INTRODUCTION De nombreux végétaux contiennent des substances odorante, volatils est peut soluble dans l’eau appelées « huiles essentielles », celles-ci sont à l’origine de l’odeur parfumé des plantes. Très vite ces composés ont intéressé les diverses industries, tel que les cosmétiques, la parfumerie, la pharmacie, l’agroalimentaires etc.… . Ainsi plusieurs techniques ont été mises au point pour l’isolement de ces constituants selon les caractéristiques de la plante ou la partie de la plante (feuilles, bois, fruits …). Quelque soit le secteur d’activité, l’étude des huiles essentielles reste une étape importante qui, malgré les progrès constants des différentes techniques de séparation et d’identification, demeure toujours une opération délicate nécessitant la mise en œuvre simultanée ou successive de diverses techniques Dans ce travail nous nous somme intéresser à l’extraction de l’huile essentielle des feuilles d’Eucalyptus globulus par 2 méthode différentes entrainement a la vapeur et macération(extraction a froid). La caractérisation de ces essences a été faite par la détermination du rendement et de leurs compositions chimique, donc qualitativement en utilisant la technique de chromatographie en phase gazeuse en programmation de température sur une colonne de polarité moyenne, en utilisant le FTIR, la séparation sur colonne et la CCM. I.GENERALITEES : 1. Définition : Telles que définies, les huiles essentielles seraient des produits généralement odorants, obtenus soit par entraînement à la vapeur d’eau de végétaux ou de parties de végétaux, soit par expression à froid du. Mais cette définition est très restrictive, car elle exclut d’une part les produits odorants d’origine animale et d’autre part les essences obtenues par d’autres procédés d’extraction. De ce fait quand on examine une huile essentielle il faut avoir à l’esprit deux préoccupations principales : le matériel botanique d’où elle est issue ainsi que le mode d’extraction. 2. Localisation dans la plante : Les huiles essentielles sont largement répandues dans le règne végétal, elles peuvent se rencontrer dans tous les organes végétaux. Dans une même plante les essences peuvent être présentes à la fois dans différents organes, leur composition chimique pouvant varier d’un organe à l’autre. 1 3. Modes d’obtention des huiles essentielles : Au vu de la richesse et de la complexité de leur composition chimique plusieurs techniques d’extraction de ces essences et des principes aromatiques végétaux ont été mises au point pour l’exploitation de ces richesses naturelles. Toutefois les normes liées à l’utilisation de ces essences limitent en général le choix de la méthode d’extraction. En effet la localisation histologique des composés aromatiques dans le végétal ainsi que la destination finale du produit extrait peuvent orienter le choix technologique. Les méthodes d’extraction sont adaptées aux propriétés les plus importantes des huiles essentielles : leur volatilité dans l’air et dans la vapeur d’eau et leur solubilité dans les solvants organiques. Entraînement à la vapeur d’eau : Ce procédé est basé sur le fait que la plupart des composés odorants volatils (en particulier les huiles essentielles) contenus dans le végétal sont susceptibles d’être entraînés par la vapeur d’eau du fait de leur point d’ébullition relativement bas et de leur caractère hydrophobe. Ils ne sont donc ni retenus (par et dans les biopolymères de la plante), ni solubilisés dans l’eau. Il en existe deux types : L’hydrodistillation : Elle consiste à immerger directement le matériel végétal à traiter (intact ou broyé) dans un alambic rempli d’eau qui est ensuite porté à ébullition. Les vapeurs hétérogènes formées sont condensées et l’essence se sépare par différence de densité. Distillation à la vapeur d’eau : Pour ce type de distillation le végétal n’est pas en contact avec l’eau. La vapeur nécessaire à l’extraction arrive à l’intérieur de l’alambic par le fond et repart de manière homogène au moyen d’un tuyau circulaire muni de nombreuses ouvertures. Extraction par solvant organique : Le matériel végétal est mis en contact avec un solvant à chaud ou à froid (on opère le plus souvent à température ambiante). Le produit obtenu après évaporation du solvant est appelé « concrète ». Ce terme résulte de la tendance du produit à se solidifier en raison de la présence de matière grasse entraînée par le solvant. Le traitement à froid de la concrète par l’alcool absolu permet ensuite de séparer les matières grasses et obtenir après évaporation de l’alcool, la phase dite « absolue » des huiles essentielles. 