Myxomatose

Manuel terrestre de l’OIE 2008 1025
SECTION 2.6.
LAGOMORPHA
CHAPITRE 2.6.1.
MYXOMATOSE
RÉSUMÉ
La myxomatose est une maladie majeure du lapin européen due au virus myxomateux (VM), un
membre de la famille des Poxviridae. Le diagnostic de la myxomatose, ses caractéristiques
cliniques mises à part, fait appel à l’isolement et à l’identification du virus ou à la mise en évidence
de ses antigènes. La présence d’une réponse immunitaire humorale autorise un diagnostic
rétrospectif de la forme subaiguë de la maladie, et peut permettre une estimation de la prévalence
de l’infection dans une population de lapin. La maladie est caractérisée classiquement par le
développement de lésions cutanées nodulaires des plus évocatrices.
Identification de l’agent pathogène : lors de la présence de lésions cutanées sur un cadavre de
lapin, la présence de l’antigène viral peut être révélée par un test d’immunodiffusion utilisant un
fragment de lésion. Des cultures en couche monocellulaire de cellules de rein de lapin, inoculées à
partir de lésions, développent un effet cytopathogène caractéristique des poxvirus. La présence du
virus peut alors être confirmée par immunofluorescence et examen au microscope électronique en
coloration négative.
L’identification de l’infection, par inoculation de lapins avec des prélèvements suspects, est plus
longue mais demeure précieuse pour confirmer la présence d’un virus infectieux et évaluer sa
pathogénicité.
Épreuves sérologiques : la mise en évidence et le titrage des anticorps spécifiques apparaissant
au cours de l’infection naturelle ou à la suite de la vaccination, est réalisée par la méthode
classique de fixation du complément ou par la méthode immuno-enzymatique (ELISA) récemment
développée, plus sensible et non affectée par les facteurs pro- ou anti-complémentaires. La
difficulté réside dans l’obtention de prélèvements de sang à partir de membres représentatifs d’une
population. Ce problème peut être résolu en récoltant sur du papier filtre du sang séché qui sera
plus tard élué et examiné en immunofluorescence indirecte ou en ELISA. Des prélèvements en
tubes microcapillaires peuvent aussi être utilisés en ELISA.
Des tests d’immunodiffusion qualitative en gélose permettent de révéler à la fois les antigènes et
les anticorps humoraux.
Spécifications applicables aux vaccins et aux produits biologiques à usage diagnostique :
des vaccins à virus vivants préparés à partir du virus du fibrome de Shope ou du virus myxomateux
modifié sont disponibles pour l’immunisation des lapins.
A. INTRODUCTION
La myxomatose est une maladie majeure du lapin européen (Oryctolagus cuniculus) due au virus myxomateux
(VM), un membre de la famille des Poxviridae. Ce virus a été isolé pour la première fois en Uruguay en 1898 à
partir de lapins de laboratoire et a été caractérisé comme un poxvirus en 1927. Dans les conditions naturelles, il
affecte deux espèces de léporidés : Sylvilagus brasiliensis en Amérique du Sud (souches sud-américaines) et
Sylvilagus bachmani en Californie (souches californiennes) (7). Chez leur hôte naturel, les souches virales

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n’induisent qu’un fibrome bénin, la maladie généralisée ne se produisant seulement que chez les jeunes. Chez le
lapin européen, deux formes de la maladie ont été décrites : la forme nodulaire (ou classique) et la forme
non-myxomateuse (respiratoire).
