PCR
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APPORT DU DIAGNOSTIC MOLECULAIRE EN PATHOLOGIE INFECTIEUSE Service de Microbiologie Hôpital Robert-Debré 1 Diagnostic Bactériologique • Isolement bactérie sur milieu de culture • Caractérisation phénotypique (morphologie, caractères biochimiques et AG) Identification • ABG 2 Identification Bactériologique en Défaut • Caractérisation phénotypique difficile – Réactifs non commercialisés – Culture lente • Caractérisation phénotypique non discriminante • Bactérie non cultivable • Infection décapitée • Espèce jamais décrite. 3 Apport des Méthodes de Diagnostic moléculaire en Bactériologie • Diagnostic – Sonde – PCR • Etudes Epidémiologiques 4 Détection directe des bactéries dans les échantillons biologiques • Intérêt pour les bactéries : – difficilement ou non cultivables – ayant des exigences nutritionnelles complexes – ayant des délais de croissance élevés – présentes en quantité infime dans l’échantillon 5 Amplification génique = multiplication de cibles moléculaires (1) • Un ADN bicaténaire chauffé au dessus d’une certaine température (Tm) deux brins indépendants. (Dénaturation) • Après chauffage à une température refroidissement nouvelle entre séquences complémentaires. au Tm, hybridation 6 Amplification génique = multiplication de cibles moléculaires (2) • Les ADN polymérases : enzymes ayant la propriété de recopier un brin d’ADN en « s’appuyant » sur un fragment complémentaire préalablement hybridé (élongation). • La PCR synthèse de grandes quantités d’ADN, par la multiplication sélective d’un fragment d’ADN donné. Connaissance des 15 à 25 bases situées à chaque extrémité en 5’ de la séquence à amplifier. (amorces ou primers) 1 cycle = 3 étapes = Dénaturation, hybridation, polymérisation 7 PCR • PCR principe général : – Amorces de ~20 bases complémentaires du gène Cible amorce 1 recherché Amorce 1 – Nucléotides (A, C, T, G) – Polymérase thermorésistante (Taq) – Cycles de T°(copies X2 / cycle) : • Dénaturation (séparation des brins d ’ADN) 95°C • Hybridation des amorces : P1 « annealing » (40-70°C selon Tm) • Extension (synthèse d ’ADN complémentaire par la polymérase depuis l’amorce) 72°C 30 cycles > 230 = 109 copies Région amplifié amplifiée Cible amorce 2 Amorce Amorce22 95°C Taq P2 8 Amplification spécifique • Choix de l’ADN cible Trois paramètres sont déterminants : – Amplification d’une séquence spécifique de genre ou d’espèce – Nombre de copies dans le génome – Taille du fragment amplifié • Choisir une cible ayant plusieurs copies dans le génome − Avantages : • augmente la sensibilité et la spécificité de la détection (IS 6110, amplification à partir de l’ARN ribosomal) • Détection : – hybridation avec sonde – détermination de la taille du fragment amplifié – profil de restriction du fragment amplifié • Avantage : – simplifie l’interprétation des résultats et est particulièrement utile lorsque l’on s’intéresse à une seule espèce bactérienne. 9 PCR classique P1 Taq PCR P2 Hybridation Electrophorèse +/- Hybridation •Temps technique important •Manipulations répétées → Risques de contaminations 10 11 Applications PCR • Pathogènes respiratoires – Mycobactérium tuberculosis, mycobactéries atypiques – Légionella – Bordetella pertussis – Mycoplasma pneumoniae – Chlamydia pneumoniae • Pathogènes de l’appareil génital – Treponema pallidum – Chlamydia trachomatis – Haemophilus ducreyi – Mycoplasma genitalium • Bactéries pathogènes de l’appareil digestif 12 TUBERCULOSE PULMONAIRE PCR M. tuberculosis • Echantillon Sputum – ED (-) Cult (+) PCR : Sensibilité 25-40% – ED (+) Cult (+) PCR : Sensibilité 95% • ED (+) Identification rapide de M. tuberculosis • ED (+) Patient HIV • – ED (-) Différentiation M. tuberculosis / autres Mycobactéries Cult (-) PCR : Faux (+) 5% • ED (-) Pas d’intérêt Carpentier JCM 1995 Truffot – Pernot 13 1995 Analyse par PCR spécifique duplex de liquides biologiques Pneumocoque/méningocoque et Streptocoque B/E. coli 1 2 3 4 5 6 7 8 Pneumocoque (gène pneumolysine) Méningocoque (gène crgA) E. Coli (gène béta-glucuronidase) S. Agalactiae (gène CAMP factor) 14 Détection de gènes de virulence bactériens par PCR • • • • • • • SGA S. aureus E. coli entéropathogènes Shiga-toxines de E. coli O157:H7 E. coli uropathogènes Toxine de Bordetella pertussis Toxines de Clostridium difficile 15 Staphylococcus aureus:détection de la résistance et de la virulence par PCR Leucocidine Panton-Valentine: lukS/lukF Résistance à la méticilline: mecA Toxine du syndrome de choc toxinique: tst Coagulase : coa 16 PCR • PCR multiplexe : – Plusieurs couples d’amorces dans un même tube de PCR – Mise au point particulière – Pouvoir discriminant dpt du nb de gènes analysés (limité) Escherichia coli groupage phylogénétique A A B1 D Streptococcus pyogenes gènes de toxines D B2 B2 chuA yjaA TspE4c2 speB ssa smeZ sic speA 17 Diagnostic bactériologique des infections à VTEC(1) Selles ou écouvillonage rectal Recherche des gènes de virulence Gélose Mac Conkey - Sorbitol Ecouvillon Sorbitol + E.coli Sorbitol Incubation 6h 37° Eau peptonée agglutination antisérum O157 identification biochimique E.coli O157 : H7 Escherichia hermanii PCR - extration ADN Hybridation sur colonie - PCR/ amorces spécifiques - électrophorèse avec sonde spécifique isolement Recherche de gènes de virulence 18 Recherche de gènes de virulence connus • PCR d’un gène de virulence • PCR multiplexe : – Ex 1 : recherche des gènes de Shiga-toxines et de l’intimine chez les EHEC 1 2 1 : eae + stx1 2 : eae + stx2 Dr Mariani-Kurkdjian CNR associé E. coli O157:H7 19 ExPEC: empreinte de virulence par PCR nonaplex Sidérophores Toxines Adhésines Yersiniabactine Hémolysine S fimbriae P fimbriae Aerobactine Adhésine PapGIII Cytotoxic necrotizing factor Adhésine PapGII Salmocheline 20 Bordetella pertussis: Séquences d’intérêt pour le diagnostic Séquence d’insertion IS481 Plus de 200 copies / chromosome Spécificité non absolue: présente chez quelques isolats de B.bronchiseptica et B. holmesii 1 copie /chromosome Spécificité absolue: La toxine pertussis n’est présente que chez B. pertussis Toxine Pertussis 21 Diagnostic de la Coqueluche et PCR Toxine Pertussis Béta-globine IS 481 22 Rémanence de l’ADN de B. pertussis après traitement Durée de positivité en jours de la PCR de l’ IS481 Patients Tel, ko Kon, am Dia, mel Dji, ch Yaf, kh Cav, pi Mad, mi Maq, sa Nou, ba 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 18 19 20 21 >3sem + + + + + + + + + + + + + (31 j) + + 23 + (51j) Méthodes génétiques de détection de la résistance aux antibiotiques Bactérie Gène Antibiotiques Méthodes génétiques Staphylococcus sp. mec A Méthicilline Sondes, PCR S. pneumoniae plp 1A, 2B, 2X β-lactamines PCR Enterococcus sp. van A, B, C, D Glycopeptides Sondes, PCR Entérobactéries tem, shv, autres β-lactamines Sondes, PCR M. Tuberculosis rpo B kat G Rifampicine Isoniazide PCR CID 1997 24 Méthodes Génétiques de détection de la résistance • Avantages – Détermination Pvt pathologique – Rapidité même si culture lente – Mise en évidence génotype • Limites – Manque de sensibilité – Différents gènes à tester – Non exhaustif – En défaut si nouveau mécanisme de R – Absence d’expression phénotypique – Absence de Standardisation 25 GENE ARNr 16S − Présents dans toutes les bactéries • Régions très conservées • Régions variables − Séquences Є Zones identiques chez toutes les bactéries ≠ gènes