2 On peut citer également d’autres procédés d’extraction tels : L’enfleurage ou macération Extraction au CO2 supercritique L’extraction par micro-onde. 4. Composition chimique : La composition chimique d'une Huile Essentielle est complexe et chaque classe chimique est étroitement liée à une réponse thérapeutique précise. Ces molécules sont généralement des hydrocarbures terpèniques : monoterpènes (C10), sesquiterpènes (C15), diterpènes (C20), triterpènes (C30), et tétraterpènes (C40), tous formés à partir d’un multiple pair ou impair d’unités isopréniques . Ils ont tous la même origine biogénique : l’isopentényl pyrophosphate, de structure hémiterpènique qui est le précurseur commun de ces molécules, bien que n’existant pas à l’état libre dans le végétal. Les huiles essentielles contiennent surtout des monoterpènes, quelques sesquiterpènes et plus rarement des diterpènes. Ces terpènes sont prépondérants. Ils peuvent être acycliques, monocycliques ou bicycliques. Ils sont formés dans cet ordre chronologique dans le végétal et sont, selon leur degré d’oxydation, fonctionnalisés par des groupes hydroxyles, époxydes, aldéhydes ou carbonyles. 5. Utilisation des huiles essentielles : Actuellement les huiles essentielles trouvent leur utilisation dans différents secteurs. Si celui de la parfumerie est leur débouché principal, ceux des produits d’hygiène et de la cosmétologie sont également de grands consommateurs, même si le coût souvent élevé des produits naturels conduit à privilégier les produits synthétiques. Certaines huiles essentielles sont aussi utilisées en nature dans l’industrie Pharmaceutique en particulier pour la préparation d’infusion et sous forme de préparation galénique simples. De plus elles servent à l’aromatisation de certaines formes médicamenteuses destinées à la voie orale. Les essences naturelles constituent le support d’une thérapeutique particulière : l’aromathérapie. 6. Les huiles essentielles d’eucalyptus : Présentation botanique : Originaire de Tasmanie en Australie, il existe environ 800 espèces dont 50 se sont acclimatées dans le bassin méditerranéen depuis leur introduction au milieu du 19 ème siècle, ils poussent dans toutes les régions chaudes et tempérées du monde jusqu’à 1000 m d’altitude. 3 Le genre Eucalyptus a été baptisé ainsi en 1788, c’est le terme, dérivé du grec « eu= bien et kalyptos= couvert » que le botaniste Français L’HERITIER a choisi pour décrire l’opercule qui recouvre les étamines dans le bouton floral. L’étude taxonomique décrite par VRODOIJAK (1965) et BECHKOK (4) a permis de déterminer la systématique suivante : - Embranchement : Spermatophytes - Sous-embranchement : Angiospermes - Classe : Dicotylédones - Sous-classe : Diatyptales - Famille : Myrtacées L’espèce la plus connue de tous est l’Ecalyptus globulus surnommée également « gommier bleu de Tasmanie » ou encore « arbre de la fièvre » et décrite pour la première fois par LABILLARDIERE vers 1799-1800 d’où son nom d’Eucalyptus globulus. Aspect de la plante : La famille des myrtacées, à laquelle appartient le genre Eucalyptus, a une origine relativement récente. Comme à l’intérieur du genre les espèces ne sont pas encore strictement fixées, elles se croisent souvent, étant donné la facilité avec laquelle les graines de pollen se transfèrent d’une espèce à une autre. Cette extrême variabilité se reflète dans certaines incertitudes ou complications de la nomenclature systématique. En tant que genre, l’Eucalyptus se reconnaît facilement mais les différentes espèces se différencient au contraire difficilement. La beauté