2016-2017 Physiologie bactérienne Biologie des Procaryotes et des Virus – UE : –VII Transcription Pas d'annexes Semaine : n°10 (du 07/11/16 au 11/11/16 Date : 09/09/2016 Heure : de 8h009h00 Binôme : n°34 Professeur : Pr. Romond Correcteur : n°5 Remarques du professeur : pas de remarque PLAN DU COURS TYPE DE PLAN DE COURS : I) Nutrition : II) Croissance : III) Métabolisme : A) Réplication B) Transcription 1) ARNm : Cours précèdent : On a fini la réplication d'ADN avec les deux systèmes unidirectionnels qui concernent plutôt les chromosomes et le système diplasmique, c'est a dire en cercle roulant. Par ailleurs, on avait envisagé la réplication rapide, c'est à dire, qu'on avait une réplication se met en marche avant même que nous avions fini de faire deux nouveaux corps microbiates. 1/12 2016-2017 I) Physiologie bactérienne Métabolisme : A) Transcription : Cette transcription ne va pas être du tout régulé comme est régulé le système eucaryote. Parlons du système intron-exon : On aura pas de régulation possible par des zones qui ne sont pas transcrites. Tout va être transcrits, effectivement, en dehors d'une partie des zones promotrices. Et c'est à ce niveau là que l'on va voir une grande partie des régulations. De façon comparable aux eucaryotes, on a va trouver un ARN avec ses bases qui vont être : – Uracile – Cytosine – Guanine – Adénine => Il nous manque la Thymine puisqu'elle va être remplacée par l'Uracile. Pour l'instant, en terme d'acides nucléiques, nous sommes sur les mêmes schémas que l'on connait : ➔ On a 3 ARN dans une cellule microbienne même si on a pas de membrane nucléaire. Donc c'est 3 ARN vont se retrouver en particulier pour l'ARN ribosomal (ARNr) à des concentrations variables dans la cellule en fonction des besoins en traduction : ➢ ARN messager (ARNm) ➢ ARN de transfert (ARNt) ➢ ARNr 1) ARN messager : Architecture : C'est à ce niveau que va se trouver les zones permettant la régulation de la transcription. On verra que la transcription une fois qu'elle déclenche est associé à la traduction. Premier schémas : 2/12 2016-2017 Physiologie bactérienne On se retrouve avec un énorme polypeptide après avoir fait un énorme ARNm avec plusieurs protéines qui sont synthétisées en même temps. Il va falloir contrôler l'énergie qu'on met à disposition pour éviter que l'on consomme trop d'énergie. En avant de cette énorme séquence polypeptide, on va trouver une séquence de tête qui sera donc traduite (correspond à 25-150 bases) et qui sont en partie 5'. (= Séquence de tête au niveau de l'ARNm qui va être transcrite) On a ensuite l'ARN codant pour le polypeptide et on a en extrémité 3' une séquence de queue qui elle même ne sera pas traduite. (on a la transcription mais dans cette énorme structure d'ARNm, deux structures qui ne sera pas traduites) Si on part de notre ADN et qu'on a la structure double brin (on a le 5' → 3') Le 3' va servir de brin matrice puisqu'on va avoir un brin d'ARNm qui lui même sera de 5' vers 3'. Dans cette zone on va se trouver avec une première partie, qui va correspondre à la zone promoteur, qui elle même n'est pas transcrite. Ensuite on à la séquence de tête et donc c'est la séquence complémentaire. Ensuite on arrive à cette séquence qui va correspondre à l'ensemble du polypeptide, qui sera donc traduit au moment où on enclenche le système. Et on a donc notre séquence de queue (=séquence de pause). Et donc on trouve la séquence complémentaire à ce niveau. Une fois qu'on à l'architecture, comment se met en place le système de détection du démarrage de la transcription ? Système de détection de démarrage de la transcription : Il faut un signal qui se trouve en amont de chaque polypeptide à transcrire et qui soit relativement homogène, qui sont les bactéries. Ce qu'in va parler concerne E.Coli (mais pas universel pour l'ensemble des bactéries) : Sur l'ADN : En -1 sur la zone promoteur on a le site de liaison de l'ARN polymérase. En -35, on avait 6 bases qui sont relativement homogènes avec de la répétition donc on a le site de reconnaissance