Les spectrométries optiques Oxymétrie de pouls
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Les spectrométries optiques Oxymétrie de pouls Introduction-Généralités 1 – Les différentes méthodes spectroscopiques p pq Techniques utilisant la lumière naturelle 2 – Loi de BEER-LAMBERT BEER LAMBERT 3 – Spectrométrie UV-Visible UV Visible Application : Oxymétrie de pouls 4 – Spectrométrie S t ét i de d Fluorescence Fl Techniques utilisant la lumière polarisée 5 – Polarimétrie 6 – Dichroïsme circulaire 1 - Différentes méthodes spectroscopiques Principe Interaction d’une onde électromagnétique avec la substance à étudier Les ondes électromagnétiques g q E : vecteur champ p électrique q H : vecteur champ magnétique temps Longueur g d’onde m cm 100 µm µm 10 nm 10-1 10 103 105 107 0,1 nm 109 J.mol-1 Energie Micro-ondes Spin IR Visible et UV RX Variation de la Rotation Vibration distribution électronique Rayons Var. config. g noyaux en m 10-12 10-9 10-6 10-3 1 10 Diffraction des rayons X Fluorescence Structure molécules à l’état solide Quantitatif certaines molécules IR et Raman Etude liaisons interatomiques UV-Visible Polarimétrie Dispersion rotatoire optique Dichroïsme circulaire Transitions électroniques Config. absolue et conformation de molécules asymétriques Mesure du pouvoir rotatoire RPE P Paramagnétisme éti RMN Localisation de certains atomes } Techniques utilisant la lumière naturelle 3 – Spectrométrie UV-Visible 4 – Spectrométrie de fluorescence Absorption Absorption pour : Spectrométrie p d’absorption p atomique q Spectrométrie UV-Visible Spectrométrie Infrarouge Spectrométrie RMN 2 - Loi de BEER-LAMBERT Schéma de principe d’un spectrophotomètre Source détecteur monochromateur Affichage et/ou enregistrement 2 - Loi de BEER-LAMBERT Schéma de principe d’un spectrophotomètre détecteur Source comparaison monochromateur détecteur Affichage et/ou enregistrement 2 - Loi de BEER-LAMBERT (1760) L’intensité de la lumière transmise traversant un milieu homogène décroît géométriquement quand l'épaisseur l épaisseur traversée augmente arithmétiquement. arithmétiquement I0 A = llog I Dans un milieu non absorbant, chaque molécule de produit dissous absorbe la même quantité de lumière et ce, qu'elle que soit la concentration. A c.l l : traversée optique c : concentration molaire : coefficient d'extinction molaire Petit p problème A (DO) A (DO) A A 1 2 3 nm c C (mol.L-1) Petit p problème A (DO) C (mol.L-1) Petit problème p A (DO) A (DO) 1 3 nm C (mol.L-1) 3 – Spectrométrie UV-Visible Rappel sur les liaisons H2 H H 1S 1S 3 – Spectrométrie UV-Visible L’absorption par une molécule dans cette gamme d’énergie produit des variations de l’énergie l énergie électronique Un électron monte de l’orbitale stable qu’il occupe à une orbitale instable de p plus haute énergie g Dans une molécule, trois « familles » d’électrons : , et n n* * * E * n 3 – Spectrométrie UV-Visible Doublets libres transition – * O O- C C R’ N R R’ N R H H O O- C C R’ N H R’ N R H R 3 – Spectrométrie UV-Visible Systèmes conjugués transition – * C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C 3 – Spectrométrie UV-Visible Groupes chromophores Tout groupe insaturé présentant une absorption caractéristique dans l’UV ou le visible est appelé chromophore. Exemples de groupements chromophores C=O C=C 3 – Spectrométrie UV-Visible Groupes chromophores – Effet de la conjugaison C4H8–HC =CH2 max = a =b H2C=CH–C2H4-HC=CH2 max = a = 2b H2C=CH–HC=CH2 max = a+ = 2b+ max effet bathochrome 3 – Spectrométrie UV-Visible Groupes chromophores – Effet de la conjugaison = O C4H9-C-CH3 =O O max = c CH2=CH-C2H4-C-CH3 = O CH2=CH-C-CH CH C CH3 max max =d max = c max = a =d =b max = c+ + max = a+ =d = b+ effet bathochrome effet ff t hyperchrome h h Hyperchrome A (DO) Hypsochrome Bathochrome Hypochrome Auxochrome A h et varient Couleurs complémentaires carotène n = 11 -carotène CH3 – (CH = CH)n – CHO n=1 200 2 3 4 5 678 400 longueur d’onde en nm 3 – Spectrométrie UV-Visible Chromophores biologiques – Acides aminés OH Phénylalanine Tyrosine NH2 NH2 CH CH COOH COOH Tryptophane NH2 CH COOH NH Applications : Détermination de la concentration d’une protéine Suivi d d’une une purification (280 nm) Spectre d’absorption A (DO) Dosage g 220 260 300 Longueur d’onde d onde en nm C (mol.L-1) 3 – Spectrométrie UV-Visible Chromophores biologiques – Bases d’ARN et ADN Adénine Guanine Thymine Application : suivi d’ARN ou ADN (260nm) cytosine Dosage non biologique Fe++ solution bleu vert max = 460 nm Abs sorban nce Fe+++ solution rouille max = 304 nm 200 600 longueur d’onde en nm 3 – Spectrométrie UV-Visible Avantages • • • • • Simple Précise Sensible Non destructive Peu de matériel (50 µL) Un laborantin maladroit a enlevé les étiquettes des flaconnages contenant les trois cétones suivantes : CH3-CO-CH CO CH3 CH3-CO-CH=CH-CH=CH CO CH CH CH CH2 CH3-CO-CH CO CH2-CH CH2-CH CH2-CH=CH CH CH2 A B C Question 9 C h la Cocher l (ou ( les) l ) proposition(s) iti ( ) vraie(s) i ( ) A - Les produits A, B et C auront tous une bande d’absorption intense autour de 1700 cm-1 en spectroscopie Infra-Rouge. B - En spectroscopie UV-visible, UV visible la longueur d d’onde onde du maximum d d’absorption absorption dû à la fonction cétone du produit A sera inférieure à celle du maximum d’absorption dû à la fonction cétone du produit C. C - En spectroscopie UV UV-Visible Visible, le coefficient d d’extinction extinction molaire de la fonction cétone du produit A est supérieur à celui du produit B. D - En spectroscopie UV-Visible, le coefficient d’extinction molaire de la fonction double liaison du p produit B est supérieur p à celui du p produit C. E - Aucune des propositions ci-dessus. Bonnes réponses : A – D Question 10 Cocher la (ou les) proposition(s) vraie(s) A- L L’augmentation augmentation de la longueur d d’onde onde du maximum d’absorption lors de l’ajout d’un substituant sur un groupement chromophore est appelé « effet g hyperchrome ». B - Pour effectuer le dosage de traces du produit B par spectrométrie UV-Visible, on choisira de se placer à la longueur d’onde d’absorption de la fonction dont le coefficient d d’extinction extinction molaire est le plus élevé. élevé CD- Le spectre de RMN du produit A ne présentera qu’un singulet. On trouvera au moins un singulet dans le spectre de RMN des trois produits. E - Aucune des propositions ci-dessus. Bonnes réponses : B – C – D Application imposée : oxymétrie de pouls Mesure simple, non invasive, continue d la de l saturation t ti de d l’hémoglobine l’hé l bi artérielle té i ll en oxygène è Hé Hémoglobine l bi (Hb) (Hb)+ O2 O hé Oxyhémoglobine l bi (HbO2) Absorban nce (2échelles ≠) Application : oxymétrie de pouls Oxyhémoglobine HbO2 Hémoglobine Hb 0,0 400 600 longueur d’onde en nm Application : oxymétrie de pouls Abs sorban nce Rouge Infra Rouge proche HbO2 Hb 660 800 940 longueur d’onde en nm Application : oxymétrie de pouls Principe de la mesure A 660 nm : absorption principalement due à l’hémoglobine non oxygénée A 940 nm : absorption principalement due à l’oxyhémoglobine. Oxyhémoglobine dans artères Artères : flux pulsatile Hémoglobine dans veines Veines : flux continu Possibilité de calculer la saturation du flux pulsatile SpO2 Tranmis T Par le sang artériel Par le sang veineux Par les tissus A Absorbé é Lumiière incid dente Application : oxymétrie de pouls Application : oxymétrie de pouls Schéma de principe Diodes