de l’Eucalyptus réside dans son feuillage. En effet ses feuilles à géométrie variable, qui sont persistantes se modifient avec astuce selon les exigences, durant leurs deux années de croissance. Elles commencent par être rondes et étalées horizontalement sans pétioles, directement rattachées aux rameaux par paires. Recouvertes d’une cire grisâtre, elles ont un aspect argenté. Leur état juvénile demeure un certain temps chez les arbres jeunes mais persiste chez les mâles nains. Ensuite passant par divers stades intermédiaires, elles se font longues, étroites sans faces différées, puis se mettent à pendre verticalement pour échapper à l’aplomb du soleil. A ce moment là, elles annoncent la couleur de leurs espèces ; des teintes pouvant aller du vert pâle au bronze mat, du gris clair au bleu le plus tendre. Chaque feuille contient un semis de mini-glandes exsudant des sécrétions huileuses, ses huiles appelées essences sont très odoriférantes. 4 Récolte : L'Eucalyptus globulus ne supporte pas les températures au dessous de +4°C. Sa multiplication se pratique par semis des graines à l'automne, dans des godets, sous serre. Repiquez les plants au printemps. Récoltez les feuilles durant tout l'été, en choisissant les plus allongées et étroites, portées par les branches plus âgées. Faitesles sécher à l'ombre dans des locaux aérés Actifs Les feuilles de l'eucalyptus globulus renferment des tanins, de l'alcool cérylique, un diphénol (pyrocatéchine), une résine acide et surtout 5 à 7% d'huile essentielle aux composants multiples, le plus notable étant l'eucalyptol. C’est dans les feuilles âgées de l’eucalyptus que l’on trouve la plus forte concentration en eucalyptol. Utilisation des huiles essentielles d’Eucalyptus : Compte tenu de la diversité de leur composition chimique que ce soit du point de vue qualitatif ou quantitatif, les huiles essentielles de feuilles d’Eucalyptus trouvent leurs emplois dans différents secteurs. En pharmacie : Leur utilisation est attribuée à son constituant principal le 1,8 cinéole (ou eucalyptol). Notons que la qualité médicinale de l’essence d’Eucalyptus doit obéir aux pharmacopées internationales qui exigent une teneur minimale en eucalyptol de 70 % et une absence ou traces de phéllandrène. Outre le 1,8 cinéole qui se révèle être un excellent antiseptique pulmonaire, les autre constituants de l’huile semblent intervenir également en augmentant de façon notable son pouvoir bactéricide. L’huile essentielle d’Eucalyptus qui est toxique à forte dose fait l’objet de prés de 200 préparations pharmaceutiques principalement comme désinfectant des voies respiratoires, mais aussi comme vermifuge, cicatrisant etc … . En parfumerie : C’est le débouché principal de la majorité des essences non médicinales. En effet le citronellal, composé principal de l’huile d’E.citriodora est utilisé directement comme parfum ou pour en produire d’autres. 5 On retrouve également les huiles riches en citral ( E.staigeriana ) et en eudesmol (E.macarthurii ). Le citral est utilisé dans la composition de l’arôme de citron et l’eudesmol est reconverti en eudesmyl-acétate, substitut de l’huile de bergamote. Les essences riches en (E)-methyl cinnamate sont très utilisées comme aditifs aromatiques. L’huile essentielle étant très fluctuante dans sa composition, on ne peut relier avec exactitude l’appartenance d’une espèce à un domaine bien défini, sauf peut-être pour l’espèce globulus, son utilisation en pharmacie ayant été retrouvée dans plusieurs pays. 7. Les indices physico-chimiques : a/Indice d’acide (IA) Définition : Le nombre de milligrammes d’hydroxyde de potassium nécessaire à la neutralisation des acides libres contenus dans 1 gramme d’HE. La neutralisation des acides libres se fait par une solution éthanolique d’hydroxyde de potassium titrée. Appareillage : *Pipettes pasteur en verre. *Pipette jaugée, de 5 ml de capacité ; *Burette, de 10 ml de capacité, graduée en 0,02 ml ; * Balance analytique, précise à 0,001 g près. Réactifs : Ethanol, à 95% (en volume) à 20°C, récemment neutralisé par la solution d’hydroxyde de potassium, en présence de l’indicateur coloré utilisé pour la détermination ;Hydroxyde de potassium, solution éthanolique étalon, [KOH] = 0, 2 M, titrée avant chaque série d’essais ; indicateur coloré, phénolphtaléine. On le calcule avec cette formule : 56.5∗𝑉∗𝐶 IA = 𝑚 Où : V : volume en ml de KOH utilisé m : masse en g de la prise d’essai c : concentration exacte de KOH en mol/l b/La densité : Définition : c'est la masse volumique de l'huile ou bien le rapport de la masse d'huile sur son volume à une température donnée. Elle est exprimée en gramme par millilitre. 