Jeudi 20 novembre 2014 LEBLANC Romane L2 Relecture

Tissus sanguins et systèmes immunitaire. Bases générales – Immunophénotypage et étude des cellules
Jeudi 20 novembre 2014
LEBLANC Romane L2 Relecture : Brassier Julia
TSSIB
Pr P. Robert
6 pages
Immunophénotypage et étude des cellules
Plan
A. Introduction
B. Phénotypage lymphocytaire
C. Tests fonctionnels
I. Isolation des lymphocytes et des monocytes
II. Activation lymphocytaire
III.
Les phagocytes
A. Introduction
Quand explorer les lymphocytes ?
On a 2 situations pathologiques (défaut ou excès de fonction )
– Défaut de fonction : déficits immunitaires
• acquis
• inné : Le système immunitaire n'est pas indispensable à la vie foetale, donc les fœtus peuvent être
viables in utero puis à la naissance le déficit du système immunitaire est beaucoup plus grave car il ne
peut pas se défendre contre les agents extérieurs
– Excès de fonction : auto-immunité (agression des Ag du soi) allergie (agression d'Ag du non soi mais
non dangereux, donc inflammation)
– Suivi thérapeutique : anticorps monoclonaux
– Au CHU : recherche
Principe des explorations :
– Explorations phénotypiques
– Explorations fonctionnelles (assez compliqué, chères et travail sur cellules vivantes)
– Exploration génotypique
B. Phénotypage lymphocytaire
Le phénotypage peut se faire à partir du sang, ou d'autres liquides. On compte le nombre de T, B et NK. On
peut ajouter des examens complémentaires afin de chercher les sous populations naïves et mémoires. On peut
également réaliser une quantification des récepteurs membranaires car certains récepteurs sont spécifiques des
populations leucocytaires.
Position du problème : sur un frottis on peut distinguer un lymphocyte d'un monocyte par exemple, mais on ne
peut pas distinguer un LT CD4 d'un LT CD8.
On va donc rechercher les récepteurs membranaires car ils sont associés à la fonction. On va utiliser des
anticorps monoclonaux fluorescents qui permettent de détecter ces récepteurs membranaires.
Après avoir produit les anticorps, on peut distinguer chaque population et chaque sous population.
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On peut donc distinguer les types cellulaires par leurs molécules membranaires qui elles-mêmes sont détectées
par des anticorps monoclonaux marqués (par fluorescence). Le problème c'est que ce processus est assez long et
cher surtout sur de grandes populations de leucocytes (car il faut analyser chaque cellule). On a aussi un
problème de fréquence, le coefficient de variation est important, on ne peut pas détecter le nombre de cellules
sur de faibles échantillons car la variation est trop importante. Sur deux échantillons différents de 100 cellules
pris au hasard l'un aura plus de lymphocytes que l'autre, ou plus de monocytes … du fait de la faible quantité de
cellules dans l'échantillon. Il faut donc utiliser un automate qui fasse le travail à notre place
On a donc créé le cytomètre de flux :
– détecte la passage de chaque cellule
– mesure l'expression de chaque marqueur (une couleur par marqueur)
Aspects techniques :
– Dilution extrême des cellules : elles passent une par une
devant le détecteur entouré de liquide de gaine, les
cellules sont étirées ce qui facilite leur passage l'une
après l'autre
– Excitation de la fluorescence par un laser (de longueur
d'onde d'excitation des molécules de fluorescence des
cellules). Chaque fois qu'une cellule passe devant le
laser, la fluorescence est atténuée, car il y a de
l'absorbance. On peut ainsi mesurer la fluorescence de
chaque cellule.
– Détection de l'émission de fluorescence par :
➢ jeux de filtres colorés (« tri » des couleurs)
➢ Photomultiplicateurs (détection de chaque couleur)
➢ Astuce de distinction des PN, monocytes et LT
On représente les données sous formes de graphique. Chaque point correspond aux données d'une cellule.