au niveau du coté 5'. Et c'est à ce niveau là, que l'on va avoir un travail d'induction ou de répression. Il faut pour réguler une transcription, empêcher ou la favoriser. Il faut donc bien jouer sur le site de reconnaissance de liaison de l'ARN polymérase. Sur ce site de liaison qui va être important : ➔ La boite de Pribnow : On va retrouver une séquence TATAAT qui est célèbre. C'est une zone qui est consensus pour une fois chez les procaryotes. Ca permet quand on va faire une séquence d'ADN eucaryote de sur le site de liaison TATAAT, par rapport à un ARN, d'anticiper sur a probabilité d'une zone polypeptide. 3/12 2016-2017 Physiologie bactérienne Sur l'ARN : Séquence consensus de Shine-Dalgano (5'-AGGA-3'). Elle se situe dans cette séquence de tête. On a ensuite un codon d'initiation (=AUG) D'un point de vu structure, une première zone qui permet d'activer la transcription. Une fois que la transcription, débute, on a un morceau d'ARN qui va commencer à être synthétisé. Quand on arrive sur la synthèse de cette structure, on initie la traduction. Donc à peine que l'on ait démarré les premiers codons, après le codon d'initiation, que l'on aura une traduction qui va se mettre en jeu. D'où dans l'environnement de la zone transcrite, le besoin d'avoir les ARNt et les ARNr. Une fois qu'on a cette structure, comment va se mettre en place ce système ? On a besoin : – d'un ARN polymérase dans l'environnement direct de ce brin qu'on a commencé à transcrire. – Il faut les ATP, GTP, EDP et les CTP de façon à pouvoir commencer à faire la transcription, à partir du brin matrice. – Ensuite, il va falloir également, de l'ARNr puisqu'une fois qu'on débute notre ARNm, on va avoir besoin de traduire tout de suite. Donc ça nous donne un système, où si on imagine un ADN super enroulé, on va zoomer partiellement la zone à transcrire pour pouvoir positionner notre ARN polymérase. Donc on a compris que c'est ici que s'est passé, avec la zone de liaison, le démarrage et la boîte TATAAT. Et si on imagine que notre polymérase s'était ajouté ici, on s trouve avec ensuite le début du brin. Donc la polymérase continue d'avancer.. On va pouvoir avoir un système qui explique que l'on aura une partie N-terminale et C-terminale qui vont indiquer quel est le sens de transcription. Et par déduction, pouvoir, sur un ARNm remonter à un ADN complémentaire (= c'est ce qu'on fait lorsqu'on fait un séquençage à partir de l'ARN) Donc il faut bien à un moment donné qu'on arrête, puisqu'on a vue qu'on avait déclenché le système par la reconnaissance de la liaison. Il a fallu avoir eu une légère ouverture pour pouvoir avoir le positionnement de cet ARN. Et donc à un moment donné faudra s'arrêter. Et donc on à la séquence complémentaire de la séquence de pause de l'ARN. 4/12 2016-2017 Physiologie bactérienne Comment va se mettre en place le système ? Arrêt de l'ARN polymérase : La séquence terminatrice va coder pour un ARN qui lui même va être de séquence répétée mais complémentaire, de façon de pouvoir créer une épingle à cheveu. Ca va permettre sur cette zone là, on a une (proton??) ou un entré très vite dès qu'on a démarré la synthèse de l'ARN sur cette partie là et bien on va avoir une boucle en état gazeux qui va se créer naturellement. Cette structure va jouer l'attachement de la polymérase (durée : milliseconde). Cette encombrement sur le brin d'ARN va ralentir d'abord l'ARN polymérase. Il faut, pour obtenir l'arrêt total, des éléments complémentaires : Il y a deux possibilités : • Premier mécanisme : Derrière cette épingle à cheveu, il y a un code qui va permettre d'obtenir sur l'ARNt 6 uridines. Ces 6 uridines devraient permettre l'arrêt complet de l'ARN polymérase. (cas des bactéries). Lorsqu'on va vouloir récupérer les ARNm, comme l'uridine est complémentaire de l'Adénine sur le brin d'ADN, il suffit de chercher les zones poly-A pour savoir où on s'arrête. Lorsqu'on veut le faire à partir d'une cellule eucaryote, une recherche des ARNm, on fait de la transcription inverse. Donc on obtient l'ADN complémentaire. Et