Polymorphismes de l`ADN

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Polymorphismes de
l’ADN
Présentation et mise en évidence
C. Camus 2008
Introduction
•Recherche de gènes responsables de maladies
génétiques :
•Analyse de pedigrees où la maladie est présente
•Sur quel chromosome ?
•À quel endroit du chromosome ?
•…
•Séquence du gène, fonction de la protéine…
•Nécessité d’avoir des repères le long des
chromosomes pour aller à la pêche…
C. Camus 2008
Chromosome 21
Carte des marqueurs connus
C. Camus 2008
Introduction
•Les marqueurs polymorphes sont des loci
présentant plusieurs allèles (de 2 à beaucoup) qui
vont servir de balises le long des chromosomes
•Ce sont rarement des gènes, mais tous se
transmettent entre générations comme des gènes

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C. Camus 2008
I- Les Marqueurs polymorphes
1. RFLP bi-allèliques
2. Minisatellites
3. Microsatellites
4. SNP (single nucleotide polymorphism)
C. Camus 2008
1-RFLP bi-allèliques
•Restriction Fragment Length Polymorphism
•À un locus donné, un site de restriction va être
soit présent soit absent
•Une mutation ponctuelle suffit
•Mise en évidence : Southern blot ou PCR
C. Camus 2008
1-RFLP bi-allèliques : Southern blot
Digestion par l’enzyme
Southern blot avec une sonde ( ) recouvrant le RFLP
Allèle 1 1 kb 2 kb
Allèle 2 3 kb
1/1 2/2 1/2
1 kb
2 kb
3 kb
C. Camus 2008
1-RFLP bi-allèliques : PCR
PCR avec 2 amorces encadrant le RFLP
Digestion par l’enzyme puis électrophorèse
Allèle 1
Allèle 2
1/1 2/2 1/2
0,4 kb
0,6 kb
1 kb

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C. Camus 2008
1-RFLP bi-allèliques : localisation
•Dans toute séquence non codante (97% ADN)
•Dans une séquence codante sans conséquence sur
la fonction du gène
•Si le polymorphisme touche la 3ème base du codon
•Allèle 1 CAG ATC TTA (site BglII AGATCT)
• Gln Ile Leu
•Allèle 2 CAA ATC TTA (site BglII absent)
• Gln Ile Leu
•Si le changement d’acide aminé n’a pas d’effet sur la fonction
•Cas particulier : la mutation étudiée crée un
polymorphisme (cf diagnostic direct)
C. Camus 2008
2-Minisatellites = RFLP multi-allèliques
= VNTR (variable number of tandem repeats)
CTGGATTAGCTTAAGCGT
CTTAGTAGGATGGATGGA
GGAGGTTCAGGTGAT---
GGAGGTTCAGGTGATGGA minisatellite
GGAGGTTCAGGTGATGGG PS3 porcin
GGAGGTTCAGGTGATGGG allèle à 7
GGAGGTTCAGGTGATGGG répétitions
GGAGGTTCAGGTGATGGA
GGAGGTTCAGGTGAT---
ACCTGGGATTCTTCGATC
C. Camus 2008
2- minisatellites
•Répétitions en nombre variable d’une séquence de
10 à 50 pb à un locus donné
•Une même séquence de minisatellite va se
retrouver à différents loci sur tout le génome
•Analyse locus par locus
•Analyse de la répartition d’un minisatellite sur le
génome entier
C. Camus 2008
2-Minisatellites - mise en
évidence des allèles à un locus
•Le contexte autour du minisatellite est spécifique
d’un locus
•Analyse par Southern blot ou PCR
•La sonde ou les amorces s’hybrident autour du
minisatellite : locus-spécifiques

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C. Camus 2008
2-minisatellites : Southern blot
Digestion par l’enzyme
Southern blot avec une sonde ( ) adjacente au minisatellite
= spécifique d’un LOCUS
1/1 2/2 1/2
2 kb
3 kb
Allèle 1 2 kb
Allèle 2 3 kb
C. Camus 2008
2-minisatellites : PCR
PCR avec 2 amorces encadrant le minisatellite
= spécifique d’un LOCUS
1/1 2/2 1/2
Allèle 1
Allèle 2
C. Camus 2008
sonde
Exemple
C. Camus 2008
2-Minisatellites - mise en évidence
des allèles sur tout le génome
•Analyse par Southern blot uniquement (PCR =
locus spécifique)
•La sonde s’hybride sur le minisatellite
•Applications : médecine légale, tests de paternité

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C. Camus 2008
sonde Chr 1
Chr 12
Chr 6
Chr 19
Chr 9
= Empreinte génétique
chromosomes
Nb répet.
C. Camus 2008
2- Minisatellites - empreinte génétique
-Chaque bande présente
chez un individu doit
l’être également soit
chez sa mère soit chez
son père :
-test d’exclusion de
paternité
(M= mother, C= child, F=
father)
- Chaque individu
a une empreinte
différente (sauf
les jumeaux
monozygotes) :
- Utilisation en
médecine légale
C. Camus 2008
2-Minisatellites - récapitulation
•Les minisatellites sont
•Poly-alléliques : grand nombre d’allèles différents à un locus donné (en
fonction du nombre de répétitions de la séquence)
•Multi-locus : une même séquence de minisatellite va se trouver à
différents endroits dans le génome (à chaque fois avec différents allèles
possibles)
C. Camus 2008
3-Microsatellites
•1-6pb répétées n fois (5≤n≤40)
•Ex : TGTGTGTGTG…..
•≥ 50 000 microsatellites (TG)n dans tout le génome humain
•Présents sur tout le génome
•Mise en évidence par PCR exclusivement
•Migration en gel d’acrylamide (plus résolutif que
l’agarose)