RÈPUBLIQUE ALGÈRIENNE DÈMOCRATIQUE ET POPULAIRE Ministère de l’Enseignement Supérieur et de La Recherche Scientifique UNIVERSITÈ DE BLIDA 1 Faculté de Technologie Département de Génie des procédés Mémoire EN vue de l’obtention du diplôme de LICENCE EN GENIE DES PROCEDES SUIVE DE PRODUCTION ET CONTROLE DE QALITE DU VACCIN CLAVAX ® Présenté par : AMRROUCHE HADJER DJOUAK ZINEB Encadré par : DR. DADOU Année universitaire 2021/2022 Remerciements Nous tenons à remercier toutes les personnes qui ont participé à mon encadrement et tous ceux qui, de près ou de loin m’ont soutenu pour réaliser ce projet dans les meilleures conditions, et particulièrement : Le professeur Mme. Dadou, notre encadreur qui nous dirigé et conseillée tout au long de ce projet. Tous les professeurs du génie des procèdes qui nous ont enseigné et en particulier notre maitre de stage Mr. Boubguira Toute l’équipe de l’institut pasteur el kouba pour leur disponibilité et leur aide précieuse en particulier son PDG et le chef de service de formation de nous avoir accepté en tant que stagiaires au sein de l’institut. Enfin, Nous remercie tous ceux qui ont contribué de près ou de loin à la réalisation de ce travail. ملخص يتمثل هذا العمل في صنع و مزاقثح خىدج كالفاكش الذي هى دواء يضتخذم في عالج خذري األغنام وهى مزض خلذي شذيذ و هى عثارج.﴾العذوي يصية األغنام ناتح عن فيزوس يختلف عن فيزوس أورف ﴿أو التهاب الدلذ الثثزي المعذي لألغنام عن لقاذ مصنىع من طزف معهذ تاصتىر الدزائز ملسق القثح زيث صمر لنا المعهذ تإتثاع خطىاخ صنع اللقاذ و مزاقثح . خىدته خاصح؛ ضمن الضىاتظ الفيزيائيح و الكيميائيح للمىاد الخام و المنتح النهائي Résumé Ce travail consiste en la fabrication et le contrôle qualité du Clavax, qui est un médicament utilisé dans le traitement de la radiculite ovine, une maladie cutanée très contagieuse du mouton causée par un virus différent du virus orphique (ou dermatite pustuleuse contagieuse du mouton). C'est un vaccin fabriqué par l'Institut Pasteur en Algérie, l'annexe du dôme, où l'institut nous a permis de suivre les étapes de fabrication du vaccin et de contrôler sa qualité notamment ; Dans le cadre des contrôles physiques et chimiques des matières premières et du produit final. Summary This work consists in the manufacture and quality control of Clavax, which is a drug used in the treatment of sheep radiculitis, a highly contagious skin disease of sheep caused by a virus different from Orphic virus (or contagious pustular dermatitis of sheep). It is a vaccine manufactured by the Pasteur Institute in Algeria, the annex of the dome, where the institute allowed us to follow the steps of making the vaccine and to monitor its quality in particular; Within the physical and chemical controls of raw materials and final product. Sommaire Remerciements ......................................................................................................................................... ملخص.......................................................................................................................................................... Sommaire .................................................................................................................................................. Liste des figures ......................................................................................................................................... Liste des tableaux ...................................................................................................................................... CHAPITRE I :............................................................................................................................................... Synthèse bibliographique ........................................................................................................................ 1 I .1.Présentation général de l’institut pasteur........................................................................................ 2 I.1.1.Historique .................................................................................................................................... 2 I.1.2. Sites de l'institut ......................................................................................................................... 2 I.1.2.1. Sites d’Alger ......................................................................................................................... 2 I. 1.2.2. Annexe du kouba ................................................................................................................ 