6 Le principe est basé sur la mesure de la masse, à une température ambiante, d'un volume de corps gras contenu dans le pycnomètre préalablement étalonné à la même température. La densité est donnée par la formule suivante : M0 : la masse en gramme du pycnomètre vide ; M1 : la masse en gramme du pycnomètre rempli d'eau ; M2 : la masse en gramme du pycnomètre rempli d'huile. c/Indice de réfraction : Définition : C'est une grandeur physique qui caractérise la vitesse de la lumière dans les solutions. Il permet de mesurer le pouvoir réfringent des huiles par rapport à la raie «D» du sodium (589,6 NM). Principe : L'indice de réfraction est déterminé dans un réfractomètre en utilisant la raie «D» du sodium à une température aussi proche que possible de la température de référence. La température est choisie de façon que le corps gras soit entièrement liquéfié et la température de référence est de 20 °C pour les huiles. Il dépend de la température du milieu, et aussi il faut que le produit analysé soit transparent car ya pas de vrais liaison intermoléculaire dans les huile essentielle. 8. Technique d’analyse : 1-La chromatographie en phase gazeuse Principe : Elle est basée sur un phénomène d’adsorption et de désorption successif entredeux phases. Un fluide appelé phase mobile parcourt un tube appelé colonne. Cette colonne peut contenir des "granulés" poreux (colonne remplie) ou être recouverte à l'intérieur d'un film mince (colonne capillaire). Dans les deux cas, la colonne est appelée phase stationnaire. A l'instant initial, le mélange à séparer est injecté à l'entrée de la colonne où il se dilue dans la phase mobile qui l'entraîne à travers la colonne. Si la phase stationnaire a été bien choisie, les constituants du mélange, appelés généralement lessolutés, sont inégalement retenus lors de la traversée de la colonne. De ce phénomène appelé rétention il résulte que les constituants du mélange injecté se déplacent tous moins vite que la phase mobile et que leurs vitesses de déplacement sont différentes. Ils sont ainsi élués de la colonne les uns après les autres et donc séparés. Un détecteur placé à la sortie de la colonne couplé à un enregistreur permet d'obtenir un tracé appelé chromatogramme. Dans des conditions 7 chromatographiques données, le "temps de rétention" (temps au bout duquel un composé est élué de la colonne au détecteur), caractérise qualitativement une substance. L'amplitude de ces pics, ou encore l'aire limitée par ces pics et la prolongation de la ligne de base permet de mesurer la concentration de chaque soluté dans le mélange injecté. La chromatographie en Phase Gazeuse s’applique à des échantillons gazeux ou susceptibles d’être vaporisés sans décomposition. La phase mobile est alors un gaz (hélium, azote, argon ou hydrogène), appelé gaz vecteur, qui balaie en permanence la colonne. Cette dernière, placée dans un four thermostaté, est un tube de faible section enroulé sur lui-même et contenant la phase stationnaire. 