émettrices Sang artériel Tissu Sang veineux Photodétecteur Application : oxymétrie de pouls Application : oxymétrie de pouls SpO2 = HbO2 (Hb + HbO2) SpO2 > 95 % normal 95 % > SpO2 > 90 % hypoxie légère 90 % > SpO2 hypoxie sévère Attention Valeurs < 80 à confronter avec les valeurs obtenues par une autre méthode V l Valeurs < 65 non fi fiables bl Application : oxymétrie de pouls Limites de la techniques Régime pulsatile Régime insuffisamment pulsatile Mouvements du patient Vernis à ongle Intoxication au CO 4 – Spectrométrie de fluorescence Absorption Emission 4 – Spectrométrie de fluorescence Orbitale instable (niveau excité) Absorption orbitale stable (niveau fondamental) Niveaux excités N s Energie E 4 – Spectrométrie de fluorescence S2 S1 Absorption Emission Niveau fondamental S0 4 – Spectrométrie de fluorescence Définition de la fluorescence Une molécule U lé l quii a la l possibilité ibili é d'absorber d' b b un rayonnement lumineux incident et de restituer rapidement l'énergie absorbée sous forme d'un rayonnement lumineux d'une longueur d'onde supérieure à celle du faisceau incident est dite fluorescente. Aequorea victoria (GFP Green Fluorescent Protein) a - Caractéristiques de la fluorescence • L Longueur d’ d’onde d d’é d’émission i i • quantique q de fluorescence Rendement q • Coefficient d’extinction ou d’absorbance spécifique • Intensité de fluorescence a - Caractéristiques de la fluorescence Em mission Ex xcitation n Longueur d d’onde onde d d’émission émission abs b En nombre de photon em a - Caractéristiques de la fluorescence Emission Exc citation Longueur d d’onde onde d d’émission émission abs En nombre de photon em a - Caractéristiques de la fluorescence Emission Exc citation Longueur d d’onde onde d d’émission émission abs En nombre de photon em a - Caractéristiques de la fluorescence Rendement quantique de fluorescence If = Ia If : nombre de photons de fluorescence émis Ia : nombre de photons absorbés a - Caractéristiques de la fluorescence Coefficient d’extinction d extinction ou absorbance spécifique Comme UV Visible : probabilité d’absorption a - Caractéristiques de la fluorescence Intensité de la fluorescence b – Facteurs influençant la fluorescence T Température é , Solvant : polarité , , Liaisons hydrogènes, pH, Présences d’ions Temps : c – Fluorochromes Pas la majorité. Typiquement, molécules ayant un important système conjugué d’électrons . Molécules ayant cycles aromatiques nombreuses doubles liaisons conjuguées. conjuguées Molécules biologiques : GFP Mais aussi minéraux http://videoandco.chez-alice.fr/photosmineraux.html c – Fluorochromes HO O O COOH Fl Fluorescéïne éï d - Spectrofluorimètre schématique Echantillon I I0 Source Monochromateur If Monochromateur Technique T h i de d dosage d 100 à 10 000 fois plus sensible que la spectrométrie UV-Visible Détecteur Amplificateur Enregistreur c Emiss sion de ffluoresce ence 4 – Spectrométrie de fluorescence e – Applications Très nombreuses, dans des domaines très variés à l’aide de fluorochromes très variés. Une des applications en microscopie confocale Spectrométries utilisant la lumière polarisée 5 – Polarimétrie 6 – Dichroïsme circulaire Lumière polarisée Source temps Lumière polarisée lumière polarisée rectiligne Lumière polarisée rectiligne (linéaire) Théorie cinématique de FRESNEL E EG ED Théorie cinématique de FRESNEL E EG ED EG ED EG ED E Plan de polarisation Dans un milieu optiquement actif vG = c nG et vD = c nD E EG E ED EG ED Substances optiquement actives Molécules ne présentant ni centre, centre ni plan de symétrie Présence de carbone(s) asymétrique(s) Pas indispensable Pas automatique Vocabulaire : dans ce cas, on parle aussi de molécules chirales 