In search of symbiotically relevant genes of - ETH E
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DISS. ETH No. 20886 In search of symbiotically relevant genes of Bradyrhizobium japonicum A dissertation submitted to the ETH Zurich for the degree of DOCTOR OF SCIENCES presented by VALERIE MURSET MSc in Genomics and Experimental Biology, University of Lausanne Born on June 27th, 1986 citizen of Twann, BE Accepted on the recommendation of: Prof. Dr. Hauke Hennecke, examiner Dr. Gabriella Pessi, co-examiner Prof. Dr. Dieter Haas, co-examiner Prof. Dr. Enrico Martinoia, co-examiner 2012 Summary Thesis summary Bradyrhizobium japonicum is a soil bacterium with the ability to infect roots of leguminous plants such as soybean, cowpea, mungbean, and siratro and induce the formation of a novel plant organ, the nodule. In the symbiotic state, the bacteria differentiate into bacteroids that are capable of fixing atmospheric nitrogen into ammonia. This source of nitrogen is used by the host plant and promotes its growth. In return, the bacteroids are supplied with an environment rich in carbon generated by the plant via photosynthesis. Symbiotic nitrogen fixation is an important component of the nitrogen cycle. The first part of this thesis is dedicated to the characterization of potentially new functions essential in symbiosis. Strict criteria were applied for candidate gene selection: up-regulation in symbiosis compared to freeliving conditions, a NifA- and RpoN-dependent expression, and protein detection in bacteroids. Four genes were chosen for characterization through mutant construction: two genes (blr2131, blr2135) that are part of an operon of unknown function (blr2131-2136), a ferredoxin gene (blr1765), and a gene coding for a hypothetical protein (bll1767); the latter two are located in the nitrogenase gene cluster. Despite the careful choice of candidate genes, no relevant phenotypes could be observed for any of the mutants of these genes. In the third chapter, I focused on the characterization of the B. japonicum 1-aminocyclopropane-1-carboxylate (ACC) deaminase gene (blr0241), which is also a NifA- and RpoN-regulated gene. ACC deaminases had been shown to protect rhizobia against the inhibitory effects of ethylene produced by the host plant during the nodulation process. This enzyme converts ACC, a precursor of the plant hormone ethylene, into ammonia and α-ketobutyrate. In free-living, wild-type B. japonicum an ACC deaminase activity could be measured, whereas a blr0241 mutant did not show any enzymatic activity. However, the mutant was not impaired in its ability to nodulate soybean, cowpea, siratro, and mungbean. Also, the blr0241 mutant strain was not affected in its competitiveness for nodulation and nodule occupation compared to the wild-type strain. These results suggested that the role of B. japonicum ACC deaminase differs from that in other rhizobial-plant interactions investigated. In the fourth chapter, the host-specific adaptation of B. japonicum to cowpea was studied. A previous report had revealed that genes coding for enzymes of the tyrosine degradation pathway are specifically up-regulated in cowpea bacteroids compared to soybean and siratro bacteroids, and the products of these genes are exclusively found in cowpea bacteroids (Koch et al. 2010). To study the possible importance of this pathway in B. japonicum, deletion mutations in the fumarylacetoacetase (bll0342) and homogentisate 1,2-dioxygenase (bll0343) genes were constructed. The mutants showed no symbiosis phenotype on all host plants tested. We 1 Summary could prove that B. japonicum wild type and the Δbll0342-bll0343 mutant were able to grow on plates with tyrosine as sole C-source, leading to the hypothesis that B. japonicum may have a bypass pathway for tyrosine degradation. In addition, and in order to possibly add new information to the host specificity concept, the metabolome of soybean, cowpea, mungbean and siratro nodules was determined, which showed striking differences. This study may lead to a better understanding of nodule metabolism and of bacterial-specific adaptation to the host. Since the initial goal of my thesis could not be reached, namely the characterization of new functions involved in symbiosis, we decided to terminate the projects so far described. In the last part of my doctoral work, I focused on a new research area, the characterization of B. japonicum copper-responsive transcriptional regulators. First, the transcriptional regulation of the pcuABCDE operon that had been shown to be involved in copper trafficking was studied. The expression of the pcuA and pcuB genes was shown by qRT-PCR to be up-regulated in copper-limited conditions compared to normal copper conditions. The mapping of the pcuABCDE promoter region did not allow the identification of regulatory elements interacting with the pcuABCDE promoter. A homology search for conserved copper-responsive transcriptional regulators in the B. japonicum genome was then performed. A homolog of the transcriptional repressor CsoR (bsr0701) was detected and characterized. Bsr0701 deletion mutants showed a strong growth delay in anoxic, denitrifying conditions. In symbiosis only one of the two mutants (kanamycin resistance cassette in opposite orientation) showed a strong phenotype which we could not explain. The Bsr0701 regulon was determined by microarray analysis. 