2- Chromatographie par colonne : La chromatographie sur colonne est une méthode efficace de séparation. Le principe de la chromatographie sur colonne consiste au partage en équilibre des molécules entre la phase stationnaire et la phase mobile (deux phases non miscibles). Selon leurs affinités avec la phase stationnaire et la phase mobile, les molécules vont éluer plus ou moins rapidement vers la sortie de la colonne. Par exemple, avec un éluant polaire, un composé polaire migre plus rapidement qu'un composé non -polaire. La séparation (apparition distincte des bandes correspondant à chacun des produits) dépende de : le diamètre et la longueur de la colonne, la façon de remplissage, de position de la colonne (qui doit être parafait verticale) et de la vitesse d’élution. La phase fixe est un solide, le plus souvent de la silice ou de l’alumine remplissant une colonne. Préparation de la colonne (phase fixe) L’opération de remplissage de la colonne conditionne l’efficacité de la séparation. Il ne faut pas qu’il y ait de bulles ou de zone sans phase stationnaire car on aurait alors des chemins préférentiels nuisant à une bonne séparation des composés. Pendant la phase d’élution avec le solvant on veillera également à ne pas assécher la partie supérieure de la phase fixe. silice coton 8 3. Analyse par CCM : Principe de la technique : Lorsque la plaque sur laquelle on a déposé l'échantillon est placée dans la cuve, l'éluant monte à travers la phase stationnaire, essentiellement par capillarité. En outre, chaque composant de l'échantillon se déplace à sa propre vitesse derrière le front du solvant. Cette vitesse dépend d'une part, des forces électrostatiques retenant le composant sur la plaque stationnaire et, d'autre part, de sa solubilité dans la phase mobile. Les composés se déplacent donc alternativement de la phase stationnaire à la phase mobile, l'action de rétention de la phase stationnaire étant principalement contrôlée par des phénomènes d'adsorption. Généralement, en chromatographie sur couche mince, les substances de faible polarité migrent plus rapidement que les composants polaires. Applications de la CCM : Lorque les conditions opératoires sont connues, elle permet un contrôle aisé et rapide de la pureté d'un composé organique. Si l'analyse, réalisée avec divers solvants et différents adsorbants, révèle la présence d'une seule substance, on peut alors considérer que cet échantillon est probablement pur. De plus, étant donné que la chromatographie sur couche mince indique le nombre de composants d'un mélange, on peut l'employer pour suivre la progression d'une réaction. La chromatographie sur couche mince est également la technique habituellement employée pour rechercher le meilleur solvant, avant d'entreprendre une séparation par chromatographie sur colonne. Description d'une analyse par CCM Préparation de l’échantillons et choix de l’éluant : Dissoudre l'échantillon dans un solvant généralement on utilise le même solvant utilisé autant qu’eluant approprié en tenant compte que le choix de l’éluant a un rapport directe avec la polarité des composé de l’échantillon et il est souvent formé d’un mélange de deux solvants l’un est polaire , l’autre est apolaire et on joue sur la polarité en changeant la concentration de chacun dans la solution. 9 Préparation de l’éluant : Introduire l'éluant ou le mélange de solvants. Ajuster le niveau à environ 0,5 cm du fond de la cuve. Fermer le récipient (la cuve doit être saturée de vapeur de solvant). Pour que la saturation et l'élution soient plus rapides, on peut placer une bande de papier filtre contre les parois de la cuve chromatographique. Préparation de la plaque et les étapes qui suivent dans l’expérience : La plaque utilisé dans la CCM sera en fonction de l’éluant utilisé en générale on utilise une plaque de silice c’est le cas dans notre TP . Concernant les dimensions de la plaque ils seront selon le nombre de points( nombres d’échantillons et d’établons quand veut déposé).Le dépôt de l’échantillon se fait sur les points déjà tracé en laissant distance de 1 a 1.5 d’un point a l’autre a l’aide d’un tube capillaire . Après avoir séché la plaque, Placer la dans la cuve en position verticale. Refermer le récipient. Lorsque le front du solvant se trouve à environ 1 cm de l'extrémité supérieure de la plaque, la retirer et marquer cette position.(le trait peut être tracé à l'avance et servir de repère pour arrêter l'élution).mettre le couvercle de la cuve et laisser attendre le temps qu’il faut pour que l’éluant entraine le maximum de composés sans dépassé le front de la plaque. 