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Correspondances en Onco-Hématologie - Vol. VII - n° 1 - janvier-février-mars 2012
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dossier thématique
Les temps forts
en hématologie en 2011
raconté à Juliette
met au point une technique fondée sur
l’addition de nouveaux nucléotides sur
le brin complémentaire de l’ADN à iden-
tier (gure 1) . Cette technique a ensuite
largement bénécié des progrès apportés
par la polymérisation en chaîne (PCR) et
l’utilisation des transcriptases reverses.
Elle repose sur l’amplication de l’ADN,
préalablement fragmenté et cloné, en
présence de désoxynucléotides et de
didésoxynucléotides. L’incorporation,
dans la séquence complémentaire syn-
thétisée par la transcriptase reverse,
d’un de ces didésoxynucléotides arrête
l’élongation. À l’issue de la PCR, des
amplicons de taille différente sont ainsi
obtenus, correspondant aux nucléotides
auxquels la transcription s’est arrêtée.
Leur migration sur un gel d’électro-
phorèse, qui les “range” par taille, per-
met de “lire” la séquence de l’ADN au
nucléotide près. Les premières techniques
utilisaient 4 amplications en présence
chacune d’un didésoxynucléotide (A, C,
G ou T) et la migration en parallèle
des 4 amplications. Elles ont été rem-
placées par l’utilisation de didésoxy-
nucléotides couplés à des uorochromes
différents et une lecture directe des
fragments séparés par chromatographie
ou électrophorèse capillaire au sortir de
la colonne de séparation. Cette méthode
est utilisée par les séquenceurs auto-
matiques.
La préparation initiale de l’ADN (frag-
mentation et clonage) permet de tra-
vailler sur de petits fragments, mais
la restauration, ensuite, de l’ordre des
séquences nécessite l’utilisation d’outils
de bio-informatique.
La technique de pyroséquençage repose
aussi sur la synthèse de l’ADN complé-
mentaire, associée cette fois à la mesure
du pyrophosphate libéré à chaque
addition, un par un, de nucléotide.
Biologie : Next Generation Sequencing
raconté à Juliette
M.C. Béné*, G. Cartron**
* Laboratoire d’immuno-
logie et faculté
de médecine de Nancy.
** Service d’hématologie
clinique et de biothéra-
pies, CHU Lapeyronie,
Montpellier.
Le nouvel acronyme “NGS” semble avoir pris son
essor ces 2 dernières années, et tout laisse à pen-
ser qu’il pourrait devenir un élément important
de l’arsenal diagnostique.
NGS pour Next Generation Sequencing, autrement dit :
“séquençage de nouvelle génération”. Cela fait un peu
science-fiction et on se demande ce qui va être séquencé :
des protéines, des gènes de fusion, le génome lui-même ?
Non, pas des protéines, on est là au cœur du moléculaire
des acides nucléiques, et effectivement dans la science-
fiction d’hier. Applications en onco-hématologie ? On y
arrive, même si une recherche PubMed avec next genera-
tion sequencing lymphoma ou next generation sequencing
leukemia ne trouve encore que 11 revues générales, dont
la majorité a moins de 2 ans. Il nous a donc paru pertinent
de raconter à Juliette de quoi il s’agit ici.
Les techniques traditionnelles
de séquençage
Au milieu des années 1970, 2 équipes
développent des techniques diamétrale-
ment opposées de séquençage de l’ADN.
Alan Maxam et Walter Gilbert utilisent
des réactions chimiques pour dégra-
der les acides nucléiques un par un.
Frederick Sanger, qui partagera en 1980
un de ses 2 prix Nobel avec Walter Gilbert,
Figure1. Technique de Sanger.
La réplication de l’ADN est stoppée (*) chaque fois qu’un didésoxynucléotide est ajouté.
Les amplicons sont triés par taille, ce qui permet de “lire” la séquence d’ADN.
