Définition : La biotechnologie végétale est un ensemble de techniques biologiques, provenant de la recherche fondamentale, qui sont appliquées à la recherche et au développement de produits. La biotechnologie végétale est un domaine précis dans lequel des techniques scientifiques servent à mettre au point de nouvelles variétés de plante. Considérée comme le perfectionnement des techniques d'amélioration génétique qui ont commencé-ils y a des dizaines de milliers d'années avec la culture de plantes sauvages pour la consommation humaine 2- Les phénomènes physiologiques liés à la culture in vitro : 2-1- Les régulateurs de croissance : La croissance des plantes obéit à des règles qui en fixent l’harmonie générale et influent, par conséquent, sur leur port. Ces règles font partie du patrimoine génétique de chaque espèce et sont exprimées à travers des messagers chimiques appelés facteurs de croissance ou encore hormones appelés aussi hormones végétales (phytohormones) sont des substances qui à faible dose, peuvent moduler ou orienter le développement de la plante dans un sens particulier. Synthétisés par le végétal lui-même, ils sont porteurs d’une information qu’ils apportent à une cellule cible, sensible à leurs actions, et dont ils influencent le fonctionnement. Ou encore on peut les définir comme des substances organiques naturelle qui, influence l’ensemble des processus physiologique de croissance, de différenciation et de développement des plantes et leur confèrent leur capacité d’adaptation aux variations des conditions de l’environnement. Les hormones végétales se distinguent des hormones animales par l’absence de tissus spécialisés dans leur fabrication, par le fait que leurs effets varient en fonction de la concentration et aussi par le fait qu’elles agissent rarement seules : leurs effets résultent d’actions coordonnées de plusieurs hormones. Les principaux régulateurs de croissance peuvent exercer un rôle de promoteurs, ce sont les auxines, les cytokinines, les gibbérellines ou un rôle d’inhibiteurs pour l’acide abscissique et l’éthylène. 2-1-1- Principes généraux d’action des phytohormones : Le message hormonal est assimilé à un signale qui doit être reconnu, lu, interprété et traduit par les cellules pour aboutir à une réponse cellulaire observable à l’échelle de la seule cellule, d’un tissu, d’un organe ou de la plante entière. Classiquement une hormone est perçue par un récepteur, ce qui engendre une cascade d’évènement, et se traduit le plus souvent par une modification de l’expression de différents gènes, gènes codant des protéines qui selon leurs fonctions vont à leur tour agir sur d’autres cibles, et ainsi de suite pour aboutir à une ou des réponses cellulaires coordonnées Les Auxines : Au sens strict, l’auxine est de l’acide indole-3-acétique (AIA) mais le terme d’auxines a été élargi à un ensemble de substances, synthétiques ou non, ayant les mêmes propriétés physiologiques et une conformation chimique proche. La synthèse de l’auxine se fait par une transamination du tryptophane dans l’apex des tiges et des jeunes feuilles. Une fois synthétisée, l’auxine se déplace dans la plante via les cellules de parenchyme xylémien selon un transport polaire, de l’apex jusque la base de la plante. Le transport polaire de l’auxine est un modèle de transport chimiosmotique. Il se réalise grâce à un ensemble de pompes à protons qui, en consommant de l’ATP, permettent de maintenir une différence de pH entre l’intérieur des cellules et la paroi cellulaire et de produire un certain potentiel de membrane qui facilitera l’expulsion des anions AIA- . L’auxine est la principale hormone agissant sur l’élongation cellulaire (ou auxèse). En effet, elle provoque le relâchement de la paroi via la stimulation d’une pompe à proton qui, en acidifiant la paroi, provoque la rupture de certaines liaisons, entraîne une entrée de cations accompagnés de molécules d’eau qui augmentent la turgescence cellulaire. De plus, l’auxine régule la synthèse d’ARNm codant pour des protéines nécessaires à l’élongation cellulaire. Au niveau cellulaire, l’auxine stimule aussi les divisions cellulaires au niveau des zones de différenciation (dans le cambium libéro-ligneux), c’est pour cette raison que l’auxine est dite cambiostimulante. D’un point de vue plus macroscopique, l’auxine contribue à la croissance des tiges et rameaux, à partir des bourgeons apicaux ou axillaires. Au niveau des feuilles, elle favorise l’élongation des pétioles et des gaines quant aux limbes, leur croissance est stimulée en présence d’auxine chez les Monocotylédones et est inhibée chez les Dicotylédones. L’action sur les racines dépend de la concentration en auxine, en effet elle stimulera la