Explorations métaboliques du coeur malade

Réunion de printemps de la Société française pour l’étude des erreurs innées du métabolisme,
Programme scientifique: Cœurs et maladies métaboliques, Nantes, France, 20 juin 2014
Explorations métaboliques
du coeur malade
Christine Des Rosiers Ph.D.
Professeur, Département de Nutrition & Biochimie
Directrice, Laboratoire de métabolomique
Centre de recherche l’Institut de cardiologie de Montréal,
Université de Montréal, Montréal, Canada
Pas de conflit d’intérêt
Plan de la présentation
• Partie I: Introduction
- Altérations métaboliques et cardiomyopathies
• Partie II: Explorations du métabolisme cardiaque
in vivo et ex vivo:
- Considérations pratiques
- Un exemple: Impact d’un déficit de la β-oxydation des
acides gras à très longue chaîne (VLCAD) chez la souris
• Partie III: Conclusion & perspectives
Partie I:
Introduction Altérations métaboliques
et cardiomyopathies
Introduction – Métabolisme et coeur
Le coeur est un organe hautement oxydatif
Oxygène (O2)
Acides gras
Glucides
(glucose; lactate; pyruvate)
Acides aminés
•
•
•
ATP
Corps cétoniques
Chaque jour, le coeur bat ~100,000x; ce qui nécessite ~6 kg d’ATP.
Les réserves d’ATP = 5 µmol/g; le pool doit être renouvelé ~10 sec.
En normoxie, 95% de l’énergie provient de l’oxydation des nutriments.
Introduction – Métabolisme et coeur
B) Production d’énergie:
Phosphorylation oxydative
C) Transfert et utilisation de
l’énergie: La navette de la
créatine kinase
Chaîne
respiratoire
NADH
ATP
Cycle de Krebs
A) Métabolisme énergétique
La sélection des substrats
Glucose
Acides gras
PCr:ATP
<1.6
↑ mortalité
Introduction – Métabolisme et coeur
Erreurs innées du métabolisme et cardiomyopathies
B) Production d’énergie:
Phosphorylation oxydative
C) Transfert et utilisation de
l’énergie: La navette de la
créatine kinase
Chaîne
respiratoire
NADH
Cycle de
Krebs
ATP
CPT-2
VLCAD
LCHAD
MCD
↓Carnitine
β-Oxydation
des AGCL
Acides gras
A) Métabolisme énergétique
La sélection des substrats
Glucose
Neubauer S, NEJM 2007
Saudubray JM et al., J Inherit Metab Dis 1999
Partie II:
Explorations du
métabolisme cardiaque
in vivo et ex vivo Considérations pratiques
Considérations pratiques - Modèles d’étude
Échantillons
(plasma; tissus)
Cellules
Troubles du
rythme
↓Contractilité
Mort subite
Organe
perfusé
Modèles
animaux
A
N
A
L
Y
S
E
S
Considérations pratiques – Les impondérables
Interprétation des données: Causes ou conséquences ?
FONCTION CONTRACTILE
Divers facteurs:
Âge; Sexe; IMC;
Diète;
État nutritionnel;
Activité physique;
Espèce;
Souche de souris;
Maladie; etc
MÉTABOLISME ÉNERGÉTIQUE
• Il existe une relation étroite entre la fonction et le métabolisme du coeur.