donc on va pouvoir accrocher les PolyA, donc on a la queue poly-A qui permet de dire qu'en amont on avait de l'ARN. • Deuxième mécanisme : C'est la présence de protéine particulière : le facteur Rho qui suit la polymérase qui au moment de la création sur l'ARN de cette épingle à cheveu, va venir taper la polymérase. C'est un accident d'embouteillage et donc on la polymérase qui est arrêtée. Une fois qu'on a cela, on se dit qu'on va pouvoir rentrer en transcription et derrière la traduction, sauf que comme on a un polypeptide qui peut correspondre à 4-5 (ou plus) protéines : On appelle cela, cluster de gènes qui vont être transcrits et traduits en même temps. Cela consomme de l'énergie. Les bactéries qui sont les plus capables de gérer leur énergie et celles qui vont avoir un avantage écologique. (population qui s'adapte) => On a une variabilité qui est toujours possible. 5/12 2016-2017 Physiologie bactérienne Multiplication du nombre de bactéries par système de répression : Nous sommes en physiologie bactérienne, et pour faire multiplier des bactéries, il faut leur apporter des substrats. Quand on a pas de substrats A mais un substrat B : Exemple du glucose : Si j'ai que du lactose dans le milieu de culture et pas de glucose directement accessible. Il faut bien trouver le moyen d'aller chercher le glucose qui est dans le lactose, si j'ai les compétences pour. Si je n'ai pas les compétences, je ne puiserai pas de molécules. Par contre si j'ai les capacités, on a un code qui va permettre de synthétiser une galactosidase. On peut donc aller chercher dans le lactose, le glucose qui nous intéresse. Si je passe d'un milieu qui n'avait que du glucose , on a pas besoin en tant que bactérie de synthétiser la galactosidase. => Donc il faut bien être capable d'induire la production du galactosidase que si il y a du lactose. Donc ce qu'on envisage, c'est les répressions et les inductions de la synthèse de toutes ces protéines qui sont dites inductibles. – Commençons par le répresseur : c'est la régulation métaboliques : Il faut avoir un système de capteur qui va reconnaître la conformation de la molécule de lactose. De quoi on a besoin ? En amont, de la zone qui va coder pour ces enzymes que j'aurai besoin quand j'aurai le substrat, on a ce qu'on appel, une zone dite répresseur (R). Puis plus loin sur mon ADN, on va se retrouver avec la zone promoteur et ensuite la zone codante. Sur la zone promoteur, c'est la qu'on a notre site de liaison de l'ADN polymérase. Si j'ai mis un système qui bloqué à ce moment la, la polymérase est bloqué et donc on va avoir un répresseur actif. Ce répresseur est actif parce qu'il a une conformation donné. Donc quand il n'y a pas de lactose, il vient bloquer le promoteur (=opéron lactose) qui vient bloquer ce système. Donc rien fonctionne. Donc on va maintenant apporter du lactose dans le milieu. 6/12 2016-2017 – Physiologie bactérienne Apport du lactose dans le milieu : Deux système : ➢ C'est le répresseur actif qui va reconnaître le lactose et on va ensuite le rendre inactif, une fois qu'il a reconnu le lactose. Donc apporte le lactose et ensuite on ne peut plus bloquer la zone opéré.(promoteur et opérateur). Donc on va bloquer la liaison. Donc le répresseur à sauter et on rentre en transcription. => Au départ on a un répresseur actif qui a une conformation qui est adapté à la zone de l'opéron et du coup on a le répresseur qui vient bloquer la liaison de l'ARN polymérase. On apporte dans le milieu de culture du lactose, est capable de venir se fixer sur le répresseur. En se fixant, il change de configuration, la conformation devient suffisamment différente pour ne plus être capable de fixer sur l'ADN. Et à ce moment là, on a de la place pour l'ARN polymérase. (On a donc une enzyme inductible avec un répresseur actif) – Ensuite on a l'autre système : On a le mécanisme de gène avec un répresseur inactif et qui va devenir actif lorsqu'on va avoir suffisamment de produit. La on est dans un premier modèle où c'est la présence du lactose qui va induire