rhizogenèse à fortes concentrations et l’inhibera à des concentrations moyennes. L’auxine joue un rôle important dans l’organogenèse végétale. Associée à des cytokinines l’auxine, à faibles doses, participe à la différenciation des bourgeons mais s’oppose, à fortes doses, à leur débourrement. On parle alors de dominance apicale, la partie terminale de la plante empêchant le développement des bourgeons axillaires pour favoriser son propre développement. Mais son effet le plus marquant est son pouvoir rhizogène à fortes concentrations. L’auxine est aussi utilisée en biotechnologie végétale. Elle permet de faire se développer des fruits comme les pommes, poires, prunes, pêches, fraises, tomates, … sans fécondations (parthénocarpie). L’auxine comme le 2,4-D (acide dichlorophénoxyacétique) peut aussi être utilisée comme herbicide sélectif. En effet, à certaines concentrations le 2,4-D agit favorablement sur les monocotylédones (maïs, blé, …) et par contre inhibe la croissance des monocotylédones nuisibles aux cultures telles que le pissenlit, chardons, … L’auxine agit alors comme agent défoliant. Il est bon de remarquer pour terminer cette partie sur les auxines que comme tous les facteurs de croissance, leurs effets dépendent fortement de leur concentration, du tissu sur lequel elles agissent, le stade de développement de la plante mais aussi du rapport entre sa concentration, la présence et la concentration des autres hormones végétales dans la plante. Les Cytokinines : Les cytokinines sont des phytohormones dérivées de bases puriques, à savoir des formes modifiées d’adénine, un autre groupement remplaçant l’hydrogène du groupement amine en position 6. Les cytokinines sont répandues dans la presque totalité des tissus des végétaux mais sont particulièrement abondantes dans les fruits, les graines et les racines. La grande partie des cytokinines sont synthétisée directement sur leurs lieux d’utilisation, cependant une forte dose de cytokinines peut être élaborée dans les racines et ensuite être transportée dans les autres parties de la plante via la sève brute. Lorsque les cytokinines sont en présence d’auxines, elles permettent de stimuler la division cellulaire. En effet, lorsque ces deux hormones sont présentes conjointement, elles permettent d’activer un facteur de transcription qui est essentiel pour que les gènes requis pour l’entrée en phase S de la mitose soient synthétisés. Au niveau cellulaire, elles permettent aussi d’interférer sur l’auxèse, sur des tissus l’auxine n’exerce pas d’effets. Mais les cytokinines ne permettent pas d’influencer seulement sur la division cellulaire, elles jouent également un rôle dans la différenciation cellulaire selon les concentrations respectives en cytokines et en auxines. Les cytokinines interviennent dans la néoformation des bourgeons en contrecarrant l'effet inhibiteur de l'auxine. Elles sont capables de lever la dominance apicale. Produites essentiellement dans les racines et circulant dans la sève brute par le xylème, on peut donc observer deux gradients antagonistes : celui de l'auxine qui part des bourgeons terminaux vers les racines dont l'effet est inhibiteur, et celui des cytokinines qui part des racines pour monter aux bourgeons dont l'effet est stimulateur. Les effets opposés de ces deux hormones ne se font pas sentir que sur les bourgeons, ils peuvent être aussi observés sur la rhizogenèse, sur laquelle les cytokinines exercent un effet inhibiteur et sur la callogenèse. Les cytokinines favorisent aussi la différenciation des proplastes en chloroplastes et prolonge la vie des feuilles en maintenant la teneur en protéines dans les feuilles et en protégeant les chloroplastes de la destruction de leur pigment. Elles retardent ainsi la sénescence des feuilles et sont donc utilisées par les fleuristes pour prolonger la durée de vie des fleurs coupées. Les cytokinines sont donc des hormones végétales dont l’action dépend fort de la présence et de la concentration en auxines. Les Gibbérellines : Le terme gibbérellines regroupe un ensemble de substances, désignées sous le signe GA, qui sont toutes des diterpènes, famille de composés à vingt atomes de carbones, et qui sont formées à base d’isoprène C5H8. Ces phytohormones ont été découvertes au Japon en 1926 chez un champignon parasite du riz, Gibberella fujikuroi. Ce champignon sécrète une substance qui provoque le gigantisme de son hôte via un allongement des entrenoeuds. Actuellement, on connaît une centaine de gibbérellines différentes mais la plus connues d’entre elles est l’acide gibbérellique (GA3). Les gibbérellines agissent sur l’élongation cellulaire mais seulement pour les cellules situées aux entre-nœuds de la plante en activant des enzymes