TP 5 : Microscopie

TP 5 : Microscopie
Licence Professionnelle Optronique
Plate-forme optique
ufr
de physique
Le microscope utilisé en TP présente de nombreuses fonctionnalités : fond clair, fond noir, polariseurs croisés, contraste de phase. Il est aussi muni d'une caméra qui vous permettra de visualiser vos
échantillons sur un écran d'ordinateur.
Il s'agira dans une première partie de repérer les diérents composants et comprendre leur fonctionnement avant de passer à la phase de réglage pour enn examiner quelques échantillons.
1
Prise en main
reconnaître les diérents composants
questions sur les caractéristiques du microscope
En vous aidant des rappels de cours donnés en n d'énoncé Ÿ6 préciser :
•
•
•
•
•
•
Le grandissement minimum, maximum
Pourquoi faut-il privilégier des objectifs avec une bonne planéité et une correction chromatique ?
Quelle est l'utilité d'un condenseur ? d'un diaphragme de champ ? d'ouverture ?
Quelle est l'ouverture numérique maximale possible lorsque l'on travaille dans l'air ?
Quelle est la meilleure résolution que l'on puisse obtenir ?
Quel est l'avantage principal dans le fait d'utiliser des objectifs de grossissement pas trop impor-
tants (<x40) ?
•
Expliquer pourquoi il vaut toujours mieux commencer les réglages avec des objectifs de grandis-
sement plus petits puis augmenter au fur et à mesure ?
•
Quels sont les avantages de l'utilisation d'un système à contraste de phase par rapport à la
technique de strioscopie ?
1
2
Réglages
2.1
Mise en place
Mettre une préparation en place (pelure d'oignon), utiliser l' objectif grossissement x10.
Eectuer la mise au point à l'aide du bouton (5)
Fermer le diaphragme de champ (10) ainsi que le diaphragme d'ouverture (7)
a. Diaphragme de champ ni focalisé, ni centré
b. Diaphragme de champ focalisé mais pas centré
c. Centré et focalisé mais le diamètre est trop petit
d. Diamètre du diaphragme de champ = diamètre champ de vision (= illumination de Koehler)
gure a, rien n'est réglé, à l'aide du bouton (3) eectuer le réglage en hauteur du condenseur,
rechercher la plus grande netteté des bords du diaphragme de champ (gure b), régler la vis butée
(4) une fois la hauteur déterminée. Mais le diaphragme n'est toujours pas centré. Il faut agir sur les
deux vis de centrage (9) du condenseur pour amener celui-ci au centre du champ (gure c). Ouvrir
progressivement le diaphragme de champ (10) ceci permet de corriger le centrage si nécessaire.
La gure d est le résultat nal à obtenir, ce réglage est appelé réglage de Koehler.
2.2
Réglage des anneaux pour le contraste de phase
Pour cela nous allons utiliser la lunette de réglage, elle se positionne à la place d'un des deux
oculaires. Elle a pour but en tirant sur la partie amovible, de mettre au point les deux anneaux
visualisés dans le trajet optique permettant ainsi le centrage précis de l'anneau du condenseur en
fonction de l'objectif contraste de phase PH1 ou PH2
2
Le centrage mécanique des anneaux de phase s'eectue à l'aide de deux clés de centrage (2) amovibles. En serrant ou desserrant les vis de centrage et en observant dans la lunette, un des anneaux se
déplace.
Le réglage consiste à superposer les deux anneaux.
3
Étalonnage
L'un des oculaires est muni d'une mire ou micromètre constitué de petits traits régulièrement
espacés.
Il faut, pour chaque objectif, déterminer la correspondance entre le micromètre oculaire et la taille
de l'objet étudié. Pour cela utiliser comme objet un micromètre constitué d'un trait de longueur 1 mm
µ
divisé en segments de longueur 100 m.
•
•
Eectuer l'étalonnage pour chacun des objectifs. Précisez vos incertitudes de mesure.
Déterminer les dimensions d'une cellule d'oignon, d'une vésicule ou de tout autre objet à votre
disposition en utilisant la méthode d'observation la plus appropriée.
4
Entre polariseurs croisés
Un premier polariseur est installé de façon xe au niveau de l'oculaire, un deuxième mobile, se
trouve juste au dessus de la lampe d'éclairage.