la synthèse. (Il n'y a pas de rétro-contrôle possible : tant qu'il y a du lactose, on continuera de produire). Dans certain système de régulation, ce n'est pas comme ça que ça fonctionne : Ca va être plutôt le substrat secondaire, qui est très complexe à produire, qui va être en concentration suffisant. Celui qui va être actif, qui va modifié le répresseur. => On a donc au départ un répresseur inactif, le métabolite de notre activité enzymatique qui va être le court répresseur. Système inactif au départ, pas de possibilité de ce mettre en place. Et on a une transmutase. On va donc produire l'acide aminée nécessaire pour produire la protéine. A un moment donné, on a suffisamment de protéine. On va continuer de faire cette acide aminée alors qu'on en a plus besoin. A ce moment là, comme la concentration va augmenter, on va avoir le corépresseur qui va modifier la conformation. Et là, on va avoir une conformation qui va venir bloquer le système. Et on aura de la place pour l'ARN polymérase. => C'est le système général : Ca veut dire qu'on va se retrouver en face de répresseur protéique et ça, ça va nous intéresser pour la sensibilité aux antibiotiques. (Une des possibilités de résister aux antibiotiques est de produire des Bêta-Lactamases. Et ces Bêta-Lactamases sont également régulables). On s'intéresse actuellement plus nécessaire à des produits qui vont être directement actif sur la bactérie. Il faut arriver a travailler sur le répresseur pour pouvoir essayer de moduler ces répresseurs pour contrôler ce que nous voulons au final comme type de production. 7/12 2016-2017 Physiologie bactérienne Modulation des systèmes de répression : Nous avons donc un système qui est parfait : on a des gènes qui vont être inductibles donc vont dépendre de répresseur inactif donc ça va être un système de réduction .Sauf que c'est très consommateur encore. Imaginons, dans notre premier système, tant qu'on a du lactose, on va produire produire produire du Bêta galactosidase, du coup on va consommer de l'énergie pour faire une enzyme, qui ne sert à rien si on a en plus du glucose dans le milieu. Donc on s'aperçoit que non seulement on avait une modulation et c'est modulation peut être encore modulées. ➔ Premier système de modulation : On a les système de répressions simples : Répression-Induction. On va pouvoir s'apercevoir qu'on va pouvoir moduler les systèmes qui sont déjà néo-répresseurs : répresseur actif et inactif. • La première possibilité, c'est que notre système inductible (=Répression Métabolique) sur un système dite croissance diauxique. C'est donc mon hypothèse où on a nos 2 substrats. Le fait qu'on veut avoir une production de galactosidase que quand je n'aurai plus du glucose dans le milieu. Donc répression métabolique et donc avec le contrôle positif des molécules d'opérons. => Ca vient moduler notre système de Répression-Induction Reprenons notre opéron lactose : On a un répresseur actif qui allé être modifié par le fait du lactose présente. On ne bloque donc plus rien. Et suite à cela, on doit être en transcription. Et si on a du glucose, on va se trouver en face de la nécessité de stabiliser l'ARN polymérase en face d'une autre protéine. Apparition d'une nouvelle protéine activatrice du catabolisme : CAP. Fonctionnement du CAP : Cette protéine pour être efficace, va dépendre de la concentration en AMP cyclique (AMPc). L'AMPc : C'est la structure qui va permettre un grand nombre de réactions enzymatique : c'est un apport d'énergie. Cet apport d'énergie va être très bas lorsqu'on a du glucose. Du coup le glucose n'a pas besoin de transport actif, va rentrer dans la cellule, va être divisé par des réactions enzymatiques. Pour que ces enzymes soient efficaces, ils vont utilisés l'AMPc. Donc en intracellulaire, dans le milieu de culture, logiquement notre AMP cyclique est bas parce qu'il y a une utilisation. 