Sujet 2 corrigé (2ème partie)

Annéeuniversitaire2011Ͳ2012
Mercredi14décembre2011
LV303EXAMEN1èresession,2ndepartieͲDUREETOTALE120min––4pages
2PARTIESARENDRESURDESCOPIESSEPAREES VOUSNEDEVEZGARDERAPORTEEDELAMAINQUEPAPIERETSTYLOS.
LESDOCUMENTS,CALCULETTES,TELEPHONESETAUTRESSMARTPHONESDOIVENTETRE
IMPERATIVEMENTPLACESATERRE.
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ENZYMOLOGIE(pages1Ͳ2,25points)ͲCOPIE1
UneenzymeallostériquehomodimériqueEfixeunsubstratSetdeuxeffecteursallostériquesXetY.Chaque
sousͲunitédeEpossèdeunsitedefixationpourS,unsitedefixationpourX,etunsitedefixationpourY.
EsuitlemodèledelatransitionconcertéedeMonod,WymanetChangeux.
SetXsefixentexclusivementsurR,etYsefixeexclusivementsurT.
On mesure les vitesses initiales Vi de la réaction en fonction de [S]. On obtient la Figure 1 où les
valeursdeVisontexpriméesenµmol.LͲ1.sͲ1,etcellesde[S]enµmol.LͲ1:
enabsenced’’effecteur(a)
enprésencede[X]=100KX(b)
enprésencede[Y]=KY(c)
KX et KY sont respectivement les
constantes d'équilibre de dissociation de
XetY.Laconcentrationd'enzymeE0est
de1µmol.LͲ1.
Q1°.CaractérisezqualitativementleseffetsdeXetYàl’’aidedecegraphe.DequelsystèmeKouVs'agitͲ
il,etpourquoi?
Sigmoïdes tendant vers une hyperbole à saturation en activateur, Km variables, Vmax apparemment
identiques(àvérifierplusloin)ÆSystèmeK
LacourbebindiquequeXestunactivateurquidéplaceEentièrementverslaformeR,compteͲtenudesa
concentrationуsaturante.
LacourbecindiquequeYestuninhibiteurquidéplacepartiellementEverslaformeT(ilesticiseulement
demiͲsaturantpourT).
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Q2°.VersquellevaleurtendKT,laconstantededissociationdeTpourS?mêmequestionpoura=KR/KT?
Fixationsexclusives=AffiniténulledeTpourS:KTÆьeta=KR/KTÆ0
Q3°.Sachantqu’’enabsencedesubstratsetd’’effecteurslaproportiondeformeTest10foissupérieureà
celledeR,quelleestlavaleurdeL0?
L0=T0/R0=10(ou100pourlesétudiantsquiontmallu)
LesdonnéesdelaFigure1sontreprésentéesselonLineweaverͲBurke(Figure2),où1/Viestexprimé
Ͳ1
Ͳ1
enPmol .L.s,et1/[S]enPmol .L
Q4°. Pourquoi seule la courbe b estͲelle
unedroite?
Parce qu’’à saturation en activateur tout est
sousformeR,pasdecoopérativitédefixation
deS,alluremichaelienne.
Q5°CettereprésentationvouspermetͲelle
de confirmer votre réponse à la Q1°
(systèmeKouV)etpourquoi?
Oui, car les 3 courbes tendent bien vers la
mêmeVmaxàsaturationenS.
Q6°.QuelleestlavaleurdeVmax(avecses
unités) de la réaction catalysée par E ?
justifiezvotreréponse
Ͳ1
Ͳ1 Ͳ1
1/Vmax=0.1Pmol .L.sÆVmax=10Pmol.L .s Q7°.QuelleestlavaleurduKm(avecsesunités)delaformeR?justifiezvotreréponse
Ͳ1
Ͳ1
Lorsque1/Vi=2/Vmax=0,2Æ1/[S]=1/Km=1Pmol .LÆKm=1Pmol.L On incube 100 µg de E en présence de [X]=100 KX. On ajoute à ce mélange une concentration
saturante d'un analogue structural de S, de formule RͲCOͲCH2ͲCl, et marqué au carboneͲ14. Cet analogue
réagitavecunecystéinedusiteactifselonlaréactionirréversiblesuivante:
EͲSH+RͲCOͲCH2ͲClÆEͲSͲCH2ͲCOͲR+HCl
13
Ͳ1
Laradioactivitéspécifiquedel'analogueestde10 cpm.mol .Enfinderéaction,Eesttotalementinactiveet
4
laradioactivitéfixéesurles100µgdeEestde10 cpm.Rappel:l'enzymeestunhomodimère.
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Q8°.Queltyped'inhibitionl'analogueRͲCOͲCH2ͲClexerceͲtͲil?QuelleestlamassemolairedeE?justifiez
vosréponses.
Mêmesic’’estunanaloguestructuraldeS,cen’’estpasuninhibiteurcompétitif«classique»,puisqu’’ilsefixe
defaçoncovalentesurE(etl’’inhibeirréversiblement).C’’estunmarqueurd’’affinité.
CompteͲtenudelasaturationenX,toutl’’enzymeestsousformeR,quipeutfixerSoubienl'analoguedeS.
En fin de réaction E est totalement inactive : les cystéines fixant l'analogue sont donc toutes modifiées. E
étantdimérique,2cystéinesdoiventêtremodifiéesparmoléculedeE.
4
4
13
Laradioactivitéfixéesurles100µgdeEestde10 cpm,correspondantà10 /10 molesdel'analogue,soit
Ͳ9
Ͳ9
10 mole.Conclusion:0,510 molesdeEontétémodifiées,correspondantàlaquantitéutiliséede100µg.