spécifiques de relâchement de la paroi. En allongeant de la sorte les entre-nœuds, les gibbérellines jouent un grand rôle dans la fructification. En effet, elles favorisent le développement et le grossissement des fruits. Dans les graines des Graminées, l'embryon sécrète des gibbérellines qui induisent dans un tissu particulier, la couche à aleurone, la synthèse d'alpha-amylase qui mobilise les réserves contenues dans l'albumen au profit de l'embryon. Les gibbérellines permettent la levée de la dormance de la graine et jouent également un rôle clé dans l'induction de la floraison où elles remplacent un traitement par le froid. L’Acide Abscissique : L’acide abscissique ou ABA est une substance qui fut isolée pour la première fois en 1963, impliquée dans l'abscission (d'où son nom) des feuilles de cotonnier. Comme les gibbérellines, l’acide abscissique est produit dans la voie de synthèse des terpènes mais cette fois-ci, il s’agit de sesquiterpènes (molécules à quinze atomes de carbone). Chez les plantes, la production d'acide abscissique est concentrée au niveau du dans le parenchyme des racines et des feuilles matures ainsi qu'au niveau des plastes. C'est à partir de mévalonate que l'acide abscissique est synthétisé dans les plantes. L’acide abscissique est une hormone de stress qui provoque la fermeture des stomates, permettant une lutte contre la sécheresse (déficit hydrique), contre un choc osmotique et contre une carence en éléments minéraux. L’acide abscissique est une hormone inhibitrice qui est antagoniste à l’action des gibbérellines. Comment nous l’avons vu plus haut, lors de la germination, l’imbibition de l’embryon déclenche la synthèse de gibbérellines qui passent du scutellum dans la couche à aleuron qui produit alors de l’amylase. L’acide abscissique bloque cette synthèse d’alphaamylase et inhibe donc la germination des graines et la levée de la dormance. En inhibant la germination de la graine, l’acide abscissique favorise également la croissance de l’embryon et l’augmentation des réserves. De par son rôle antagoniste aux gibbérellines, l’acide abscissique exerce bien sur un effet négatif sur la croissance des entre-nœuds qui est favorisée en présence de gibbérellines. La fonction pour laquelle l’acide abscissique est la plus reconnue est le fait qu’elle soit responsable de l’accélération de l’abscission des feuilles (repos hivernal) mais sans la déclencher directement. L’Ethylène : L’éthylène est la seule hormone végétale présente sous forme de gaz. Elle est donc très volatile ce qui lui permet une diffusion rapide dans la plante mais aussi vers l’extérieur et donc sur les plantes avoisinantes. L’éthylène est un hydrocarbure insaturé de structure brute C2H4. L’éthylène ‘végétal’ est synthétisé à partir de la S-adénosine-méthionine et par l’intermédiaire de l’ACC (acide 1-amino-cyclopropane-carboxylique). Sa production se produit dans pratiquement tout l’organisme, que ce soit dans les nœuds des tiges, dans les tissus des fruits de maturation, dans les feuilles ou encore dans les fleurs sénescentes L'éthylène une action sur l'orientation des microtubules dans la cellule. Par cela, elle permet d'intervenir sur le sens de croissance de la cellule. En effet, l'orientation des microfibrilles de cellulose est en relation (selon certaines hypothèses) avec l'orientation des microtubules. L’éthylène, tout comme l’acide abscissique, est une hormone de stress. L'éthylène est une hormone essentielle à la régulation de la réaction des plantes aux perturbations de l'environnement telles que les inondations, la sécheresse, les attaques de pathogènes. Toutefois, elle détruit les feuilles si les conditions sont défavorables, sacrifiant ainsi les parties les moins essentielles d'une plante pour protéger le point végétatif qui contient les organes de reproduction de la plante. L’éthylène est aussi capable de provoquer une ‘réponse triple’. En effet, qu’il soit fournit artificiellement ou produit naturellement à la suite d’une quelconque contrainte physique, on se rend compte que l’éthylène provoque dans les plants en germination un ralentissement de l’allongement, un épaississement de la tige et une croissance horizontale ;c’est ce qu’on appelle une réponse triple. Cette réaction de croissance est en fait une adaptation qui permet aux plants de contourner les obstacles qu’elles rencontrent dans le sol. L'éthylène est surtout connue pour le rôle capital qu’elle joue dans le mûrissement des fruits en stimulant la synthèse des enzymes lytiques, par exemple, les pectinases. Les plantes qui sont devenues insensibles à l'éthylène suite à une mutation présentent des phénotypes caractéristiques: élongation excessive, retard ou absence de maturation