3 I.1.3. Missions assurées par l'institut ................................................................................................. 4 I .1.3.1. Référence national ............................................................................................................. 4 I .1.3.2. Formation .......................................................................................................................... 4 I .1.3.3. Recherche épidémiologique et appliquée ......................................................................... 4 I. 1.3.4. Distribution des vaccins dans le cadre de la prévention sanitaire ..................................... 5 I .2.Production du vaccin ......................................................................................................................... 5 I .2.1. Définition des vaccins en général .............................................................................................. 5 I .2.2. Type de vaccins.......................................................................................................................... 5 I .2.2. A. Vaccins vivants atténués .................................................................................................. 5 I .2.2. B. Vaccins inactivés ............................................................................................................... 5 I .2.2. C. antigènes vaccinaux purifiés ............................................................................................. 5 I .2.3. Clavelée ovine........................................................................................................................ 5 I .2.4. Vaccin clavax ......................................................................................................................... 6 I .2.5. Cycle de production du vaccin............................................................................................... 7 CHAPITRE II : .............................................................................................................................................. II. 1.Production du vaccin CLAVAX ®....................................................................................................... 8 II.1.1. Identification du vaccin ............................................................................................................. 8 II.1.2.Matériel utilisés .......................................................................................................................... 9 II .1.2.1. Matériel biologique ........................................................................................................... 9 II .1.2.2. Milieux et réactifs .............................................................................................................. 9 II .1.2.3. Matériel non Biologique .................................................................................................. 10 II.1.3.Méthode ................................................................................................................................... 10 II .1.3.1. Prélèvement du fœtus de mouton ...................................................................................... 10 II .1.3.2. Extraction des reins fœtaux............................................................................................. 11 II .1.3.3 .Trypsination des reins fœtaux ......................................................................................... 11 II .1.3.4. Mise en culture ................................................................................................................ 12 II .1.3.5. Repiquage des cellules RM .............................................................................................. 12 II .1.3.6. Inoculation de la suspension virale ................................................................................. 13 II .1.3.7. Reconstitution du vaccin en vrac (le bulk) ...................................................................... 13 II .1.3.8. Lyophilisation du vaccin .................................................................................................. 14 Principe de lyophilisation ............................................................................................................. 14 II .1.4.control de qualité .................................................................................................................... 15 II .1.4.1.conditionnement primaire : ............................................................................................. 