codant pour ARN ribosomal homme on pourra « isoler » ADN bactérien/ADN humain avec amorces permettant amplifier que gènes codant pour ARNr 16S bactérien − Séquences Є Zones identiques pour bactéries d’un même phylum bactérien (G+, G-) −Séquences Є Zones spécifiques de genre ou d’espèce bactérienne identification bactérie Séquençage des gènes codant pour ARNr 16S Approche pour l’identification des germes non cultivables 26 Organisation schématique du gène codant pour l’ARNr 16S 0 517 F 1513R 1191R 1546 779F 5’ 3’ 408 pb 995 pb Séquence non conservée Séquence conservée 27 METHODOLOGIE Lyse Tissu Infecté Extraction de l’ADN + Amplification gène ARNr16S (remplace culture ) Séquençage du fragment amplifié Comparaison Banque Données (Banque : 1802 séquences d’ARNr 16S) Si séquence déjà connue Bactérie identifiée Si séquence inconnue Positionnement phylogénétique 28 Principales applications de la PCR 16S • Découverte de nouvelles bactéries – Tropheryma whippelii (Relman NEJM 1992) – Bartonella henselae (Relman NEJM 1990) • Identification de bactéries présentant des caractères phénotypiques inhabituels • Diagnostic d ’infections bactériennes à culture négative – Germes à croissance difficile – Infections décapitées par des antibiotiques 29 Apport de la PCR 16S dans le diagnostic microbiologique • Diagnostics étiologiques d’infections sans diagnostic microbiologique • 2 diagnostics d’arthrites – Kingella sp – Neisseria meningitidis (PCR spécifique W135) • 3 diagnostics de méningites – Haemophilus influenzae (PCR spécifique b négative) – Neisseria meningitidis (PCR spécifique négative) – Streptococcus agalactiae (PCR spécifique positive) • 3 diagnostic d’infections à anaérobies – 2 Fusobacteriumies necrophorum, 1 peptostreptococcus sp 30 Cinétique de la PCR 16S dans le sang chez un patient présentant un sepsis à méningocoque T- J0 J1 J2 J2 J3 J7 Début de l’antibiothérapie 31 Temps après début d ’ATB (h) Etude de la persistence de l’ADN bactérien sous ATB N. Meningitidis (J6) 120 n=2 100 80 60 S. S. agalactiae 40 S. S. pneumoniae n=2 S. pneumoniae 20 0 H. S.H. influenzae N. 0 N. meningitidis LCR=6 Liquides Pleuraux n=6 PCR 16S+ PCR 16S - 32 PCR classique P1 Taq PCR P2 Hybridation Electrophorèse +/- Hybridation •Temps technique important •Manipulations répétées → Risques de contaminations 33 PCR en temps réel • Avantages : – Réduction du temps technique – Réduction des manipulations (moins de risque de contaminations) – Quantification Excitation : Captation : LASER, Filtre Caméra CCD Fluorescence • Captation d’un signal de fluorescence au cours de la PCR – Non spécifique : SybrGreen, BET – Spécifique : Sondes fluorescentes 1 10 20 30 40 Cycles de PCR R Q Sonde Taqman R R Q Q 34 Prévention de l’IMF à Streptocoque B PCR entièrement automatisée en 30 min POSITIF 30min Antibio Prophylaxie IV Salle de travail: Prélèvement vagilna Cartouche réactionnelle Prête à l’emploi 35 Remco Lancet Inf Dis 2004 36 Remco Lancet Inf Dis 2004 37 Les Limites de La PCR • Faux négatif : – paramètres d’amplification inappropriés – quantité d’ADN cible inadéquate – présence d’un inhibiteur de la Taq polymérase • Faux positif : – dus à la contamination des échantillons – constituent le problème majeur de cette technique qui impose des mesures expérimentales draconiennes. 