www.photoshopgurus.com500
Considérations pratiques - Approches
La métabolomique: Vers une meilleure
compréhension de la relation génotype-phénotype
Métabolomique
métabolome
Protéomique
protéome (106 protéines)
Transcriptomique
transcriptome (150,000 RNAm)
(30,000 gènes)
Génomique
11
Adapted from: Kelleher (2004) Metabol Eng. 6: 1-5
PHÉNOTYPE
Environment
Métabolites > 1,500 Da; ~20,000
GÉNOTYPE
12
Considérations pratiques - Approches
Le métabolisme est “dynamique” et non pas statique
http://blingee.com/blingee/view/74007301-patinage-artistique
Considérations pratiques - Approches
Le métabolisme est “dynamique” et non pas statique
Fluxomique
Substrats marqués
FLUX
métabolome
protéome (106 protéines)
transcriptome (150,000 transcripts)
(40,000 gènes)
Adapted from Kelleher (2004) Metabol Eng. 6: 1-5
Considérations pratiques - Approches
Faits, concepts et défis
Radioisotopes
(14C/3H)
*Isotopes stables (13C/2H)
Spectrométrie de masse (MS)
Développement et validation de modèles d’études
Identification de processus métaboliques altérés par la maladie
Utilité clinique
Investigations métaboliques in vivo
Tomographie par émission de
positons (TEP: 11C/18F)
*Isotopes stables (13C/2H)
Résonance magnétique nucléaire
Partie III:
Explorations du métabolisme
cardiaque in vivo et ex vivo Un exemple: Impact d’un déficit de
la β-oxydation des acides gras à très
longue chaîne (VLCAD) chez la souris
Déficit en VLCAD – Mise en contexte
Impact chez l’humain
• Désordre de l’oxydation des AG à chaîne longue le plus commun
(Incidence: 1/50 000- 1/120 000 (Liebig et al. 2006)
• Transmission autosomique récessive
- Chromosome 17p; très grande hétérogénéité moléculaire
(58 mutations; 55 patients; Gobin-Limballe et al. 2007)
- Pas de relation génotype-phénotype
• Symptômes cliniques incluent: cardiomyopathies, troubles du
rythme et mort subite
• Thérapie actuelle inefficace pour le contrôle ou la prévention des
symptômes
Saudubray et al., J Inherit Metab Dis 1999 & Inborn Metabolic Diseases 2012; Labarthe et al. Cardiovasc Drug Ther 2008;
Spiekerkoetter J Inherit Metab Dis 2010; Houten & Wanders J Inherit Metab Dis 2010; Brunengraber & Roe J Inher Metab Dis 2006
Déficit en VLCAD – Mise en contexte
Impact et traitement: les hypothèses
LC-Acyl-Carnitine
AGCL
(↑C14:1; C16; C18…)
LC-Acyl-CoA
CPT-I
TRANS
CPT-II
Troubles
du rythme
LC-Acyl-Carnitine
LC-Acyl-CoA (toxicité)
VLCAD
LCAD
MCAD
MC-Acyl-CoA
SCAD
SC-Acyl-CoA
Acétyl-CoA
Faiblesses
musculaires
Cycle de Krebs
(énergie)
Mitochondrie
AGCMs C8 C7
• Restreindre
l’apport en AGCL
• Supplémentation
en carnitine
• Diète enrichie en
glucides
• Éviter le jeûne
Déficit en VLCAD – Mise en contexte
Modèles de souris
• Deux modèles indépendants de souris invalidées pour la VLCAD ont
été créés qui présentent un phénotype similaire - bien que moins
sévère - à celui observé chez l’humain (Strauss & coll. 2003; Wood & coll. 2001) .
• Ceci inclût: hypoglycémie du jeûne, stéatose hépatique, niveaux
plasmatiques élevés d’acylcarnitines à longue chaîne, moindre
capacité à supporter l’exercice et une exposition au froid, etc.
(Spierkerkoetter & coll.).
• Au niveau cardiaque: cardiomyopathie caractérisée par une
histologie anormale (dépôts lipidiques) et une hypertrophie, des
troubles du rythme - susceptibilité accrue à la tachycardie même en
absence de stress.
Déficit en VLCAD - Étude chez la souris
• Objectifs général: Améliorer les connaissances sur les causes de la
cardiomyopathie reliée aux défauts de VLCAD en vue d’optimiser les thérapies.
• Approche: Étape 1 – Phénotypage fonctionnel et métabolique du cœur:
Perfusion ex vivo en mode travaillant avec des substrats marqués au 13C.
Glucose 7-11 mM
Lactate 1.5 mM
Insuline 0.8 nM
Épinephrine 5 nM
Pyruvate 0.2 mM
Carnitine 50 µM
Palmitate 0.4-1 mM
(Albumine)
Canule
intraventriculaire
(Fonction)
Chromatographie gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (Métabolisme)
(Gélinas et al. Am J Physiol Heart & Circ Physiol 301: H813, 2011)
Déficit en VLCAD chez la souris
Des résultats inattendus ...