15 II .1.4.2.conditionnement final: ..................................................................................................... 15 CHAPITRE III : RESULLTAT ET DISCUSSION................................................................................................. III.1. Control de qualité .......................................................................................................................... 16 III.1.1.conditionnement primaire ...................................................................................................... 16 III.1.2.Conditionnement secondaire................................................................................................... 17 III.1.2.1.Etat demi-finale ................................................................................................................ 17 III.1.2.1.a. Aspect ........................................................................................................................... 17 III.1.2.1.b. Cinétique de la dissolution dˈune pastille ..................................................................... 17 III.1.2.1.c Mesure de Ph ................................................................................................................. 19 III.1.2.2.Etat final du vaccin ........................................................................................................... 19 Conclusion ................................................................................................................................................. Liste des figures FIGURE I.1 : INSTITUT PASTEUR. ............................................................................................................................. 2 FIGURE I.2 : ANNEXE DE KOUBA ............................................................................................................................. 3 FIGURE I.3 : MALADIE CLAVEE. ............................................................................................................................... 5 FIGURE I.4: VACCIN CLAVAX. .................................................................................................................................. 6 FIGURE I.5: ORGANIGRAMME CYCLE DE PRODUCTION DU VACCIN CLAVAX. ................................. 7 FIGURE II. 1: REINS DU FŒTUS. ............................................................................................................................ 11 FIGURE II. 2: TRYPSINATION. ......................................................................................................................... 11 FIGURE II. 3: INCUBATION APRES LA TRYPSINATION DANS L ETUVE. ................................................................... 12 FIGURE II. 4:OBSERVATION MICROSCOPIQUE. ..................................................................................................... 12 FIGURE II .5:CHAMBRE FROIDE. ............................................................................................................................ 13 FIGURE II. 6: LYOPHILISATION. .............................................................................................................................. 14 FIGURE II. 7 : LYOPHILISATEUR .............................................................................................................................. 14 FIGURE III. 1: CHANGEMENT DE COULEUR DES MILIEUX DE CULTURE. .......................................... 16 FIGURE III. 2: CHANGEMENT DE MORPHOLOGIE A, B, C ........................................................................ 16 FIGURE III.3 : VACCIN CLAVAX. ................................................................................................................... 17 FIGURE III.4:DISSOLUTION DUNE PASTILLE.............................................................................................. 18 FIGURE III.5: SOLVANT ET VACCIN.............................................................................................................. 18 FIGURE III. 6:MESUR DE PH. ........................................................................................................................... 19 FIGURE III. 7:VACCIN A L’ETAT FINAL. ...................................................................................................... 19 Liste des tableaux TABLEAU II.1 : COMPOSITION POUR UNE DOSE VACCINALE (0.5ML﴿ .................................................................... 8 TABLEAU II.2:MATERIEL UTILISE. .......................................................................................................................... 