E N C É P H A L O M...

CHAPITRE 2.8.10.
ENCÉPHALOMYÉLITE À TESCHOVIRUS
(anciennement encéphalomyélite à entérovirus ou maladie de
Teschen/Talfan)
RÉSUMÉ
L’encéphalomyélite à Teschovirus, anciennement dénommée maladie de Teschen/Talfan (ou
encéphalomyélite à entérovirus) a été d’abord décrite comme une encéphalomyélite du porc
particulièrement virulente à issue souvent fatale. L’agent étiologique est un Teschovirus porcin de
sérotype 1 (PTV-1 pour Porcine Teschovirus-1) du genre Teschovirus de la famille des
Picornaviridae. Des formes moins sévères de la maladie ont été décrites tout d’abord au
Royaume-Uni, où elle est connue sous le nom de « maladie de Talfan » ou sur le continent
européen sous celui de « Poliomyelitis suum » ou parésie enzootique bénigne. En plus des
souches virales de type PTV-1, des formes plus atténuées de la maladie sont associées à d’autres
sérotypes de PTV, comme les PTV-2, -3, -4, -5, -6, -9 et 10.
La maladie a été décrite pour la première fois à Teschen en Tchécoslovaquie en 1929. Dans les
années 1940 et 1950, elle a été à l’origine de pertes sévères en Europe, et s’est étendue aux
autres continents. La forme clinique est devenue rare à l’heure actuelle et n’a pas été signalée en
Europe de l’Ouest depuis 1980. Cependant, des enquêtes sérologiques indiquent que des variants
de virus peu ou pas pathogènes circulent toujours parmi les populations porcines.
Identification de l’agent pathogène : le virus présente une affinité pour le système nerveux
central, par conséquent des broyats de cerveau ou de moelle épinière sont utilisés comme
inoculum pour l’isolement viral. Le virus se cultive sur tapis cellulaire en monocouche d’origine
porcine, notamment à partir de tissu rénal. L’effet cytopathogène (ECP) du PEV est caractérisé par
la présence de cellules arrondies et réfringentes. L’identification du PEV et des différents sérotypes
est basée sur l’utilisation de sérums spécifiques ou d’anticorps monoclonaux préparés contre les
différentes souches de référence de PTV. Les tests de neutralisation virale ou de détection par
immunofluorescence indirecte sont les plus indiquées. Une réaction d’amplification en chaîne par
polymérase ciblant une partie du génome viral existe mais, à ce jour, aucun test spécifique n’a été
formellement accepté pour le diagnostic.
Épreuves sérologiques : en raison de la prévalence sérologique vis-à-vis du PTV-1 qui peut
dépasser 60 % dans des populations de porcs sains en Europe centrale et de la présence de
signes cliniques similaires dus à d’autres virus, incluant d’autres sérotypes de PTV, une simple
recherche d’anticorps positive ne permet pas de conclure que les signes neurobiologiques
observés sont vraiment dus à une infection par le PTV-1. Pour considérer le virus PTV-1 comme
l’agent infectieux responsable de la maladie clinique, il faut avoir une augmentation de l’ordre de 4
fois du titre en anticorps, associée aux signes typiques. La séroneutralisation virale (SN) en
microplaques ou la méthode immuno-enzymatique (ELISA) sont les épreuves de détection
d’anticorps recommandées pour la réalisation d’enquêtes sérologiques spécifiques du PTV-1 au
sein de populations porcines.
Spécifications applicables aux vaccins et aux produits biologiques à usage diagnostique :
quand la maladie clinique était fréquente, des vaccins étaient utilisés. Maintenant que les cas de
maladie sont rares, il n’existe plus de vaccins disponibles.
