AH)
L'hypothèse que des défauts d'éclosion pouvaient être responsables d'échecs d'implantation a été émise par
COHEN et Coll en 1990 (4) suite à 2 observations :
1 - L'analyse rétrospective de l'aspect morphologique des embryons et du résultat de leur transfert a montré
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que les embryons à ZP épaisse s'implantaient beaucoup moins que les embryons à ZP fines et irrégulières
(10% contre 25%)
2 - Les embryons issus d'une fécondation assistée par PZD ( " Partial Zona Dissection " ) s'implantaient
mieux que les embryons à ZP intacte. D'ou l'idée que la capacité à éclore des embryons pouvait être
augmentée par un amincissement artificiel de la ZP ou par la création d'un trou dans la ZP .
D'autre part, on sait que les conditions de culture in vitro ; ou un vieillissement in vivo des ovocytes peuvent
induire un " durcissement de la zone pellucide, c'est à dire une augmentation de la résistance de la ZP à sa
dissolution par différents agents chimiques et enzymatiques (souris, femme)
Les techniques d'eclosion assistee
- " PZD " (Partial Zona Dissection)
C'est une technique mécanique qui consiste à embrocher la ZP avec une aiguille de verre et à frotter le
segment sous tendu contre la pipette de contention, on réalise alors une incision de taille variable.
Perforation au tyrode acide
L'application d'une solution de tyrode acide (pH 2,3) permet de dissoudre la ZP ; réalisant ainsi un orifice
rond et large.
Perforation au laser
Le principe est le même que celui de la technique au tyrode acide, cependant cette technique est très
coûteuse.
- Amincissement de la ZP
- Au tyrode acide (souris)
- Au laser (femme)
Etude in vitro des consequences de la micro-manipulation de la zp
sur l'eclosion de l'embryon
Une étude in vitro sur les embryons de souris, comparant la technique de perforation au tyrode acide (TA) a
montré que la taille de l'ouverture est déterminante pour le devenir de l'embryon. Si par la technique PZD, on
réalise une incision trop étroite £ 5µm ; on obtient seulement 22% d'éclosions complètes (contre 72% si
l'incision est de 11 à 25µm) ; la plupart des embryons pouvant être piégés dans la zone pellucide conduisant
ainsi à des anomalies d'éclosion.
Deux études portant sur la culture d'embryons humains frais (5) ou congelés(6) après éclosion assistée par
PZD n'ont pas retrouvé d'anomalies d'éclosion des embryons.
Selon COHEN et Coll, la technique de perforation au tyrode acide semble la mieux adaptée car elle permet
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de réaliser des trous de taille constante ; suffisamment larges et ronds pour permettre une éclosion totale des
embryons sans traumatisme (92% d'éclosions complètes).
Cette technique est par ailleurs utilisée pour le diagnostic pré-implantatoire des embryons par HANDYSIDE
et COLL (7) et permet un taux d'implantation embryonnaire satisfaisant.
Modeles anti hatching pour evaluer le benefice apporte par
l'eclosion assistee au tyrode acide
Le modèle souris n'est pas un modèle directement transposable à l'homme puisque tous les embryons
cultivés in vitro à partir du stade 2 cellules peuvent éclore.
Ce modèle permet surtout de montrer l'éffet délétère éventuel d'une technique de Hatching mais pas son
éffet bénéfique.
Il était donc nécessaire de créer un modèle d'embryons ayant un développement normal excepté pour leur
capacité à éclore.
Deux modèles souris ont été proposés pour l'inhibition de l'éclosion embryonnaire in vitro :
1- La culture d'embryons dans des conditions non optimales ; culture en milieu sans protéines induisant un
durcissement de la zone pellucide et une inhibition de l'éclosion (10% d'éclosions complètes contre 87%
dans le groupe témoin) (8).
2- La destruction d'un blastomère au stade 4 cellules afin d'obtenir des blastocystes plus petits dont le taux
d'éclosions in vitro est réduit (58% contre 83% chez les témoins) (9).
