Differentiation du trophoblaste au cours du developpement in vitro d

J. Embryo}, exp. Morph. Vol. 25, 2, pp. 175-187, 1971 175
Printed in Great Britain
Differentiation du trophoblaste au cours du
developpement in vitro d'embryon de Souris
Par D. HERNANDEZ-VERDUN1 ET C. LEGRAND1
Faculte des Sciences et Unite de Physiologie Placentaire a VInserm,
Hopital Saint Antoine, Paris
SUMMARY
Differentiation of the trophoblast during in vitro development
of the mouse embryo
Mouse embryos obtained at the presomitic stage develop in vitro up to 70 h. During the
first 24 h development remains comparable in vitro and in utero. Afterwards, the chronology
of embryonic development is modified and in our successful prolonged experiments (70 h
culture), foetal organogenesis reaches a stage corresponding only to \\ days in utero. In
some instances a chorioallantoic circulation has been observed in the umbilical cord.
The three trophoblast cell types present in egg-cylinders at 8 days post coitum, develop in the
same way in utero or in vitro. After 48 h culture electron microscopy shows that numerous
annulate lamellae appear in the nuclei and in the cytoplasm of some of the giant cells. The
syncytium does not differentiate between the trophoblast and the allantoic mesoderm. The
haemo-trichorial placental barrier does not differentiate in vitro, although foetal capillaries
form.
In vitro, the endoderm cells (from the splanchnopleure or from the omphalopleure) actively
proliferate and form an homogeneous substance located between the giant and the polyhedric
trophoblast cells.
INTRODUCTION
Faisant suite a nos observations morphologiques sur le trophoblaste des
Rongeurs (Verdun, 1967; Legrand, 1968; Hernandez-Verdun, 1969; Legrand,
1969), nous avons cultive des embryons de Souris au stade de l'ovo-cylindre
(8eme jour de la gestation). Cette technique permet d'observer a ce stade
revolution du trophoblaste en relation avec l'organogenese foetale et le developpe-
ment de la vascularisation allantoidienne. La culture permettra ulterieurement
d'experimenter directement sur revolution du trophoblaste.
Les travaux de certains auteurs ont deja abouti au developpement, in vitro,
d'embryons de Rongeurs pendant 1, 2 ou
3 jours (Jolly & Lieure, 1938; Nicholas
& Rudnick, 1938; New & Stein, 1963, 1964; New, 1966, 1967; Givelber & Di
Paolo, 1968; Morelec, Rouer & Haegel, 1968; Clarkson, Doering & Runner,
1969; Le Goascogne & Brun, 1969; New & Daniel, 1969; New & Coppola,
1970#, b). Recemment, New & Coppola (1970a), etudiant l'effet de differentes
1
Adresses des auteurs: Faculte des Sciences et Unite de Physiologie Placentaire a l'lnserm,
Hopital Saint Antoine, 184 Rue de Faubourg Saint Antoine, Paris 12°, France: et 105
Boulevard Raspail, Paris 6, France.