des fruits, fleurs de longue durée ne flétrissant plus et qui présentent un intérêt incontestable pour la fleur coupée. L’éthylène entraîne donc le mûrissement, qui à son tour, permet au fruit de produire de l'éthylène. Un véritable engrenage. Ainsi, si on place dans une même corbeille une banane très mûre (qui dégage donc beaucoup d'éthylène), et une autre verte, cette dernière verra sa maturation accélérée. Les cinq familles d'hormones végétales 2-1-2- L’importance des hormones végétales dans la culture in vitro : comment on “oriente” une culture à l’aide de deux hormones : l’auxine et la cytokinine. On joue sur le rapport Auxine / Cytokinine : R= concentration en auxine/concentration en cytokinine Si R =1 : formation de cal uniquement ; R <1 : formation de fleurs ou de feuilles sur le cal ; R > 1 : formation de racines sur le cal. 3- Les besoins nutritifs des tissus et cellules cultivés en conditions aseptiques 3-1 - Le milieu de culture : II existe pour chaque espèce végétale 3 milieux : - un milieu d'activation, - un milieu de multiplication, - un milieu d'enracinement. a-Les sels minéraux : Les besoins nutritifs des plantes en culture in vitro concernent d’abord les sels minéraux. Le praticien doit avant toute chose recréer pour la plante un milieu de vie comparable au sol dont elle sera maintenant dépourvue. Tous les éléments essentiels à sa croissance doivent donc être incorporés au milieu sans quoi une carence minérale peut survenir. De plus, le choix des différents sels devra respecter un équilibre ionique afin de favoriser une croissance harmonieuse sans créer d’inhibition. Les besoins des cultures de tissus en éléments minéraux ont été étudiés par différents auteurs et le fruit de leurs recherches a donné lieu à différentes compositions minérales toujours utilisées aujourd’hui. Ce formulations portent souvent le nom de leurs auteurs tels que GAMBORG (Canada), GAUTHERET (France), HELLER (France), MURASHIGE et SKOOG (Etats-Unis), WHITE (Etats-Unis), MOREL (France ), etc. (Tableau n°1) La composition du milieu de culture Murashige et Skoog est sans doute la plus utilisée car elle convient à un très grand nombre de plantes de familles botaniques différentes. Ce milieu est très riche en sels minéraux et il convient souvent de le diluer de moitié ou plus afin d’éviter des effets osmotiques inhibiteurs, particulièrement chez les espèces à croissance très lente. b- Les vitamines : Les vitamines sont des substances organiques reconnues pour stimuler la croissance. Elles sont particulièrement utiles en micropropagation lorsqu’un fragment seulement de la plante est utilisé pour générer la culture de plantes entières. On comprendra que dans ces circonstances, la synthèse endogène (par le tissu végétal lui-même) de vitamines risque d’être insuffisante et que le milieu devra y suppléer en conséquence. Les vitamines les plus fréquemment utilisées sont la thiamine HCL, la pyridoxine, la biotine,le pantothénate de calcium et le myo-inositol (le myo-inositol est parfois considéré comme un sucre). Les concentrations sont souvent faibles et il sera alors nécessaire de fabriquer des solutions-mères. La conservation de ces solutions-mères pourra se faire au congélateur en contenants de plastique ou distribuées dans des cubes à glaçon par petits volumes (exemple 10 ml), puis démoulés une fois gelés et rangés dans des sacs à congélation. Une fois la solution sortie et décongelée, elle devra être utilisée dans les 2 à 4 semaines qui suivent. c- Les régulateurs de croissance : On les appelle aussi « phytohormones » ou « hormones végétales », mais considérant qu’il s’agit variablement de produits de synthèse ou de produits synthétiques, il est préférable d’utiliser le terme régulateurs de croissance. Ces substances sont utilisées à des doses très faibles (0.01mg/l à 10 mg/l) et nécessitent le plus souvent d’être pesées sur une balance de précision à 0.0001g. Il est toutefois possible de fabriquer des solutions-mères à partir de masses s’élevant à 100 mg et d’opérer par la suite une série de dilutions. Les trois principaux groupes de régulateurs de croissance d’usage fréquent sont les AUXINES, les CYTOKININES et les GIBBERELLINES. Le choix du ou des régulateurs utilisés ainsi que leur quantité est généralement guidé par la littérature. Si l’espèce végétale convoitée ne figurent pas parmi vos lectures et qu’aucun milieu de culture ne semble disponible à titre de référence, une première expérience pourrait être tentée en utilisant un milieu de culture réputé convenable pour une espèce voisine ou pour une plante d’un même genre ou même d’une même famille botanique. 