10 Introduction Introduction L'industrie pharmaceutique est un élément important des systèmes de santé. Elle comprend de nombreux services qui mettent au point, fabriquent et commercialisent des médicaments au service de la santé humaine et animale. La production pharmaceutique nécessite un Contrôles de qualité pour matières premières et substances actives afin d’assurer la qualité des produits Afin de renforcer notre Recherche On a fait une étude qui se concentre sur La fabrication et le contrôle de vaccin Clavax Dans ce travail, nous introduisons différents étapes de fabrication aussi que la contrôle qualité lors la chaîne de production, ce travail s'organise donc autour de deux grands parties : La première partie et consacrée à une étude bibliographique générale sur fabrication de vaccin. La deuxième partie décrit les différentes étapes de fabrication du clavax, les contrôles physiques et chimiques utilisés dans la chaîne de production. 1 CHAPITRE I : Synthèse bibliographique Chapitre I : Synthèse bibliographique I .1.Présentation général de l’institut pasteur L’institut pasteur d’Algérie est l’un des centres du réseau international des instituts pasteur situé à Alger. Figure I.1 : Institut pasteur. I.1.1.Historique L’institut pasteur d’Alger fut créé en 1894 à l’initiative des docteurs Jean Baptiste Paulin Trolard et H.Soulie. Il avait pour mission au départ, d’assurer le traitement antirabique des personnes mordues. En l’an 1900, l’institut pasteur de paris détacha à Alger une mission permanente, dirigée par les frères Edmond et Etienne sergent pour vérifier les hypothèses émises par le docteur Alphonse Laveran sur l’agent du paludisme. Conformément aux conclusions de cette mission, fut créé le 31 décembre1909, l’institut pasteur d’Algérie (IPA), né de la fusion entre cette mission et l’institut pasteur d’Alger, comme un centre de recherches scientifiques d’après les méthodes pasteuriennes. I.1.2. Sites de l'institut L’institut pasteur d’Alger dispose actuellement de 5 sites : I.1.2.1. Sites d’Alger Le Nouvel Institut Pasteur d'Algérie (NIPA), nouveau siège social de l'Institut Pasteur d'Algérie est situé à Dely-Brahim sur une assiette de 30 hectares. Le NIPA a été initié en 1974 dans le but de regrouper tous les sites de l'IPA d'une part, et augmenter la gamme de production des vaccins et sérums à usage humain et à usage vétérinaire selon les normes G.M.P, d'autre part, l'optimisation de nos productions (vaccins antirabiques, sérums thérapeutiques, milieux de culture), Il a été programmé 2 Chapitre I : Synthèse bibliographique l'acquisition de procès pour une partie des vaccins de programme élargi de vaccination (PEV), et pour les vaccins utilisés dans le cadre de prophylaxie de masse pour le cheptel. De plus, la mise en place d'une unité de répartition et de lyophilisation moderne, ainsi que la production d'animaux de laboratoire SPF et d'animalerie d'expérimentation en atmosphère contrôlé ont été envisagés. Le projet été à l'arrêt depuis 1986, a été repris en 2005 et après transfert de certains services, il abrite actuellement :La direction générale et toutes les structures administratives, les principaux services de diagnostic spécifique et de recherche en bactériologie, immunologie, parasitologie, mycologie, le service de contrôle de qualité bactériologique des aliments et des eaux, le service de contrôle qualité des vaccins et sérums, le centre de prélèvement et enfin, les chevaux producteurs de sérums antivenimeux. Le NIPA dispose actuellement de 4 annexes : L’annexe Hamma ; L’annexe Kouba 1 ; L’annexe Kouba 2 ; L’annexe Sidi Fredj. I. 1.2.2. Annexe du kouba Le stage a été effectué au niveau de l’institut pasteur, annexe Kouba. Figure I.2 : Annexe de kouba Datant de 1910 et d'une superficie de près de cinq hectares, elle abrite : le service de production des vaccins contre la rage (à usage humain et à usage vétérinaire), les animaux de laboratoire, les chevaux producteurs de sérum antirabique, le laboratoire de mise en forme pharmaceutique et enfin la direction commerciale. Cédée par le Ministère de la Santé en 1974, cette annexe héberge : le service de diagnostic et de recherche en microbiologie vétérinaire et d'épizootiologie (diagnostic de la rage 3 Chapitre I : Synthèse bibliographique notamment) ainsi que le laboratoire de production des vaccins viraux vétérinaires (vaccins anti-claveleux, ...). Les produits réalisés par l’institut pasteur sont des produits qui doivent stériles. Dans cet annexe Ilya sic zones principales: 1. ZAC ou salle blanche 2. Laboratoire des milieux de culture 3. Département