unexpected importance of potential parasites

UNEXPECTED IMPORTANCE OF
POTENTIAL PARASITES IN THE
COMPOSITION OF THE FRESHWATER
SMALL-EUKARYOTE COMMUNITY
LEPÈRE C, DOMAIZON I, DEBROAS D. APPL ENVIRON MICROBIOL. 2008
MAY;74(10):2940-9. DOI: 10.1128/AEM.01156-07. EPUB 2008 MAR 21.
CONTEXTE
PICOPLANCTON : - RÔLE FONDAMENTAL DANS LE FONCTIONNEMENT DES
ÉCOSYSTÈMES AQUATIQUES (PRODUCTEURS PRIMAIRES).
- MAIS PEU DE CARACTÉRISTIQUES MORPHOLOGIQUES QUI
PEUVENT ÊTRE IDENTIFIÉES EN MICROSCOPIE
 DONC UTILISATION DE TECHNIQUES MOLÉCULAIRES POUR IDENTIFIER ET
DÉCRIRE LA DIVERSITÉ DU PICOPLANCTON EUCARYOTE DANS LES ENVIRONNEMENTS
AQUATIQUES.
 CEPENDANT LA DIVERSITÉ, LA DISTRIBUTION ET L’ABONDANCE NATURELLE DU
PICOPLANCTON EUCARYOTE ONT ÉTÉ TRÈS PEU ÉTUDIÉES EN EAU DOUCE.
 DES ÉTUDES RÉCENTES RÉVÈLENT UNE GRANDE DIVERSITÉ EN ARN 18S DANS LES LACS.
OBJECTIFS
IDENTIFICATION DES PRINCIPAUX GROUPES PHYLOGÉNÉTIQUES EUCARYOTES
PRÉSENTS DANS L’ÉPILIMINNION DU LAC DU BOURGET (LAC MÉSOTROPHE). VIA
DEUX MÉTHODES MOLÉCULAIRE DISTINCTES (CLONAGE/SÉQUENÇAGE ET TSAFISH)
 DESCRIPTION DE LA COMPOSITION ET DE L’ÉVOLUTION DES COMMUNAUTÉS
EUCARYOTES DU PICOPLANCTON (0.2 À 5µM) À DEUX DATES DIFFÉRENTES:
AOÛT ET MAI.
MATÉRIEL ET MÉTHODES
HYBRIDATION IN SITU COUPLÉE À UNE AMPLIFICATION DU SIGNAL TYRAMIDE
 TSA-FISH.
CLONAGE TOPO TA/SÉQUENÇAGE.
COMPARAISON AUX BANQUES DE DONNÉES.
ANALYSE PHYLOGÉNÉTIQUE.
ECHANTILLONNAGE
 PRÉLÈVEMENTS ENTRE 100 ET 120 ML D’EAU DU LAC.
 DEUX FILTRATIONS SUR FILTRE DE POLYCARBONATE (PORES DE 5µm PUIS PORES DE 0.2µm).
 FIXATION DES BACTÉRIES AU FORMALDÉHYDE (1%).
 FIXATION DES PROTISTES AU GLUTARALDÉHYDE (4%).
 FIXATION DU MÉTAZOOPLANCTON AU SUCROSE/FORMALDÉHYDE (6/4%).
 COMPTAGE DU MICROPHYTOPLANCTON ET DU MÉTAZOOPLANCTON À L’INRA.
EXTRACTION D’ADN
Filtres
Tampon (tris EDTA) et de solution de lysozyme, et incubation à
37 °C durant 30min.
SDS et protéinase k et incubation à 37°C, 60min.
Après ajout de bromure d'hexadécyltriméthylammonium
(CTAB), les échantillons sont incubés à 65°c pendant 10min.
Chloroforme-éthanol
Phénol-chloroforme
 Après ajout d’isopropanol , les acides nucléiques sont précipités à 20°C
pendant 12h.
 Après centrifugation , le culot d’A.D.N. est rincé avec de l’éthanol et
resuspendu dans du tampon Tris-Edeta.