La forme nodulaire due à une souche virulente du VM est caractérisée par des lésions cutanées exubérantes et
une immunodépression, souvent associées à des surinfections de l’appareil respiratoire par des bactéries
contaminantes Gram négatives. Des souches prototypes isolées de foyers australiens ou européens
caractérisent les différents degrés de virulence (du niveau I au niveau V) tels qu’ils sont établis sur des lapins de
laboratoire (8). Après infection par une souche de niveau I (la plus virulente), le premier symptôme est une
boiterie du côté du point d’inoculation qui devient protubérant et s’ulcère. Une blépharo-conjonctivite aiguë et un
œdème du périnée et du scrotum se développent graduellement. Les lésions cutanées secondaires apparaissent
entre environ 6 et 7 jour (7). La mort peut éventuellement survenir entre le 8e et le 15e jour après l’infection. Lors
d’une infection avec des souches des niveaux II à V, les symptômes sont en général identiques excepté que
l’évolution est plus lente et moins grave. Quand les animaux survivent, les lésions guérissent progressivement. Le
taux de mortalité varie de 20 % à 100 % selon la souche virale. La transmission habituelle de la forme nodulaire
se fait par des insectes piqueurs, mais une transmission de lapin à lapin est possible lorsqu’ils sont enfermés,
mais elle est limitée. Cette forme est plus fréquemment observée dans les petits élevages (2). Les symptômes de
la forme non myxomateuse sont essentiellement respiratoires, les nodules cutanés étant petits et peu nombreux.
On pourrait penser que cette forme n’est pas transmise par des vecteurs et qu’elle survient plutôt dans les grands
élevages intensifs, mais il convient d’être prudent avant d’avancer cette hypothèse, car la forme non
myxomateuse a aussi été observée chez des lapins sauvages. Jusqu’à présent, ces formes de myxomatose n’ont
été signalées qu’en France (5, 15), en Espagne (18) et plus récemment en Belgique (16).
Le spectre d’hôtes du VM est très étroit et ne présente aucun risque pour les humains.
B. TECHNIQUES DE DIAGNOSTIC
Dans la mesure où les signes de la maladie deviennent plus discrets avec l’atténuation des souches de virus,
l’envoi de prélèvements au laboratoire devient de plus en plus nécessaire. Cependant, le tropisme cutané est
réduit dans le cas des souches non myxomateuses du VM, et l’expression clinique de la forme non myxomateuse
rend le diagnostic clinique plus difficile que dans le cas de la forme classique. Les différentes techniques
disponibles varient dans leur capacité à détecter le VM dans les lésions myxomateuses typiques, dans l’œdème
des paupières ou des organes génitaux. Néanmoins, le diagnostic des formes atténuées ou des formes atypiques
(non myxomateuses) doit être confirmé par isolement du virus sur des lignées de cellules sensibles telles que la
lignée RK-13 (ATCC CCL37) et par identification du virus par les méthodes immunologiques. Dans tous les cas,
l’agent causal peut aussi être identifié par la mise en évidence de l’acide nucléique du VM par amplification en
chaîne par polymérase (PCR) ; les techniques moléculaires n’ont pas été évaluées quant à leur utilité
diagnostique.
1. Identification de l’agent pathogène
Une portion de lésion (myxome, organes ou tissus, notamment les paupières) est excisée à l’aide de ciseaux. Le
myxome est débarrassée de l’épiderme et de la couche superficielle du derme. Elle est lavée en solution
physiologique tamponnée au phosphate (PBS) additionné d’antibiotiques comme défini ci-dessous, puis broyée et
homogénéisée à une dilution de 1 g de tissu pour 4,5 à 9,0 ml de PBS. Les cellules sont rompues par deux cycles
de congélation-décongélation, ou par ultrasonication, afin de libérer les virions et les antigènes. Cette suspension
est centrifugée pendant 5 à 10 min à 1 500 g. Le surnageant est utilisé pour les épreuves.
a) Culture
L’isolement du virus en culture de cellules peut utiliser des cultures de cellules de première explantation de
rein de lapin (RK), ou des cellules établies en lignée continue, telle que la lignée RK-13, en milieu Opti-MEM
(MEM pour milieu essentiel minimal) contenant 2 % de sérum de veau ; 300 Unités Internationales (UI)/ml
de pénicilline ; 300 μg/ml de streptomycine ; 100 μg/ml de gentamycine ; 50 UI/ml de nystatine
(mycostatine) ; et 5 μg/ml d’amphotéricine (fungizone). L’inoculum est représenté par le surnageant de
l’homogénat de lésion ou par du jetage oculo-respiratoire repris en Opti-MEM additionné de 2 % de sérum
de veau et d’antibiotiques. L’inoculum est retiré de la couche de cellules au bout de 2 h. Les cellules sont
rincées avec un faible volume de milieu puis recouvertes de milieu d’entretien (Opti-MEM).
