Génie Génétique 1

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GÉNIE GÉNÉTIQUE
PARTIE I : GÉNIE GÉNÉTIQUE 1
CHAPITRE I : L’ADN ET LES ENZYMES
Au cours de cette partie nous allons voir l’isolement d’ADN source, les ADNg et c, les enzymes de restriction et de modification,
et visualiser l’ADN
I – L’ADNG
Pour extraire de l’ADN génomique, il faut :
• Casser les cellules. Pour étudier l’ADN, la purification doit se faire en essayant le moins possible de casser celui-ci. Pour
cela, on n’étudie pas une mais des dizaines de milliers de cellule.
• Séparer l’ADN des fragments de membrane et de protéine via extraction phénolique. Ceci est nécessaire pour séparer
les acides nucléiques hydrophiles des protéines hydrophobes, en créant une interface de phénol (parfois avec du
chloroforme). Ces protéines sont :
o DNA polymérases / RNA polymérases
o DNAses / RNAses (spécifique simple ou double brin)
o Exonucléases / Endonucléases
• Concentrer l’ADN par précipitation alcoolique, qui déshydratera les acides nucléique. Le sel peut favoriser cette
réaction.
• Analyser l’ADN resuspendu dans de l’eau pour ouvrir une gamme de manipulation. Dans de l’EDTA, on peut le
conserver.
II – L’ADNC
L’ADN complémentaire est une réverse transcription de l’ARNm, utilisé chez les Eucaryotes car plus significatif que l’ADNg
(lequel possède des introns et donc, sa séquence n’est pas identique à celle de l’ARNm obtenu). L’ADNc est double brin. Pour le
fabriquer :
- Réverse transcription avec une Reverse Transcriptase. On a besoin pour cela d’une amorce, de magnesium, et de nTP,
car elle fonctionne comme une DNA polymérase. L’amorce est un Poly-T, qui se liera ainsi facilement au Poly-A de
l’ARNm. On obtient ainsi un hybride ARN/ADN.
- Utilisation d’une RNAse H, exonucléase générant des 3’OH.
- Utilisation d’une DNA polymérase pour détruire le brin d’ARN et synthétiser de l’ADN par-dessus.
Le résultat obtenu est un ADNc double brin, mais avec un bout d’ARN au début. Si on veut vraiment en avoir un complet, au lieu
de la RNAse H, on peut utiliser des oligonucléotides connus et leurs complémentaires, avant de digérer et synthétiser : c’est plus
cher et plus chiant.
III – LES ENZYMES DE RESTRICTION
Ce sont des enzymes qui coupent l’ADN sur des sites de restriction spécifiques. Ces sites sont palindromiques pour la plupart.
Certaines enzymes font une coupure avec des bouts francs, d’autre laissent des extrémités 5’ sortantes ou 3’ sortantes qui sont
dites cohésives lorsqu’elles peuvent ainsi adhérer à un autre site. Ces extrémités cohésives ne sont pas forcément compatibles ;
on aura besoin de grignoter ou de polymériser.
Pour cela, existe des enzymes clés :
• Les kinases (ajoutent un P)
• Les phosphatases (enlèvent un P)
• L’enzyme Klenow (DNA polymérase + 3’ exonucléase  sous fragment de la DNA polymérase)
• La T4 DNA polymérase

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Il faut prévoir à long terme pour utiliser la meilleure enzyme.
CHAPITRE II : LE CLONAGE
I – POURQUOI LE CLONAGE ?
Le clonage permet de produire un ADN en de très grandes quantités. Il consiste en l’insertion d’un fragment d’ADN dans un
vecteur de clonage  on obtient un plasmide recombinant formé d’ADN appartenant à deux espèces différentes.
Pour cloner, il faut :
- Isoler l’ADN à cloner (via des enzymes de restriction)
- Choix d’un vecteur de clonage en fonction de l’ADN
- Linéarisation du vecteur par la même enzyme
- Insertion de l’ADN  on obtient un plasmide recombinant
- Propagation dans la cellule hôte
- Sélection des bactéries l’ayant intégré
Les vecteurs doivent être capable de réplication autonome dans la cellule, posséder un polylinker ou site multiple de clonage, et
supporter l’insertion d’un fragment d’ADN plus ou moins grand.
