Etude immuno-electrophoretique de F apparition

Etude immuno-electrophoretique de F apparition
progressive de quelques constituants caracteristiques
de Fadulte dans le foie embryonnaire du Poulet
par YVON CROISILLE1
Laboratoire d'Embryologie experimentale du College de France et du C.N.R.S.
DANS le cadre des recherches consacrees a l'etude de l'apparition des con-
stituants specifiques de l'adulte au cours du developpement embryonnaire, les
methodes immunochimiques ont trouve un emploi toujours grandissant pendant
les 15 dernieres annees. Le nombre de travaux, dont les principaux ont ete
recemment exposes (Croisille, 1958), permet de juger combien l'emploi de ces
methodes
s'est revele fructueux dans ce domaine. La plupart des auteurs ont
utilise les methodes immunochimiques classiques: reaction a l'interface, epuise-
ment des anti-serums, techniques de precipitation en milieu gelifie et reaction
de deviation du complement. Mais ces methodes ne permettent souvent pas,
malgre leur specificite et leur sensibilite, de denombrer et d'identifier correcte-
ment tous les constituants, surtout s'il
s'agit de l'analyse d'un melange complexe.
Aussi
y a-t-il des resultats contradictoires dus pour la plupart a des difficultes
techniques ou d'interpretation, notamment en ce qui concerne Pidentification
certaine des constituants embryonnaires et adultes.
Dans l'etude presente, nous nous sommes adresse
a une methode nouvelle,
la technique d'immuno-electrophorese de Grabar & Williams
(1953, 1955) qui
utilise
a la fois la migration electrophoretique et la precipitation specifique en
milieu gelifie. Cette methode permet done de caracteriser chaque constituant
d'un melange par une double definition,
sa mobilite electrophoretique et ses
proprietes immunochimiques.
Grace
a l'emploi de cette technique, nous avons pu suivre l'apparition pro-
gressive de quelques constituants caracteristiques de l'adulte dans
le foie de
l'embryon de Poulet.
MATERIEL ET TECHNIQUE
Preparation des extraits d'organes
Les extraits utilises dans cette etude proviennent d'organes preleves sur des
Poulets (adultes ou embryonnaires) de la race Leghorn blanc. Les foies preleves
1
Author's address: Laboratoire d'Embryologie experimentale du College de France, 49
bis
Avenue de la belle Gabrielle, Nogent-sur-Marne, France.
[ J. Embryol. exp. Morph. Vol. 8, Part 2, pp. 216-225, June 1960J

Y. CROISILLE 217
ont ete coupes en petits morceaux et laves dans du liquide de Tyrode. Ensuite,
ils ont ete broyes dans un mortier avec du sable jusqu'a obtention d'une masse
homogene. Le broyat a ete repris dans du liquide de Tyrode a la temperature de
5°C. dans les proportions suivantes: 1 cm.3 de Tyrode pour 1 g. de tissu, pour
le foie adulte; et 1 cm.3 de Tyrode pour 5 g. de tissu pour les extraits de foie
embryonnaire.
Apres centrifugation a 10.000 t.p.m. (environ 10.000 g.) pendant 15 k 20
minutes, l'extrait obtenu a ete maintenu entre — 10 et — 15° C. jusqu'a utilisa-
tion.
Preparation de V immunserum
Pour preparer le serum anti-foie adulte (SAF), nous avons injecte de l'extrait
de foie de Poulet adulte a 6 lapins males ages de 6 a 8 mois, au rythme de 2 a 3
injections par semaine. Chaque injection a ete partagee en 2 cm.3 par voie intra-
peritoneale et 1 ou 2 cm.3 par voie intraveineuse. Apres 3 mois, nous avons
preleve 15 cm.3 de sang par ponction cardiaque. Les serums des 6 lapins ont
donne un ring-test positif avec l'extrait de foie adulte. Cependant 3 lapins seule-
ment avaient produit un nombre satisfaisant d'anticorps. Le melange de ces 3
serums a ete retenu pour faire quelques etudes preliminaries. Apres un mois de
repos, les 3 lapins selectionnes ont recu 7 nouvelles injections en 15 jours. Le
serum recueilli 10 jours apres la derniere injection avait un pouvoir precipitant
et un nombre d'anticorps nettement plus eleve. Les resultats exposes dans cette
etude ont ete obtenus avec le melange de ces derniers serums. Le detail de la
progression de l'immunisation sera expose dans un prochain travail.
Techniques utilisees
Double diffusion en plaques de gelose
Nous avons effectue quelques essais en utilisant la technique de double dif-
fusion d'Ouchterlony (1948). L'antigene et l'immunserum liquides sont verses
dans des trous prepares dans une plaque de gelose; ainsi
les deux reactif s diffusent
librement dans le gel et, lorsqu'ils se rencontrent en proportions convenables,
forment une ligne ou bande de precipite. Mais il arrive que les lignes de precipi-
tation se superposent ou se dissocient, ce qui rend leur denombrement et leur
identification difficiles et souvent impossibles.
lmmuno-electrophorese
La methode de Grabar & Williams (1953) consiste a effectuer une electro-
phorese du melange a etudier dans un gel de gelose. Lorsque la dispersion des
constituants est jugee suffisante, on fait diffuser Pimmunserum perpendiculaire-
ment a l'axe de migration. Chaque constituant donnant une fine bande de pre-
cipite avec l'anticorps correspondant, on peut le definir par son emplacement
sur l'axe de migration. Le nombre de lignes ainsi obtenues correspond au