Un effet cytopathogène (ECP) typique des poxvirus (14) se développe en 24 à 48 h (à 37 °C et 5 % de
CO2), mais avec certaines souches, il peut être plus lent et n’apparaître qu’au bout de 7 jours. Selon la
souche de virus, des groupes de cellules voient leur cytoplasme confluer et forment des syncytia de taille
variable, renfermant de 2 à 50 noyaux et même rassemblant jusqu’à une centaine de noyaux. Le noyau de
certaines cellules présente des altérations, la chromatine formant des agrégats basophiles de taille et en

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nombre variables, donnant à la culture un aspect en peau de léopard. Les inclusions intracytoplasmiques
éosinophiles, lorsqu’elles sont présentes, demeurent discrètes. Les cellules infectées s’arrondissent, se
contractent, deviennent pycnotiques puis se lysent et se détachent de leur support (verre ou plastique). A la
longue, toutes les cellules seront infectées et la couche monocellulaire se détache complètement.
Le virus du fibrome de Shope produit tout d’abord des foyers d’accumulation de cellules arrondies qui
prolifèrent et s’empilent (14). À la périphérie, les cellules récemment infectées montrent de légères
modifications nucléaires et des inclusions cytoplasmiques acidophiles nombreuses et précoces. La couche
cellulaire est détruite en plusieurs jours.
b) Méthodes immunologiques
Les tests d’immunodiffusion en gélose (IDG) sont de réalisation facile et rapide – les résultats peuvent être
obtenus en 24 h. Les plaques de gélose sont préparées avec de l’agar Noble (0,6 g), de l’éthylène diamine
tétra-acétique (EDTA) (2,5 g), du chlorure de sodium (4,5 g), et de l’eau distillée (500 ml) contenant du
thiomersal (merthiolate) à 1/100 000. L’antisérum de référence (voir ci-dessous) et l’échantillon à tester sont
placés dans des puits opposés de 6 mm de diamètre, séparés de 5 mm. Une autre technique consiste à
déposer un fragment de lésion directement sur la gélose, à 5 mm d’un disque de papier filtre imprégné de
l’antisérum. Des lignes de précipitation, habituellement jusqu’à 3, apparaissent en 48 h, indiquant la
présence d’antigènes du VM. Une ligne unique apparaît lors de réaction hétérologue avec le virus du
fibrome de Shope.
Les épreuves d’immunofluorescence indirecte (IFI) peuvent être appliquées sur les cultures à partir de 24 h
d’incubation. Les épreuves d’IFI révèlent la multiplication intracytoplasmique du virus mais ne peuvent
distinguer le VM de celui du fibrome de Shope. L’inoculation de cellules d’embryon de poulet (trypsinisées à
11 jours d’incubation) n’entraîne pas d’ECP mais est propice à la détection des antigènes viraux par
immunofluorescence.
c) Microscopie électronique
La microscopie électronique en coloration négative peut être appliquée à un fragment de lésion cutanée. La
technique est simple et rapide, donnant des résultats en 1 h. Environ 1 mm3 de tissu est disposé sur un
verre de montre et 3 gouttes d’eau distillée sont ajoutées. Après 1 à 2 min à la température ambiante une
grille de microscopie électronique revêtue de formvar et de carbone est posée sur le liquide. Après 1 min,
l’excès de liquide est éliminé délicatement à l’aide d’un papier filtre et, immédiatement une goutte d’une
solution aqueuse à 2 % de molybdate d’ammonium, pH 7,0 ; est déposée sur la grille. Au bout de 10 s,
l’excès de liquide est absorbé à l’aide d’un papier filtre et la grille est prête pour l’examen au microscope
électronique. Lors d’examen positif, des particules typiques de poxvirus peuvent être vues mais cette
méthode ne permet pas de différencier le VM de celui du fibrome de Shope.