 Plasmide bactérien : limité à 20 kB
 Phage λ : limité à 25 kB
 Cosmide (Plasmide qui possède le site COS) : limité à 45 kB
 PAC (chromosome artificiel de phage) : limité à 100 kb
 BAC (chromosome artificiel de bactérie) : limité à 300 kB
 YAC (chromosome artificiel de levure) : limité à 1000 kB
III – LE PLASMIDE BACTÉRIEN
Les vecteurs les plus utilisés sont les plasmides trouvés dans les bactéries, en général circulaires. Y’en a 1 à quelques centaines
par bactérie. En règle générale, on y trouve de l’ADN sous forme circulaire DL (double brin) et ils possèdent :
- Une origine de réplication (ori). Sa réplication est donc indépendante de celle du chromosome. Ce site est spécifique
selon l’hôte et régule le nombre de copies (Plasmide F = 1 par bactéries ; PIJ110 = 40 à 300 par bactéries).
- Un polylinker qui permet de cibler l’insertion d’un fragment dans un vecteur (se fait en phase avec une étiquette
« Tag »). Le polylinker réunit plusieurs sites de restriction, uniques dans le plasmide.
- Un ou plusieurs gènes de résistance à un antibiotique
- Parfois LacZ codant pour la β-gal.
Lorsque le plasmide est recombiné, il faut procéder à une ligation de fragments qui doivent être compatibles. Des phosphates et
de l’ATP sont nécessaire.
La phosphorylation du vecteur empêche la recircularisation
IV – LA TRANSFORMATION
Processus qui permet à la bactérie de capturer directement de l’ADN qu’on a fait entrer dedans. La capacité à faire ça,
transitoire, est nommée état de compétence.
L’ADN transféré doit posséder un marqueur de sélection que la bactérie n’a pas. Pour transformer les bactéries on fait un choc
thermique (bactérie au froid puis subitement au chaud, dilatant ainsi les lipides de la membrane pour faire entrer l’ADN) ou pas
une électroporation.

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Si on veut que le gène cloné puisse s’exprimer dans une bactérie, il faut :
- Pour les procaryotes : que l’intégralité du gène, promoteur compris, soit cloné.
- Pour les eucaryotes : utiliser un vecteur d’expression contenant un promoteur en amont du site, et cloner l’ADNc.
Au-delà des bactéries, on pourrait utiliser d’autres systèmes (levure, champignons, cellules animales) mais malgré leurs
avantages (modifications post-traductionnelles plus poussées et stabilité accrue) il y a des inconvénients comme la complexité
du milieu de culture et la plus grande fragilité des cellules.
V – ISOLATION D’UN FRAGMENT D’INTÉRÊT
Tout ça c’est bien, mais comment isoler le fragment d’ADN que je veux ? Pour cela, on a plusieurs types de clonage :
- Si on connait la fonction du gène porté par le fragment : Clonage fonctionnel
- si on connait un gène homologue, un fragment du gène, un ou une fraction de messager correspondant : Clonage par
hybridation ou Clonage par PCR
A] LE CLONAGE FONCTIONNEL
Il faut que les fragments clonés s’expriment : chez les procaryotes, il n’ya pas d’introns, on peut donc y aller directement en
faisant un clonage complet du génome ; pour cela, une digestion partielle de l’ADNg suivi d’un clonage est nécessaire, le fait de
digérer partiellement augmentant la probabilité d’avoir le gène complètement, avec son promoteur.
Chez les Eucaryotes en revanche, il faut cloner l’ensemble des ADNc, c’est donc un peu plus dur.
Quoi qu’il en soit, on obtient ainsi une banque, ensemble des clones correspondants au génome. Si le vecteur d’expression
contient un promoteur, on parlera de « banque d’expression ». Il faut maintenant transformer les bactéries (ou transfecter s’il
s’agit de cellules eucaryotes) avec tout les clones, puis imaginer un test qui permettra de repérer les bactéries contenant la
fonction voulue.