Sur le premier graphique (CD3 abscisse et CD8 ordonnée) : En bas à gauche on trouve les cellules NK car elles
n'expriment pas CD3. En bas à droite il y a expression de CD3 il peut donc s'agir d'un LTCD4 ou d'un LTCD8,
on voit aussi qu'il y a expression de CD4 donc c'est un LTCD4. En haut à droite il y a expression de CD8 et de
CD3 donc c'est un LTCD8.
LTCD8 et LTCD4 ont la même expression de CD3.
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Sur le 2ème graphique (CD3 abscisse et CD19 ordonnée): En bas à gauche ce sont des NK car il n'y a pas de
TCR donc pas de CD3 et il y a peu de CD19. En bas à droite il y a peu de CD19 et expression de CD3 en
grande quantité donc c'est un LT (sans précision de quel type de LT). En haut à gauche c'est un LB car on
trouve une grande quantité de CD19
Sur le 3ème graphique (CD3 abscisse et CD16/CD56 ordonnée) : En bas à gauche on trouve les LB car de
nouveau faible expression de CD3 et de CD16/CD56. En bas à droite on trouve les LT car expression
importante de CD3 mais faible de CD16/CD56. Enfin en haut à gauche, les NK car faible expression de CD3
mais forte expression de CD16/CD56
Les marqueurs usuels utilisés :
– CD45 : pan leucocytaire, important dans l'activité des T, est présent dans
tous les leucocytes mais pas dans les hématies → c'est donc un
marqueur leucocytaire qui permet l'élimination des hématies
– CD3 : marqueur des LT, on rajoute CD4 ou CD8 pour déterminer le type
de LT
– CD56+/-CD16 : marqueur des NK (car CD3 négatif)
– CD19 : marqueur des LB
Si on trouve des anomalies en général on utilise des marqueurs
supplémentaires.
On a aussi des marqueurs spéciaux :
– CD25 (chaîne alpha du récepteur de IL2) : Quand le LT s'active il exprime le récepteur à IL2 (par
transcription de la sous unité alpha) qui peut donc fixer IL2. CD25 est donc un marqueur de l'activation.
En se fixant sur la chaîne alpha de l'IL2, il montre que la cellule est activée
– CD45 : marqueur des cellules T naïves/mémoires. Exemple du syndrome de « Di George » caractérisé
par des problèmes cardiaques important entraînant des problèmes de développement du thymus, le
rapport cellules naïves/mémoires est très bas, il y a beaucoup plus de mémoires que de naïves. CD45
mémoire a une queue beaucoup plus longue que CD45 naïf.
– Clonalité des T ou des B : Si on reprend l'exemple du syndrome Di George, peu de LT fabriqués donc il
y a peu de diversité, seulement quelques chaînes, V,J,D. Si on prend une vingtaine d'Ac spécifiques on
aura une vingtaine de chaînes V différentes. Si un patient fabrique des LT normaux, on aura seulement
quelque % de V identiques, car il a une très grande diversité donc peu de versions d'un même V mais
beaucoup de versions différentes. S'il ne fabrique pas des LT normaux, on aura de grands % de V car il y
aura peu de type de V différents mais beaucoup de version d'un même V
– Tétramères
C. Tests fonctionnels
I. Isolation des lymphocytes et des monocytes
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On ne peut pas travailler sur du sang car il y a trop d'hématies qui pourraient fausser les résultats, il faut séparer
les lymphocytes des autres types cellulaires. On utilise donc un Gradient de centrifugation qui va permettre
de séparer les cellules du fait de leur différence de densité. La densité des Lymphocytes est plus importante que
celles des polynucléaires, hématies …
On fait couler le sang du patient sur un liquide de densité intermédiaire entre les hématies/polynucléaire et les
lymphocytes/monocytes → séparation des types de cellules. Les hématies vont au fond du tube (elles seront
aspirées ensuite) et les lymphocytes/monocytes sont plutôt à la surface. On va donc pouvoir étudier les
lymphocytes`
II. Activation lymphocytaire
1) Prolifération
But : Capacité des LT à être activés (la prolifération étant la prise de décision lymphocytaire finale)
Méthode
– Recueil de PBMC (prélèvement sanguin périphérique de
cellules mononuclées)
– Stimulation :
• Antigène : Les LT peuvent être activés par un antigène, il
faut donc des CPA ce que sont les monocytes (présent dans
l'échantillon). On rajoute donc un Ag (pour lequel le patient
est immunisé), les monocytes vont donc le capter et le
présenter aux LT, il le présentera donc au LT mémoire
(puisqu'il est déjà immunisé) → activation lymphocytaire
• Mitogènes : Un LT peut être activé par un mitogène (de
manière non physiologique), on utilise de la phytolectine
(d 'origine végétale) qui recrute tous les ligand présents
proches du TCR ce qui va former des paquets de ligands.