d) Tests d’inoculation
L’inoculation d’un lapin par voie intradermique permet aussi d’identifier le virus grâce à ses caractéristiques
pathogènes (niveaux de virulence, formes classique ou non-myxomateuse), à savoir son tropisme cutané
(forme nodulaire) et oculo-respiratoire (forme non myxomateuse). Elle doit être évitée si possible, mais
présente l’avantage de permettre d’apprécier la virulence en fonction du type d’inflammation des lésions
(local ou généralisé), de l’étendue des lésions et du temps de survie, ainsi que de distinguer le virus du
fibrome de Shope (avec une simple lésion fibromateuse locale) du virus myxomateux (capable d’entraîner
une infection généralisée chez l’adulte). On choisira des lapins domestiques pesant environ 2 kg, non
vaccinés et chez lesquels on vérifiera préalablement l’absence d’anticorps (14).
L’inoculum peut être le surnageant d’une lésion homogénéisée (avec antibiotiques) ou le produit d’une
culture. Un volume de 0,1 à 0,2 ml est injecté par voie intradermique à la face postérieure de l’oreille ou
dans la région dorso-lombaire préalablement débarrassée de ses poils. L’inoculum peut faire l’objet
d’injections de dilutions sériées en tampon salin à raison de un site par dilution. Une lésion primaire
apparaîtra au point d’injection en 2 à 5 jours, suivie d’une conjonctivite. En utilisant 5 sites par dilution il est
possible de calculer une dose infectieuse 50 % (DI50). Si l’animal survit, la maladie peut être confirmée par
la sérologie 15 jours plus tard.
2. Épreuves sérologiques
Les anticorps apparaissent en 8 à 13 jours. Lors de formes non létales ou après vaccination, le titre atteint un
sommet entre 20 à 60 jours ; il décline ensuite et les anticorps deviennent indétectables au bout de 6 à 8 mois en
l’absence de ré-infection (données correspondant à la fixation du complément [FC]) (19).

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Diverses épreuves sérologiques peuvent être utilisées, mais l’immunodiffusion en gélose (IDG), la FC, l’IFI et la
méthode immuno-enzymatique (ELISA), (dans l’ordre de sensibilité croissante), sont les épreuves les plus
appropriées pour les échanges internationaux et les autres applications. Ces épreuves réclament des antigènes
et antisérums de référence. L’antigène peut être préparé à partir de la souche Lausanne ou d’une souche
antigéniquement rattachée, produites sur lapins ou culture de cellules.
• Préparation des réactifs de référence (IDG, FC et IFI)
• Préparation de l’antigène
Des lésions myxomateuses sont prélevées sur lapins, 6 à 7 jours après inoculation, puis homogénéisées en
tampon véronal à la dilution de 1/5. L’antigène est le surnageant obtenu après centrifugation (1 500 g
pendant 5 à 10 min). Une activité anti-complémentaire éventuelle est supprimée par addition de 0,6 % de
chloroforme. Le liquide antigénique peut être stocké à –30 °C ou –70 °C ou utilisé directement en FC après
titrage à l’aide d’un antisérum de référence.
L’antigène peut être préparé à partir de culture sur cellules de lignée RK-13. Les cellules RK-13 (cellules de
rein de lapin CCL-37) sont cultivées 48 h avant inoculation dans du milieu de Eagle modifié Dulbecco
(DMEM, Gibco) contenant 10 % de sérum de veau fœtal, de la pénicilline et de la streptomycine. Les
cellules sont incubées à 37 °C avec une atmosphère à 5 % de CO2. Les cellules sont infectées avec la
souche de VM à un taux d’infection de 1-5. Après une incubation de 2 h à 37 °C, l’inoculum est retiré et les
cellules sont cultivées pendant 48 h dans du milieu DMEM avec 5 % de sérum de veau fœtal (incubation :
37 °C, 5 % de CO2). Le tapis cellulaire est récolté 48 h après infection, quand l’ECP est clairement visible
(80 %), puis centrifugé (1 000 g). Le liquide surnageant est recueilli. Le culot cellulaire est
congelé-décongelé 3 fois pour récupérer tout le virus et la suspension virale est clarifiée à 1 000 g. Le
surnageant est ajouté au précédent. L’ensemble des surnageants constitue l’antigène qui est stocké à
-20 °C ou -70 °C pour être conservé. Il est titré en cultures cellulaires avant son utilisation.