8/12 2016-2017 Physiologie bactérienne C'est la qu'on va retrouver avec CAP inactive. Elle ne va pas pouvoir venir se fixer. Et c'est la qu'on voit qu'il y a une nouvelle régulation. Parce que en faite, pour synthétiser l'ARN polymérase, il faudrait que la CAP. Donc il faut que l'ARN polymérase ait de la place mais qu'il y a un petit système d'accroche qui permet de rester accroché à l'ADN pour pouvoir trans-loquer. => Donc tant que on a une consommation d'énergie de l'AMPc, la CAP ne peut pas venir se mettre sur la zone de l'ADN et on ne peut donc pas stabiliser l'ARN polymérase. Donc on ne va pas avoir de transcription. Dans la répression métabolique ce qu'on oublie, c'est un système qui applique deux systèmes, deux protéines : on a bien notre répresseur actif lequel, il a été modifié par le lactose. Mais c'est quand on a du lactose ET du glucose qu'on voit la différence : logiquement l'ARN polymérase peut fonctionner, mais dans certain cas, il faut un système d'accrocher dans certaine zone de l'ADN. => Donc ce n'est pas vrai dans l'ensemble des systèmes inductibles, ça va dépendre un petit peu du besoin de la bactérie, des métaboliques concernés. Et la on est en face du métabolisme principale : le glucose. C'est vraiment le nutriment principal, sans lequel on arriverait pas à faire fonctionner un système cellulaire. Il faut absolument s'adapter, sinon on est en épuisement d'énergie sans arrêt. Donc on fait de l'épargne, et cette épargne ne peut se concevoir qu'avec un deuxième système puisque la case vide de l'ARN polymérase peut pouvoir fonctionner. Et si elle ne fonctionne pas, pourquoi ? Parce qu'on ne la pas stabiliser et donc ne peut pas démarrer son système. => Il faut stabiliser l'ARN polymérase. Qu'est ce qui se passe lorsque le Glucose est consommé ? A ce moment la, on a l'AMPC cyclique qui modifie notre CAP et la on a de la place pour notre ARN polymérase et ensuite commencer son travail. => Dans un milieu où on a des charges (un nutriment comme le glucose), on aura pas de production de Galactosidase même en présence de lactose. C'est un double système, on oublie toujours qu'on a notre répresseur actif qui est devenu inactif et donc qui à libéré de la place. Il faut en plus on a suffisamment d'AMPc car il n'est pas consommé par l'utilisation du glucose. Rmq : Ce n'est pas le glucose lui-même qui modifie la conformation de la CAP, c'est bien le résultat de la présence du glucose qui va moduler. A partir du moment que le glucose est là, il consomme de l'énergie. C'est l'AMPc qui va être le régulateur final. En culture bactérienne : La croissance diauxique. On va se retrouver avec des croissances de cet ordre assez fréquemment lorsqu'on va s'attacher à des métabolismes principaux. 9/12 2016-2017 Physiologie bactérienne → Si on est en biomasse, ce qu'on observe c'est un premier phénomène de croissance, ensuite un deuxième phénomène de croissance. ( donc on a une phase de latence, une phase de croissance, une phase stationnaire, une phase de croissance, une phase stationnaires,...) → Si on regarde du coté de la consommation en glucose. On s'aperçoit que le glucose est en phase de latence puis s’effondre. → Si on regarde le lactose qui était présent dans le milieu : il ne va s'effondrer plus tard.. La croissance diauxique : c'est la croissance dans laquelle où on a mis dans le milieu de culture deux substrats dont le glucose et on s'aperçoit qu'on utilise d'abord le glucose puis ensuite le lactose. Pour utiliser le lactose, il faut avoir une galactosidase. Donc ça veut dire qu'a un moment donné on va retarder la production du galactosidase parce qu'il y avait du glucose. On l'utilise depuis 100 ans, dans le milieu de Kigler : c'est un milieu dans lequel on a du glucose et du lactose avec un rapport très favorable au lactose. Lorsqu'on va faire ensemencement de notre antéro-bactérie (E.coli en particulaire), on va commencer par faire un ensemencement par piqure dans la gélose, et donc nos bactéries vont être déposé. Ensuite, on va se répartir sur la tranche. Donc on va avoir des bactérie sur la tranche et des bactéries en profondeurs où on a une double population. 