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Chapitre 2.8.10. — Encéphalomyélite à teschovirus (anciennement encéphalomyélite à entérovirus ou
maladie de Teschen/Talfan)
A. INTRODUCTION
L’encéphalomyélite à Teschovirus (anciennement maladie de Teschen/Talfan puis, ensuite, encéphalomyélite à
entérovirus) présente une forme aiguë chez le porc caractérisée par des désordres du système nerveux central
(SNC). Teschen est le nom de la ville de la République Tchèque où la maladie a été décrite pour la première fois
en 1929 (4, 5). Dans les années 1950, la maladie a diffusé à travers l’Europe et a causé d’énormes pertes à
l’élevage porcin. Des formes moins sévères, d’expression enzootique bénigne, ont été reconnues tout d’abord au
Royaume-Uni sous le nom de maladie de Talfan et au Danemark, sous celui de « Poliomyelitis suum ».
L’encéphalomyélite à Teschovirus n’a pas été signalée en Europe occidentale depuis 1980 (en Autriche) et elle
est considérée comme rare à l’heure actuelle Au cours des douze dernières années (depuis 1996) la maladie n’a
été rapportée à l’OIE que par les pays suivants : Belarus (1996, 1999 et 2005), Japon (2002), Lettonie (1997 et
2000–2002), Madagascar (1996–2000, 2002 and 2004–2005), Moldavie (2002–2004), Roumanie (2002), Russie
(2004), Ouganda (2001) et Ukraine (1996–2005). Dans la plupart des cas, il n’est pas possible de savoir si le
diagnostic a été porté sur la base des seuls signes cliniques ou s’il y a eu confirmation par le laboratoire, excepté
au Japon en 2002 (17).
L’agent causal de l’encéphalomyélite à teschovirus est le teschovirus porcin de sérotype 1 (PTV-1 pour Porcine
Teschovirus-1) qui appartient à l’espèce Teschovirus porcin, du genre Teschovirus, de la famille des
Picornaviridae (2, 5). Auparavant, les PTV étaient classés parmi les Enterovirus et les 11 sérotypes des
entérovirus porcins, PEV-1 à PEV-11, étaient regroupés en 3 groupes – I, II et III – sur la base de l’effet
cytopathogène (ECP) observé, de leur culture sur des types cellulaires différents, et des réactions sérologiques
(7). Le groupe I est composé des sérotypes PEV-1 à PEV-7 et PEV-11 à PEV-13. Sur la base des séquences
nucléotidiques et des analyses phylogénétiques, les virus du groupe I des PEV sont maintenant classés parmi les
Teschovirus. Les PEV-1 à PEV-7 ont été renommés PTV-1 à PTV-7 et les PEV-11 à 13 ont été renommés PTV-8
à PTV-10 ; un sérotype supplémentaire, PTV-11, a été décrit récemment (8, 14). Le groupe II contient le PEV-8
(espèce Porcine enterovirus A) et le groupe III, les sérotypes PEV-9 et -10 (espèce Porcine enterovirus B),. Ces
deux derniers groupes appartiennent au genre Enterovirus (14, 18) bien qu’il ait été suggéré de reclasser le PEV8 dans un nouveau genre de picornavirus (8).
Les PTV-2, -3, -4, -5, -6, -9 et -10 ont été isolés de porcs présentant des formes atténuées de la maladie (16). Les
infections dues aux PTV sont souvent asymptomatiques. Les sérotypes peuvent être différenciés en utilisant un
test de séroneutralisation virale (SN) (2, 7), un test de fixation du complément (6) ou par immunofluorescence
indirecte (IFI) (1, 13).
Les infections à PTV se développent uniquement chez les suidés ; les autres espèces animales ne sont pas
connues comme étant sensibles.
Le diagnostic différentiel doit être fait avec la maladie d’Aujeszky (pseudo-rage) et la peste porcine classique
(forme aiguë). En outre, l’encéphalite japonaise, l’infection à Streptococcus suis et les encéphalomyélites à virus
hémagglutinants peuvent à l’occasion entraîner des symptômes similaires. Des étiologies non infectieuses,
notamment des intoxications, peuvent aussi être prises en considération.