5 – Polarimétrie ( donné) L id Loi de BIOT = [[]] l l pouvoir rotatoire (en degré °) concentration massique (en g.cm-3) longueur du trajet optique ( en dm) [] pouvoir rotatoire spécifique Dépend T solvant 5 – Polarimétrie ( donné) L id Loi de BIOT n La loi de BIOT est additive =l CH3 H HO i=1 []i i CH3 CO2H HO2C H OH 5 – Polarimétrie ( donné) Plan de polarisation Rotation du plan de polarisation d’un angle Substance active Polarisation rotatoire Vers la droite > 0 Vers la gauche < 0 substance Dextrogyre (+) Levogyre (-) 5 – Polarimétrie ( donné) A Appareillage ill Polarisateur Source Lumière naturelle Lumière polarisée Rotation du plan de polarisation Analyseur Observateur 5 – Polarimétrie ( donné) A li ti Applications Industrie pharmaceutique Industrie agroalimentaire Industrie cosmétologique Laboratoire 6 – Dichroïsme circulaire E EG ED EG ED L absorption préférentielle de l’une L’absorption l une de ces polarisations résulte en une déviation de la résultante. La mesure de cette déviation est appelée DICHROISME CIRCULAIRE + 6 – Dichroïsme circulaire C Courbe b de d dispersion di i rotatoire t t i optique ti [] fonction de Monotone positive G absorbe plus que D [[]] 200 nm 800 nm Monotone négative G absorbe moins que D 6 – Dichroïsme circulaire C Courbe b de d dispersion di i rotatoire t t i optique ti [] fonction de Effet COTTON positif [ ] [] 200 nm 800 nm Effet COTTON négatif 6 – Dichroïsme circulaire A li ti Applications Les structures secondaires n n’absorbent absorbent pas de façon égale la lumière polarisée circulaire gauche et la lumière polarisée circulaire droite. Et d de Etude d la l structure t t • Protéines • ADN • Sucres • Molécules chirales (cofacteur, hèmes, pigments…..) 6 – Dichroïsme circulaire Et d d Etude de lla structure t t secondaire d i d’une d’ protéine téi UV lointain 180 nm à 250 nm : - Détermination du contenu en structure secondaire de protéines - Etudes dynamiques (dénaturation (dénaturation, renaturation) 6 – Dichroïsme circulaire Et d d Etude de lla structure t t d’une d’ protéine téi UV lointain 180 nm à 250 nm : chromophore liaison peptidique O C H C H C n * N C * O 6 – Dichroïsme circulaire Et d d Etude de lla structure t t d’une d’ protéine téi Hélice - bande p positive à 192 nm transition π->π* - bande négative à 209 nm transition π->π* - bande négative à 222 nm transition n->π* [] (d deg.cm2.dmol-1) 60 000 Feuillet - bande positive à 196 nm transition n->π* - bande négative à 218 nm transition π->π* 40 000 Aléatoire - bande négative à 195 nm transition n->π* 20 000 0 20 000 40 000 160 200 240 (nm) 6 – Dichroïsme circulaire Et d d Etude de lla structure t t secondaire d i d’une d’ protéine téi Myoglobine Chymotrypsine 160 220 Structure en % Hélice 240 (nm) Feuillet Aléatoire Myoglobine 75 0 12 Chymotrypsine 10 34 36 6 – Dichroïsme circulaire Et d d Etude de lla structure t t secondaire d i d’une d’ protéine téi UV lointain 180 nm à 250 nm : - Détermination du contenu en structure secondaire de protéines - Etudes dynamiques (dénaturation (dénaturation, renaturation) - Effet de l’environnement sur la structure d’une molécule - Effet de ligands sur la structure - Etudes d’interactions protéine-protéine et acides nucléiques-protéines UV proche 250 nm à 350 nm : - Effet de ligands sur la structure - Effet de l’environnement l environnement sur la structure d’une d une molécule 6 – Dichroïsme circulaire Effet de l’environnement sur la structure d’une molécule 0 0 pH 7 pH 2 200 240 ((nm)) 250 290 Spectre de Dichroïsme Circulaire de l’α-lactalbumine Théorie cinématique de FRESNEL – Dichroïsme circulaire Animations http://www.enzim.hu/~szia/cddemo/edemo8.htm http://www.enzim.hu/~szia/cddemo/edemo14.htm