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conditions d'oxygenation sur la croissance de l'embryon de Ratte in vitro,
emettent l'hypothese que celle-ci ne pourra etre amelioree qu'en utilisant une
technique permettant le developpement du placenta allantoidien et de la vesicule
ombilicale. Or actuellement une etude sur revolution in vitro du trophoblaste
qui formera le placenta allantoidien n'a pas, a notre connaissance, ete publiee.
En effet, les auteurs qui ont etudie les cellules trophoblastiques chez les Rongeurs
se sont interesses a un type particulier de cellules. 11s ont cultive des cellules
geantes de placenta (Dorgan, 1969), des cellules trophoblastiques de nodules
formes apres la greffe de blastocystes sous la capsule renale (Schlesinger &
Koren, 1967; Koren & Behrman, 1968), et des blastocystes tres jeunes dans
lesquels les differentes lignees trophoblastiques n'etaient pas encore indivi-
dualisees (Cole & Paul, 1965; Gwatkin & Love, 1968). Nous avons etudie,
in vitro, le trophoblaste pendant un temps qui correspond a la periode ou, in
utero, il prolifere intensement (8 jours a 9,5 jours) et est envahi par les cellules du
mesoderme allantoidien (9,5 jours); ce stade represente la premiere etape dans
la formation de la vascularisation utero-placentaire.
MATERIEL ET METHODES
Les ovo-cylindres sont preleves au 8eme jour de la gestation, le ler jour de la
gestation etant determine par la detection du bouchon vaginal chez les femelles
mises, la veille, en presence de males.
Dans quelques gouttes du milieu employe pour la culture, les ovo-cylindres
sont extraits des tissus deciduaux qui les entourent, puis debarrasses de leur
membrane de Reichert, et des cellules de l'endoderme et du trophoblaste qui y
adherent. A ce stade de developpement, il est pratiquement impossible d'enlever
la totalite de la membrane de Reichert, car une trop grande traction risque de
rompre le faible pedicule qui rattache le cone au reste de l'ovo-cylindre (Fig. 2).
Apres plusieurs lavages, les ovo-cylindres sont mis en culture sur le fond d'une
saliere contenant 1,5 cm3 d'un milieu compose de liquide de Eagle (B.M.E.
modifie, Institut Pasteur) additionne de 25 % de serum de veau foetal, 10 a 30 %
de serum de Souris, et de glucose (concentration finale dans la solution 5 g/1). Le
serum de Souris provient, soit de la mere, soit d'une autre femelle au meme
stade de la gestation, soit d'une femelle non gravide. Nous avons choisi ce
milieu car il semble assurer un bon developpement non seulement a l'embryon
mais egalement au trophoblaste. Le milieu de Eagle B.M.E. additionne soit de
5 % de serum de veau foetal (Gwatkin & Love, 1967), soit de 15 % de serum de
veau foetal (Koren & Behrman, 1968) ne nous a pas donne satisfaction. Toutes
ces manipulations sont faites dans des conditions rigoureuses de sterilite, ce qui
permet de ne pas utiliser d'antibiotiques. Les salieres sont fermees, lutees a la
paraffine et placees dans une etuve a une temperature constante de 37 °C.
Au bout de 1, 2 ou 3 jours de culture, les ovo-cylindres sont fixes pendant
1 h dans un melange de glutaraldehyde et d'acide osmique dilues a 2 % dans un

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tampon phosphate 0,1 M (pH 7,2), le melange etant maintenu a 4 °C. Apres
deshydratation dans la serie montante des alcools, les prelevements sont inclus
dans de l'araldite Durcupan. Dans ces prelevements, des coupes semi-fines ont
ete faites, selon une epaisseur de 1 a
3 fi puis colorees pendant 1 h a 60 °C dans
une solution de Giemsa et observees au microscope photonique. Dans les
zones interessantes, nous avons alors effectue des coupes ultrafines, qui ont
subi une double coloration par l'acetate d'uranyle en solution alcoolique et le
citrate de plomb selon la technique de Reynolds (1963). Les observations ont
ete faites au microscope electronique RCA EMU 3H.
RESULTATS
Aucours de cette experimentation, quarante-cinq embryons se sont developpes
dans un delai de 1 a
3 jours de culture. Nous n'avons observe aucune difference
dans leur developpement, qu'ils soient cultives dans un milieu additionne de
serum maternel, de serum de Souris au meme stade de la gestation, ou de serum
de Souris non gravide.
Au moment de la mise en culture, les ovo-cylindres sont surmontes d'un
cone ectoplacentaire volumineux coiffant la splanchnopleure de la vesicule
ombilicale, et sont creuses de trois cavites: amniotique, exocoelomique (ou se
distingue deja le bourgeon allantoidien) et ectoplacentaire; ces deux dernieres
cavites sont separees par la lame ectoplacentaire. A ce stade pre-somitique, les
bourrelets neuraux representent la seule manifestation du futur embryon (stade
intermediate entre les stades 13 et 14 de la classification de Witschi (1962)).
Le trophoblaste d'un ovo-cylindre de
8 jours, regroupe trois lignees cellulaires
distinctes (Figs.
1 A, 2): (1) la partie superieure du cone formee de cellules qui
evoluent vers la forme geante (cellules geantes trophoblastiques I), (2) la partie
centrale formee de petites cellules polyedriques (cellules II), (3) la lame ecto-
placentaire constitute d'une assise de cellules prismatiques (cellules III).
Observations en
microscopie photonique
Quelques heures apres la mise en culture, le cone ectoplacentaire s'implante
sur le fond de la saliere et la cavite ectoplacentaire s'oblitere. L'ovo-cylindre
s'arrondit, determinant un etirement de la cavite dans le sens horizontal; de plus
la multiplication intense tout d'abord des petites cellules polyedriques puis des
cellules de la lame ectoplacentaire entraine la disparition de cette cavite.
Vers la 20eme h de culture, a la peripherie de la zone des cellules tropho-
blastiques II, se depose une substance anhiste presentant en microscopie optique
les memes caracteristiques que la membrane de Reichert (Fig. 1B).
Entre la 26eme h, le bourgeon allantoidien a atteint le centre de la lame
ectoplacentaire et les ilots sanguins apparaissent a la partie superieure de la
splanchnopleure de la vesicule ombilicale.
Apres
48 h de culture, les dimensions de l'ovo-cylindre ont double, et l'embryon