10 Partie expérimentale : I-Extraction de l’huile : a)Macération : Mode opératoire : On a fait dans notre TP trois macérations en tous en utilisant le même solvant qui est le dichlorométhane avec de quantité différentes(V1=800ml,V2=400ml,V3=900ml). l’espèce végétal utilisés est les feuilles d’eucalyptus qu’on a utilisé avec de différente quantités (m1=215.5g , M2=164g,M=100.61g).L’espèce été séché a l’ambre pour une seul expérience de macération et pour les autre macération on la utilisé tel quel est sans séchage. On a pris 1e bouteille de 2L qu’on rempli avec notre matière végétale après bien l’avoir découpé en petit morceau pour augmenté la surface de contacte entre le solvant et la matière végétal .Après avoir bien tassé l’espèce végétale on rempli la bouteille par le solvant jusqu’a pouvoir couvrir la matière végétales puis mélanger bien le tous en remuant la bouteille, laissé macéré pendant 2 semaines. Après avoir attendu la période qu’il faut on essaye de récupéré le liquide contenu dans la bouteille bien filtré é faire passé le mélangé par un rotavapeur pour se debarassé du solvant et obtenir l’extrait avec un minimum de solvant .Mettre l’extrait dans un petit flacon puis le pesé. Résultats et discutions : Première macération : Masse d’extrait = 3.62g et que l’on peu pas prendre en considération pour calculé le rendement parce que on a u des pertes. Deuxième macération :Masse d’extrait = 5.32g avec un rendement de 3.24%. Troisième macération :Masse extraite = 6.87 avec un rendement de 6.82% qui est meilleur que celui de la deuxième macération malgré que dans la deuxième ma macération on a utilisé une masse de matière végétal plus importante , on croit bien que c’est due a la quantité du solvant utilisé et sa prouve que plus on utilise une quantité importante de solvant plus on évite la saturation du solvant par les produits extrait et plus l’extraction est meilleur avec une bonne quantité de composé extraie. 11 b) Entrainement a la vapeur d’eau : Matériels utilisés : Chauffe ballon. Réfrigérants balance pour la pesé de la matière végétal. 2 supports. Ampoule a décanté. Béchers. Pinces pour tenir le réfrigérant é l’ampoule a décanté. Ballon de 1l. Bain marie. Mode opératoire : Cette fois si on a fait quatre expériences d’entrainement a la vapeur avec des quantités de matières végétal équivalentes a 3OOg. Après avoir bien lavé la matière végétal et bien la découpé, on introduit cette dernière dans l’ampoule a décanté qu’on place au dessus d’un ballon rempli d’eau bien collé l’ampoule au ballon et déclencher l’expérience. Après avoir entrainé tous les produits volatils dans l’espèce et avoir obtenu un liquide de deux phases une huileuse et autre aqueuse on essaye de récupéré le maximum de composé contenu dans la phase aqueuse par une extraction par solvant le solvant dans se cas est l’éther. Laisser décanté puis séparé les deux phases et récupéré la phase organique qui sera traité par la suite par une distillation a l’aide d’un rota vapeur. Mettre l’huile obtenu dans un petit flacon puis faire la pesé. Résultats et discutions : On a obtenu une masse globale égal a 1.3878g avec un rendement de 0.15%. Qui représente un rendement moyen comparent au rendement obtenu par d’autre expériences d’entrainement a al vapeur de la même espèce qui tends vers 0.2%. Conclusion : Comparent les deux rendements celui de la macération et l’entrainement a la vapeur on voit clairement que la macération donne un très bon rendement mais sans seul problème c’est l’utilisation d’un solvant lourd qui est difficile a séparé et que l’extrait doit subir d’autre traitement contrairement a l’huile obtenu par l’entrainement a la vapeur. 