4.1
Détermination de l'épaisseur d'un ob jet
Sachant qu'une lame couvre objet fait 0.17 mm d'épaisseur étalonner la molette de mise au point,
déterminer l'épaisseur de petits cristaux ou de tout autre objet, précision ?
4.2
Épaisseur optique
Croiser les polariseurs, placer la plaquette munie de la lame de quartz compensateur. Repérer les
diérentes couleurs et en tirer les variations de diérence de marche lorsqu'on fait coulisser la lame.
Sachant que pour le quartz
n0 = 1.5443
et
ne = 1.5534
marche correspondent.
Étudier la biréfringence d'une lame de mica
3
, préciser à quelles épaisseurs ces diérences de
4.3
Ligne neutre
Vous avez à votre disposition, diérents échantillons cristallins. Entre polariseurs croisés, rechercher
les lignes neutres de diérents cristaux, expliquer votre démarche.
Expliquer les diérences entre un cristal un peu fracturé ou abîmé mais monocristallin et un polycristal. Utiliser par exemple les échantillons R9 Gneiss, M7 Orthose ou l'Andésite.
5
Observations diverses
Vous disposez d'une couche mince de verre dans laquelle ont été diluée de tout petits cristaux
organiques, la taille de ces cristaux est de l'ordre de 0.5
µm. Expliquez ce que vous observez en éclairage
direct et entre polariseurs croisés. Pouvez-vous conclure quelque chose sur la taille des cristaux et si
non pourquoi ?
Parmi les modes d'observation il existe l'éclairage à fond noir (bague DF)
•
•
6
Que voit-on à l'aide d'un tel dispositif
A quoi cela sert-il ?
Rappel de cours
6.1
Le microscope
6.1.1
généralités
Le microscope est généralement étudié en optique élémentaire comme une optique composée de
l'association de deux systèmes centrés : l'objectif et l'oculaire. Par exemple pour deux systèmes de
distances focales respectives 2 mm et 10 mm, séparés de 180 mm et pour une image virtuelle à la
distance minimale de vision distincte de 250 mm, les lois des lentilles conduiraient à un grossissement
γ=
180
2
×
250
10
= 2250
Un tel grossissement ne peut pas être observé pour deux raisons :
•
•
L'augmentation des aberrations géométriques liée à l'ouverture numérique de l'objectif.
La résolution théorique limitée à la longueur d'onde par diraction.
Dans la réalité, un microscope optique permet d'obtenir un grossissement maximal de l'ordre de
1700, permettant d'observer des objets de dimension voisine de quelques microns.
6.1.2
grandissement-grossissement
Il convient de rappeler comment on distingue le grandissement du grossissement.
•
Le grandissement est le rapport de la hauteur de l'image, non accessible car sur la rétine, sur la
hauteur de l'objet.
•
Le grossissement est le rapport de l'angle sous lequel on observe l'image virtuelle de l'objet à
travers le microscope sur l'angle sous lequel on observerait l'objet s'il n'y avait pas d'optique (i.e. sans
le microscope).
Malheureusement, une assez grande confusion entre les deux grandeurs règne, compte-tenu du fait
qu'elles mesurent le même eet. Notamment il est courant d'utiliser la dénomination de grossissement
commercial pour le grandissement obtenu à l'aide d'une optique de focale
l'image serait la distance minimale de vision distincte
Grossissement commercial =
dm
f
4
dm = 25 cm
:
f,
où la distance de l'oeil à
6.1.3
objectifs
Sur le fût de l'objectif sont gravées entres autres des indications numériques du type :
40 × /0.65
, elles représentent le grandissement et l'ouverture numérique. Quand l'objectif est aussi destiné au
contraste de phase la notation PH remplace Plan.
160 représente la longueur (en mm) du tube sur lequel il doit être vissé.
0.17 représente l'épaisseur (en mm) de la lamelle de microscope qu'il faut placer sur l'objet pour
que les aberrations soient minimales
6.2
Rôle du condenseur
Il permet d'éclairer de façon homogène le champ du microscope. Le dispositif le plus courant est
le condenseur de Köhler constitué d'une source lumineuse, suivie d'un diaphragme de champ (limitant l'illumination du champ microscopique visible) une lentille collectrice qui collecte la lumière de
la source, un diaphragme d'ouverture permettant d'ajuster l'ouverture numérique du condenseur en
fonction de celle de l'objectif utilisé (donc d'ajuster la luminosité de l'image), et enn la lentille condenseur qui focalise l'illumination l'objectif, tout en éclairant l'échantillon de façon homogène. Le réglage
des diérents paramètres du condenseur est capital pour l'obtention d'une image résolue et de bon
contraste.