218 Y. CROISILLE — ETUDE IMMUNO-ELECTROPHORETIQUE
nombre minimum de constituants presents dans le melange. Nous avons utilise
cette methode dans les conditions experimentales suivantes:
— gelose a la concentration de 1 pour cent et sous une epaisseur de 3 a
4 mm.,
— tampon veronal sodique de pH 8,2 et
fx = 0,05,
— potentiel de 4 a 5 volts/cm.,
— duree de l'electrophorese:
3-} heures,
— distance entre l'antigene et l'immunserum liquide: 5 a 6 mm.
Les plaques sont maintenues en chambre humide a la temperature du labora-
toire et le developpement des lignes de precipitation suivi et surveille pendant
5 jours.
RESULTATS
Diffusion en milieu gelifie
En utilisant la methode de double diffusion d'Ouchterlony, nous avons obtenu
jusqu'a
5 zones de precipitation avec l'extrait de foie adulte. Leur denombrement
exact est cependant assez difficile; trois d'entre elles sont reellement nettes, les
deux autres sont plutot floues et semblent correspondre a la superposition de
plusieurs lignes. Les trois systemes principaux correspondent a un constituant
a diffusion rapide (X), un constituant a diffusion lente (Y) et un constituant a
diffusion moyenne (Z). Les lignes X et Y se forment avec l'extrait de foie adulte
et les extraits de foie de poussin de 5 jours, d'embryons de 17,14 et 10 jours. La
ligne Z correspond a un constituant qui apparait vers le
16
6me
jour de la vie
embryonnaire.
Immuno-electrophorese
Avec le melange de serum anti-foie adulte choisi, nous avons obtenu jusqu'a
16 lignes de precipitation distinctes pour l'extrait de foie de Poulet adulte. La
nomenclature que nous avons adoptee (Fig. 1) est basee sur l'emplacement des
lignes de precipitation en partant du pole positif (+) vers le pole negatif (—) de
l'axe de migration. Nous avons en outre tenu compte des positions relatives des
lignes les unes par rapport aux autres.
L'ordre d'apparition des differentes lignes est le suivant: tout d'abord se
forment les lignes A, C, D, E, E\ G (pendant les 20 premieres heures), puis
apparaissent les lignes B, E"', F, H, I (pendant les 20 heures suivantes). Les
autres apparaissent plus tardivement et assez irregulierement. Par leur position
les 16 lignes de precipitation observees semblent toutes correspondre a des
systemes precipitants differents. En outre, elles finissent presque toutes par se
croiser. La ligne F peut dans certains cas sembler correspondre a un dedouble-
ment de la ligne G, mais, si on prolonge la duree de l'electrophorese, elle peut
etre situee au niveau de l'intersection des arcs E et G, ce qui montre bien qu'elle
correspond elle aussi a un constituant distinct.