 L’A.D.N. est quantifié par fluorescence (DNA quantification kit; Sigma) et
stocké à 20°C.
AMPLIFICATION PCR
 Avec amorces Ek-82F, Ek-1F
et Ek-1520R (spécifiques des
eucaryotes).
MÉTHODE DE CLONAGE TOPO TA
 INSERTION DIRECTE DU PRODUIT D’AMPLIFICATION PCR DANS UN VECTEUR
PLASMIDIQUE.
 SANS LIGASE, SANS PROCÉDURE POST-PCR, ET SANS SÉQUENCES SPÉCIFIQUES
DANS LES AMORCES PCR.
 LE VECTEUR PLASMIDIQUE EST FOURNI LINÉARISÉ AVEC :
- 3´-THYMIDINE (T)
- UNE TOPOISOMERASE 1 ATTACHÉ DE FAÇON COVALENTE
(LE VECTEUR EST DIT ACTIVÉ)
CLONAGE TOPO TA
 La Topoisomérase 1 se lie a l’ADN
et brise une liaison phosphodiester
en 5’ après CCCCTT sur un brin.
 L’énergie est conservée par
formation d’une liaison covalente
entre le résidu 3’phosphate et un
résidu tyrosine de la
topoisomérase.
 L’extrémité 5’hydroxyle du brin
coupé original attaque la liaison
phospho-tyrosyne, relâchant
l’enzyme.
CLONAGE TOPO TA
 Le kit fournit des bactéries
compétentes.
 Transformation par choc
thermique.
 Sélection ampicilline ou
kanamycine.
 Crible des transformants
lacZ-/+, blancs/bleus.
ANALYSE RFLP (RESTRICTION FRAGMENT LENGTH
POLYMORPHISM)
 LES CLONES SONT SÉLECTIONNÉS AU HASARD DANS LES
BOITES  LES INSERTS CONTENANT LA SÉQUENCE CODANTE
SONT RECHERCHÉS PAR PCR EN UTILISANT LES SÉQUENCES
FLANQUANTES M13F ET M13R.
 LES PRODUITS D’AMPLIFICATION DE LA TAILLE DÉSIRÉE SONT
DIGÉRÉS PAR HAE III.
 SÉPARATION PAR ÉLECTROPHORÈSE.
 LES CLONES PRODUISANT LE MÊME PROFILE RLFP SONT
CONSIDÉRÉS COMME APPARTENANT AUX MÊMES OTUS
(OPERATIONAL TAXONOMIC UNIT).
 AU MOINS UN CLONE DE CHAQUE OTU EST SÉLECTIONNÉ ET
SEQUENCÉ.
ANALYSE PHYLOGÉNÉTIQUE
 COMPARAISON DES SÉQUENCES AVEC LES SÉQUENCES DISPONIBLES DANS LA BASE DE
DONNÉES BLAST.
 ALIGNEMENTS DES SÉQUENCES DANS LA BASE DE DONNÉES ARB.
 CORRECTION MANUELLE DES RÉSULTATS.
 CRÉATION D’UN ARBRE PHYLOGÉNÉTIQUE OPTIMISÉ GRÂCE AU PRINCIPE DE PARCIMONIE.
• AFIN DE CRÉER L’ARBRE : ON DÉFINIT UN CLADE ENVIRONNEMENTAL COMME
COMPRENNANT AU MOINS 2 SÉQUENCES AVEC AU MOINS 95% D’IDENTITÉ ET DES
ÉCHANTILLONS D’ORIGINE D’AU MOINS 2 SITES AQUATIQUES DIFFÉRENTS.
TSA-FISH
• PRÉPARATION DES ÉCHANTILLONS
• HYBRIDATION :
 FLUORESCEIN ISOTHIOCYANATE
 4 SONDES
 COLORATION AU CALCOFLUOR BLANC
 COMPTAGE
TSA-FISH
Tyramide Signal Amplification-Fluorescent in situ Hybridization
Cellules cibles
(de 0,2 à 5 µm)
+
HRP
+
T
FITC
Sonde oligonucléotidique marquée au FITC
( EUK 1209R)
1) Dénaturation
2) Déshydratation
3) Perméabilisation
HRP:HorseRadish Peroxydase
FITC: Fluoresceine IsoThioCyanate
VISUALISATION:
- MICROSCOPE À ÉPIFLUORESCENCE
- MICROSCOPIE CONFOCALE
COMPTAGE:
-CYTOMÉTRIE EN FLUX
RÉSULTATS
 LA DIVERSITÉ DES EUCARYOTES (0.2 À 5µM) VARIE SELON LA PÉRIODE (MAI/AOÛT).