Les PTV peuvent être identifiés par la sérologie et des sérums spécifiques de référence ont été préparés par
hyperimmunisation de cobayes, lapins, ou de porcelets indemnes d’immunité maternelle (privés de colostrum)
avec des souches de référence des sérotypes de PTV-1 à11.
Le porc s’infecte par voie oronasale. La période d’incubation est d’environ 14 jours. Les principaux signes de l’état
prodromique sont de l’hyperthermie jusqu’à 41,5 °C, de la lassitude, de l’anorexie et des problèmes locomoteurs.
Cette étape est suivie par une hypersensibilité, des tremblements, des spasmes des membres, une paralysie
flaque, de l’opisthotonos et du nystagmus. Des convulsions peuvent être observées chez les jeunes cochons. En
phase clinique terminale, il est observé de la paralysie démarrant de la zone lombaire et évoluant
progressivement vers la partie antérieure du sujet. La paralysie du centre de thermorégulation provoque une
hypothermie. Quand les muscles respiratoires sont paralysés, l’animal meurt de suffocation.
Le diagnostic de laboratoire est basé sur la présence de signes cliniques typiques associés à des lésions
histologiques du cerveau et de la moelle épinière, ainsi que sur l’identification du virus à partir du SNC des porcs
affectés et la détection d’anticorps spécifiques dans le sang des animaux convalescents.
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B. TECHNIQUES DE DIAGNOSTIC
1.
Examen histologique et immunohistochimie
Pour un diagnostic histologique, des échantillons de cerveau, cervelet, diencéphale, bulbe rachidien et de la
moelle épinière cervicale ou lombaire sont prélevés. Les échantillons sont fixés au formol et les coupes réalisées
sont colorées selon les méthodes histologiques conventionnelles. Le virus se multiplie dans le SNC en
provoquant une polio-encéphalomyélite non suppurative avec une infiltration périvasculaire de lymphocytes, en
particulier au niveau de la moelle épinière (4). Des modifications pathologiques sont observées dans la matière
grise du diencéphale, du cervelet, du bulbe rachidien et des cornes ventrales de la moelle épinière (notamment,
de façon constante, les ganglions des racines des nerfs dorsaux et trijumeaux [ganglioneurites]), et dans une
moindre mesure des hémisphères cérébraux. Chez les très jeunes animaux, les lésions peuvent toucher aussi les
cornes dorsales de la moelle épinière. La dégénérescence des neurones (épaississement, chromatolyse,
nécrose, neurophagie et dégénérescence axonale) et leur remplacement par microgliose (astrobytose,
astrogliose) sont observés pendant la phase terminale de la maladie.
La détection des antigènes des teschovirus par immunohistochimie sur coupe de prélèvements de SNC fixés est
très délicate et n’est pas toujours possible. Si des anticorps spécifiques ou des anticorps monoclonaux sont
disponibles, ainsi que les techniques de détection appropriées, une corrélation entre les modifications
pathologiques observées et la localisation de l’agent est possible sur des coupes paraffinées de prélèvements de
SNC fixés.
2.
Identification de l’agent pathogène
a)
Isolement viral
Les progrès dans le diagnostic de l’encéphalomyélite à teschovirus et dans la production de vaccins ont été
rendus possible par la multiplication du virus sur culture cellulaire (9, 11).
Des échantillons de cerveau et de moelle épinière sont récoltés à partir de porcs abattus au stade précoce
de la maladie. Si les échantillons ne sont pas traités immédiatement, ils sont conservés dans une solution
tamponnée faite à parts égales de solution physiologique tamponnée au phosphate (PBS) de pH 7,4 et de
glycérol. Des morceaux de tissu sont broyés pour préparer une suspension à 10 % (poids/vol) dans du PBS.
La suspension est centrifugée à 800 g pendant 10 min. et le liquide surnageant est utilisé pour l’inoculation
des cultures cellulaires. Des cellules de première explantation de rein de porc en monocouche ou des
lignées cellulaires établies d’origine porcine sont utilisables pour l’isolement viral des PTV.
b)
•
Protocole
i)
Un tapis cellulaire quasi confluent (monocouche) est utilisé en tube ou en flacons de culture cellulaire.