38 Recherche de gènes de virulence connus / inconnus • DNA array – Macro-array : • Membrane de Nylon • ADN marqué P33 – Micro-array : • « Puce à ADN » • marquage fluorescent 39 DNA arrays : le principe Sonde 1 Sonde 2.. Extraction d’Ac nucléiques Echantillon X Analyse quantitative hybridation marquage lavage Détection du signal Empreinte d’hybridation 40 DNA array 22 F G 23 22 24 (O45) 23 24 F (O2) ECMN colon S 50 nnC59 G ~1000 ORF spécifiques des ExPEC 41 Marqueurs moléculaires et pathologie infectieuse • Surveillance des infections nosocomiales • Analyse des voies de contamination des KT 42 MARQUEURS PHENOTYPIQUES • • • • Aspect des colonies Antibiotypes (sensibilité aux ATB) Biotypes (typage biochimique) Enzymes métaboliques Sérotypes (Ag de surface) LPS, capsule, protéines • lysotypes (sensibilité aux bactériophages) • électrophorèse de protéines (PAGE) Ac LPS Paroi 43 APPROCHE MOLECULAIRE Analyse de l ’ADN = molécule porteuse de l’information génétique et donc caractéristique d ’une souche Progrès décisifs dans l’identification précise des souches Pallier aux difficultés inhérentes à l ’analyse phénotypique 44 TECHNIQUES DE GENOTYPAGE DE L’ADN CHROMOSOMIQUE • Basées sur la digestion par une enzyme de restriction – RFLP – RFLP + hybridation : Ribotypage, IS, gènes divers – ECP • Basées sur la PCR – PCR multiplexe de gènes variables – De séquences répétées (REP-PCR, ERIC-PCR, PCR-ribotypage) – Aléatoire (AP-PCR / RAPD) 45 EPIDEMIE NOSOCOMIALE Diffusion d’un même clone de patient à patient – Enquête du service d’hygiène hospitalière – Recherche de la source de contamination (manuportage, matériel, produits, alimentation, eau…) 1 2 3 4 5 6 1, 2, 3 : isolats de S. aureus en service de réanimation 4, 5, 6 : souches témoin de S. aureus 46 SCN METHICILLINE RESISTANTS EN NEONATOLOGIE 47 Epidémie à Enterobacter cloacae chez 9 patients 48 Infections post opératoire à S.aureus 49 ROLE DU LABORATOIRE Diagnostic Septicémies sur KT 50 Voies de contamination des KTC Septicémie sur KT à SCN : RAPD K I P H Origine = point d’insertion du KT tunnelite > retrait du KT K I P H Origine = Pavillon du KT > manœuvre iatrogène changement du pavillon KT 51 METHODES TYPAGE MOLECULAIRE • Infirment/confirment Hypothèses cliniques • Ne remplacent pas Analyses épidémiologiques 52 BACK 53 54 APPROCHE GLOBALE • Polymorphisme de restriction de l ’ADN de total • Enzymes de restriction – Clive ADN au niveau sites spécifiques – Fragments de taille = selon nb et position de ces sites – Polymorphisme de taille des fragments de restriction 55 Principe de la PCR Séquence à amplifier 95°C 55°C ADN cible + Amorces spécifiques + Taq polymérase 72°C Nouveau cycle A chaque cycle le nombre de séquence est doublé 30 cycles=109 copies 56 PCR 16S et endocardites (2) • Pogdlajen, Emerg Infect Dis, 2003 – 36 valves cardiaques – 83% hémocultures positives – 14%: diagnostics réalisés uniquement par PCR 16S • 3 cas d ’endocardites à Bartonella quintana • 1 cas d ’endocardites de Bartonella henselae • 1 cas d ’endocardite à Streptococcus gallolyticus 57 Cas clinique (1) • Ostéo-arthritre de l’épaule droite chez un garçon de 3ans. • ATCD : • Janvier 2003 : Ostéomyélite à S. aureus de l’extrémité inférieure du tibia droit et de la malléole sur fracture platrée depuis 3 semaines • Mars 2003 : Broncho-pneumopathie du lobe supérieur gauche • HDM : Avril 2003 • Impotence fonctionnelle douloureuse de l’épaule droite, tuméfiée, évoluant depuis plus de trois jours avec anorexie, perte de poids et quelques épisodes fébriles depuis quelques semaines 58 • Examens complémentaires : – CRP = 145mg/l – GB = 12800/mm3, 71%PN – 863000 plaquettes/mm3 • Traitement : Ceftriaxone, Fosfomycine, Amikacine pendant 24 heures puis transfert à Robert Debré • A son arrivée à Robert Debré : – Scintigraphie osseuse : Ostéomyélite de l’extrémité supérieure et de la diaphyse de l’humérus – Abcès de 6 cm sur 2cm, excision des lésions septiques – Culture stérile 59 • Traitement : Céfotaxime, Fosfomycine 10 jours jusqu’à normalisation de l’aspect clinique Retour à Beaumont • PCR 16S+ : Haemophilus influenzae, la PCR spécifique des sérotypes capsulés était négative • Au total : abcès à Haemophilus influenzae non capsulé chez un enfant dont le bilan immunitaire mettra en évidence une maladie de Bruton. 