Ͳ6
Ͳ9
5
Ͳ1
LamassemolairedeEestdoncde10010 g/0,510 mol=210 gmol ͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲ
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METABOLISME(pages3Ͳ4,25points)ͲCOPIE2
Attention:lestroispartiespeuventêtretraitéesdefaçonindépendante
Chezlesbactéries,bienquelavoiedelaglycolyseestlapluscommunémentempruntéepourlaconversiondes
hexosesenpyruvate,d’’autresvoiesmétaboliquespeuventégalementl'êtredefaçonplusoumoinsspécifique
selon le genre bactérien considéré. Ces différentes voies vont être étudiées ciͲdessous à l’’aide de bactéries
mutéesdanslegènegpi,cequiprovoquelasynthèsed'uneglucose6Ͳphosphateisomérasenonfonctionnelle.
I.CatabolismeduglucosechezlegenreEnterococcus.
Les bactéries mutées sont incubées en anaérobiose ou en aérobiose dans un mileu de culture
complet en présence de glucose radioactif marqué au carboneͲ14 en C1. En anaérobiose, ces bactéries
produisent du CO2 radioactif et 5 molécules de lactate à partir 3 molécules de glucose marqué, alors qu'en
aérobiose,cesmêmesbactériesneproduisentqueduCO2dontseuleunefractionestradioactive.
Q1°. En justifiant votre réponse, donnez le nom des voies métaboliques permettant d’’expliquer ces
observations.
1èrepartiedelaglycolyseimpossible
Voie des PP obligatoire, production de CO2
radioactif,convergencevers5GAP
Aérobiose:PYRpuisKrebspuisCO2
Anaérobiose:PYRpuisLACT
II. Catabolisme du glucose chez le genre
Agrobacterium.
II.1.Les bactéries mutées sont incubées en anaérobiose dans un milieu identique à celui décrit
précédemment. Curieusement, la quantité de CO2 radiomarqué libéré est moindre que celle observée chez
Enterococcus en conditions anaérobies. Cette observation a conduit à la mise en
évidence d’’une voie parallèle à celle décrite ciͲdessus, et qui ne mène pas à la
production de CO2. Un intermédiaire radioactif de cette voie parallèle, le 2ͲcétoͲ3Ͳ
désoxyͲ6Ͳphosphogluconate (KDPG), radiomarqué en C1, a été caractérisé et est
présentéciͲcontre:
Æ
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Q2°.SachantqueleprécurseurimmédiatduKDPGestunintermédiaired’’unedesvoiesdécritesdansla
partieI,quelestͲil?
Le6ͲPͲgluconate
Q3°. Précisez les réactions métaboliques permettant
d’’expliquerlaformationdeKDPGradiomarquéenC1àpartir
duglucose.Lenomdesenzymesouletypedesréactionsenzymatiquesmisesenjeudevraêtreprécisé
maislesformulesdéveloppéesnesontpasdemandées.
II.2. Le KDPG radiomarqué en C1 conduit à la formation en une seule étape d’’une molécule de
pyruvateetd’’unintermédiairedelaglycolysedénomméX,quiestensuiteluiͲmêmemétaboliséenpyruvate.
Q4°.Identifiezl'intermédiaireXetdonnezsaformuledéveloppée.Précisezletypederéactionouletype
d’’enzymeimpliquédanscettetransformation.
Q5°.Enutilisantlesdonnéesquiprécèdent,
établissezlesbilanscarboné,énergétiqueetélectroniquedelaconversiond’’unemoléculedeglucoseen
lactateparcettevoiealternative.
+
Comparez ces bilans avec ceux de la glycolyse en considérant que les coenzymes NAD /NADH et
+
NADP /NADPHsontéquivalents.
Justifiezrigoureusementvosréponses.
Bilanredoxéquilibré,1seulATPproduit,Rdténergétiquemoitiédelaglycolyse
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III.ConversiondupyruvateenleucinechezEnterococcusetAgrobacterium.
Lors de la conversion du glucose en lactate, l’’intermédiaire pyruvate peut également servir de
précurseurpourlabiosynthèsedecertainsacidesaminésdontlaleucine.Unelecturedecetteconversionest
proposéeciͲdessous:
Q6°.Sachantquelesréactions1,2et3sontanaloguesauxtroispremièresréactionsducycledeKrebs,
vousdonnerezpourchacunedes4réactionsnumérotéessontypeainsiquelessubstrats,lesproduitset
lescoͲenzymessicelas'avèrenécessaire.Deplus,vouspréciserezlaformuledéveloppéede
l’’ɲͲisopropylmalate.
(1) synthèse de squelette carboné ou condensation, analogue de la citrate synthétase (DͲ
isopropylmalatesynthétase)
(2) DéshydratationͲHydratation/Isomérisation (ou isomérisation), analogue de l'aconitase (DͲisopropylͲ
malateisomérase)
(3) OxydoͲréductionetdécarboxylation spontanée (oudécarboxylation oxydative),analoguedel'isocitrate
déshydrogénase(DͲisopropylmalatedéhydrogénase)
Autressubstrats:NAD+;autresproduits:NADH,CO2
(4)transaminase(leucineaminotransférase,PLP).
Autressubstrats:aminoacides;autresproduits:DͲcétoacides
Autres réponses acceptables : déshydrogénase (type glutamate déshydrogénase): Autres substrats :
+
+
NAD(P)H,NH4 ;autresproduits:NAD(P) ou synthétase (type glutamate synthétase): Autres substrats : NAD(P)H,
+
Glutamine;autresproduits:NAD(P) ,glutamate.
ͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲ
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