Le milieu de culture est éliminé et les tubes ou flacons sont inoculés avec 0,1 ml du broyat tissulaire
suspect.
ii)
Les tubes ou les microplaques inoculés sont incubés pendant 1 h à 37 °C sous agitation douce (tubes
roulants ou balancelle).
iii)
L’inoculum est éliminé, et les tubes ou flacons de culture cellulaire sont rincés avec du PBS avant de
les remplir avec 1 à 20 ml (selon le type de flacon de culture cellulaire utilisé) de milieu de survie sans
sérum de veau.
iv)
Les tubes ou microplaques sont examinés au microscope chaque jour. Si l’échantillon contient du PTV,
un ECP caractéristique est visible après 3 à 4 jours. L’ECP est caractérisé par de petits foyers de
cellules rondes et réfringentes. Après plusieurs passages, le virus se multiplie mieux et génère des
ECP complets dès 24 h. L’identification du PTV peut être confirmée par utilisation de sérum spécifique
ou d’anticorps monoclonaux. La SN ou l’IFI sont les tests les mieux adaptés à cette fin. Quand, par
identification sérologique, l’isolat a été confirmé être du PTV, l’inoculation à des porcelets est le seul
moyen certain d’en vérifier la pathogénicité.
Le test de séroneutralisation virale pour l’identification du teschovirus porcin
Le virus récolté à partir de culture cellulaire est dilué dans le milieu de survie selon un pas de dilution de dix
de 10–1 à 10–6. Pour sérotyper le teschovirus, 12 rangées de chaque dilution sont préparées ; 50 µl de sérum
spécifique de référence anti-PTV-1 à 11 dilué au 1/10 sont ajoutés aux rangées 1 à 11 et 50 µl de sérum
négatif sont ajoutés dans la dernière rangée. Ces mélanges sont incubés pendant une nuit à 4 °C ou 1 h à
37 °C, puis inoculés sur un tapis cellulaire confluent dans des tubes de culture ou dans des puits de
microplaques. Les cultures cellulaires inoculées sont incubées à 37 °C. La présence d’un ECP est
recherchée après 72 h et chaque jour suivant jusqu’au 10e jour, selon le jour où l’ECP apparaît.
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L’identification d’un sérotype de PTV est confirmée si le titre viral observé en présence de cet antisérum est
au moins 103 fois plus faible que le celui obtenu en présence de sérum négatif.
c)
L’épreuve d’immunofluorescence indirecte pour la confirmation de la présence d’antigène de
teschovirus porcin sur cellules
L’épreuve d’immunofluorescence indirecte (IFI) est basée sur la reconnaissance des antigènes présents
dans des cellules infectées par des anticorps spécifiques d’un sérum positif (13). Grâce à l’utilisation
d’antiglobulines conjuguées à de l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC), la réaction est visualisée en
microscopie à UV ou utilisant une source lumineuse bleue. Les antigènes sont détectables dans les cellules
dès 12 h après l’infection par le PTV, c’est-à-dire avant le début de l’ECP. Les sérums polyclonaux montrent
souvent des réactions croisées entre les différents types de PTV, qui peuvent conduire à des erreurs
d’interprétation.
•
Protocole
i)
Le matériel suspect est inoculé sur une lamelle recouverte d’un tapis de cellules rénales porcines. Il est
recommandé d’introduire et de traiter des témoins positif et négatif en parallèle des échantillons à
tester.
ii)
Après une incubation de 12 à 16 h, les lamelles sont lavées 2 fois au PBS, séchées à l’air puis fixées
avec de l’acétone froid pendant 5 à 15 min.
iii)
Les lamelles sont placées dans une boîte humide et recouvertes avec du sérum de porc ou de lapin
anti-PTV préalablement dilué au 1/10 dans du PBS ou avec un anticorps monoclonal spécifique à sa
dilution de travail.
iv)
La boîte humide est fermée et mise à incuber à 37 °C pendant 60 min.
v)
Les lamelles sont ensuite rétirées et lavées 3 fois avec du PBS, puis recouvertes avec un sérum de
chèvre anti-lapin ou anti-porc conjugué FITC, à une dilution déterminée au préalable, puis incubées à
37 °C pendant 30 min.
vi)
Les lames sont ensuite lavées 3 fois avec du PBS, séchées à l’air et montées dans du tampon Tris 0,1
M - glycérol, pH 8,6.