3-2 - Les facteurs physique de l’environnement de culture : a) besoin de lumière : Chez les plantes cultivées in vitro, la photosynthèse n'est pas une activité nécessaire puisque l'énergie est fournie par les glucides du milieu. Cependant, même réduite la photosynthèse persiste dans les tissus. De plus la lumière est indispensable au déclenchement et au bon déroulement de certains processus morphogénétiques : nécessité de jours longs pour obtenir des boutons floraux par exemple. La puissance lumineuse à fournir dépend de la durée de l'éclairement et de la qualité spectrale de la lumière reçue par la culture. On exprime l'intensité lumineuse en W.m-2, intensité mesurée au niveau de la culture. On obtient généralement 100 à 150 W.m-2 pour des tubes fluorescents placés à 20cm au dessus des récipients de culture. b) rôle de la température La température est généralement régulée à 20/25°C en continu. Il ne faut pas négliger que la température dans les flacons de cultures peut être supérieure de 2 à 4°C à la température de la pièce à cause de l'éclairage. c) hygrométrie : Elle doit atteindre les 100% d'humidité relative dans les flacons. Cependant, il faut veiller à ne pas noyer les explants par un excès de condensation à la surface du milieu. d) stérilité : Le propre de la culture végétale est qu'il s'écoule un laps de temps important entre les repiquages (jusqu'à 3 mois). Comme les milieux sont riches et les conditions de cultures chaudes et humides, toutes les conditions d'un développement bactérien ou fongique sont réunies. Les causes d'infection sont nombreuses. Il faut donc manipuler dans des conditions d'asepsie rigoureuses : - matériels passés à l'alcool ou flambés, - désinfection des plantes à l’eau de Javel puis rinçage à l'eau distillée avant l'extraction de l'explant. 4-2- Réalisation d’une culture a- Préparation d’un milieu de culture : Voir fiche de TP n° :2 b- Les infections et quelques unes de leurs causes : Lorsque l’on a des cultures infectées, cela peut provenir de différentes causes. Dès l’apparition des symptômes, on regarde d’abord s’il s’agit d’un champignon (moisissure) ou d’une bactérie. S’il s’agit d’un champignon, on voit un développement mycélien qui a une texture feutrée, souvent blanche ou grisâtre. Si le feutrage est vert, il s’agit sans doute du Penicillium. Si le feutrage présente des petits grains noirs (fructifications), il peut s’agir du Rhizopus nigricans qui se multiplie très vite et qu’il faut détruire à l’autoclave sans tarder. S’il s’agit d’une bactérie, on voit alors un voile d’aspect laiteux, développé à l’intérieur du milieu et à la surface. Ce voile est quelquefois coloré (rose, jaune, orangé …). On regardera ensuite si l’infection part de la zone de contact entre les tissus et le milieu, et si oui, ce sont les tissus eux-mêmes qui sont la source de l’infection. Si l’infection part d’un point quelconque du milieu, la source de l’infection peut être soit l’air, soit une mauvaise stérilisation du milieu, soit une infection de l’air ambiant par l’intermédiaire de l’eau de condensation au niveau du couvercle. Dans certains cas, rares heureusement, des spores de certaines bactéries peuvent résister à l’autoclave; il faudra alors stériliser la verrerie à l’eau de Javel. Lorsque l’on voit un développement de mycélium de Penicillium, cela provient de l’air et indique une mauvaise manipulation. Les exemples de mauvaises manipulations sont nombreux : bavardage pendant le travail sous la hotte à flux laminaire, contact des tissus végétaux avec des doigts, mauvaise stérilisation des instruments qui portent alors les microorganismes de l’explant infecté sur les autres. En cours de culture, on peut ne voir apparaître aucune trace de voile bactérien, alors que les bactéries sont présentes dans les tissus. Dans ce cas, le milieu de culture utilisé ne permet pas le développement de la bactérie; toutefois, on peut permettre son expression en ajoutant de la peptone à 2 g/L dans le milieu (la peptone est un constituant classique des milieux de culture des bactéries). On fera ensuite le tri en éliminant les tubes infectés, et on obtiendra ainsi une collection de tissus indemnes de bactéries. 5- Application à la culture in vitro 5-1- Micropropagation ou multiplication végétative C'est une culture de méristèmes situés au niveau des tiges, des racines de fragments de feuilles, ... etc.La multiplication se produit et il y a DEDIFFERENCIAT1ON des cellules : les cellules redeviennent totipotentes et régénéreront une plante entière. Chronologie de la méthode : 1) mise en culture de l'explant. 2) formation d'un cal (= amas de cellules dédifférenciées en division), 3) multiplication avec apparition de bourgeon. 4) chaque bourgeon est repiqué sur un milieu de propagation. 