• Titrage de l’antigène de référence par la fixation du complément
i) Inactiver un antisérum de référence pendant 30 min au bain-marie à 56 °C. Il n’existe pas de sérum de
référence international, mais des sérums de référence interne au laboratoire doivent être préparés et
titrés selon une échelle appropriée, en utilisant la FC ou l’ELISA. Après cela, la méthode suivante est
utilisée pour normaliser les lots d’antigène.
ii) Faire des dilutions en série, de raison deux, du sérum de référence en tampon
calcium/magnésium/véronal (CMV) (BIOMERIEUX, réf. 72171), pH 7,2, de 1/2 à 1/4096, dans une
plaque de micro-titrage à 96 puits à fond rond, une dilution par range (colonne) et 25 μl par puits.
iii) Utilisant des tubes, faire des dilutions de raison deux de l’antigène en tampon CMV de 1/10 à 1/1280.
iv) Ajouter 25 μl par puits de la même dilution du premier antigène à chaque puits de la première ligne de
la plaque ; de manière similaire, ajouter les dilutions suivantes de l’antigène dans les puits des lignes
suivantes afin d’obtenir un titrage en échiquier de l’antigène et de l’anticorps.
v) Ajouter 25 μl (6 unités H50 [50 % d’hémolyse]) de complément par puits.
vi) Incuber la plaque couverte d’un film de plastique, pendant 1 h à 37 °C ou 14 h à 4 °C.
vii) Ajouter 50 μl par puits du système hémolytique (2,5 % de globules rouges [GR] de mouton et un
volume égal de sérum anti-GR de mouton, les deux dilués dans du CMV (pour avoir la dilution de
travail optimale, suivre les recommandations du fabricant, sinon déterminer individuellement cette
dilution pour chaque lot de sérum utilisé).
viii) Couvrir de nouveau la plaque et incuber pendant 30 min à 37 °C.
ix) Lire la plus haute dilution de l’antigène donnant une hémolyse complète (H100) avec la plus haute
dilution du sérum de référence. Il y a 1 unité antigénique (AgU) dans 25 μl de cette dilution de
l’antigène.
• Titrage des particules infectieuses du virus Myxoma en cultures cellulaires
i) Diluer le virus de 10-1 à 10-5 dans du DMEM avec antibiotiques et 2 % de sérum de veau fœtal.
ii) Infecter un tapis confluent de cellules RK-13 (P6 – plaques Falcon) trois exemplaires avec 200 µl des
dilutions en série intéressantes et incuber à 37 °C pendant 2 h dans une atmosphère à 5 % de C02.
iii) Retirer l’inoculum et ajouter dans chaque puits 2 ml de DMEM avec 5 % de sérum de veau fœtal.
iv) Incuber à 37 °C en atmosphère à 5 % de CO2 pendant 2 jours.
v) Retirer le milieu liquide et le remplacer par un milieu solide avec 1 % d’agarose LMP et 2 % de sérum
de veau fœtal.

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vi) Incuber à nouveau 1 à 2 jours ; les plages sont alors comptées sans coloration pour chaque dilution
(une coloration est possible en ajoutant du rouge neutre dans le milieu solide).
vii) Le titre est donné en unités formant plages (UFP) par ml.