Après ce traitement, les lamelles sont observées au microscope. Les lamelles témoins sont examinées en
premier pour valider la spécificité de la fluorescence observée. La fluorescence est de couleur vert pomme
et apparaît dans le cytoplasme et à la périphérie du noyau. À la place de lamelles, on peut aussi utiliser des
inserts pour chambre de culture cellulaire multipuits, ou des microplaques.
d)
La technique de la transcription inverse couplée à une amplification en chaîne par polymérase
La transcription inverse couplée à une amplification en chaîne par polymérase (RT-PCR) permet la détection
et la différenciation de régions spécifiques du génome des teschovirus porcins (12, 19). La RT-PCR nichée
utilisant des sondes spécifiques est utilisée pour différencier les virus entre les PTV et les PEV (19). La PCR
est plus rapide et moins laborieuse que l’isolement viral sur culture cellulaire et l’identification du virus par
sérotypage. Toutefois la PCR est actuellement encore réservée à des laboratoires spécialisés.
3.
Épreuves sérologiques
Comme la séroprévalence du PTV-1 peut dépasser 60 % dans des populations porcines saines de certains pays
d’Europe centrale, et que les mêmes symptômes peuvent être dus à d’autres virus dont certains autres sérotypes
de PTV, un résultat positif à une simple analyse sérologique pour le PTV-1 ne confirme pas que les signes
nerveux observés sont réellement dus au PTV-1. La possibilité d’une infection à PTV-1 peut être prise en
considération pour expliquer une expression clinique de la maladie seulement si en plus des signes typiques, on
observe une augmentation de 4 fois le titre en anticorps spécifiques. L’existence de réactions croisées avec
d’autres teschovirus orphelins est une des raisons pour laquelle l’analyse des sérums deux par deux est
nécessaire pour confirmer la signification des titres en anticorps.
Les porcs qui ont guéri de la maladie ou ceux qui ne l’ont pas exprimée produisent des anticorps spécifiques. Des
méthodes sérologiques sont disponibles pour leur détection, dont la SN en microplaque utilisant des cultures
cellulaires de rein de porc qui est la plus utile (10). Une épreuve immuno-enzymatique (ELISA) a aussi été
développée qui est plus sensible et plus rapide (3).
Pour la mise en œuvre du diagnostic sérologique, il est indispensable de disposer des souches de référence des
différents sérotypes de PTV cultivées sur cellules et de sérum hyperimmun monospécifique de ces types de PTV.
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•
Souches de référence de teschovirus porcins
Caractéristiques : basée sur une longue expérience, la souche « Zabreh », isolée en Tchécoslovaquie au moment
du pic d’incidence de la maladie, a été sélectionnée comme souche de référence pour générer une forme sévère
d’encéphalomyélite à teschovirus. Le pouvoir pathogène de la souche est maintenu par passage intracérébral sur
des porcelets privés de colostrum. Le virus génère des signes typiques d’encéphalomyélite à teschovirus après
une période d’incubation de 5 à 7 jours. Pour le diagnostic sérologique, les souches de sérotypes de PTV à
utiliser sont pour le type 1 : Talfan, pour le type 2 : T80, pour le type 3 : O2b, pour le type 4 : PS36, pour le
type 5 : F26, pour le type 6 : PS37, pour le type 7 : F43, pour le type 8 : V13, pour le type 9 : Ger-2899/84, pour le
type 10 : Ger-460/88, pour le type 11 : Dresden.