Dans ces 2 modèles le défaut d'éclosion est corrigé par une technique d'éclosion assistée au tyrode acide
(amincissement ou perforation de la ZP) permettant de restaurer un bon taux d'implantation in vivo (26% à
37%)
Eclosion " assistee " : application clinique
L'équipe pionnière de COHEN et Coll (4,10) dans une étude portant sur 330 couples et plusieurs essais
randomisés a montré que :
L'éclosion assistée appliquée a une population non sélectionnée n'augmentait pas significativement les taux
de grossesses et d'implantation.
Chez les femmes d'âges inférieur à 39 ans et à FSH normale ; seuls les embryons ayant un ou plusieurs
critères morphologiques défavorables pour l'implantation (ZP ³ 15µm ; moins de 5 cellules à J3 , excès de
fragmentation > 20%) doivent être soumis à l'éclosion assistée.
Seules les femmes d'âge supérieur ou égal à 39 ans et/ou à FSH élevée (> 15 UI) pouvaient bénéficier de
l'éclosion assistée appliquée sur la totalité des embryons transférés.
Analyse des resultats en fonction des indications
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Femmes d'âges supérieur ou égal à 39 ans
Parmi les études publiées (tableau 1) seules trois d'entre elles rapportent un meilleur taux de grossesses et
d'implantation dans le groupe de patients avec éclosion assistée. Dans notre expérience (tableau 2) les
techniques d'éclosion assistée ne semblent pas avoir d'éffets délétères sur les embryons mais ne semblent
pas non plus améliorer le taux d'accouchement dans cette catégorie de patientes. Ces résultats corroborent
ceux de BIDER et Coll, 1997 , qui ne montrent pas de différence significative entre le groupe contrôle et le
groupe " hatching " pour lesquels ils trouvent respectivement : 3,8% d'enfants nés par transfert contre 3,3%.
Femmes à FSH de base élevée
Seul COHEN et Coll (4) ont rapporté une petite étude randomisée portant sur 30 patientes. Cette courte série
a permis d'obtenir 26% d'implantation par embryon transféré dans le groupe éclosion assistée contre 10%
dans le groupe témoin.
Aucune autre série plus importante n'a été publiée depuis l'obtention de ces résultats préliminaires.Une étude
randomisée en cours dans notre équipe, donne l'avantage au groupe " hatching " en terme de grossesses
cliniques par transfert. Nous continuons l'étude.
Echecs répétés d'implantations
Le tableau 3 montre que seules 2 équipes : OBRUCA et Coll et ANTINORI et Coll obtiennent des
augmentations significatives des taux de grossesses et d'implantation chez des femmes ayant eu plusieurs
transferts d'embryons avec échecs d'implantation. Ces 2 groupes utilisent le laser pour réaliser l'éclosion
assistée.
Eclosion assistée et transferts d'embryons congelés
Seules 2 équipes ont publié des résultats ( tableau 4). CHECK et Coll obtiennent une différence significative
dans les résultats entre le groupe témoin et le groupe expérimental. Cependant, il est difficile de dire si
l'amélioration provient exclusivement de l'éclosion assistée ou bien si elle provient aussi de la modification du
protocole de congélation - décongélation.
Conclusion
L'éclosion assistée a-t-elle un intérêt ?
D'après les études de COHEN et Coll (4) et HELLEBAUT et Coll, l'éclosion assistée appliquée à une
population non sélectionnée n'améliore pas les résultats de façon significative. Par contre, selon les auteurs ;
elle pourrait avoir un intérêt chez les femmes âgées et/ou à FSH élevée et également chez les femmes à
échecs répétés d'implantation.
Il est difficile de conclure sur l'intérêt de l'éclosion assistée car la différence de méthodologie entre les
équipes rend difficile l'interprétation et la comparaison des résultats pour plusieurs raisons : différences dans
la sélection des patients, le choix de la technique, le jour de l'éclosion assistée, le traitement de la phase
lutéale (utilisation de corticoïdes et antibiotiques)
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Il semble indispensable de faire des études cliniques randomisées avec une méthodologie comparable à
celle des équipes les plus performantes.