A
C
G
T
AC
ACA
ACAG
ACAGG
ACAGGT
ACAGGTA
ACAGGTAT
ACAGGTATC
ACAGGTATCA
ACAGGTATCAT
ACAGGTATCATG
ACAGGTATCATGA
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Biologie : Next Generation Sequencing raconté à Juliette
Si le nucléotide correspond à celui qui
doit être complémenté, le pyrophosphate
est libéré. Sinon, on ajoute le nucléo-
tide suivant. Cette technique impose
de travailler sur de petites séquences
mais est bien adaptée à la recherche
de mutations ou de délétions dans
des zones précises sélectionnées par
le choix des amorces de la réaction.
Elle permet aussi de travailler sur de
l’ADN extrait de tissus xés au formol.
L’utilisation de la spectrométrie de
masse avec des techniques de MALDI-
TOF permet de rechercher des muta-
tions ou des variations d’un nucléotide
( single nucleotide polymorphisms
[SNP]). Elle peut être employée pour
lire des produits d’amplication après
méthode de Sanger, mais elle ne permet
pas d’études à grande échelle.
Les techniques de PCR allèle-spéciques
sont très utilisées pour la détection de
réarrangements spéciques, notamment
ceux des gènes des récepteurs aux anti-
gènes des lymphocytes B ou T dans les
leucémies aiguës lymphoblastiques.
Les techniques de nouvelle génération
La technologie développée par Lynx et
acquise depuis par Illumina, Inc. consti-
tue le premier type de NGS (gure 2) .
L’ADN à étudier est d’abord fragmenté
et chaque fragment est anqué à ses
extrémités de 2 séquences adaptatrices.
Cette étape conduit à l’obtention d’une
librairie de molécules d’ADN simple
brin de 200 à 500 paires de bases,
capables de se xer à une séquence
complémentaire de leurs adaptateurs.
Ces molécules sont ensuite déposées
sur une lame recouverte de milliers
d’amorces complémentaires des adap-
tateurs. Une série de séquences d’am-
plication dites “en pont” est réalisée
en présence d’oligonucléotides non
marqués. Cela permet, à chaque site de
xation d’une séquence simple brin, la
formation d’un cluster de molécules
d’ADN identiques. La troisième étape
est alors celle du séquençage, réalisé
par l’addition des 4 nucléotides en
conguration bloquante marqués par
4 uorochromes différents. Il n’est
donc possible de xer qu’un nucléotide,
correspondant, pour le premier cycle,
à la première base de l’ADN de chaque
cluster. La uorescence ainsi émise au
niveau des clusters est lue après une
excitation laser. Le nucléotide xé est
“renaturé” pour permettre la xation
de la base suivante et ainsi de suite.
La séquence est ainsi lue au fur et à
mesure de chaque cycle, sur chaque
cluster. Plusieurs dizaines de millions
de séquences peuvent ainsi être déchif-
frées simultanément en 3 à 4 jours.
Cette méthodologie permet la descrip-
tion du génome et l’identication de
SNP. L’utilisation d’amorces spéciques
permet de rechercher et de séquencer
des régions particulières du génome ;
par exemple, des sites de mutation ou
d’amplication.
La technique Helicos est une variante
qui incorpore un nucléotide à la fois,
ce qui évite les erreurs dans les régions
homopolymériques, mais elle ne permet
de lire que de courtes séquences.
La technologie 454 (développée par
Roche) repose sur le pyroséquençage,
comme décrit plus haut (figure 3,
p. 16) . La sensibilité et la rapidité de la
Figure2. Technique Illumina.
Au cycle suivant, ce cluster
apparaîtra dans la fluores-
cence correspondant
à la fixation d’un A
complémentaire du T
Des adaptateurs sont fixés aux extrémités des fragments d’ADN.
Cela permet de les fixer sur les adaptateurs complémentaires
de la lame de verre.
Chaque brin d’ADN est amplifié par PCR “en pont”.
Les clusters d’ADN identique ainsi amplifiés sont ensuite séquencés
en cycle en ajoutant une amorce complémentaire de l’adaptateur
et les nucléotides bloquants.
À chaque cycle, l’ajout d’un nucléotide se traduit par un signal
fluorescent au niveau du cluster correspondant sur la lame de verre.

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Les temps forts
en hématologie en 2011
dossier thématique
raconté à Juliette
REV/060/03-12-T - Photos : Gey Images.