de production du sérum thérapeutique 4. Département de production du vaccin anti-claveleux 5. Département de production du vaccin antirabique 6. Département de lyophilisation I.1.3. Missions assurées par l'institut I .1.3.1. Référence national Participer au développement et au perfectionnement des méthodes, techniques et outils de prévention, de diagnostic et de traitement des maladies infectieuses, parasitaires et immunitaires ;Réunir les conditions pour une reconnaissance des laboratoires de l'Institut, chacun dans son domaine de compétence, en qualité de centre de référence international pour la prévention, le diagnostic et le traitement des maladies infectieuses, parasitaires et immunitaires. I .1.3.2. Formation Assurer, en collaboration avec les instituts et universités concernés, les formations pratiques liées à l'enseignement de post-graduation dans les domaines relevant de son objet statutaire et contribuer à l'enrichissement des programmes d'enseignement universitaire et de formation spécialisés ; Contribuer, par l'accueil en stage dans ses laboratoires, à la formation, au perfectionnement et au recyclage des personnels de laboratoires de diagnostic biologique des établissements publics dans le cadre des programmes convenus. I .1.3.3. Recherche épidémiologique et appliquée Développer des programmes de recherche scientifique liés à la prévention, au diagnostic par des techniques modernes et au traitement des maladies infectieuses, parasitaires et immunitaires, et les mettre en œuvre ; Mettre au point, développer et améliorer les productions et prestations liées à l'objet de l'Institut ainsi que les méthodes et techniques correspondantes. 4 Chapitre I : Synthèse bibliographique I. 1.3.4. Distribution des vaccins dans le cadre de la prévention sanitaire Stockage, conservation et renouvellement d'un quota stratégique de vaccins destinés à assurer une couverture sanitaire de certaines maladies. L'IPA a le monopole de la production et de la commercialisation des vaccins à usage humain. I .2.Production du vaccin I .2.1. Définition des vaccins en général La vaccination est un processus consistant à stimuler les réponses immunitaires adaptatives protectrices contre des micro-organismes en exposant l’individu à des formes non pathogènes ou à des composants des micro-organismes. I .2.2. Type de vaccins I .2.2. A. Vaccins vivants atténués Ils sont généralement obtenus par passages successifs de l’agent infectieux sur des cultures cellulaires visant à atténuer sa virulence I .2.2. B. Vaccins inactivés Il s’agit d’agents infectieux entiers inactivés par des méthodes physiques comme la chaleur. I .2.2. C. antigènes vaccinaux purifiés Peuvent être des protéines responsables d’une activité du pathogène (toxines tétanique et diphtérique), inactivées avant leur administration (anatoxines) mais présentant la même immunogénéicité. Il peut également s’agir de protéines cibles des anticorps protecteurs (hépatite B) I .2.3. Clavelée ovine Figure I.3 : Maladie clavée. 5 Chapitre I : Synthèse bibliographique Maladie connue aussi sous le nom de la variole ovine, sheeppox (en anglais), La clavelée est une maladie virale infectieuse ; hautement contagieuse ; virulente ; inoculable et spécifique du mouton. Elle est due à un virus de la famille des poxviridae. Par sa symptomatologie elle se rapproche de la variole humaine, elle est caractérisée après un épisode fébrile, par une éruption papuleuse pouvant devenir parfois pustuleuse apparaissant sur la peau. I .2.4. Vaccin clavax Figure I.4: vaccin clavax. Le vaccin anti-claveleux est un vaccin vivant atténué lyophilisé présenter dans des flacons en verre ;sous la forme d une pastille déshydratée. Malgré son efficacité, ce vaccin présente beaucoup de contraintes : -Nécessité d’animaux neufs (jamais vaccinés contre la clavelée). -Difficulté d’interprétation du titrage in-vivo du mélange virus /sérum. -La quantité de vaccin préparée est tributaire de la disponibilité en animaux neufs. Ce sont ces contraintes qui ont conduits à développer un vaccin sur cultures cellulaires. La souche utilisée: Pour la production de vaccin, on utilise la souche virale fixe RM6. 6 Chapitre I : Synthèse bibliographique I .2.5. Cycle de production du vaccin Extraction feotus et reins Trypsination Lavage, agitation et filtration Incubation 24h à37c˚et 5% co₂ Changement du milieu RM2 ou RM33 Incubation 4jà7j Récupération du virus vivant atténué Congélation et décongelation -70c˚ Récupération du vaccin Répartition et lyophilisation inoculun Conditionnement et expédition Figure I.5: Organigramme cycle de production du vaccin clavax. 