 LACS MÉSOTROPHES PLUS DIVERSIFIÉS QUE LACS AVEC NIVEAUX TROPHIQUES DIFFÉRENTS. ( LA TAILLE
DU LAC DEVANT ÊTRE CONSIDÉRÉE).
 IL EXISTE UNE RELATION POSITIVE ENTRE L’AIRE DU LAC ET LA RICHESSE EN BACTÉRIES. (CONCEPT
« ISLAND BIOGEOGRAPHY »)
 LE LIEN ENTRE LA DIVERSITÉ DES PROTISTES ET LE STATUT TROPHIQUE DU LAC N’A PU ÊTRE MIS EN
ÉVIDENCE SIGNIFICATIVEMENT DANS CETTE ÉTUDE.
 MAIS LE NIVEAU D’EUTROPHISATION, TOUT COMME LA COMPÉTITION, LA PRÉDATION ET L’ACCÈS AUX
RESSOURCES SONT DES FACTEURS IMPORTANTS POUR LA DIVERSITÉ DU LAC.
COMMUNAUTÉ PHYTOPLANKTON ET
MÉTAZOOPLAKTON
Mai
• DIFFÉRENCE DANS LA STRUCTURE DU NANO- ET
MICROPHYTOPLANKTON ENTRE LES MOIS DE MAI ET AOÛT:
 PICOPLANCTON:
Diatomées
MAI: CHLOROPHYCEAE (64%) ET DE DIATOMÉES (22%)
AOÛT: CYANOBACTÉRIES (39%), CHLOROPHYCEAE
(34%) ET CHRYSOPHYCEAE (14%)
Chlorophyceae
Août
 ZOOPLAKTON:
MAI: CLADOCERANS (74,4%), ROTIFER (19%) ET
COPEPODS (21%)
Chrysophyceae
Cyanobactéries
AOÛT: CLADOCERANS (59%), ROTIFER (2%) ET
COPEPODS (41%)
Chlorophyceae
COMMUNAUTÉ EUCARYOTE
• TSA-FISH => IDENTIFICATION ET QUANTIFICATION DES PETITS EUCARYOTES TOTAUX ET DES GROUPES
SPÉCIFIQUES.
• SONDES EUK 1209R (CONCENTRATION TOTALE EUCAROYTE):
 CONCENTRATION DE 2053,4 (CELL/ML) EN MAI.
 CONCENTRATION DE 1272,6 (CELL/ML) EN AOÛT.
• SONDES NCHLO01 CIBLENT 44,4% DES EUCARYOTES TOTAUX EN MAI ET 43,1% EN AOÛT.
• SONDES NCHLO02 CIBLENT 27,2% DES EUCARYOTES TOTAUX EN MAI ET 17,2% EN AOÛT.
• SONDES CRYPT13 CIBLENT 26,6% DES EUCARYOTES TOTAUX EN MAI ET 33,5% EN AOÛT (2 FOIS PLUS QUE
POUR LA SONDE NCHLO02).
• OBSERVATION MICROSCOPIQUE APRÈS COLORATION À LA PRIMULINE: CRYPTOPHYTES DOMINENT LES
FLAGELLÉS PIGMENTÉS.
• CALCOFLUOR BLANC COUPLÉ À LA TSA-FISH: FUNGUS (19,2%) EN MAI ET (6,9%) EN AOÛT.
LIBRAIRIE ARNR 18S
 LES CONSTRUCTIONS DES CLONES DONNENT UNE INFORMATION TAXONOMIQUE PRÉCISE SUR LA
COMPOSITION DE LA COMMUNAUTÉ EUCAROYTE.
