Principes généraux

Méthodologie en endocrinologie
Introduction
Une hormone est une molécule diffusible dans le sang, donc logiquement on peut mesurer à chaque
instant une concentration hormonale dans le sang. La concentration de l’hormone dans le sang
révèle le niveau d’activité de la glande endocrine qui l’a produite, et son aspect fonctionnel. Le
problème de ce concept est que certaines hormones ont plusieurs fonctions physiologiques, quand
on va doser l’hormone, on ne rendra pas compte de toutes les fonctions de l’hormone. Par exemple,
la GnRH (gonadolibérine) entraine la libération au niveau de l’adénohypophyse de la FSH et de la LH.
Donc si on dose la concentrationde GnRH dans le sang, on n’évaluera pas les effets finaux,qui
dépendent des concentrations respectives de FSH et LH. Malgré ces limites, c’est quand même
largement utilisable.
Principes généraux
Principe de compétition
La plupart des dosages repose sur la comparaison de la réponse produite par un échantillon donné,
et ceux produits par une gamme de concentration connue par une gamme de références (standard).
On a donc une courbe de calibration, et à partir de cette courbe, l’échantillon à tester, on peut
déterminer sa concentration hormonale par voie d’interpolation. On a 2 grands principes de dosage
généralement utilisés :
-
-
Les dosages biologiques : consistent à déterminer l’activité de l’hormone en quantifiant
l’effet biologique produit par cette hormone. Par exemple, on prend le cas de l’insuline et
son effet hypoglycémiant. L’inconvénient et que l’on a de nombreux problèmes pratiques
dans ce type de dosage dans le sens que doser un effet biologique donné n’est pas toujours
précis.
Les dosages immunologiques : ces dosages sont les plus employés. Ils reposent sur la
reconnaissance de l’hormone par un anticorps spécifique de l’hormone. L’hormone prend ici
le rôle de l’antigène. Elles sont faciles d’emploie, et on peut traiter de nombreux
échantillons. On utilise 2 systèmes de révélation :
o Des marqueurs radioactifs (RIA = radio immunologic assay) : ces dosages sont très
précis, mais ils sont chers d’emploi car les isotopes coutent cher, et ça nécessite de la
protection
o Des révélations enzymatiques (ELISA = enzyme like immunoabsorbant assay) :
l’enzyme la plus couramment utilisée est la péroxydase, plus utilisée en réagissant
sur une molécule appelée chromogène, qui est la diaminobenzidine, qui en présence
d’eau oxygénée (H2O2) va se transformer en un composé coloré. Ce système
présente une D.O. mesurable au spectrophotomètre, elle est proportionnelle à la
reconnaissance du complexe.
Dans ces 2 cas, 2 variations sont utilisée dans le dosage réactionnel :
o Le couplage direct du révélateur avec anticorps ou antigène. La
limite est encombrement stérique.
o
-
-
Le couplage indirect : révélateur couplé à un deuxième anticorps. C’est un anticorps
de lapin, anti-anticorps de souris. Ce système permet de s’affranchir du problème
d’encombrement stérique.
Les dosages par dilution isotopique : ce sont des dosages qui reposent sur le principe
suivant : lorsqu’une hormone donnée génère un métabolite de manière exclusive, on va
mesurer le niveau d’activité de l’hormone en dosant le métabolite produit. Pour cela, on va
injecter une hormone radioactive, et on mesure le métabolite qui est produit, qui est dosé
par des méthodes de purification, on va faire une chromatographie pour obtenir le
métabolite pur, qui sera recueilli soit dans le sang, soit dans les urines, et ensuite on fait une
quantification de celui-ci. On connait la quantité d’hormone injectée, donc la quantité de
métabolites produits, et la quantité d’hormone produite. On parle de dilution isotopique car
l’hormone injectée est radioactive.
Les dosages par compétition : ils sont basés sur une compétition entre un ligand radioactif et
une hormone froide, l’hormone native non radioactive. Cette hormone froide peut être un
standard, c'est-à-dire une hormone de concentration connue, ça peut être l’hormone à doser
et la molécule de haute affinité (comme le CBG = corticosteroid binding globulin), ou un
anticorps anti-hormone. Cette technique a été mise en place par Yalow et Berson (1960) sur
une hormone à l’époque bien connue, qui est l’insuline I131* à laquelle ils font réagir des
anticorps anti-insuline. Ils obtinrent alors des complexes anticorps-anti-insuline/insuline I131*
+ de l’insuline I131* en excès, libre. La deuxième étape est l’apport sur ce schéma réactionnel
de l’insuline froide. On va alors engendrer un complexe anticorps anti-insuline/insuline
froide. On forme un complexe supplémentaire. Il y a alors compétition entre l’insuline
radiomarquée et l’insuline froide, pour former les complexes. Par des effets stériques,
l’hormone radiomarquée est plus facilement détachable des anticorps, et l’insuline froide va
prendre sa place. On va ensuite, après lavage (élimination des insulines libres), doser les
complexes, mesurer la radioactivité liée uniquement à ces complexes radiomarqués.
Quantitativement, on aura cela :
Exercice 1
radioactivité de 125I (en cpm) en fonction de la
concentration en prolactine ajoutée
29000
27000
Radioactivité (en cpm)
25000
23000
21000
19000
17000
15000
13000
11000
9000
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
Concentration en prolactine (ng/mL)
Liaison ligand-récepteur
Des auterus ont chercher à quantifier la liaison hormone-récepteur pour caractériser la liaison, en
particulier l’affinité du récepteur pour l’hormone.
[H] + [R]  [HR]
ka est la constante de vitesse d’association, exprimée en M-1s-1.
kd est la constante de vitesse de dissociation, exprimée en s-1.
A partir de ces constantes de vitesse, on peut déterminer les constantes d’association et de
dissociation. Ce sont respectivement KA et KD.
𝐾𝐴 =
𝑘𝑎
𝑘𝑑
=
[𝐻𝑅]
[𝐻][𝑅]
(M-1)
𝐾𝐷 =
𝑘𝑑
𝑘𝑎
=
[𝐻][𝑅]
[𝐻𝑅]
(M)
N = [RT] = [HR] + [R]
[HT] = [H] + [HR]
[HT] = F + B
𝐾𝐴 =
[𝐻𝑅]
[𝑅𝑇 − 𝐻𝑅][𝐻]

[𝐻𝑅]
[𝐻]
=
𝐵
𝐹
= −𝐾𝐴 ∗ 𝐻𝑅 + 𝐾𝐴 ∗ 𝑅𝑇 = −𝐾𝐴 ∗ 𝐵 + 𝐾𝐴 ∗ 𝑁
B/F
N/KD
-KA
B
N
Bmax = N
B
½ Bmax
KD
F
B/F
-KA1
-KA2
B
2 situations, 2 récepteurs différents pour H :
-
KA1 de forte affinité
KA2 de faible affinité
Il y a un seul type de récepteur pour lesquels l’affinité évolue en fonction de l’apport en hormones. Il
y a coopérativité sur le site récepteur avec l’hormone.
Exercice 2 : récepteurs aux LDL. Démontré par Goldstein et Brown en 1985. Sur le placenta, existe-t-il
des récepteurs aux LDL, comme l’hCG.