Stock viral : les souches de référence sont multipliées sur culture de cellules de première explantation de rein de
porc ou sur lignée cellulaire établie, par exemple des PK-15. Une suspension à 10 % dans du PBS, pH 7,4, est
préparée à partir du cerveau ou de la moelle épinière de porcelets infectés expérimentalement avec du PTV.
Certains types sont isolés à partir des fèces. La suspension est centrifugée et le surnageant est utilisé pour
inoculer les cultures. Le protocole de multiplication du PTV sur culture cellulaire est décrit ci-après :
Le milieu de culture est éliminé et après rinçage au PBS, les cellules sont inoculées avec la suspension virale à
37 °C. Le volume de l’inoculum est environ 10 % du volume usuel de milieu de culture. Après 1 h d’incubation à
37 °C, l’inoculum est éliminé, le flacon de culture est rincé avec le PBS et le tapis cellulaire est recouvert du
volume approprié de milieu sans sérum mais supplémenté en antibiotiques. L’ECP se développe dans les 48 h, et
le tapis cellulaire se désintègre plus ou moins complètement pendant les 48 à 72 h suivantes. Après 3 à
5 passages consécutifs en culture cellulaire, le développement de l’ECP s’accélère et la concentration en virions
augmente. Le titrage viral est réalisé dans des tubes de culture ou en microplaques. Une souche adaptée en
culture cellulaire peut atteindre un titre de 106–107 DICT50/ml (Dose de virus infectant 50 % de la culture
tissulaire).
Le surnageant récolté est vérifié pour sa spécificité en utilisant des sérums hyperimmuns spécifiques connus. Un
traitement avec 5 % de chloroforme ou un essai de culture sur cellules humaines, bovines ou d’embryons de
poulet sont utilisés pour exclure une contamination par d’autres virus. Le PTV est résistant au chloroforme et se
multiplie uniquement sur des cellules d’origine porcine. Une révélation par immunofluorescence est utile pour
détecter de possibles contaminants qui sont résistants au chloroforme et qui se multiplient aussi sur cellules
d’origine porcine (ex : le parvovirus), ou qui sont non-cytopathogènes. Le stock viral est distribué en petites
fractions aliquotes qui sont conservées à une température inférieure à –60 °C. Le virus congelé conserve ses
propriétés pendant plusieurs années. Pour une utilisation en neutralisation virale, une dose de virus constante de
100 DICT50 est recommandée.
•
Sérum hyperimmun spécifique
Un sérum hyperimmun spécifique est obtenu par immunisation répétée de cobayes, lapins ou porcelets privés de
colostrum avec du PTV. Même si les animaux proviennent d’élevages exempts d’organismes pathogènes
spécifiques, ils sont tout de même testés avant immunisation pour vérifier l’absence d’anticorps anti-PTV. Des
souches de référence sont utilisées de préférence. Les lapins sont immunisés par administration intraveineuse de
la suspension virale seule, ou par voies sous-cutanée ou intrapéritonéale en utilisant une suspension virale avec
10 % d’adjuvant huileux. De bons résultats peuvent être obtenus par administration de 3 doses de 2 ml de
suspension virale + 0,2 ml d’adjuvant huileux à intervalle de 2 semaines. Les lapins sont saignés 10 jours après la
dernière immunisation. Les porcelets sont immunisés de la même manière. Les sérums sont clarifiés par
centrifugation et conservés en petites fractions aliquotes à –20 °C. Les sérums sont titrés par neutralisation virale
en présence d’une dose constante de virus. Seuls les sérums dont le titre est supérieur au 1/256 peuvent être
utilisés pour l’identification du virus.
a)
Le test de séroneutralisation virale en microplaques
Le test est réalisé sur des microplaques de culture cellulaire à fond plat, en utilisant des cellules de première
explantation de rein de porc d’un passage peu élevé, ou des lignées cellulaires d’origine porcine. Le stock
viral est multiplié sur tapis cellulaire. Le virus récupéré à partir de cultures cellulaires est clarifié par
centrifugation et conservé en fractions aliquotes à –20 °C. Le milieu de culture, comme du milieu complet de
Eagle ou LYH (solution saline tamponnée de Hanks avec une solution d’extrait de levure, de lactalbumine et
d’antibiotiques), est utilisé comme diluant. Le virus récolté des cultures cellulaires est clarifié par
centrifugation et conservé en parties aliquotes à –70 °C, ou sous forme d’un mélange 50/50 avec du glycérol
qui peut être conservé à –20 °C.