 SUR UN TOTAL DE 486 CLONES: IDENTIFICATION DE 129 OTUs APRÈS ANALYSE DES PROFILES RFLP.
 LE SÉQUENÇAGE DES CLONES ONT PERMIS LA CONSTRUCTION DE DIFFÉRENTS GROUPES
PHYLOGÉNÉTIQUE.
CRYPTOPHYTA
 EUCARYOTES PIGMENTÉS
 30% DES EUCARYOTES (0.2 À 5µM) TOTAL DÉTECTÉS PAR
TSA-FISH
 4 CLADES IDENTIFIÉS
CHLOROPHYTES
 3 SÉQUENCES AFFILIÉES AUX CHLAMIDOMONALES DANS LE LAC.
 22% DES EUCARYOTES CIBLÉS AVEC LA SONDE EUK 1209R (TSAFISH) POUR LES DEUX DATES.
 ENVIRON 45% DES EUCARYOTES CIBLÉS AVEC LES BANQUES DE
CLONES DE L’ARN 18S.
 CHLOROPHYTES SOUS ESTIMÉS AVEC LA MÉTHODE TSA-FISH :
 CECI PEUT ÊTRE EXPLIQUÉ PAR LA DIFFÉRENCE DU NOMBRE DE
COPIES DE L’ARN 18S OU DES BIAIS DANS LA PCR.
 ESSAI DE CORRECTION AVEC AMPLIFICATION DU GÈNE DE LA
RUBISCO.
HAPTOPHYTES
 EUCARYOTES PHOTOSYNTHÉTIQUES TOUJOURS PRÉSENTS
EN FAIBLE PROPORTION DANS LES LACS ET LES
ENVIRONNEMENTS MARINS.
 UNE SEULE SÉQUENCE RETROUVÉE DANS LE LAC DU
BOURGET (EN AOÛT).
CHRYSOPHYCEAE
• PRÉSENTS À UNE SEUL DATE : LE 16 MAI.
• 8 SÉQUENCES DE OIKOMONAS MUTABILIS.
• CES SÉQUENCES ET D’AUTRES ÉTUDES  UN GRAND CLADE FORMÉ PAR LES
SÉQUENCES DES ÉCOSYSTÈMES D’EAU DOUCE À TOUS LES NIVEAUX
TROPHIQUE SAUF EN HYPERTROPHIQUE.
• CHRYSOPHYCEAE SONT RECONNUS COMME UN IMPORTANT COMPOSANT
DES MILIEUX D’EAU DOUCE.
RHIZARIA
 GROUPE NON IDENTIFIABLE AU MICROSCOPE: UTILISATION DES TECHNIQUES
DE BIOMOL POUR LES IDENTIFIER.
• CLASSÉS DANS LE GROUPE DES FLAGELLÉS NON IDENTIFIÉS LORS DES
PRÉCÉDENTES ÉTUDES.
• ACANTHAREA RETROUVÉS UNIQUEMENT EN MAI:
 HÉTÉROTROPHES TYPIQUES DES EAUX OCÉANIQUE
 DISTRIBUTION COSMOPOLITE.
=> ADAPTATION OU TRANSPORT SUR LONGUE DISTANCE.
AUCUNE SÉQUENCE RETROUVÉE DANS D’AUTRES ÉTUDES EN SYSTÈME
LACUSTRE.
SÉQUENCES RETROUVÉES SE SITUENT PRÈS DE SÉQUENCES MARINES, À UNE
POSITION SPÉCIFIQUE DANS LA COLONNE D’EAU (FORTE PROFONDEUR).
CILIÉS
• SÉQUENCES RETROUVÉES COMPRENNENT 2 CLADES D’ALVÉOLATES APPARTENANT AU GROUPE
DES CILIÉS
• => PRINCIPAL GROUPE DE LA LIBRAIRIE DE CLONES EN AOÛT (39 %) => REPRÉSENTE 5% DES
CLONES EN MAI.