60 Cas clinique (2) • Méningite et endocardite chez un nouveau-né de 27 jours. – HDM : – Consultation à 27 jours de vie pour une fièvre à 40°C depuis la veille avec des pleurs, des difficultés à prendre le biberon. – Examen clinique : bébé fatigué, tachycarde, pas de point d’appel clinique évident à la fièvre. L’examen clinique quelques heures après l’admission montre un souffle systolique. 61 • Examens complémentaires : – CRP = 157 mg/l – Fibrinogène = 5.71 g/l – LCR : 7000 éléments / mm3, 89%PN, antigènes solubles négatifs. – protéinorachie = 1.75g/l, glycorachie = 1.4 mmol/l (Glycémie = 3.6 mmol/l) – Culture du LCR stérile (sans antibiothérapie préalable) – Hémocultures négatives – Traitement : Céfotaxime, Amoxicilline, Amikacine – Apyrexie obtenue rapidement. – Echographie cardiaque à J15 montre une insuffisance mitrale moyenne + végétation 62 – PCR 16S dans le LCR (J0) + : Streptococcus agalactiae – PCR 16S dans le sérum (J1) + : Streptococcus agalactiae – Confirmation par la PCR spécifique de Streptococcus agalactiae – Au total : endocardite associée à une méningite à Streptococcus agalactiae. 63 Pour pouvoir constituer un réel progrès par rapport aux méthodes classiques ces techniques doivent offrir les avantages suivants : • Simplicité et rapidité (automates) • Possibilité de détecter des agents infectieux difficiles voir impossible à cultiver • Possibilité de détecter directement le microorganisme recherché dans n’importe quel type de prélèvement pathologique • Possibilité d’une estimation quantitative de l’agent infectieux présent dans l’échantillon biologique. 64 Comment interpréter un Résultat PCR • Vrai positif : – Signal positif franc, reproductible, simultané de signaux témoins négatifs. – Signifie la présence de l’ADN cible vivant ou mort dans l’échantillon. – L’interprétation varie selon le choix de la cible amplifiée. • Vrai négatif : – Signal négatif franc, reproductible, simultané de signaux témoins positifs. – Signifie l’absence de la cible ADN dans l’échantillon. 65 Détection de gènes de résistance aux antibiotiques • Détection de la résistance à la rifampicine et à l’isoniazide chez M. tuberculosis et chez M. Leprae. • Détection de la résistance à la méticilline par amplification du gène mecA chez S. aureus. • Détection des β-lactamases à spectre élargi chez les entérobactéries par amplification du gène bla et oligotypage. 66 Principe de l’utilisation des sondes • Séparation des 2 brins d’ADN (Dénaturation) • Appariement bases d’un brin cible (immobilisé sur support solide ou support liquide) avec la sonde ADN marquée 67 • BACK 68 Sondes nucléiques pour la détection et l’identification des agents pathogènes (1) • Importance croissante : nombreux kits commercialisés • Définition : – fragment d’ADN ou d’ARN marqué • enzymes • substrat antigénique • radio-isotope • composé chémoluminescent – capable de s’hybrider spécifiquement à une séquence nucléique complémentaire – ADN ou ARN, taille 20 à > 1000pb 69 Sondes nucléiques pour la détection et l’identification des agents pathogènes (2) • Avantages : – Spécificité (mais parfois faux -) – Détection d’organismes morts ou difficilement cultivables – Rapidité – Flexibilité • Inconvénients – Manque de sensibilité : 105 CF/ml – Manque d’automatisation 70 LIMITES ET PIEGES DE LA PCR (1) Quelques questions non résolues • Le DNA bactérien persiste-t’il au site infectieux où à distance après guérison ou traitement ? • Délai de la négativité de la PCR/culture ? – Méningocoque : 24/48 H – Maladie de Lyme : 5 jours • La PCR peut-elle permettre de suivre une réponse au TT ? (PCR quanti ?) 