7 CHAPITRE II : PARTIE EXPERIMENTAL Chapitre II : Partie expérimental II. 1.Production du vaccin CLAVAX ® II.1.1. Identification du vaccin Le vaccin lyophilisée est présenté dans des flacon en verre blanc étiré de type 01, sous la forme d'une pastille déshydratée de couleur rose clair, correspondent à 100 doses vaccinale ; Le vaccin est délivré par flacon de 100 doses accompagnés chacun d'un (01) flacon de 50ml de solvants (solutions de chlorure de sodium, Phosphate mono sodique et Phosphate disodique). Tableau II.1 : Composition pour une dose vaccinale (0.5ml﴿ Composant Quantité Matière active Virus vaccinal (souche RM65). Au moins 10³ DICT50. *Excipient •Di hydrate de chlorure de calcium. • 0 ,0925 mg •Chlorure de potassium. • 0,2 mg •Phosphate mono potassique . • 0,03 mg •Sulfate de magnésium heptahydrique . • 0,1 mg •Chlorure de sodium. • 4 mg •Phosphate disodique. • 0,02376 mg •Bicarbonate de sodium. • 0,175 mg •Rouge de phénol. • 0,0085 mg •Saccharose. • 50 mg •Hydrolysât de lactalbumine . • 25 mg Solvant •Eau purifiée . • QSP 0.5 ml •Chlorure de sodium. • 8,3 ‰ •Phosphate mono sodique. • 0,046 ‰ •Phosphate disodique. • 13 ‰ 8 Chapitre II : Partie expérimental II.1.2.Matériel utilisés II .1.2.1. Matériel biologique Fœtus ovin : Fœtus de mouton issu de l’abattage ou de l’élevage interne Lignée cellulaire RM : Les cellules primaires du rein de mouton fœtal Souche virale vaccinale RM65 : il s’agit du virus de la clavelée atténué venu de la Yougoslavie cultivé sur les cellules du rein du mouton fœtal en Iran et récupéré au 65 ème passage. II .1.2.2. Milieux et réactifs DMEM : (Dulbeco Modified Eagles Medium), il s’agit d’un milieu reconstitué dans de l’eau permutée contenant les éléments de croissance nécessaires (acides aminés, glucides, vitamines…) SVF : Sérum du veau fœtal, utilisé comme complément de culture cellulaire, contenant les facteurs de croissances indispensable à l’adhésion et à la prolifération des cellules. Trypsine-versène : Solution enzymatique composée de la trypsine, qui est une enzyme protéolytique agissant sur la trame protéique, et la versène, qui est l’EDTA, un chélateur de cations renforçant l’action de la trypsine. La solution est utilisée pour détacher le tapis cellulaire de la surface des boites de culture. Solution antibiotique/antimycotique : Les antibiotiques/ Antifongique ont pour but de minimiser les risques de contaminations bactériennes ou fongiques. Les plus utilisés sont la gentamycine, la néomycine et l’amphotéricine B. Trypsine-HBSS : Solution enzymatique composée de la trypsine, qui est une enzyme protéolytique agissant sur la trame protéique, et de l’HBSS ( Hanks’ Bufferd Saline Solution) qui est un tampon. La solution est utilisée pour détacher les cellules du cortex rénal. PBS : Phosphate Buffer saline, un tampon utilisé pour le lavage des cellules du cortex rénal et du tapis cellulaire avant sa manipulation. 9 Chapitre II : Partie expérimental II .1.2.3. Matériel non Biologique Tableau II.2:Matériel utilise. Consommable Alcool chirurgical à 70% Equipement de laboratoire Erlenmeyers Agitateurs magnétiques Flasques de culture cellulaire stériles de 75 Verreries : avec des barreaux magnétiques, cm² ou 150 cm² becher…. Compresses stériles Bec benzène Eau distillé Balance de précision Pipettes graduées en verre ou jetable (5 ml, Centrifugeuse 10 ml) Hotte à flux laminaire verticale Bain-marie Trousse chirurgicale : pinces, paires de ciseaux et lame bistouri Système de filtration : support-filtre et membrane poreuse (0,45 µm et 0,22 µm) II.1.3.Méthode II .1.3.1. Prélèvement du fœtus de mouton Les fœtus de muton contenus dans leur sac placentaire sont récupérés après l’abattage des brebis. Une fois arrivés au laboratoire de production des vaccins viraux vétérinaire LVBV, la poche du fœtus est lavée à l’eau du robinet, ensuite elle subit une incision pour récupérer le fœtus en question en coupant le cordon ombilical après l’avoir noué près du ventre du fœtus. 