•
Protocole
i)
Inactiver le sérum par la chaleur pendant 30 min à 56 °C.
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ii)
Les sérums à tester sont dilués dans du milieu de culture cellulaire selon un pas de dilution de raison
deux du 1/2 au 1/64, à raison de 4 puits par dilution et de 50 µl de volume par puits.
iii)
Les témoins incluent des sérums témoins positif et négatif, des contrôles cellulaires et de milieu.
iv)
Ajouter à chaque puits 50 µl de la dose à l’emploi, préalablement diluée dans du milieu de culture pour
obtenir 100 DICT50.
v)
Incuber pendant 1 h à 37 °C avec les plaques recouvertes. Le virus résiduel est incubé de la même
manière.
vi)
Réaliser un titrage de la dose d’emploi selon un pas de dilution de raison dix en utilisant 50 µl par puits
et 4 puits par dilution.
vii)
Ajouter 50 µl de suspension cellulaire de rein de porc à 5 × 105 cellules par ml.
viii) Après agitation, les plaques sont recouvertes et mise à incuber à 37 °C sous une atmosphère à 5 % de
CO2 pendant 2 à 3 jours ou plus, jusqu’à un maximum de 8 jours.
b)
ix)
Les plaques sont examinées au microscope pour rechercher l’ECP. Le test est validé par
vérification du titrage de la dose à l’emploi et du titre du sérum témoin positif. Le titre du virus est de
100 DICT50 avec une variation tolérable entre 30 et 300. Le titre du sérum témoin positif peut varier de
0,3 log10 unités autour du titre moyen prédéterminé. Le sérum témoin négatif ne doit pas neutraliser le
virus à sa plus faible dilution, ex : au ½.
x)
Le titre neutralisant est déterminé selon la méthode de Spearman-Kärber, comme étant la dilution du
sérum qui neutralise le virus dans 50 % des puits.
xi)
Les titres en neutralisation virale sont considérés comme positifs si le sérum neutralise le virus à la
dilution initiale supérieure au 1/8.
Épreuve immuno-enzymatique
La technique ELISA est une méthode alternative de détection des anticorps contre le PTV (3). Le test est
réalisé en microplaques en utilisant du PTV cultivé sur cellules comme antigène. La technique peut être
mise en œuvre en appliquant les étapes suivantes.
•
Préparation de l’antigène
i)
Le stock de virus est préparé en culture cellulaire soit sur cellules de première explantation de rein ou
de testicule de porc, soit sur lignée cellulaire établie comme, par exemple les cellules PK-15. Le milieu
de croissance est retiré et après rinçage avec du tampon, les cellules sont inoculées avec la
suspension virale à un faible taux de multiplicité d’infection. Après 30 min d’incubation à 37 °C, les
cellules sont recouvertes d’un volume approprié de milieu sans sérum mais avec antibiotiques.
L’incubation se poursuit à 37 °C avec observation quotidienne au microscope. L’ECP doit apparaître en
48 h et le tapis cellulaire doit être plus ou moins détruit au cours des 48-72 h suivantes. Une souche
adaptée à la culture cellulaire peut donner des titres de 106 à 107 DICT50 par ml.
ii)
Le virus récupéré est clarifié par centrifugation à 200 g pendant 15 min, puis précipité avec une
solution saturée à 50 % de (NH4)2SO4 pendant 120 min à 4 °C.
iii)
Après centrifugation à 2 000 g, le précipité récupéré est resuspendu dans du tampon TEN
(Tris-hydroxymethyl-methylamine [0,01 M], éthylène diamine tétra-acétate [1 mM] et NaCl [0,15 M]),
pH 7,4, au 1/100 du volume initial.