Ces derniers vont donc être phosphorylés par les kinases
présentes sur le domaine cytosolique → Activation des
lymphocytes T non spécifiques, donc tous les LT seront
activés sans spécificité et le signal sera très important
– Culture 4 jours (mitogènes) à 7 jours (antigènes)
– Décompte des cellules issues de mitoses, permettant d'observer la prolifération
=> Le système immunitaire entretient peu de copies du même LT mais une grande diversité de LT différents.
On observe donc la prolifération des LT
Méthodes de décompte des cellules :
– Radioactivité (incorporation de thymidine tritiée) : compte de la
radioactivité
– Cytométrie de flux : Incorporation d'un marqueur cytoplasmique
en début de culture (CFSE), mesure de la fluorescence moyenne,
mesure de la fluorescence en fin de culture car les cellules
présentes seront issues des mitoses à partir des cellules de bases
et la fluorescence sera plus faible car elle diminue d'un facteur 2 à
chaque génération cellules non dinisées (fluorescence initiale)
2) Synthèse de cytokines
Méthode :
– Recueil des PBMC
– Culture avec stimulation et culture témoin
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2 méthodes :
• On recueil des surnagent de culture que l'on dose par ELISA
• ELISPOT (détection directe dans la culture)
On distingue les cellules qui produisent les cytokines
–
3) Fonction des LB
On peut aussi détecter les LB par leur récepteurs : les BCR Ig.
On dose les Ig
III. Les phagocytes
1) La phagocytose
•
•
•
Recueil des cellules
On utilise des particules recouvertes d'opsonines (zymozan opsonisé ou microsphères)
On décompte les cellules ayant phagocyté une particule
– Cette méthode peut être manuelle (microscopie en champs clair)
– Ou automatisée (cytométrie de flux) distinction adhésion/phagocytose
2) La bactéricidie
Les phagocytes en plus de leur fonction de phagocytose ont une fonction de bactéricidie qui permet d'éliminer
la bactérie. Lors de cette bactéricidie la cellule produit des dérivés réactifs de l'oxygène qui vont léser la cellule.
On peut étudier ce phénomène par bactéricidie direct.
• Dérivés de l'oxygène :
– Synthèse d'anion superoxydes (O2-) : NADPH oxydase
– Synthèse d'H2O2 : superoxyde dismutase
– Peroxydase : OH+, HCl-, Hbr– Colorimétrie
• Bactéricide directe :
– co-culture leucocytes/bactérie vivantes
– dénombrement à intervalle régulier des bactéries survivantes
3) Le chimiotactisme
Les phagocytes produisent un gradient chimiotactiques.
• Substance : fMLF, C5a
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Culture avec membrane perméable séparant 2 compartiments (chambre de Boyden) : les leucocytes se
déplacent vers ce gradient chimiotactique car ils sont attirés, enfin on dénombre les cellules ayant migré
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