Tableau 1 :
Résultats d'éclosion assistée pour age > ou = 39 ans
EQUIPE TECHNIQUE RESULTATS
COHEN et COLL TA(J3) + n=99 16% I/E 1992 Hum .Reprod. n=59 3%I/E Vol.7, N°5
OLIVENNES et COLL PZD(J2) n=45 cycles 22,2% GT 1994 Contracept 11,1% I/E Fertil. Sex Vol 22, N° 9
STEIN et COLL PZD(J2) + n=46 23,9% G/P 1995 Fertil. Steril n=43 7 % G/P Vol 63 pp 838-841
SCHOOLCRAFT TA(J3) + n=38 22% I/E et COLL 1995 47% Acc/P J.of . Ass Reprod . And n=28 6% I/E Gen
. Vol 12, N° 9 11% Acc/P
BIDER et Coll, 1997, Hum. TA(J3) n=312 cycles 3,8% BB/T Reprod. Vol .12,N°2 n=274 cycles 3,3% BB/T
+ : Différence significative entre groupe expérimental et groupe témoin
TA : Tyrode Acide ;
" PZD " : Dissection Partielle de la ZP,
n : nombre de patients ;
P : Patients, I : Implantation ;
E : Embryon ;
G : Grossesses.
TABLEAU 2 : Essais d'éclosion assistée pour âge > ou = 39 ans
PZD TA
CYCLES 61 122
AGE MOYEN DES FEMMES 40,9 (39-44)
41(39-44)
EMBRYONS TRANSFERES 209(3,5 E/T)
403(3,3 E/T)
GROSSESSES CLINIQUES 11 (18%/T)
15(12,3%/T)
GROSSESSES EVOLUTIVES --- 6 (+2 FCS + 1 GEU)
ACCOUCHEMENTS 7 6
AMP EYLAU
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Tableau 3 : Eclosion assistée pour échecs répétés d'implantation embryonnaire
EQUIPE TECHNIQUE RESULTATS
OBRUCA et COLL Laser (J2) + n= 129 33% G/T 1994 Contracept 14,4% I/E Fertil . Sex . Vol 22, N° 5
OLIVENNES et SELVA PZD (J2 ou J3) n= 37 24,3% G/T Contracept . Fertil Sex. Vol 22,N° 5 12,7% I/E
VEIGA et COLL 1995 TA (J3) n=24 16,7% G/T Hum. Reprod Vol 10 Supplt 2 6,5% I/E
STEIN et COLL 1995 PZD (J2) n=154 20,8% G/P Fertil . Steril . Vol 63 : 838-841 ? % I/E
ANTINORI et COLL 1996 Laser(J2) + n=200 36,4% G/P Hum . Reprod. Vol 11 N° 3 : 590-594 12,2% I/E
Tableau 4: Eclosion assistée et transferts d'embryons congelés
EQUIPE TECHNIQUE RESULTATS
TUCKER et COLL 1991 PZD (J2) n= 32 cycles 16% I/E
Am.J. Obstet. Gynecol n= 33 cycles 9% I/E 165,341-345
CHECK et Coll,1996 TA (J3) + n=79 15,2 % G/T Fertil. Steril. Vol 65, 5,3 % I/E
N°2 . n=79 30,4 % G/T 13,7 % I/E
Bibliographie
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Reprod. Gen.1996 : Vol 13,1 : 19-22
Laboratoire d'Eylau 55, rue Saint Didier 75116 PARIS Clinique P . CHEREST ,5, rue Pierre CHEREST 92200 NEUILLY SUR SEINE Clinique de la Muette
46-48, rue Nicolo 75116 PARIS Hôpital Antoine BECLERE, 157, rue de la Porte de Trivaux 92141 CLAMART
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