2 Résumé Résumé Bradyrhizobium japonicum est une bactérie capable d'induire la formation d'organes particuliers, les nodules, sur les racines des plantes de la famille des légumineuses tels que le soja, le haricot mungo, le siratro et le niébé. Dans le nodule, les bactéries se différencient en bactéroïdes capables de fixer l'azote atmosphérique en ammoniac. Cette source d'azote est utilisée par la plante et améliore sa croissance. En échange, la plante hôte procure des glucides aux bactéroïdes, ceux-ci sont utilisés comme source d'énergie. La fixation symbiotique de l'azote joue un rôle clé dans le cycle de l’azote. La chapitre deux de cette thèse est dédiée à la découverte et à la caractérisation de nouvelles fonctions potentiellement essentielles dans la symbiose entre B. japonicum et le soja. Des critères de sélection stricts ont été appliqués dans le choix des gènes candidats. Ces gènes doivent être surexprimés durant la symbiose comparé à leur expression dans la bactérie à l'état libre. De plus, l'expression de ces gènes doit être dépendante de NifA et RpoN. Finalement, le produit de ces gènes doit être détecté au niveau protéique dans les bactéroïdes. En suivant ces critères de sélections, quatre gènes ont été choisis pour être étudiés par analyse mutationnelle: Deux gènes (blr2131, blr2135) faisant partie d'un opéron de fonction inconnue et deux gènes, le premier codant pour une ferrédoxine (blr1765) et le deuxième pour une protéine hypothétique (bll1767) localisés dans le génome à proximité des gènes codant pour l'enzyme nitrogénase. Aucun phénotype spécial n'a pu être observé pour aucun des mutants dans les gènes sélectionnés. Ces résultats suggèrent que des critères de sélections tels qu'une surexpression du gène en symbiose, une régulation de la transcription par NifA et RpoN ainsi que la détection des protéines dans les bactéroïdes ne garantissent pas un rôle essentiel du gène en symbiose. Dans le troisième chapitre, j'ai caractérisé l'1-aminocyclopropane-1-carboxylate (ACC) désaminase de B. japonicum (blr0241) dont l'expression dépend également de NifA et RpoN. Cette enzyme dégrade l'ACC, un précurseur direct dans la biosynthèse de l'hormone végétale éthylène, en ammoniac et α-cétobutyrate. Il a été démontré précédemment que l'ACC désaminase protège les bactéries fixatrices d'azote contre les effets inhibiteurs de l'éthylène produit par les plantes en réponse au processus de nodulation. Contrairement à la souche sauvage de B. japonicum où une activité de l'ACC désaminase a pu être mesurée, aucune activité n'a pu être détectée dans la souche mutante dans le gène blr0241. En revanche, la mutation du gène blr0241 n'affecte pas la capacité de la bactérie à entrer en symbiose avec les plantes de soja, siratro, haricot mungo et niébé. De plus, la souche mutante dans le gène blr0241 est aussi compétitive que la souche sauvage dans la formation de 3 Résumé nodules. Ces résultats suggèrent que le rôle et l'importance de l'ACC désaminase différent selon le couple bactérie fixatrice d'azote-plant hôte étudié. Dans le chapitre quatre, nous avons étudié l'adaptation spécifique de B. japonicum pour la symbiose avec le niébé. Une étude récente a mis en évidence le fait que des gènes codant pour des enzymes de la voie de dégradation de la tyrosine sont spécifiquement surexprimés lors de la symbiose avec le niébé et que les produits de ces gènes sont exclusivement détecté dans les bactéroïdes en symbiose avec le niébé (Koch et al. 2010). Afin d'étudier l'importance de cette voie de dégradation, des souches mutantes ont été construites où les gènes codant pour une fumarylacétoacétase (bll0342) et pour une homogentisate 1,2-dioxygénase (bll0343) ont été délétés. En symbiose avec les différents légumes hôtes, aucun phénotype n'a pu être observé pour les souches mutantes. Nous avons démontré que la souche sauvage ainsi que la souche mutante Δbll0342-bll0343 de B. japonicum peuvent pousser en milieu solide avec de la tyrosine comme seule source de carbone. Ces résultats suggèrent que B. japonicum a différentes voies de dégradation de la tyrosine. Afin d'obtenir de nouvelles données concernant les mécanismes d'adaptation de B. japonicum aux différentes plantes, le métabolome de nodules provenant du soja, du haricot mungo, du siratro et du niébé a été caractérisé. Les profils métaboliques des nodules de différentes provenances montrent des caractéristiques intéressantes. L'usage de la métabolomique pourrait permettre une meilleure compréhension du métabolisme des nodules ainsi que de l'adaptation spécifique de la bactérie à la plante hôte. Comme l'objectif de départ, à savoir caractériser de nouveaux processus important dans la symbiose n'a pas pu être atteint, nous avons décidé de clore les projets décrits jusqu'ici. Dans la dernière partie de mon travail de doctorat, j'ai changé de sujet de recherche et me suis concentrée sur la caractérisation de régulateur transcriptionnel cuivre-dépendant. Premièrement, la régulation de la transcription de l'opéron pcuABCDE impliqué dans le transport du cuivre a été étudiée. L'expression de pcuA et pcuB, mesurée par qRT-PCR, est plus importante dans des conditions de culture limitées en cuivre comparé à des conditions de croissance normale. La détermination du site d'initiation de la transcription du gène pcuA n'as pas permis l'identification de régulateurs transcriptionnels interagissant avec le promoteur de l'opéron pcuABCDE. Deuxièmement, par homologie, nous avons cherché dans le génome de B. japonicum des régulateurs transcriptionnels cuivredépendant conservés. Cette recherche a abouti à l'identification et à la caractérisation d'un homologue du répresseur transcriptionnel CsoR (bsr0701). Un mutant dans le gène bsr0701 a une croissance retardée en conditions anoxic dénitrifiantes. En symbiose avec le soja, seul un des deux mutants (orientation de la cassette 4 Résumé de résistance à la kanamycine opposée au gène) a un phénotype, cette observation n'a pas pu être expliquée. Finalement, le régulon de Bsr0701 a été déterminé en utilisant la technique des puces à ADN. 5