12 II-Analyse de l’huile : 1/Analyse physico-chimique : A- Indice d’acide : On fait l’indice d’acide pour l’huile essentielle et pour l’extrait : Mode opératoire ; Concernant l’extrait : On a pesé exactement, à 0,15g d’extrait et le dilué dans 10 ml de dichlométhane, ensuite on a introduit cette prise d’essai dans un bécher. Et on ajoute 3 gouttes au maximum d’indicateur coloré, puis titré avec le KOH. Poursuivre l’opération jusqu’à obtention le virage de la solution persistant pendant 30 sec. Noter le volume de solution d’hydroxyde de potassium utilisé. Concernant l’huile essentielle : Mesurer 3 ml d’huile essentielle dans une burette qui été préalablement dilué dans le dichlorométhane,après on ajoute 3 gouttes d’indicateur coloré et commence a titré avec le KOH. Résultants et discussion ; On a trouvé un volume de KOH lors du titrage de l’HE et celui de l’extrait le même qui est égale à ;0.17 ml On a ; VKOH CKOH = CHE VHE 0.2∗0.17 CHE = 3 = 0.011 M nHE = CHE VHE = 0.011 * 3 = 0.033 mole Donc ; IA = MKOH nHE = 56.5 * 0.033 IA= 1.8645 B- Densité : Mode opératoire ; On a mesuré la densité de l’HE pur à 20 °C, on utilisant un pycnomètre qu’on d’abord peser vide, après on lui a ajouté l’huile jusqu’au trait de jauge, puis on a pris la valeur de la masse de l’huile. Résultat et discussion ; d= 𝑚 𝐻𝐸 0.5 = 0.461 0.5 d= 0.922 13 on comparent nos résultat avec les normes Afnor(0.905-0.925),la valeur trouvé qui est égale à 0.922 est conforme aux normes qui est de 0.910 à 20 °C. C- Indice de réfraction : Mode opératoire ; On utilisant un réfractomètre, afin de mesuré l’indice de réfraction de l’HE pur,on prend quleques ml à l’aide d’une pipette et on la dépose sur l’appareil puis on lit la valeur à une température du milieu de 20°C environ. Résultat et discussion : Indice de réf = 1.4238 On le compare avec les normes Afnor (1.458-1.465) qui est égale a 1.461, on peut constate qu’on est dans les normes. 2/ Analyse qualitatif : a- Chromatographie sur colonne capillaire ; On a fait cette opération sur un extrait l’eucalyptus qui est de forme pâteuse, qu’on a préalablement traité et le but c’est de voir la séparation des composés de cet extrait. Mode opératoire ; Fixer verticalement la colonne à l’aide d’une pince. Déposer un petit morceau de coton dans le bas de la colonne. Peser environ 40 g de silice. Dissoudre la silice dans l’hexane puis l’introduire dans la colonne Tapoter la colonne afin d’obtenir une surface plane de silice. Placer un bécher sous la colonne. Remettre un autre bout de coton Peser 0.678 g l’extrait sec et le dissoudre dans l’hexane et l’acétate d’éthyle Déposer très doucement à l’aide d’une pipette, sans toucher les parois de la colonne, l’échantillon il faut faire attention de ne pas déformer la surface de la phase stationnaire pendant cette opération. Lorsque l’extrait a pénétré à la surface de la phase stationnaire, éluer avec 100 % d’hexane en remplissant la colonne. Lorsque le premier produit commence à descendre, on change d’éluant Eluer ensuite avec un autre éluant : un mélange 10 %acétate d’éthyle + 90% hexane Puisque y’a pas une grande différence dans on encore changé les conditions et on a pris comme éluant d’abord 20% acétate d’éthyle et 80 % d’hexane, ensuite a on changé la polarité de la phase en la rendant moyennement polaire jusqu'à complètement polaire afin de séparé les composés polaires. 14 Quand le premier colorant arrive en bas de la colonne le récupérer dans un bécher, et ainsi de suite concernant les autre composés. Chaque composés on le récupère dans bécher a part selon la couleur mais aussi par volume. A la fin on rince la colonne avec du méthanol. Résultat et discussion : Par manque de moyens on pas pu faire l’analyse quantitative, on fait juste la séparation des différents composés que contient l’extrait mais on est sur d’une chose c’est que le premier composé correspond au béta-carotène qui sort le premier lors le l’utilisation de l’éluant 100 % apolaire, et on a eu en tous 8 fraction de couleur différente. b- Chromatographie sur couche mince : Dans notre TP on a fait en tous , trois expériences de CCM on utilisant quatre plaques CCM dans le but d’avoir les meilleurs conditions pour de meilleur résultats. Matériels, produits et conditions opératoires : Type et dimensions de Plaque CCM : La plaque utilisé dans notre TP c’est une plaque d’aluminium avec une couverte d’une face d’un gel de silice, les dimensions de la plaque différé dans chaque expérience : Dans l’experience 1 on a utilisé une plaque de silice de dimensions 9.3/ 9.9 . Experience2, dimensions : 6/ 10.1 Expérience 3, on a utilisé deux plaques CCM avec les dimensions suivantes : 7/10.3 et 7/9.7. Éluant: Solution de deux solvants contenant 60% de d’isooctane avec 40% d’acétate pour la première expérience. Solution de deux solvants contenant 68% d’hexane avec 38% d’acétate. Etalons : citral,cineol,1-8 cineol,limonene,pinene. Echantillons : l’huile essentielle d’eucalyptus obtenu par l’entrainement a la vapeur. Extrait d’eucalyptus obtenu par une macération dans le dichlorométhane. 