10/12 2016-2017 Physiologie bactérienne Qu'est ce qu'il va se passer? On va incuber pendant la nuit (18h-24h) et on revient le lendemain et on regarde le mirage parce qu'on part du principe qu'on allait regarder le comportement de bactéries aéro-anaérobies. Il y a des expressions des galactosidases qui sont plus ou moins rapides. – Etape 1 : Pendant la nuit, on aurait un mirage par utilisation du glucose quelque soit l'antéro-bactérie. Tout le monde a utilisé le glucose car ne demande pas d'énergie particulière. Et une fois que le glucose est entré dans la bactérie, elle va être utilisé pour faire une série de réaction, et en particulier produire des acides qui vont donner lieu à un mirage du pH. Et comme on a un colorant qui est sensible au pH, on va avoir notre tube complet en jaune. – Etape 2 : Le matin à 8h00 du matin, on aura des bactéries qui vont garder ce jaune et donc qui vont venir faire du rouge-jaune au niveau de la zone où on a le plus de bactérie : En profondeur. Cela veut dire que en profondeur il n'y a pas de galactosidase. Et donc production d'amine et le pH va augmenter. (rouge) Rmq : Si on a une galactosidase, on a une croissance de diauxique (le matin) : c'est le groupe jaune-jaune. Au départ cette compétence de bactérie à utilisé le glucose puis le lactose. Et on a compris ultérieurement ce qui se passait lorsqu'on allait regarder les répresseurs. La possibilité de produire du galactosidase, ça été très important au niveau pathologique parce que c'est la différence entre E.coli et Shigella. C'est le même type de bactérie, même ADN sauf que c'est sur ce rétrocontrôle là qu'il y a une modification et donc on est dans ce qu'on appel du lactose+lent : il faut attendre plus de 2448heures..(Donc par rapport a E.coli, très long pour produire du lactose). => Au niveau physiologie, c'est à dire de l'adaptation de la bactérie à leur environnement nutritionnel ce que cela veut dire en terme de régulation. On est pas dans une adaptation génétique. 11/12 2016-2017 Physiologie bactérienne ➔ Deuxième système de modulation par Répression-Induction : On a le phénomène du répresseur actif mais on peut aussi avoir le répresseur inactif qui devient actif a partir du moment où il y a sont co-répresseur. C'est ce deuxième système que l'on va regarder qu'on appel, l'atténuation. Le soucis, ça va être de se dire que si on prend un acide aminée : le Tryptophane. Pour faire du tryptophane, il faut 5 gènes de structures, 5 enzymes de la boite de synthèse des acides aminées. Il falloir que je dépende de la concentration en tryptophane, mon système commence à ralentir au moment où on a un répresseur inactif qui rencontre l'excès du tryptophane. Ce dernier va le rendre actif et va venir arrêter par encombrement l'ARN polymérase. Sauf que pour faire du tryptophane, on en a besoin lorsqu'on a besoin de faire de la protéine. Si on a du tryptophane dans le milieu du culture, on a juste besoin d'enzyme qui vont dégradé l'apeptone pour pouvoir avoir du tryptophane : donc on peut générer du tryptophane sans devoir faire la synthèse du tryptophane. Le tryptophane on en a besoin lorsqu'on a besoin de produire des protéines. Mais si on nous fournis une protéine dans lequel on a déjà des protéases efficace, on va générer du tryptophane et pouvoir ensuite l'utiliser. Donc la régulation ne sera pas uniquement liée à la concentration du tryptophane mais va être liée au niveau d'activité de synthèse protéique qui va exister dans la bactérie. En fait le principe est de se dire, il faut atténuer le phénomène, c'est à dire, avoir un système qui va être plus précis que simplement la concentration du tryptophane. Donc on va être obligé de prendre en compte, non seulement : – le répresseur protéique, – la concentration, – le degré d'activité de synthèse. Un degré d'activité de synthèse mobilise des ribosomes. => Donc le principe du jeu, va être dépendant d'une nouvelle structure : Le taux de ribosome est donc leur capacité d'atténuer la zone opéron. Rmq : On va avoir dans la séquence de l'ADN, des charges qui vont permettre de réguler de façon plus précis le système. 12/12