REVLIMID® (lénalidomide) gélules. COMPOSITION(*) Gélule dosée à 5 mg (Revlimid 5 mg), 10 mg (Revlimid 10 mg), 15 mg (Revlimid 15 mg), 25 mg (Revlimid 25 mg) de lénalidomide. Excipient à effet notoire :
lactose anhydre. INDICATION Revlimid est indiqué, en associaon avec la dexaméthasone, pour le traitement du myélome mulple chez les paents ayant déjà reçu au moins un traitement antérieur. POSOLOGIE/
MODE D’ADMINISTRATION(*) Revlimid doit être pris chaque jour environ à la même heure. La dose iniale recommandée est de 25 mg de lénalidomide par voie orale en une prise par jour pendant les jours 1 à 21
des cycles récurrents de 28 jours. La dose recommandée de dexaméthasone est de 40 mg en une prise par jour par voie orale les jours 1 à 4, 9 à 12 et 17 à 20 de chaque cycle de 28 jours pour les 4 premiers cycles
de traitement, puis de 40 mg en une prise par jour les jours 1 à 4, tous les 28 jours pour les cycles suivants. Les médecins prescripteurs doivent déterminer avec précauon la dose de dexaméthasone à uliser, en
tenant compte de la pathologie et du statut de la maladie du paent. Le traitement par lénalidomide ne doit pas être inié si la numéraon des polynucléaires neutrophiles est < 1,0 x 109/l et/ou si la numéraon
plaqueaire est < 75 x 109/l ou, selon le niveau d’infiltraon des plasmocytes dans la moelle osseuse, si la numéraon plaqueaire est < 30 x 109/l. Il est recommandé d’ajuster la posologie pour prendre en charge
les neutropénies ou thrombopénies de grade 3 ou 4, ou autres effets toxiques de grade 3 ou 4 jugés en rapport avec le lénalidomide. Chez les paents âgés, le choix de la posologie devra être fait avec précauon
en raison de fréquentes diminuons de la foncon rénale. Lénalidomide est essenellement excrété par les reins. Aucun ajustement de la posologie n’est nécessaire chez les paents aeints d’insuffisance rénale
légère. Des ajustements de posologie sont recommandés en début de traitement en cas d’insuffisance rénale modérée ou sévère ou en cas d’insuffisance rénale terminale. Lénalidomide ne doit pas être ulisé en
pédiatrie. CONTRE-INDICATIONS Femmes enceintes. Femmes suscepbles de procréer, à moins que toutes les condions requises par le Programme de Prévenon de la Grossesse soient remplies. Hypersensibilité à
la substance acve ou à l’un des excipients. MISES EN GARDE ET PRECAUTIONS D’EMPLOI(*) GROSSESSE : En raison d’un effet tératogène aendu chez l’être humain, les condions du Programme de Prévenon
de la Grossesse doivent être remplies par toutes les paentes, à moins de pouvoir affirmer avec certude que la paente est dans l’impossibilité de procréer, sinon elle comprend la nécessité d’une contracepon
efficace. Les hommes traités par lénalidomide doivent comprendre les risques tératogènes aendus en cas de rapport sexuel avec une femme enceinte ou suscepble de procréer, et comprendre qu’il est
nécessaire d'uliser des préservafs en cas de rapport sexuel avec une femme suscepble de procréer. Les paents ne doivent pas faire de don de sang pendant la prise de lénalidomide et pendant 1 semaine après
la fin du traitement. AUTRES : • Des cas d’infarctus du myocarde ont été rapportés chez les paents recevant du lénalidomide, une surveillance étroite s’impose chez les paents présentant des facteurs de risque
connus (parmi lesquels un antécédent de thrombose) Des mesures doivent être prises pour essayer de réduire au minimum tous les facteurs de risques modifiables (par exemple le tabagisme, l’hypertension et