AGCL: 13C-Palmitate (16C)
13C
12C
Fonction: Contractilité
LC-Acyl-CoA
CPT-I
TRANS
CPT-II
LC-Acyl-CoA
VLCAD
Métabolisme: Palmitate → acétyl-CoA
##
Autres
sources
(Glucides)
Acétyl-CoA
(citrate)
Cycle de Krebs
(Énergie)
Palmitate
(mM)
Basal
0.4
Basal Stress
1.0
Jeûne
Basal
0.4
Déficit en VLCAD chez la souris
Des résultats inattendus ... suggèrent la présence d’un
mécanisme compensatoire: Le rôle de LCAD
Activité (%)
VLCAD
Poids du coeurt / poids total
Hypertrophie cardiaque
LCAD
LCAD-/-
VLCAD-/WT
Longueur de la chaîne de carbone
Cox et al., 2009
(Adaptée de : Wanders et al. J Inher Metab Dis, 1999)))
• Le phénotype est plus sévère chez la souris LCAD-/- vs. VLCAD -/-.
• Le rôle de la LCAD semble plus important chez la souris que chez l’humain
(Aoyama et al 1993; Vianey-Saban et al. 1998; Chegary et al. 2009; Houten et al. ).
Déficit en VLCAD chez la souris
Impact au-delà de la β-oxydation des acides gras?
Approche: Étape 2
Souris témoins et VLCAD -/7 mois
Diète standard
+/- 24 h jeûne
Diète riche en gras
(35% du poids total sous forme de lard)
2 semaines +/- 24 h jeûne
Paramètres métaboliques
Métabolomique: Profil des lipides
dans le plasma, cœur, foie, etc.
•Analyse ciblée (GC-MS)
Profil d’acides gras (17) dans les
triglycérides et les phospholipides
•Analyse non ciblée (LC-QTOF)
Toutes les classes de lipides
Paramètres physiologiques
Souris conscientes:
Télémétrie et ECG
Déficit en VLCAD chez la souris
Analyse des lipides: Approche ciblée (GC-MS)
50
Niveaux de DHA dans le coeur
Phospholipides totaux
QTc
80
Mitochondrie
60
(msec)
(%)
40
30
20
*
*
**
10
0
Standard
Riche en gras
VLCAD+/+ (n=5-7)
Standard
VLCAD-/- ( n=5-7)
###
#
40
20
0
Standard
Riche en gras
t-test:* p<0,05; **p<0,005 vs contrôles
2 way ANOVA et Bonferroni post-test:
# p<0,05 ; ### p<0,001 vs contrôles
• L’acide docosahexaénoïque (DHA: oméga-3) est diminuée dans
les phospholipides des coeurs de souris VLCAD-/-.
• Ceci est associée à une prolongation de l’onde QT.
• Une diminution du DHA a aussi été rapportée dans les coeurs de
souris LCAD-/- (Bakermans et al. 2011)
(Gélinas et al. Am J Physiol Heart & Circ Physiol 301: H813, 2011)
Déficit en VLCAD chez la souris
Analyse des lipides: Approche non-ciblée (LC-QTOF)
Toutes les classes de lipides du coeur = 2118 signaux
Cardiolipines
Phospholipides
Triglycérides
Diacylglycérides, céramides,
sphyngomyélines
Forest A, Bouchard B, et al. Metabolomics Meeting 2013; Manuscrit en rédaction
Déficit en VLCAD chez la souris
Analyse des lipides: Approche non-ciblée (LC-QTOF)
-log10 (corrected P value)
Volcano Plot: Données des souris VLCAD-/- vs. témoins exprimées en ratio
Plasma
↑Acylcarnitines ≥ 16C
Log 2 (fold change)
Coeur
↑Acylcarnitines ≥ 16C
Facteur 2
P<0.05
(corrigée)
Log 2 (fold change)
Forest, Bouchard, et al. Manuscrit en rédaction
• Les coeurs de souris VLCAD-/- présentent une diminution (>2x) des
niveaux de phospholipides de type phosphatidylcholine (PC) contenant
des acides gras polyinsaturés oméga 3 (DHA), et des cardiolipines.