5) les bourgeons redonnent des plantes. Cette méthode présente les avantages suivant : – taux de multiplication très élevé, – possibilité de propagation de plantes réfractaires au bouturage, – multiplication durant toute l'année, – obtention de plants dépourvus de virus, – constitution de collection des pieds mère. Quelques limites sont à signaler : risque de mutation au stade de formation du cal, difficulté ou impossibilité de mettre au point un milieu de culture adapté aux plantes à multiplier. La micropropagation connaît beaucoup d'applications : • production à grande échelle de plante pour les fleuristes (Saint Paulia, Phylodendron, rosier nain, Chrysenthème), • culture d'arbres précieux (noyer, merisier) ou de reboisement (pin), • culture de plantes ayant des propriétés pharmacologiques (production de médicaments). 7-1 Définition d’un OGM : Un organisme génétiquement modifié (OGM) est un organisme (animal, végétal, bactérie) dont on a modifié le matériel génétique (ensemble de gènes) par une technique nouvelle dite de "génie génétique" pour lui conférer une caractéristique nouvelle. Ce processus s'inspire des techniques de sélection ou de mutation, qui existent déjà dans le monde agricole. Les trente dernières années ont vu se développer des techniques modernes de "génie génétique", consistant à introduire un ou plusieurs gènes dans le patrimoine génétique d'un organisme et de construire des organismes dits "génétiquement modifiés" (organismes génétiquement modifiés -OGM- et les micro-organismes génétiquement modifiés -MGM). Ces techniques permettent de transférer des gènes sélectionnés d'un organisme à un autre, y compris entre des espèces différentes. Elles offrent ainsi potentiellement la possibilité d'introduire dans un organisme un caractère nouveau dès lors que le ou les gène(s) correspondants sont identifiés. La transformation génétique peut être effectuée sur de nombreuses espèces végétales, depuis les céréales jusqu'aux légumes ou aux arbres. En tout, ce sont plus de 60 espèces qui peuvent être transformées. Les OGM les plus avancés correspondent surtout à des espèces de grande culture comme le maïs, la betterave et le colza. Les gènes introduits sont très divers mais actuellement ce sont principalement des caractères d'intérêt agronomique qui sont le plus développés 7-2-Méthodes d’obtention d’un OGM: Un organisme génétiquement modifié (OGM) est un organisme vivant dont on a modifié le patrimoine génétique en y insérant par génie génétique un ou plusieurs gènes issus d'un autre organisme vivant. Aujourd'hui, l'homme peut transférer n'importe quel gène en ayant la totale maîtrise de l'expérimentation. En effet, le gène est isolé, puis introduit dans un petit fragment d'ADN. Ce composé est transféré dans une bactérie, qui après avoir été cultivée dans un milieu biologique, est implantée dans la cellule de l'organisme que l'on veut modifier. a/-Transfert indirect : De l'acide désoxyribonucléique (ADN), étranger à l'organisme, est introduit dans l'organisme de l'hôte par l'intermédiaire d'un virus, d'un plasmide bactérien ou tous autres systèmes vecteurs biologiques. Puis, par le phénomène de recombinaison, l'ADN introduit peut être intégré dans le génome et impliquer la formation d'une nouvelle combinaison du matériel génétique. Afin d'être déclarée "viable " cette nouvelle information doit pouvoir se maintenir dans le génome sur les générations suivantes. b/-Transfert direct : Des organismes dont les membranes sont fragilisées ou des cellules végétales dépourvues de parois (telles les protoplastes) sont mis en contact avec de l'ADN. Puis un traitement physique ou chimique permet l'introduction de l'ADN dans les cellules. D'autres techniques telles que la micro-injection, la macro-injection et d'autres techniques de biolistique se basent sur l'introduction mécanique de l'ADN dans les cellules. c/-Fusion cellulaire : La fusion cellulaire (y compris la fusion de protoplastes) ou d'hybridation dans lesquelles des cellules vivantes présentant de nouvelles combinaisons de matériel génétique héréditaire sont constituées par la fusion de deux cellules ou davantage au moyen de méthodes qui ne sont pas mises en œuvre de façon naturelle. En revanche, les organismes produits par les techniques énumérées ci-dessous ne sont pas des OGM sur le plan réglementaire : ● Les techniques qui ne sont pas considérées comme entraînant une modification génétique, à condition qu'elles n'impliquent pas l'emploi de molécules d'acide nucléique recombinant ou d'OGM : o la fécondation in vitro, o les processus naturels tels que la conjugaison, la transduction, la transformation, o l'induction polyploïde. ● Les techniques ou méthodes de modification génétique suivantes, à condition qu'elles n'impliquent pas l'utilisation de molécules d'acide nucléique recombinant ou d'OGM : o la mutagenèse, o la fusion cellulaire (y compris la fusion de protoplastes) de cellules végétales d'organismes qui peuvent échanger du matériel génétique par des méthodes de sélection traditionnelles. 