l’hyperlipidémie) • L’associaon lénalidomide/dexaméthasone est associée à un risque accru de thrombose veineuse profonde et d’embolie pulmonaire. L’érythropoïéne et les autres médicaments pouvant
accroître les risques de thrombose, comme les traitements hormonaux substufs, doivent être ulisés avec précauon. La prescripon d’an-thromboques en prophylaxie est recommandée, en parculier chez
les paents présentant des facteurs de risque de thrombose supplémentaires. En cas d’évènements thrombo-emboliques, le traitement du paent doit être interrompu et une thérapie ancoagulante standard doit
être mise en œuvre • L’associaon lénalidomide/dexaméthasone induit une incidence accrue de neutropénies et de thrombopénies. • Il est conseillé aux paents et à leurs médecins d’être aenfs aux signes
et symptômes évocateurs d’une hémorragie, notamment en cas de traitement concomitant suscepble d’induire des saignements. Une diminuon de la dose de lénalidomide pourra être nécessaire. Un
hémogramme complet, avec numéraon et formule leucocytaire, numéraon plaqueaire, hémoglobinémie et hématocrite, doit être réalisé en début de traitement, ainsi que de façon hebdomadaire pendant les
8 premières semaines du traitement par le lénalidomide, puis une fois par mois, afin de dépister les éventuelles cytopénies. L’administraon concomitante de lénalidomide et d’autres myélosuppresseurs ne doit
être entreprise qu’avec précauon. • Chez les paents insuffisants rénaux, la posologie devra être adaptée et il est recommandé de surveiller la foncon rénale. • Un contrôle de la foncon thyroïdienne devra être
envisagé. A l’heure actuelle, le potenel neurotoxique du lénalidomide ne peut être exclu en cas d’administraon prolongée. • En raison d’un risque de complicaons de type syndrome de lyse tumorale, les
paents présentant une charge tumorale élevée avant le traitement doivent faire l’objet d’une surveillance étroite et de précauons appropriées pendant le traitement. • Les paents ayant présenté des réacons
allergiques pendant un traitement antérieur par le thalidomide doivent faire l’objet d’une surveillance étroite en raison d’une possibilité de réacon croisée entre le lénalidomide et le thalidomide. • Le traitement
par Revlimid doit être arrêté en cas d’apparion ou de suspicion d’un syndrome de Stevens-Johnson ou d’un syndrome de Lyell. • Revlimid est contre-indiqué chez les paents présentant une intolérance au
galactose, un déficit en lactase de Lapp ou un syndrome de malabsorpon du glucose et du galactose. • Les paents doivent être avers qu’ils ne doivent jamais donner leur médicament à quelqu’un d’autre et qu’ils
doivent rapporter les gélules non ulisées à leur pharmacien en fin de traitement. • Cancers secondaires au traitement : Dans les études cliniques menées chez des paents recevant l’associaon lénalidomide/
dexaméthasone et ayant déjà reçu un traitement pour leur myélome, une augmentaon de l’incidence de cancers secondaires (CS) a été observée chez les paents sous lénalidomide/dexaméthasone. Les CS non
invasifs sont essenellement des épithélioma basocellulaire ou spinocellulaire. La majorité des CS invasifs étaient des tumeurs solides.Parmi les CS invasifs, des cas de leucémie aigüe myéloblasque (LAM), de
syndromes myélodysplasiques (SMD) et de tumeurs solides ont été observés chez des paents recevant Revlimid en associaon avec le melphalan ou immédiatement après melphalan à forte dose et autogreffe
de cellules souches (AGCS). Des cas d’hémopathies malignes lymphoïdes B (dont lymphome de Hodgkin) ont été observés dans les études cliniques au cours desquelles les paents ont reçu Revlimid après une AGCS.