iv)
La suspension virale concentrée est extraite par agitation avec du fréon 3/1 pendant 10 min à 4 °C.
v)
Après une autre centrifugation, le surnageant est divisé en deux phases séparées. La phase aqueuse
supérieure contenant l’antigène viral est dessalée par passage sur colonne en Sephadex G 25 de 2,5 ×
40 cm.
vi)
La solution virale est finalement concentrée par ultracentrifugation à 160 000 g pendant 3 h.
vii)
Le culot est repris dans du tampon TEN, pH 7,4, sous un volume d’environ le millième du volume initial
du virus.
viii) Les protéines insolubles sont séparées par centrifugation douce et le surnageant est utilisé comme
antigène positif en ELISA.
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•
Protocole
i)
les plaques sont sensibilisées en ajoutant 100 µl à chaque puits de l’antigène prédilué dans du PBS,
pH 7,2. L’adsorption de l’antigène à la surface de la plaque se fait sur une nuit à 4 °C. Des rangées
parallèles de la plaque sont sensibilisées avec de l’antigène négatif.
ii)
La plaque est lavée 5 fois avec du PBS pour éliminer l’excès d’antigène.
iii)
Les sérums à tester sont dilués au 1/20 dans du PBST (solution physiologique tamponnée au
phosphate contenant 0,05 % de Tween 20). Chaque sérum dilué est déposé en 4 exemplaires à raison
de 50 µl par puits : deux avec de l’antigène positif et deux pour l’antigène négatif (l’antigène négatif est
préparé comme décrit ci dessus à l’exception que le tapis cellulaire n’est pas inoculé avec du virus et
que les cellules sont éclatées par congélation). La plaque est incubée pendant 1 h à 37 °C.
iv)
Les plaques sont lavées 5 fois avec du PBST.
v)
50 µl d’une dilution préalablement déterminée de sérum de lapin anti-immunoglobulines de porcs
conjugué à la peroxydase de raifort, sont ajoutés dans chaque puits. Les plaques sont à nouveau
incubées pendant 1 h à température ambiante.
vi)
Les plaques sont lavées 5 fois au PBS.
vii)
100 µl de la solution du substrat (0,1 % orthophenyl-endiamine et 0,03 % de peroxyde d'hydrogène
dans du PBS, pH 6,0) sont ajoutés à chaque puits.
viii) Après l’ajout de substrat, les échantillons positifs changent de couleur et deviennent marron foncé.
Quand la réaction colorée est suffisamment développée dans les puits contenant les sérums témoin
positif, la réaction est arrêtée en ajoutant 50 µl d’acide sulfurique 2 M à chaque puits. L’absorbance
dans les puits est mesurée à la longueur d’ondes de 492 nm, en utilisant de préférence un
spectrophotomètre à multicanaux avec un système d’impression. Les sérums témoin positif et négatif
et le témoin cellules non infectées sont traités de la même manière que les échantillons à tester.
ix)
Le calcul de l’absorbance d’un sérum prend en compte la valeur moyenne des 2 puits avec antigène
positif à laquelle est soustraite la valeur moyenne des 2 puits avec antigène négatif. Pour qu’un sérum
soit considéré comme positif, la valeur calculée de l’absorbance doit excéder au moins de 2 fois la
moyenne obtenue pour le sérum témoin négatif.
C. SPÉCIFICATIONS APPLICABLES AUX VACCINS
ET AUX PRODUITS BIOLOGIQUES À USAGE DIAGNOSTIQUE
•
Vaccins anti-encéphalomyélite à teschovirus
Lors de la période d’incidence la plus élevée en Europe et à Madagascar, une immunoprophylaxie active a été
menée pour contrôler l’infection (15). Depuis que les formes cliniques sévères ont disparu, la vaccination est
arrêtée et le vaccin n’est plus utilisé ni produit nulle part dans le monde.
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