71 LIMITES ET PIEGES DE LA PCR (2) • La PCR peut elle distinguer une infection d’une colonisation ? • Un site normalement stérile peut il contenir du DNA bactérien ? • Place de la détection RNA bactérien versus DNA 72 • Sonde : séquence acide nucléique (≥ 20 nucléotides) Homologue à une séquence d’ADN ou ARN avec laquelle elle s’hybride de façon stable et spécifique par réassociation entre bases complémentaires 73 Amplification non spécifique • Amplification non spécifique : – amplification d’une séquence présente dans toutes les espèces bactériennes (ARN 16S), ou présente dans une espèce bactérienne (groEL) • Avantage : – permet théoriquement la détection de n’importe quelle espèce bactérienne. • Inconvénient : – impose des conditions de détection stringentes pour assurer la spécificité de la réponse. 74 TUBERCULOSE PULMONAIRE (1) • Dans un échantillon biologique : ED (-) Culture (+) PCR M. tuberculosis sensibilité : 25 et 40%. • A l’inverse, chez des patients suspects de tuberculose mais pour lesquels le diagnostic a été écarté sur des critères bactériologiques et cliniques, la PCR donne parfois des résultats faussement positifs, la spécificité étant de 95% 75 Maladie Whipple: Coloration PAS Culture sur monocytes sanguin Macrophages LCR 76 Découverte de nouvelles bactéries • Tropheryma whippelii – Maladie rare : lipodystrophie intestinale responsable de malabsorption – PCR 16S sur biopsies tissulaires de 5 patients non reliés : amplification positive – Comparaison banques de données : bacille Gram + de la famille des actinomycètes • Bartonella henselae – Angiomatose bacillaire, Maladie des griffes du chat – séquence apparentée à Rochalimaea quintana 77 PCR 16S et méningites • Lu, JCM, 2000 – 15 LCR de méningites bactériennes – 80% cultures positives – 20% diagnostics réalisés uniquement par PCR 16S • Schuurman, JCM, 2004 – 28 LCR de méningites bactériennes – 78% cultures positives – 18% diagnostics réalisés uniquement par PCR 16S (Notion d ’une ATB préalable dans 80%) 78 Rôle du Laboratoire Microbiologique • Détecter Agent Pathogène • Identifier Agent Pathogène • Proposer un choix thérapeutique • Aide à l’étude épidémiologique 79 INTERET DES MARQUEURS • Infections nosocomiales – – – Reconnaître une épidémie Prouver la transmission d’une souche Identifier l’origine d’une infection • Infections communautaires – Etudier la circulation des souches ? (épidémies, vaccinations) – Différentier les récidives des réinfections • Recherche fondamentale – Corrélation fond génétique <> virulence / résistance aux ATB 80 – Détection de fragments d ’ADN portant des gènes de virulence • L’Examen Direct du Sputum reste la méthode la plus rapide et la moins coûteuse pour détecter un patient tuberculeux contagieux. • Sur un échantillon (+) au direct, l’amplification génique peut servir de test d’identification rapide. • Sur un échantillon (-) au direct, se pose l’intérêt de l’amplification génique en raison de son manque de spécificité et du coût. 81 Stratégie diagnostique PCR 16S PCR spécifique LCR <3mois Streptocoque B + E. coli >3mois Pneumocoque + méningocoque Liq. Pleural Pneumocoque + : séquençage en fonction de la PCR spécifique - : utilisation d’un deuxième couple d’amorces 82 ARN ribosomal 16S • Ribosomes : traduction des ARNm en protéines – 2 ss-u : 30s (ARNr16s) et 50S (ARNr 23S et 5S) • ARNr16S codé par rrs – M. tuberculosis : 1 copie, E. coli : 7 copies • Séquence de l’ADN codant pour l’ARNr 16S très conservée entre les bactéries • Classification phylogénétique bactérienne basée sur le séquençage de l’ARNr 16S 83