Déficit en VLCAD chez la souris
Utilité des approches d’imagerie pour
l’exploration du métabolisme cardiaque in vivo
↓ PCr/ATP
↓ Fraction d’éjection
WT VLCAD-/-
↑ Captation du glucose
TEP: 18F-désoxyglucose (FDG)
Captation
WT
Taegtmeyer, J. Nucl. Med 51: 80S (2010)
VLCAD-/WT VLCAD-/-
Tiré de: Tucci, al., Spiekerkoetter, BBA 1842: 677, 2014
Déficit en LCAD chez la souris
Utilité des approches d’imagerie pour
l’exploration du métabolisme cardiaque in vivo
13C
12C
IRM - 13C-pyruvate hyperpolarisé
[1-13C]Pyruvate
Carboxylation
(Anaplérose)
Décarboxylation
(Oxydation)
CO2
Acétyl-CoA
OAA (citrate)
Citrate
Malate
13C-
Concentration - Malate
Aspartate
Cycle de Krebs
(Énergie)
Tiré de: Bakermans A J et al. Cardiovasc Res 2013;100:441-449
Conclusion et perspectives futures
Explorations métaboliques du cœur malade
• Plusieurs options sont disponibles: modèles d’études, approches,
analyses, et techniques, avec des avantages et des inconvénients;
• Il s’avère important d’inclure des approches qui sondent la
dynamique du métabolisme;
• Des nouvelles technologies se développent et permettront
d’approfondir cette exploration in vivo.
Flux
Métabolomique
Imagerie TEP in vivo
Remerciements
Membres du laboratoire
Roselle Gélinas, Ph.D.
Bertrand Bouchard M.Sc.
Anik Forest M.Sc.
Isabelle Robillard-Frayne M.Sc.
Caroline Daneault M.Sc.
Matthieu Ruiz, Ph.D.
Julie Thompson-Legault ,M.Sc.
Collaborateurs
Dr. François Labarthe, Univ. Tours
Dr. Arnold Strauss, Univ. Cincinnati
Dr. Henri Brunengraber, CWRU
Dr. Victor Gavino, Univ. Montréal
Dr. Guy Charron, ICM
Marc-Antoine Gillis, ICM
Natacha Duquette, ICM
Financement
Instituts de recherche en santé du Canada
Fonds de la Recherche en Santé du Québec
Fondation canadienne pour l’innovation
National Institutes of Health
Métabolisme des ACGM au niveau cellulaire (cardiomyocytes)
Considérations pratiques - Approches
La métabolomique: une démarche avec des défis,
choix, compromis et besoins ...
Principales technologies
Spectrométrie de masse (MS)
Résonance magnétique nucléaire (NMR)
Deux approches (cible à atteindre: ~20,000 métabolites)
Analyses ciblées
(“targeted”)
1-~500 métabolites connus;
quantitative, précis et
reproductible, mais nombre
limité de métabolites;
Analyses non-ciblées
(“non-targeted”)
tous les signaux détectés >1,000;
très grand potentiel de découverte,
mais complexe dans l’analyse
et traitement des données;
Traitement et interprétation des données
Plusieurs outils bioinformatiques (à développer), logiciels et analyses
32
statistiques complexes, etc.
Le coeur travaillant
perfusé ex vivo
Pré-charge: 11.5mmHg
Post-charge: 50mmHg
Paramètres
physiologiques
Flowprobe
Compliance
chamber
Débit cardiaque
Rythme cardiaque
Pressions systolique et
diastolique
Contractilité (dP/dtmax)
Consommation
d’oxygène
Paramètre d’intégrité
membranaire
Oxygenator
Perfusion
pressure
transducer
Flowprobe
O2 Consumption
Filter
Pressure
transducer
Pump
Influent
Effluent
Overflow
MÉTHODE – Substrats marqués au carbone 13
Triglycérides
Estérification
Glycolyse
Pyruvate
*Acides gras
Lactate
*Glucose
Pyruvate
Lactate
CPT-I
Carboxylation Décarboxylation
Oxidation
Anaplérose
Acétyl-CoA
OAA
Citrate
Cycle de Krebs
(NADH)
Mitochondrie
Cytosol
β-Oxydation
La résonance magnétique nucléaire - Utilité in vivo
La tomographie par émission de positons (TEP)
Demi-vie des isotopes très
courtes: < 2 à 110 min
Introduction – Métabolisme et coeur (Rappel)
Erreurs innées du métabolisme et cardiomyopathies
B) Production d’énergie:
Phosphorylation oxydative
C) Transfert et utilisation
de l’énergie: La navette
de la créatine kinase
Chaîne
respiratoire
NADH
Cycle de Krebs
ATP
CPT-2
VLCAD
LCHAD
MCD
↓Carnitine
β-Oxydation
des AGCL
Acides gras
A) Métabolisme énergétique
La sélection des substrats
Glucose
Neubauer S, NEJM 2007
Saudubray JM et al., J Inherit Metab Dis 1999