B] LE CLONAGE PAR HYBRIDATION
La base est pareille : il faut fabriquer une banque d’ADNg ou d’ADNc. Dans le cas d’un ADNg, on va d’abord procéder au choix de
l’enzyme utilisée pour construire la banque à l’aide d’un Southern blot.
La technique du Southern Blot part d’un constat : chaque brin d’ADN peut s’apparier avec son complémentaire inverse. On n’a
donc plus qu’à fabriquer des brins d’ADN marqués radioactivement, et reproduire les conditions d’un appariement, pour
détecter ainsi le brin voulu. Ces fragments sont des sondes. La taille des sondes n’a aucune importance.
Pour fabriquer une sonde, on peut fabriquer un oligonucléotide et marquer son extrémité au phosphate. Sinon on part d’un
fragment d’ADN homologue à notre gène d’intérêt et on réalise un marquage selon une des 4 techniques suivantes :
 Marquage aux extrémités via remplissage
 Nick-translation (translation de coupure) : consiste à faire des cassures sur l’ADN avec des DNAses, et de mettre ensuite
des polymérases en présence de dxTP marqués. Au final, le brin sera donc marqué aux différents endroits de coupure.
 Random priming (initiation aléatoire) : consiste à dénaturer l’ADN par chauffage, donnant de l’ADN sous forme SL
(simple brin). On va ajouter des amorces aléatoires en excès pour empêcher le réappariement, et ensuite on peut
envoyer une polymérase avec des dXTP marqués. Tout le brin sera alors marqué.
 Sondes ARN SL : on peut également faire des sondes d’ARN simple brin, en utilisant ici un fragment d’ADN cloné dans
un vecteur possédant des promoteurs de phages. On ajoute ensuite des RNA polymérases phagiques avec des xTP
marqués pour fabriquer ainsi l’ARN simple brin marqué.
Notre sonde préparée, on peut maintenant réaliser le Southern Blot. Cette technique nous permettra, à l’aide de la sonde, de
révéler l’ADN voulu. Il faut :
- Préparer l’ADN et le digérer par enzyme de restriction.
- Le faire migrer sur PAGE (gel d’électrophorèse de polyacrilamide).
- Faire tremper ce gel dans une solution alcaline (soude) pour dénaturer, et neutraliser ensuite la solution.
- Placer le gel sur une éponge, l’éponge dans une solution saline, et mettre une membrane de nitrocellulose sur le gel,
suivie de serviettes en papiers pour faire pression et permettre à l’ADN de se transférer sur la membrane par capillarité.
- Faire une fixation covalente de l’ADN à la chaleur.

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- Préhybrider avec des acides nucléiques, pour empêcher que la sonde que l’on va mettre ne se fixe de partout.
- Hybrider avec la sonde, dans un sac hermétique.
- Rincer et éliminer le surplus de sonde.
- Faire une autoradiographie pour repérer les fragments marqués.
Dans le cas de l’ADNg, pour construire une banque, on choisit l’enzyme en fonction des résultats du blot pour avoir le moins de
fragments possibles.
La présence de l’insert qu’on veut dans l’ADN plasmidique peut-être vérifiée par une hybridation directement sur colonies
(transfert, dénaturation, neutralisation, fixation, hybridation, lavages et révélation).
C] PCR
La technique de PCR est une technique d’amplification d’ADN par polymérisation en chaine, en utilisant la Taq Polymérase,
enzyme de la bactérie Thermophilus aquaticus, insensible à la chaleur, en plusieurs cycles.
Il va nous falloir un ADN (g isolé, fragment, ou ADNc), des amorces bien spécifiques, car elles doivent être parfaitement
complémentaire inverse des extrémités du fragment à amplifier en prenant garde au sens de polymérisation, et bien sûr des
dxTP. La Taq nécessite également un cofacteur, le magnésium.
Le fonctionnement de la PCR n’est pas dur : on porte le mélange à 94° C, dénaturant ainsi l’ADN. La polymérase n’est pas
affectée. On baisse la température pour permettre aux amorces de s’accrocher, et on la remonte à 72° C, température optimale
de la Taq. En répétant plusieurs fois cette opération, on obtient de l’ADN double brin, sélectionné comme voulu.