7-3 -Catégories des gènes concernés a/-But de la transgénèse Selon les promoteurs des organismes transgéniques, fabriquer des OGM a pour but de doter un organisme vivant de propriétés ou de caractères qu'il pourrait avoir via la sélection conventionnelle (croisements/mutagenèse/culture in vitro, fusion de protoplastes, hybridations interspécifiques) et/ou qu’il ne pourrait avoir par le biais de la reproduction naturelle, soit que cela soit trop lent via les techniques de croisement et d’hybridation, soit que cela est impossible car nécessitant une transgression de la barrière des espèces. On définit typiquement cinq catégories de gènes concernés. b/-Gènes de résistances aux insectes Cette résistance est conférée aux plantes par des gènes codant une forme tronquée d'endotoxines protéiques, fabriquées par certaines souches de Bacillus thuringiensis (bactéries vivant dans le sol). Il existe de multiples toxines, actives sur différents types d'insectes : par exemple, certaines plantes résistantes aux lépidoptères, tels que la pyrale du maïs (Ostrinia nubilalis), portent des gènes de type Cry1(A). Des pesticides contenant des suspensions de bactéries portant ce type de gènes sont utilisés depuis plus de 40 ans, et ils sont d'ailleurs autorisés en agriculture biologique. Il n'a pas été rapporté d'effet néfaste pour l'environnement, en dehors de l'apparition de populations résistantes d'insectes, constatée sur la teigne des crucifères (Plutella xylostella) et sur une noctuelle : Heliothis virescens. Certains auteurs soulignent par ailleurs que la toxine produite par les plantes transgéniques n'est pas identique à celle des biopesticides autorisés, et qu'elle nécessite une évaluation spécifique des risques induits ce qui est réalisé avant mise en culture (tests de toxicité aiguë et sub-chronique). Chez B. thuringiensis, plus de 230 toxines sont actuellement répertoriées. En agriculture biologique, on utilise des suspensions bactériennes afin de se prémunir de l'attaque de certains ravageurs (insectes). Il est cocasse de remarquer qu'aucune étude de toxicité n'a été entreprise afin de garantir la non toxicité de l'épandage de ces suspensions bactériennes. c/-Gènes de tolérance aux herbicides Il s'agit par exemple du gène codant pour une enzyme conférant une tolérance au glufosinate d'ammonium (que l'on peut trouver dans l'herbicide Basta) et au glyphosate (dans le Roundup). On ne parle pas de résistance vis à vis d'herbicides mais de tolérance (vis à vis d'un herbicide donné). Note : contrairement à ce que l'on entend régulièrement, ces OGM ne permettraient pas une diminution de l'usage des herbicides concernés, puisqu'ils permettraient d'épandre ces derniers sur des plantes telles que des céréales avec pour but de détruire les "mauvaises herbes" présentes dans le même champ. Qu'en sera-t-il des résidus d'herbicides qui resteront sur / dans les céréales OGM, si celles-ci sont destinées à la consommation humaine ? d/-Gènes marqueurs de résistance aux antibiotiques Ces gènes sont utilisés comme marqueurs de sélection, pour repérer les cellules dans lequel le gène voulu a été introduit. Les trois principaux marqueurs utilisés étaient des gènes provoquant une résistance vis à vis des familles d'antibiotiques suivantes : kanamycine/néomycine, ampicilline et streptomycine. Dans tous les cas, les antibiotiques spécifiques de chacune de ces familles sont peu ,voire pas utilisés en médecine humaine. L'utilisation de ces gènes a provoqué de nombreux débats, car il a été avancé qu'ils pourraient migrer vers des bactéries pathogènes, qui deviendraient alors résistantes aux antibiotiques, nécessaires pour traiter une infection. Il existe un certain risque à voir des bactéries du tube digestif humain devenir résistantes à ces antibiotiques, mais il est admis qu'une part importante d'entre elles (50 à 70 %) le sont déjà. En effet, les études sur des souris dont le tube digestif a été rendu stérile, puis ensemencé avec une population bactérienne connue, ont montré l'apparition spontanée, par mutation, de gène de résistance aux antibiotiques. En revanche, l'utilisation d'un gène de résistance à la kanamycine a été jugé globalement plus préoccupant, car cet antibiotique est utilisé pour les infections humaines particulièrement difficile à traiter. Note : il ne s'agit certainement pas de la kanamycine car justement cet antibiotique n'est pas utilisé en médecine humaine (peut-être s'agit il de l'ampicilline ?). Non. L'ampicilline est certes très largement utilisée en médecine humaine,mais une forte proportion de souches résistantes dans la population a rendu son emploi beaucoup plus limité depuis au moins une dizaine d'années. Elle n'est certainement pas utilisée pour traiter des infections sévères ou dues à des souches multi-résistantes ! Bien qu'il n'y ait pas eu de démonstration expérimentale du risque de transfert de gène de résistance aux antibiotiques, le principe de précaution a prévalu, et l'Union européenne souhaite l'élimination progressive de ces gènes dans les OGM autorisés. Plus précisement, la directive 2001/18/CE prévoit dans son article 4 alinéa 2, que : « Les États membres et la Commission veillent à ce que l'on accorde une attention particulière aux OGM qui contiennent des gènes exprimant une résistance aux antibiotiques utilisés pour des traitements médicaux ou vétérinaires lors de l'évaluation des risques pour l'environnement, en vue d'identifier et d'éliminer progressivement des OGM les marqueurs de résistance aux antibiotiques qui sont susceptibles d'avoir des effets préjudiciables sur la santé humaine et l'environnement. Cette élimination progressive a lieu d'ici le 31 décembre 2004 dans le cas des OGM mis sur le marché conformément à la partie C et d'ici le 31 décembre 2008 dans le cas des OGM autorisés en vertu de la partie B. » e/-Gène de stérilité mâle Le gène de stérilité mâle (barnase) code une ribonucléase, et est contrôlé de façon à ne s'exprimer que dans le grain de pollen. Il s'oppose alors à l'expression des molécules d'acide ribonucléique nécessaires à la fécondité. Le gène barstar, quant à lui est un inhibiteur de cette ribonucléase. Ces deux gènes ont été utilisés pour empêcher l'autofécondation et permettre la production de semences hybrides homogènes pour des salades en Europe. f/-Gènes servant à en réduire d'autres au silence L'opération consiste à introduire un exemplaire supplémentaire d'un gène cible, mais en orientation inverse (on parle alors de gène « antisens »), ou, parfois, dans le bon sens, mais tronqué. La présence de ce gène « erroné » diminue de manière drastique l'expression du gène normal, ce qui empêche la synthèse de l'enzyme cible. Un exemple de ce type est celui de la pomme de terre, dont les synthétases sont inhibées, de façon à produire un amidon C'est une technique biochimique 7-4-Exemples d'applications possibles: Les OGM utilisés aujourd'hui le sont principalement dans les domaines de l'agriculture (alimentation et industrie) et de la santé. Les applications présentées dans les médias dans les autres domaines restent des potentialités du domaine de la recherche, suscitant un intérêt commercial ou pratique qui reste à mettre en œuvre (ou à ne pas mettre en œuvre). a/-Alimentation ● ● ● Alimentation humaine (par exemple la chymosine, originaire du veau, est produite par la bactérie E. coli, et est utilisée pour la fabrication du fromage) ; Alimentation animale (par exemple, le tryptophane) ; Restent du domaine de la recherche et du laboratoire les améliorations de la qualité alimentaire (tomate à mûrissement ralenti, riz doré codant pour le bêta-carotène). b/-Agriculture Amélioration des pratiques culturales (plantes produisant en cas de sécheresse une protéine fluorescente (car le gène est sous contrôle d'un promoteur inductible en cas de déficit hydrique et est donc arrosée lorsque nécessaire), maïs, soja tolérant un herbicide total et afin d'éviter des pertes de rendement : maïs, soja, cotonnier produisant une toxine insecticide issue d'un gène de Bacillus thuringiensis...) ; c/-Industrie et recherche ● ● ● Amélioration des qualités industrielles des matières premières (exemple du peuplier ayant un taux de lignite inférieur et facilitant le processus de fabrication de la pâte à papier) ; Optimisation des techniques de la recherche génétique (protocoles de définition de l’expression de gènes) ; La bioremédiation et la phytoremédiation (bactérie dégradant des hydrocarbures, plantes capables de stocker des métaux lourds) restent des projets à l’état de recherche. Les agriculteurs se trouvent en marge avec cette technologie, principalement dans les pays pauvres. d/-Santé ● ● ● La biomédecine, avec la production de substances médicales comme l’insuline ou le vaccin contre la rage ; La thérapie génique, qui nécessite une bonne évaluation du rapport bénéfices-risques pour ne pas porter atteinte aux enfants soignés par cette technique ; Les alicaments représentent un secteur de recherche important : il s'agit d’intégrer directement des gènes producteurs de substances médicamenteuses dans des aliments. Un exemple souvent cité est la banane médicament, qui reste aujourd'hui un projet.