Le risque de survenue d’un cancer secondaire doit être pris en compte avant d’instaurer le traitement par Revlimid. Les médecins doivent évaluer soigneusement les paents avant et pendant le traitement en
ulisant les méthodes habituelles de dépistage des cancers pour surveiller le développement de CS et instaurer un traitement s’il est indiqué. INTERACTIONS(*) Les agents érythropoïéques et les autres agents
pouvant accroître les risques de thrombose, comme les traitements hormonaux de substuon, doivent être ulisés avec précauon. Il ne peut être exclu que l’efficacité des contracepfs oraux se trouve réduite
lors du traitement. Les mesures efficaces nécessaires doivent être prises pour éviter toute grossesse. L’administraon de lénalidomide avec des médicaments inhibant les enzymes du cytochrome P450 ne devrait
pas entraîner d’interacons médicamenteuses métaboliques. Il est conseillé de surveiller étroitement la concentraon de la warfarine et de la digoxine pendant le traitement par le lénalidomide. CONDUITE DES
VEHICULES ET UTILISATION DES MACHINES(*) Des cas de fague, verges, somnolences et vision trouble ont été signalés. EFFETS INDESIRABLES(*) Lors de deux essais de phase II contrôlés par placebo (MM-009 et
MM-010), les effets indésirables les plus graves ont été les accidents thrombo-emboliques veineux (thromboses veineuses profondes, embolies pulmonaires) et les neutropénies de grade 4. Les effets indésirables
les plus fréquents et significavement plus fréquents dans le groupe lénalidomide/dexamethasone sont les suivants : neutropénie, thrombopénie, anémie, conspaon, diarrhées, érupons cutanées, fague,
asthénie, crampes musculaires. Des cas de cancers secondaires ont été reportés dans les essais cliniques menés chez des paents aeints d’un myelome, les cas de cancers secondaires (CS) non invasifs consistants
principalement en épithélioma basocellulaire ou spinocellulaire. SURDOSAGE(*) Traitement symptomaque. PROPRIETES PHARMACODYNAMIQUES(*) Immunomodulateur. Code ATC : L04 AX04. CONSERVATION
Pas de précauons parculières de conservaon. CONDITIONS DE PRESCRIPTION ET DE DELIVRANCE Liste I. Médicament soumis à prescripon hospitalière. Prescripon réservée aux spécialistes en oncologie ou
en hématologie, ou aux médecins compétents en cancérologie. Médicament nécessitant une surveillance parculière pendant le traitement. Pour tous les paents : la prescripon nécessite la signature d’un
accord de soins. Pour les femmes suscepbles de procréer : la prescripon est limitée à 1 mois de traitement ; un test de grossesse doit être réalisé tous les mois, dans les 3 jours précédant la prescripon ; la
date et le résultat du test de grossesse doivent être menonnés dans le carnet paent ; la délivrance doit être effectuée au plus tard 7 jours après la prescripon et après avoir vérifié la date et le résultat du
test de grossesse. AMM Boîtes de 21 gélules (3 plaquees thermoformées de 7 gélules) Revlimid 5 mg : EU/1/07/391/001 (CIP 34009 381 022-5 3), Revlimid 10 mg : EU/1/07/391/002 (CIP 34009 381 023-1 4),
Revlimid 15 mg : EU/1/07/391/003 (CIP 34009 381 024-8 2), Revlimid 25 mg : EU/1/07/391/004 (CIP : 34009 381 025-4 3) (AMM du 14 juin 2007, mise à jour janvier 2012). Spécialités
agréées collecvités publiques, inscrites sur la liste de rétrocession et sur la liste des spécialités prises en charge en sus de la T2A. Base de calcul par UCD des tarifs de responsabilité
et des prix de cession : Revlimid 5 mg : 164,082 € HT (UCD 929815-9), Revlimid 10 mg : 172,037 € HT (UCD 929811-3), Revlimid 15 mg : 181,464 € HT (UCD 929813-6), Revlimid 25 mg :
199,611 € HT (UCD 929814-2) TITULAIRE DE L’AMM Celgene Europe Limited, Royaume-Uni. Représentant en France : Celgene, S.A.R.L., 16-18 rue du Quatre Septembre, 75002 Paris
(*) Pour une informaon complète, consulter le RCP du médicament disponible sur le site de l’Afssaps. (mise à jour janvier 2012)
▲ Résumé des caractéristiques du produit.
● Dimopoulos M, et al. Lenalidomide plus dexamethasone for relapsed or refractory multiple myeloma. N Engl J Med. 2007;357:2123-32.
Durée médiane de la réponse: 16,5 mois bras Rev/Dex; vs 7,9 mois bras placebo/Dex.