10 Chapitre II : Partie expérimental II .1.3.2. Extraction des reins fœtaux Figure II. 6: Reins du fœtus. Le fœtus est déposé sur un plateau émaillé et pulvérisé abondamment à l’alcool. Il est par la suite transféré sous hotte à flux laminaire, munie de bec Benzène et de matériel chirurgical convenable à l’extraction (pinces, paires de ciseaux et bistouri). Une incision de la paroi abdominale est effectuée sur le flanc du fœtus à la hauteur des reins. Les reins sont extraits ainsi, ensuite transférés dans une grande boite chirurgicale (ou boite de pétri) stérile. II .1.3.3 .Trypsination des reins fœtaux Figure II. 7: Trypsination. A l’aide d’une pince et d’une petite paire de ciseaux les reins sont décapsulés et débarrassés de toutes membranes. Le cortex rénal est raclé au bistouri. Le tissu obtenu est haché finement, afin de préparer à l’étape de trypsination. La trypsination débute par un lavage du tissu rénal haché par le PBS dans un premier temps, afin de se débarrasser de l’excès de sang, ensuite par la solution enzymatique Trypsine-HBSS. Le tissu lavé est remis dans un volume de la solution Trypsine-HBSS et mis à l’agitation 11 Chapitre II : Partie expérimental pendant 1h à température ambiante. Une fois le temps coulé, la matière trypsinée est récupérée dans des flacons à volumes égaux pour subir enfin une centrifugation de 2500Tr/ 10min à + 4 °C. II .1.3.4. Mise en culture Figure II. 8: Incubation apres la trypsination dans l étuve. Une fois le culot est récupéré, il est repris dans un volume de DMEM à 10% SVF, en aspirant et refoulant à l’aide de la pipette afin d’homogénéiser la suspension cellulaire. Cette dernière est transférée dans un volume adéquat du DMEM selon la formule suivante : 1 ml de culot 200 ml de milieu de culture DMEM La suspension cellulaire est répartie dans flasques de culture à raison de 75 cm², pour enfin être incubés à 37°c à 5% CO2 pendant 24h. C’est le stade RM II .1.3.5. Repiquage des cellules RM Une fois le tapis cellulaire est formé et arrive à l’état de confluence. Les cellules fixées subissent un détachement par l’effet de la trypsine-versène, puis réensemencées dans d’autres boites, à raison de : 1e boite mère donne 2 boites à une densité faible. Figure II. 9:Observation microscopique. 12 Chapitre II : Partie expérimental II .1.3.6. Inoculation de la suspension virale Au passage RM2 ou RM3 ; nous procedons a l inoculation du virus de la clavlée ﴾l infection﴿ les flasques sont vidés de leur milieu et infectés par 2ml d inoculan . Lesser agire a l incubateur 30min a 37°C. Ensuite remplire 30ml du DMEM a 50% SVF,enfin incuber 4-7 jours jusqu a l apparition d ECP﴾ effet cytopatique﴿ signe d infilration et prolifération virale. Récupération du virus vivant atténué par éclatement des cellules et cela en réalisant trois cycles de congélation à (-70°)-décongélation. Figure II .10:chambre froide. Remarque : la récolte de la culture virale se fait sur une boite dont l’ECP est supérieur ou égale à 80% Après la dernière décongélation ; le contenu des flasques est utilisé soit pour : -Servir comme inoculum -Reconstitution du vaccin. II .1.3.7. Reconstitution du vaccin en vrac (le bulk) On mélange la suspension virale avec un volume égal d’excipient de lyophilisation, représentée par le milieu de Hanks additionné de saccharose et d’hydrolysat de lactalbumine à des proportions bien définie. Le mélange est réalisé immédiatement avant les opérations de répartition et de lyophilisation 13 Chapitre II : Partie expérimental II .1.3.8. Lyophilisation du vaccin La dernière étape de fabrication est la répartition et la lyophilisation de bulk dans l’unité de lyophilisation. Figure II. 11: Lyophilisation. Principe de lyophilisation La lyophilisation anciennement appelée cryodessiccation, est la dessiccation d’un produit préalablement congelé, par sublimation. La lyophilisation consiste à retirer l’eau d’un produit liquide, pâteux ou solide, à l’aide de la surgélation puis une évaporation sous vide de la glace sans la faire fondre. Le principe de base est que lorsqu’on réchauffe de l’eau à l’état solide à très basse pression, l’eau se sublime, c’est-à-dire qu’elle passe directement de l’état solide à l’état gazeux. La vapeur d’eau (ou de tout autre solvant) quitte le produit et on la capture par congélation à l’aide d’un condenseur, ou piège froid. Cette technique permet de conserver à la fois le volume, l’aspect et les propriétés du produit traité. Elle peut avoir lieu naturellement (séchage en montagne), ou, plus rapidement, dans un lyophilisateur. Lyophilisateur Un lyophilisateur est un appareil qui permet d’effectuer un vide poussé et qui doit descendre à basse température, cet appareil est composé de trois parties : Figure II. 12 : lyophilisateur 14 Chapitre II : Partie expérimental A. Chambre de lyophilisation Une chambre de iyophilisatin avec des étagères à température contrôlée par le fluide caloporteur (sublimation) ou réfrigérant (congélation). B.Condenseur Un condenseur est utiliser pour la séparation de la vapeur d’eau à des températures très basses variant entre -50°C et -80°C. C. Pompe à vide ou plusieurs en série Une pompe à vide ou plusieurs série sont présentes afin d’assurer le vide dans tout le système. II .1.4.control de qualité II .1.4.1.conditionnement primaire : En cours de culture, les cellules sont contrôlées pour ce qui concerne leur morphologie , leur couleur, ainsi que pour l'absence d'ECP anormal. II .1.4.2.conditionnement final: Caractères : -Aspect : la couleur du vaccin lyophilisé est rose clair . - Ph après réhydratation du vaccin avec son solvant : 7.5 ±0.3. 