CHEZ LE POULET
219
La distribution et le moment d'apparition des differents constituants pendant
le de"veloppement sont resumes dans la Fig. 2
A, B. On voit que les constituants
A,B,C,D,EetG sont deja presents dans le foie de l'embryon de 6\ jours. Nous
avons effectu6 deux experiences avec de l'extrait de foie d'embryons de 5 jours,
Reservoir de l'anti_serum
I H G FE
Reservoir de depart du melange a etu__
_d'ier [exLrait de foie adulte.]
FIG. 1. Schema et nomenclature des lignes de precipitation
obtenues avec de l'extrait de foie adulte en presence de se"rum
anti-foie de Poulet adulte.
TABLEAU 1
Apparition progressive des constituants adultes pendant le developpement
embryonnaire
Constituants:
Stades
Foie adulte
Foie de poussin 5 jours
Foie embryonnaire 17-18 jours
,, 13-14 jours
8-9 jours
,,
6i jours
,, 5 jours
.
A
x
B
J
C
x
c
+
+
1
III!
D
x
D'
+
D"
1
1 1 1
1
1
+
E
|
E'
+
+
E"
III!
11
+
F
x
G
\
H
1111+++
I
et nous n'avons pu voir l'apparition que d'une seule ligne qui, par sa position,
pourrait correspondre au constituant E. L'absence de reaction ne demontre pas
l'absence des autres constituants. On peut penser plutot qu'a ce stade leur con-
centration n'est pas suffisante pour former un precipite. Ne disposant que d'une
quantite tres minime
de materiel a ce stade, nous n'avons pas pu concentrer
l'extrait.

220 Y. CROISILLE—ETUDE IMMUNO-ELECTROPHORETIQUE
Notons qu'aucune reaction n'a pu etre observee avec l'extrait de foie de
Souris adulte ou embryonnaire. Les constituants correspondants aux lignes de
precipitation observees, semblent done etre lies a l'espece etudiee ou au moins
a
la classe des Oiseaux. De nouvelles experiences devront etre faites avec des
extraits d'organes de Canard, par exemple, pour preciser cette question.
A l'interieur de l'espece, nous avons observe de nombreuses reactions avec le
serum et d'autres extraits tels que l'extrait de cerveau, d'intestin, de peau, de
mesonephros, de metanephros, de poumon et de coeur. Nous avons aussi note
des reactions avec
les jus d'embryons de 5 jours et de 3 jours et avec le jaune
d'oeuf
et le blanc d'eeuf.
Dans ce travail, nous n'etudierons que les reactions obtenues avec le serum de
Poulet adulte (SP). Comme le montre la figure 3, le serum de Poulet donne un
certain nombre de lignes au contact du SAF. En absorbant le serum anti-foie
adulte
par du serum de Poulet adulte (SAFISP), il ne reagit plus avec aucun
Reservoir de I'antLserum
FIG. 2A
FIG. 2 A, B. £tude comparative des extraits de foie de Poulet adulte et embryonnaire a diffe"rents
stades du developpement. Les rectangles paralleles aux axes de migration eiectrophoretiques
represented les reservoirs dans lesquels a ete verse" le serum anti-foie adulte. Les lignes de
precipitation n'ont e"te" figure"es que d'un seul cote pour eviter de surcharger les schemas qui sont
donnes en grandeur reelle.
(a) Foie de Poulet adulte: en presence de serum anti-foie on obtient 16 lignes de precipitation
distinctes. (Pour la nomenclature, voir Fig. 1.) La plupart de ces lignes se croisent, ce qui montre
que les constituants correspondants n'ont aucune parente immunologique.
(b) Foie de poussin de 5 jours: on observe 11 lignes. En dehors des arcs S et S', il manque les
arcs D', D" et E".
(c) Foie d'embryons de 17-18 jours: on note la presence de 9 lignes. II manque les arcs S, S', C,
D', D", E et E".
(d) Foie d'embryons de 13-14 jours: il manque les arcs 5, S', C", D', D", E', E" et H.