Après x cycles, on obtient :
݊݋ܾ݉ݎ݁ ݀݁ ݉ܽݐݎ݅ܿ݁ݏ ∗ 2
௡
݂ݎܽ݃݉݁݊ݐݏ
La PCR permet donc le clonage d’un fragment d’ADN, mais aussi le clonage d’un messager après une étape de reverse
transcriptase : l’amorce de la reverse transcriptase peut alors être la même que la PCR. Cette technique permet également de
vérifier la présence et l’orientation d’un insert dans des vecteurs recombinants.
CHAPITRE III : SÉQUENÇAGE
I – TECHNIQUE DE SÉQUENÇAGE
En plus de déoxynucléotides, on va avoir besoin de didéoxynucléotides, c'est-à-dire des nucléotides ne possédant pas du tout de
OH, ni en 5’ ni en 3’. La première étape consiste à dénaturer notre matrice, et à l’hybrider avec des amorces spécifiques. On fait
ensuite 4 tubes :

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Chaque tube possède donc les 4 déoxynucléotides plus un didéoxynucléotide différent dans chaque. Il faut savoir qu’a chaque
fois qu’on a un ddXTP incorporé, il y a arrêt de la polymérisation. De ce fait, on va obtenir toutes les combinaisons possibles, et
donc, les positions de chaque nucléotide. Pour les lire, il suffit de faire migrer les contenus de chaque tube sur électrophorèse en
séparant par la taille, et on lit la séquence de bas en haut.
Attention, ceci est le brin complémentaire du brin séquencé, qui ici, est en fait ACCAGTGCGTTTAACGGAT.
Il faut marquer les ddXTP avec un fluorophore pour détecter les différents produits de séquençage.
II – LE CODE GÉNÉTIQUE
4 nucléotides codent pour 20 acides aminés : il en faut donc 3 par lettres, donnant 4
3
= 64 possibilité. Le code génétique est
donc redondant, universel, et non chevauchant, c'est-à-dire que les codons ne gèrent qu’un seul acide aminé, comme le
montrent les mutations ponctuelles qui, en changeant un codon, changent un seul acide aminé.
L’ARN est une molécule polaire. Ce n’est pas forcément le cas des acides aminés, qui peuvent aussi être hydrophobes. On a donc
besoin d’un adaptateur entre les deux : l’ARNt. En cas de mutation dans cet ARNt, on risque d’avoir le mauvais acide qui se fixe.
Le code est organisé, les 3 bases ayant une fonction différente :
- 1
ère
base : si on la change, le plus souvent, ça va modifier l’Acide Aminé
- 2
ème
base : si c’est une Purine, l’acide aminé sera polaire. Si c’est une pyrimidine, il sera hydrophobe.
- 3
ème
base : Dans la plupart des cas, n’influe pas sur le choix de l’acide, car l’ARNt, qui lie l’ARNm au niveau de sa boucle
anticodon, complémentaire du codon, possède en 3
ème
base une inosine, base particulière capable de se lier avec C, U
ou A. Cette position de base est appelée position du wobble.
Le code génétique a été étudié par test. On a tenté toutes les combinaisons assemblant des ribosomes, des poly(X), un ARNt et
du cytosol, avec de l’ATP et un des acide aminé marqué, et on a vu ce que ça donnait. L’opération a été répétée jusqu’à avoir
tous les acides.
La Biosynthèse des protéines
L’ARNm est lu et les acides aminés accrochés les uns aux autres. On a besoin pour ça qu’une enzyme, l’aminoacyl tRNA
synthétase. il en existe autant que d’acides aminés, et dispose de 3 sites : un pour l’acide, un pour l’ARNt, et un pour l’ATP. En
consommant celui-ci, il permet la liaison de l’acide au site accepteur, sur l’ARNt. Celui-ci dispose également de deux boucles
latérales, la boucle D à gauche, contenant la base atypique déhydrouridine, et la boucle TΨC à droite, qui contient les bases
ribothymidine et pseudouridine.
La traduction commence majoritairement par le codon initiateur, AUG, donnant la méthionine, qui associera avec le premier
ARNt. Avant ce codon, se trouve la séquence shine-dalgarno, qui s’associe avec l’ARN 16S du ribosome. Après fixation au site du