• DÉTECTION DE CES SÉQUENCES DANS LA FRACTION DU PICOPLANCTON:
 PROBLÈMES DANS LA MÉTHODE ?
 EXPLICATION LA PLUS PROBABLE EST LA PRÉSENCE DE PETITS CILIÉS NON IDENTIFIÉS => FUTURES
RECHERCHES (SONDES SPÉCIFIQUES + MICROSCOPIE PERMETTRAIENT DE RÉPONDRE SUR LA PRÉSENCE DE
CES ORGANISMES (LARGES CELLULES) DANS LA PETITE FRACTION).
ALVÉOLATES
• LE GROUPE DES ALVÉOLATES A ÉTÉ IDENTIFIÉ À PARTIR
DE SÉQUENCES RETROUVÉES DANS DES
ENVIRONNEMENTS MARINS.
=> ALVÉOLATES
MARINS NON RETROUVÉS
DANS CE LAC OU DANS D’AUTRES SYSTÈMES
LACUSTRES.
MYCÈTES
•
•
•
•
•
•
•
•
LES MYCÈTES SONT RENCONTRÉS DANS TOUS LES LACS.
30% DES OTUS (40% DES CLONES) POUR LES DEUX DATES.
DOMINENT LE 16 MAI AVEC 24 SÉQUENCES (40% DES CLONES).
CHYTRIDIALES (SOUS FORME DE ZOOSPORES PÉLAGIQUES (2 À 5µM))
REPÉRÉS À L’AIDE D’UNE ANALYSE MORPHOLOGIQUE EN MICROSCOPIE.
PARASITES DE BACILLARIOPHYCÉES, DE CHRYSOPHYCÉES, DE
CYANOBACTÉRIES...
RÔLE DANS LA SUCCESSION DES COMMUNAUTÉS DE PHYTOPLANCTON ET
DANS LA RÉDUCTION DES BLOOMS ALGAUX.
EX: LORSQU’IL Y A MOINS DE MYCÈTES EN AOÛT IL Y A PLUS DE
PLANKTHRONIX (CYANOBACTÉRIES), L’INVERSE EN MAI.
RELATION BACILLARIOPHYCÉES/MYCÈTES N’A PAS PU ÊTRE MONTRÉE.
PERKINSOZOA
• ALVÉOLÉS À LA BASE DES APICOMPLEXÉS ET DINOFLAGELLÉS.
• PARASITES AVEC UN PASSAGE EN ZOOSPORES
 PERKINSUS MARINUS PARASITE DE BIVALVES
 PARVILUCIFORA INFESTANS PARASITES DE DINOFLAGELLÉS
• DANS LE LAC DU BOURGET : UN CLADE INCLUANT DES ESPÈCES
MARINES.
Perkinsozoa
CONCLUSION
 MISE EN ÉVIDENCE D’UNE GRANDE DIVERSITÉ ET DE L’IMPORTANCE DES DIFFÉRENTS
GROUPES D’EUCARYOTES (0.2 À 5µM) DANS L’ÉPILIMNION D’UN LAC MÉSOTROPHE.
 CONSTRUCTION DE LA PHYLOGÉNIE DES DIFFÉRENTES LIGNÉES.
 D’HABITUDE LE PARASITISME EST ÉCARTÉ DES RÉSEAUX TROPHIQUES LACUSTRES.
 LES DEUX MÉTHODES D’ANALYSE MOLÉCULAIRE SONT COMPLÉMENTAIRES ET ONT
PERMIS LA RÉVÉLATION DE BIAIS.
 LES RÉSULTATS MONTRENT ICI L’IMPORTANCE DES MYCÈTES ET PERKINSOZOA COMME
PARASITES POTENTIELS DES EUCARYOTES PHYTOPLANCTONIQUES D’EAU DOUCE.
 CECI SUGGÈRE QUE PLUS DE RECHERCHES SUR CES GROUPES SONT NÉCESSAIRES
POUR COMPRENDRE LEUR RÔLE ÉCOLOGIQUE ET LEUR IMPACT SUR LA DYNAMIQUE
DES POPULATIONS MICROBIENNES ET PHYTOPLANCTONIQUES.