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dont le rythme cardiaque est de 100 a 150 pulsations par minute, a atteint un
developpement correspondant au stade 16 de la classification de Witschi (1962).
A ce stade, les cellules III provenant de la lame ectoplacentaire, et dont l'index
mitotique est eleve, sont au contact du mesoderme allantoidien deja partielle-
ment organise en capillaire (Figs.
3, 8). Dans quelques cas favorables, la vas-
0,1 mm

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cularisation allantoTdienne est suffisemment differenciee pour permettre une
circulation fonctionnelle, pendant quelques heures, dans le cordon ombilical.
Tout autour
de la masse des cellules polyedriques II, devenues tres nombreuses,
on retrouve
la substance anhiste qui separe deux formations trophoblastiques:
le groupe
des cellules I geantes et l'ensemble forme par les cellules II et III
(Fig. 1C). 11 se produit assez frequemment une rupture au niveau de ce depot,
ce
qui entraine alors l'elimination du groupe des cellules I geantes de l'ensemble
de l'ovo-cylindre. Dans
cet ensemble de cellules expulsees, la substance continue
a
se deposer, au contact de cellules trophoblastiques geantes et de petites cellules
plus sombres (Fig.
1C). On retrouve de telles cellules recouvrant le trophoblaste
de l'ovo-cylindre sous forme d'une assise superficielle, dans
le prolongement de
I'endoderme vitellin (Figs. 1C, C; 3).
Apres 65 a 70 h de culture, l'embryon presente un debut de rotation dans la
region des plis cephaliques et de la queue (forme dite en S) (Snell, 1941; Yama-
mura, 1968). Nous avons observe
un cas ou la rotation etait assez avancee, la
courbure de l'embryon prenant la forme d'un C. A ce stade de developpement,
les ilots sanguins recouvrent toute
la surface de la vesicule ombilicale. Les
cellules du mesoderme allantoidien s'insinuent entre les cellules trophoblastiques
III
(Fig. 8), les isolant en petits groupes, tandis que les cellules II situees im-
mediatement sous la membrane anhiste degenerent.
Fig. 1. Schema de revolution du trophoblaste au cours du developpement in vitro
d'embryons de Souris.
(A) Le trophoblaste d'un ovo-cylindre au 8eme jour de la gestation (stade du pre-
levement).
(B) Le trophoblaste apres 24 h de culture. On note la disparition de la cavite ecto-
placentaire.
(C et C) Le trophoblaste apres 48 h de culture. II existe toujours une substance
anhiste entre les cellules endodermiques et les differents groupes de cellules tropho-
blastiques. II se produit souvent une rupture au niveau du depot de la substance
anhiste (C). On observe aucune ebauche de formation du sinus endodermique.
|foV'ij£| groupe des cellules trophoblastiques geantes (cellules I)
|frj$££| les cellules trophoblastiques polyedriques (cellules II)
| mg | les cellules de la lame ectoplacentaire (cellules III)
| TTT | endoderme proximal de la splanchnopleure vitelline
| — | endoderme distal
|*a.-o. | mesoderme
| c | substance anhiste
I -*- I mesoderme allantoidien