6.3
Ouverture numérique
L'ouverture numérique NA, est une caractéristique essentielle d'un objectif,
gure ci-dessous) où
n
N A = n sin α
(voir
est l'indice du milieu, le plus souvent il s'agit de l'indice de l'air.
C'est elle qui est directement responsable de la luminosité et de la résolution d'un objectif. Elle
dépend directement de 1- l'indice de réfraction du milieu. 2- de l'angle formé par trois points particuliers
qui sont : le centre de la lentille, le foyer objet de la lentille et le bord de la lentille. Plus cet angle sera
grand et meilleures seront la luminosité (plus de rayons lumineux se trouvent collectés) et la résolution.
Deux autres caractéristiques de l'objectif dépendent de l'ouverture numérique : ce sont la distance de
travail D et la profondeur de champ
∆z .
Un objectif de haute qualité sera caractérisé par une grande
ouverture numérique (1.0<NA<1.45) ce qui a comme conséquence une distance de travail limitée (90
à 180
µm)
et une profondeur de champ réduite (eet de sectionnement optique).
5
D'une manière générale les objectifs de faible grossissement (5x à 20x) sont dotés d'une faible
NA (0.5 à 0.75), ils orent une grande distance de travail et une grande profondeur de champ. Les
objectifs de grandissement supérieur (40x, 100x) ont une NA supérieure à 0.75 et orent une excellente
résolution mais une faible profondeur de champ.
Voici une illustration permettant de comprendre la notion de profondeur de champ.
6.4
Optique ondulatoire
La formation d'une image dans un microscope est la résultante de deux fonctions de répartition de
la lumière
•
la fonction d'étalement du point dans le plan focal conditionnant la résolution latérale (en X et
en Y).
•
la fonction de défocalisation conditionnant la résolution axiale (en Z).
La fonction d'étalement du point (ou PSF pour Point Spread Function) est la description mathématique de l'image du disque d'Airy (gure ci-dessous) obtenue lorsque l'on observe un point lumineux
idéal (inniment petit) au travers d'un objectif. Elle est directement liée à la résolution.
6.5
Résolution
La résolution conférée par un objectif est dite limitée par la diraction. Elle résulte des interférences
au niveau du plan image, des ondes lumineuses diractées le long du trajet des rayons.
6
La résolution telle qu'elle est dénie par Rayleigh (dmin Rayleigh) correspond à la distance entre
deux points objets pour laquelle le maximum d'intensité du disque d'Airy du premier point correspond au premier minimum d'intensité du disque d'Airy du second point. Elle est égale en théorie à
dmin = 0.61λ/N A.
Cette dénition n'est valable que si l'objectif collecte de la lumière provenant d'un
condenseur ayant la même ouverture numérique.
6.6
Observation en fond clair
Un diaphragme à iris placé devant la lampe permet de réduire le champ éclairé de façon à éviter
que la lumière parasite pénétrant dans le microscope puisse diminuer le contraste de l'image observée.
6.7
Éclairage en fond noir
L'éclairage à fond noir (bague DF : Dark Field) est un procédé particulier d'éclairage par lumière
transmise, un écran arrête tous les rayons lumineux qui pénètrent directement dans l'objectif, de sorte
que les faisceaux qui éclairent la préparation sont très obliques, leur inclinaison étant supérieure à
l'angle d'ouverture
6.8
Contraste de phase
Une source ponctuelle S, supposée à l'inni, éclaire un objet plat transparent AB qui est par
exemple une lame à face parallèle mince. Une lentille L forme de la source S une image S' dans son
plan focal image. L'image de l'objet AB se forme dans le plan conjugué A'B'. L'expression des vibrations
lumineuses dans la face de sortie de la lame AB peut se mettre sous la forme :
0
dans le plan image A'B' : V0
= A sin(ωt − Φ).
7
V0 = A sin ωt
et s'écrira
Nous supposerons maintenant que l'objet AB, au lieu d'être d'épaisseur optique rigoureusement
constante, présente de petites variations locales d'épaisseur optique, dues soit à des variations d'épaisseur
∆e,
soit à des variations d'indice de réfraction
∆n.