• Préparation et titrage du sérum positif de référence
Pour l’anti-sérum de référence, un lapin adulte, à sérologie négative, est vacciné avec une souche atténuée
de VM ou avec le virus du fibrome de Shope. Après 3 à 4 semaines, ce lapin est inoculé par voie
intradermique avec une souche virulente de VM (souche Lausanne ou apparentée) (5 × 103 UFP). Le
sérum, obtenu 3 semaines plus tard, est titré en FC ou en ELISA. Si le titre atteint ou dépasse 1/640 ou
1/1000 respectivement pour la FC et l’ELISA, l’animal est saigné et son sérum stocké à –20 °C.
a) Test de fixation du complément
Les tests de FC (19) sont effectués en tubes ou en plaque de micro-titrage (6) par les méthodes
conventionnelles, en retenant 100 % ou 50 % d’hémolyse. C’est, à l’heure actuelle, la méthode de
référence.
i) Titrer le complément en tubes à hémolyse, en présence de 1 AgU, afin de déterminer l’unité H50.
ii) Inactiver le sérum à tester et les sérums témoins positif et négatif au bain-marie pendant 30 min à
56 °C.
iii) Faire des dilutions de raison deux, du sérum à tester et des sérums témoins, en CMV, de 1/4 à 1/1024,
en utilisant une plaque micro-titrage à 96 puits à fond rond, à raison de 25 μl par puits. Utiliser le
premier puits pour la dilution 1/4 initiale et le second comme témoin sérum (contrôle du pouvoir anti-
complémentaire à la dilution du 1/4). Préparer les puits contrôles de l’antigène (sans sérum), du
complément et des GRs (voir ci-dessous) (2 puits pour chacun).
iv) Ajouter 1 AgU d’antigène du VM dans 25 μl par puits (à l’exception des puits témoins du sérum, du
complément et des GRs), puis, ajouter 6 H50 de complément dans 25 μl par puits (à l’exception du
témoin GRs).
v) Incuber les plaques recouvertes d’un film plastique, pendant 14 h (durant la nuit) à 4 °C.
vi) Ajouter 50 μl de système hémolytique par puits.
vii) Couvrir à nouveau les plaques et incuber pendant 30 min à 37 °C.
viii) Préparer une échelle de témoins d’hémolyse H100, H75, H50, H25 à partir des témoins complément
(H100) en tampon CMV.
ix) Lire, après centrifugation (1 000 g pendant 10 min) ou sédimentation passive à 4 °C. Le titre des
sérums testés est exprimé par la plus haute dilution du sérum donnant au moins 50 % d’inhibition de
l’hémolyse.
x) Un sérum négatif doit donner une inhibition de l’hémolyse < 50 %, à la dilution du 1/4.
b) Épreuve d’immunofluorescence indirecte
L’épreuve d’IFI (11) est réalisée sur culture de cellules d’embryon de poulet ou de cellules RK-13 obtenue
en plaque de microtitrage à puits à fond plat : la suspension cellulaire (4 × 104 cellules dans du milieu), est
distribuée dans tous les puits et une couche confluente de cellules est produite en 24 h. Le milieu est alors
éliminé et 100 μl de suspension virale (taux de multiplicité de 0,05) sont ajoutés dans chaque puits. Après
2 h d’incubation, 100 μl de MEM contenant 2 % de sérum de veau est ajouté. Après 48 h d’incubation, les
plaques sont lavées avec du PBS et fixées à l’acétone contenant 50 % d’éthanol, pendant 30 min à –20 °C
ou au paraformaldéhyde (4 % dans du PBS) à température ambiante. Les plaques sont ensuite séchées à
37 °C pendant 15 min. Les plaques peuvent dès lors être stockées à –30 °C ou –70 °C pendant 3 mois. Les
sérums sont soumis à l’épreuve d’IFI utilisant des IgG anti-lapin conjugués à de l’isothiocyanate de
fluorescéine. Les résultats peuvent être exprimés de façon qualitative avec des sérums dilués au 1/20, ou
de façon quantitative en utilisant des dilutions sériées des sérums.
c) Épreuve immuno-enzymatique (ELISA)
Un test ELISA récemment développé (10) utilise un virus myxomateux semi-purifié (souche française
T1 hyper virulente, antigéniquement rattachée à la souche Lausanne) produite en cellules RK-13. Le virus
est récolté sous la forme d’une suspension de cellules 48 h après infection, puis centrifugé. Le culot