15 Révélation : Lampe UV pour les trois expériences. Solution d’acide sulfurique pour la première expérience. Révélation par les vapeurs d’iode pour la 2eme et la 3éme expériences. Résultats et discutions : résultats Expérience N1 : Rf solvant= 7.4 Étalons : Rf citral =0.72 Pas de tache visible pour le cineol , le 1-8cineol,le limonene et le pinéne. Pour l’huile essentielle : Rf tache 1=0.54 Rf tache 2=0.64 Rf tache 3=0.77 RF tache 4=0.90 Pour l’extrait : Rf tache 1=0.18 Rf tache 2=0.22 Rf tache 3=0.28 RF tache 4=0.35 Rf tache 5=0.51 Rf tache 6=0.55 Rf tache 7=0.74 RF tache 8=0.93 Expérience N2 : Rf solvant=7.7 Étalons : Rf citral =0.84 Rf cineol=0.77 Pour deux l’extraits : Rf tache 1=0.62 Rf tache 2=0.77 Rf tache 3=0.83 RF tache 4=0.96 interprétation -En premier on remarque dans la 1er plaque plusieurs taches résultantes de l’extrait et l’huiles essentielle se qui signifie que l’éluant était bon pour les deux il a pu entrainer et séparé 4 composés de l’huile essentielle et 8 composés pour l’extrait ,on remarque aussi qu’il était plus efficace pour l’extrait comparant a l’huile essentielle parce que il a entrainé plus de composé donc la polarité de l’éluant est assez bonne. -Si on voit les taches des éluant on remarque qu ’une seul tache pour le citral malgré qu’on a utilisé plusieurs éluants et c’est pas due au éluant mais plutôt a la révélation puisque on a pu voir les taches des composé de l’huile essentielle et l’extrait qi sont bien coloré. -Si on compare les Rapports frontaux des taches de l’huile essentiel, de l’extrait et le cital on remarque que : Rf citral(0.72 )est comparable a Rf tache 3 de l’huile essentielle e (0.77) et Rf tache7 de l’extrait on conclu que tel que l’huiles essentielle et l’extrait contiennent du citral. - on remarque dans la 2eme plaque et avec de nouvelles conditions d’éluants plusieurs taches aussi mais moins que les résultats de la 1ere expérience donc l’éluant n’a pas bien entrainé les composé de l’extrait mais malgré sa on changeant la révélation les taches que donne les éluant été beine visible grâce a la révélation par les vapeurs d’iode donc c’est la bonne révélation pour notre expérience. - si on compare les rapports fronteaux on trouves : 16 Rf citral(0.84) est proche du Rf tache 3 de l’extrait(0.83) et Rf cineol50.77) est le même que celui de la tache 2 ,on conclu que l’extrait contient en plus du citral du cineol qui est en principe sont composé majoritaire d’après le s expériences qui ont été déjà faites par d’autres personnes. Expérience N3 : Plaque CCM n1 : Rf solvant=7.9 Étalons : Rf 1.8cineol=0.75 Rf cineol=0.75 Rf pinéne=0.54 pour l’huile essentielle : Rf tache 1=0.56 Rf tache 2=0.69 Rf tache 3=0.77 RF tache 4=0.86 -on maintenant les mêmes conditions de d’éluant et de révélation de l’expérience 2 on obtient les presque les mêmes résultats mais cette fois ci on utilise tous les éluants utilisé dans la 1ere expériences. -comparent les rapports frontaux on trouve : Rf cineol comparable avec Rf tache 3et Rf pinéne est comparable avec Rf pinéne pour la paque n1. Pour la plaque n2 , Rf limonéne est comparable a Rf tache 3,Rf citral est comparable a Rf tache5. D’où l’huile essentiel contient du limonéne,citral,pinéne et cineol. Plaque CCM n2 : Rf solvant=7.9 Étalons : Rf limonéne=0.69 Rf citral=0.84 Pour l’huile essentielle : Rf tache 1=0.4 Rf tache 2=0.56 Rf tache 3=0.68 RF tache 4=0.77 RF tache 5=0.88 Conclusion de la CCM : Cette méthode chromatographique nous a aidé servi a l’identification des composés de notre espèce végétale qui sont le 1-8 cineol, limonéne ,citral et pinéne. 17