Les irrégularités de chemin optique de l'objet se manifestent dans la structure de l'onde qui a
traversé cet objet. L'amplitude des vibrations de cette onde est partout constante, mais sa phase subit
des altérations locales. Après traversée de l'objet la surface d'onde présente un prol irrégulier reétant
les inégalités de chemin optique de l'objet, et les vibrations arrivant dans le plan image peuvent se
mettre sous la forme :
V 0 = A sin(ωt − Φ + ϕ)
où
ϕ
est l'avance de phase, positive ou négative et
variable de place en place.
Comme l'oeil n'est pas sensible aux phases du phénomène lumineux et que l'éclairement en chaque
point est proportionnel à
A2 ,
le plan image paraîtra uniformément éclairé. Les inégalités de chemin
optique ne se manifesteront pas dans la perception de son image.
L'expression
V0
peut se mettre sous la forme :
V 0 = A cos ϕ sin(ωt − Φ) + A sin ϕ cos(ωt − Φ)
Si les uctuations locales de chemin optique introduites par l'objet restent petites par rapport à
λ de la lumière : ϕ π2 , cos ϕ ' 1 et sin ϕ ' ϕ, l'expression de V 0 se simplie :
V = A sin(ωt − Φ) + Aϕ cos(ωt − Φ). L'onde lumineuse V 0 peut être considérée comme due à la
0
superposition de deux ondes : l'onde principale V0 = A sin(ωt − Φ) non aectée par les irrégularités de
0
chemin optique de l'objet, et une onde secondaire : V1 = Aϕ cos(ωt − Φ) dont l'amplitude Aϕ reste
la longueur d'onde
0
petite et varie localement, proportionnellement aux variations locales de chemin optique.
Remarque : Dans le cas du TP ltrage, la tâche noire nous avait pour but d'éliminer l'onde
Aϕ et donc d'intensité proportionnelle à ϕ2 . Les
principale et de ne conserver que l'onde d'amplitude
variations de phase étaient donc bien visibles.
Dans le cas du TP ltrage du 1er semestre nous avions placé une tache opaque sur le trajet du
faisceau principal de façon à ne laisser passer que les rayons diractés par l'objet de phase. Le procédé
d'observation imaginé par Zernike en 1934 dière de la strioscopie par le fait que la lame qui couvre
la tache de l'onde principale est maintenant une lame d'épaisseur optique
un déphasage de
± π2 . Si V0
est avancé de
λ/4
, c'est-à-dire impliquant
π
2 on parle de contraste de phase positif, dans le cas contraire
le contraste de phase sera négatif.
8
En l'absence de lame de phase, les ondes principales
V00
et secondaires
V10
sont en quadrature, après
introduction de la lame de phase elles sont en concordance, soit en opposition de phase. Dans le cas
V000 = A sin(ωt − Φ + π2 ) et l'onde résultante
π
aura l'expression : V =
== A sin(ωt − Φ + 2 ) + Aϕ cos(ωt − Φ) = A(1 + ϕ) sin(ωt − Φ + π2 ).
2
L'éclairement du fond (endroits où ϕ = 0) est proportionnel à I0 = A . Aux régions de l'image
de contraste de phase positif, l'onde principale devient :
00
V000
+ V10
correspondant à une avance de phase de l'onde (ϕ
A2 (1 + ϕ)2 ' A2 (1 + 2ϕ).
> 0),cavité
de l'objet) l'éclairement est
I1 =
< 0,
Aux régions de l'image correspondant à un retard de phase de l'onde (ϕ
bosses de l'objet) l'éclairement est
A2 (1 − 2 |ϕ|). Les cavités de l'objet donnent des images plus claires,
les bosses des images plus sombres que le fond.
De la répartition d'intensité dans le plan image on peut en déduire la topographie de l'épaisseur
optique de l'objet.
Si le contraste de phase est négatif , les contrastes sont inversés.
6.9
Biblio
G. Dévoré et R. Annequin : Cours de Physique : Optique II (Vuibert 1964)
G. Bruhat : Optique (Masson 1942)
Sextant : Optique expérimentale (Hermann 1997)
Y. Usson : Bases de la microscopie (cours net :
http ://www-timc.imag.fr/Yves.Usson/COURS/BASES-MICROSCOPIE.pdf )
Notice Leïca
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