Revlimid® est indiqué,
en associaon avec la dexaméthasone, pour le traitement du myélome mulple chez les paents ayant déjà reçu au moins un traitement antérieur
AP REV 210x297 03-12_1 13/03/12 12:41 Page1
technique dérivent d’une première ampli-
cation des fragments d’ADN xés sur
des microbilles au sein de gouttelettes
d’émulsion huileuse. Chaque bille capte
ainsi initialement un seul fragment d’ADN
(génomique ou plus souvent amplicon
ciblé). Après la phase d’amplication
par PCR, chaque bille est recouverte de
plusieurs millions de copies de la même
séquence et le pyroséquençage est réalisé
dans des micropuits ne contenant qu’une
bille. La technique de pyroséquençage
permet de détecter à chaque cycle quel
nucléotide a été ajouté dans chaque puits.
Enn, la technique SOLID (Supported
Oligonucleotide Ligation) utilise la
xation, grâce à une ligase, d’octamères
aléatoires d’oligonucléotides sur l’ADN
à séquencer à partir d’une amorce uni-
verselle. Deux des 8 nucléotides de l’oc-
tamère peuvent s’attacher. La continuité
de la séquence est obtenue en répétant
la réaction avec des amorces différant
d’un nucléotide. Cette méthode ne per-
met de lire que de courtes séquences.
Applications aux pathologies
onco-hématologiques
Les nombreuses anomalies chromoso-
miques associées aux leucémies et lym-
phomes constituent autant de cibles à
explorer non seulement pour comprendre
la physiopathologie de ces maladies,
mais également pour stratifier les
patients et probablement appliquer dans
un futur proche un traitement adapté.
Il ne s’agit pas là de séquencer de
l’ADN génomique, mais plutôt de recher-
cher des anomalies au sein d’amplicons
ciblés par une réaction de PCR pré-
alable concernant une région parti-
culière. Les technologies NGS sont
capables de détecter les SNP, les pertes
d’homozygotie ou d’hétérozygoties, les
amplications de gènes et les trans-
locations. Elles peuvent être adaptées à
l’étude du méthylome, du transcriptome
et des miRNA. À l’inverse de la tech-
nique de Sanger, qui est généralement
limitée à un seul gène, les méthodolo-
gies NGS permettent d’étudier des cen-
taines de gènes dans le même test avec
une grande sensibilité et une grande
précision. À titre d’exemple, A. Kohlmann
et al. (J Clin Oncol 2010) ont récem-
ment recherché dans les leucémies
lymphoïdes chroniques les mutations
de TET2, CBL, NRAS, KRAS, JAK2, MPL et
RUNX1 à partir de 43 amplicons ciblés
et séquençés dans un second temps.
La qualité du matériel de départ est
importante, notamment en termes de
représentativité des cellules portant
un matériel génomique anormal, la
sensibilité étant actuellement estimée
à environ 1 %. L’utilisation en paral-
lèle de génome normal est utile pour
détecter plus facilement les mutations
et pertes de matériel, mais la masse
de données actuellement disponibles
dans les banques, tant de génome nor-
mal que d’anomalies associées à des
pathologies précises, rend cette analyse
en parallèle de génome normal moins
cruciale. En revanche, la sensibilité des
techniques et les étapes d’amplica-
tion préalables au séquençage laissent
entrevoir la possibilité de travailler sur
des cellules isolées, cellules tumorales
circulantes pour les tumeurs solides,
maladie résiduelle pour les lymphomes
et les leucémies. ■
Figure3. Technique 454.
Des adaptateurs sont ajoutés aux fragments d’ADN.
Une dilution limite de l’ADN permet la fixation d’un seul fragment par bille.
La séquence fixée est amplifiée en millions de copies sur chaque bille.
Les billes sont distribuées dans des puits de manière à ce que chaque puits ne contienne qu’une bille.
Le pyroséquençage est réalisé en cycles additionnant chaque fois un seul nucléotide.
Si ce nucléotide correspond au suivant sur la séquence en cours de complémentation, un signal
lumineux est émis dans le puits.