15 CHAPITRE III : RESULLTAT ET DISCUSSION Chapitre III : Résultat et discussion III.1. Control de qualité III.1.1.conditionnement primaire Au cour de la production et à l étape de mise en culture, on remarque un changement de couleur de milieux de culture, et aussi un changement de morphologie des cellules. Changement de couleur Figure III. 13: changement de couleur des milieux de culture. La couleur du milieu est significative : -Couleur violet basique, donc c’est un mauvais signe (pas de poussée de cellules) ; -Couleur jaune orangée c’est un bon signe (poussée de cellules). Changement de morphologie Figure III. 14: Changement de morphologie A, B, C 16 Chapitre III : Résultat et discussion A : Après la trypsination de 24h, on remarque la formation du tapis cellulaire avec présence de débris cellulaire. B : Tapis cellulaire lésé, formation de plages de lyse, signe de toxicité cellulaire. C : Tapis cellulaire confluent après la trypsination, passage RM1. III.1.2.Conditionnement secondaire III.1.2.1.Etat demi-finale III.1.2.1.a. Aspect A l’état demi-finale le vaccin est une pastille de couleur rose claire. Figure III.15 : vaccin clavax. Le vaccin lyophilisé est une pastille de couleur rose claire homogène. III.1.2.1.b. Cinétique de la dissolution dˈune pastille On prend 2 ml du solvant anti-claveleux, on le mis dans un flacon de vaccin lyophilisé, on démarre le chrono et on marque combien du temps la pastille a mis jusqu'à ce qu'il fonde 17 Chapitre III : Résultat et discussion Figure III.16:dissolution dune pastille. Pour le temps, d'habitude Il faut que la pastille ne dépasse pas une minute pour qu'elle se dissolve, dans notre cas elle nous a pris 8 second, alors on est dans les normes. Puis on remet cette solution dans le flacon de 50 ml du solvant, et la couleur de la solution est devenue rose clair. Figure III.17: solvant et vaccin. Apres la dissolution de la pastille on aura le vaccin à l état final ﴾prêt à l injection ﴿on remarque il est liquide et de couleur rose claire par rapport a le solvant qui est transparan 18 Chapitre III : Résultat et discussion III.1.2.1.c Mesure de Ph On mesure le Ph de la solution avec un ph mètre, et en prend la valeur affichée qui est 7,47. Figure III. 18:Mesur de Ph. La valeur de ph doit être inclus dans l'intervalle [7,20 ; 7,80], notre ph mètre a affiché la valeur 7,47. Par conséquent, cette valeur se situe dans les contrôles spécifiée. •On conclu, que tous les résultats du contrôle de vaccin indiquent que ce produit remplit toutes les conditions spécifiée par la producteur. III.1.2.2.Etat final du vaccin Figure III. 19:Vaccin à l’état final. 19 Chapitre III : Résultat et discussion Le vaccin lyophilisée est présenté dans des flacons en verre blanc étiré de type 01, sous la forme d'une pastille déshydratée de couleur rose clair, correspondent à 100 doses vaccinale. Le vaccin est délivré par flacon de 100 doses accompagnés chacun d'un (01) flacon de 50ml de solvants (solutions de chlorure de sodium, Phosphate mono sodique et Phosphate disodique) 20 Conclusion Conclusion Dans le cas de notre pays , où la maladie sévit de manière endémique, la vaccination constitue le seul moyen qui permettrait l’éradication de la maladie ou tout au moins de limiter les lourdes pertes économiques qu'elle engendre systématiquement. Ce qui implique une contrôle régulier de l’efficacité du vaccin utilisé. L'institut Pasteur se distingue par son unicité de la production de vaccin CLAVAX , cela se fait dans des laboratoires bien équipés et sous la supervision d'experts qui supervisent le suivi des étapes de production de ce vaccin et contrôlent sa qualité jusqu'à l'état finale 21 Références bibliographiques : 1. Document interne de laboratoire, 2015. 2. https://www.pasteur.dz/fr. 3. Rapport de stage "Institut Pasteur d'Algérie ", université Saad Dahleb Blida 01 , faculté de médecine-département de pharmacie, 2020-2021. 4. Etude comparative de la cinétique des anticorps anti-claveleux post vaccinaux, évalués par Séro-neutralisation sur culture cellulaire primaire RM65 et de lignée continue VERO" , Kahina KALLI èpousr TAHTAH , Décembre 2014. 5. Document d'activité de l'institut Pasteur d'Algérie, 2015 .
