Etude de l`interaction antagoniste entre Lactibacillus sp. et quelques

République Algérienne Démocratique et Populaire Ministère de l'enseignement
supérieur et de la recherche scientifique
Université d'Oran Es-Senia Faculté des Sciences
Département de Biologie
MEMOIRE DE MAGISTER
Option: Microbiologie Alimentaire
Thème
Etude de l’interaction antagoniste entre Lactibacillus sp.
et quelques souches d’entérobactéries
Présenté par
Mademoiselle Bey Faiza
Soutenu le : / /2009
Devant le jury:
Pr. SAIDI Djamel
Président
Université d’Oran
Pr. SLIMANI Miloud
Examinateur
Université d’Oran
Dr. ABBOUNI Bouziane
Examinateur
Université de Sidi Bel-Abbés
Dr. CHERIGUENE Abderrahim
Examinateur
Université de Mostaghanem
Pr. BENSOLTANE Ahmed
Rapporteur
Université d’Oran
Année universitaire
2008-2009
Remerciement
Avant tout, je remercie Dieu le Tous Puissant de m’avoir donné la force, le
courage, la santé et la patience pour pouvoir accomplir ce travail.
J’adresse mes sincères remerciements au Pr BENSOLTANE Ahmed
qui m’a offert par ses compétences scientifiques et pédagogiques et ses qualités
humaines, les moyens de mener à bien ce travail. Je tiens également à le remercier
pour la confiance et le soutien permanent.
J’adresse toute ma reconnaissance au Pr SAIDI Djamel d’avoir
accepter de présider le jury de soutenance.
Je remercie Pr SLIMANI Miloud, Dr ABBOUNI Bouziane et Dr
CHERIGUENE Abderrahim d’avoir accepter de juger mon travail.
Je remercie Monsieur BOUDILMI Benabdellah docteur vétérinaire au
laboratoire vétérinaire régional de Tlemcen.
A la mémoire de Monsieur LOKBANI Ismail spécialiste en virologie au
laboratoire vétérinaire régional de Tlemcen.
Je remercie Monsieur LAKHAL Abdalhafid chargé de cours à l’université
Aboubakr Belkaid Tlemcen.
A tous le personnelle du laboratoire vétérinaire régional de Tlemcen.
A mes chers parents pour leur aide, leur soutien durant mon travail, et à toute
ma famille.
Enfin je remercie tous ceux qui ont de prés ou de loin contribué
à la réalisation de ce travail.
Résumé
Afin de stabiliser le microbiote intestinal et prévenir ou traiter les infections
entériques, il est suggéré depuis des décennies d’utiliser certaines bactéries lactiques
dites « probiotiques». La consommation de ces bactéries, qui sont des composants
normaux du microbiote intestinal, aurait des effets bénéfiques sur la santé.
Cependant, leur éventuel rôle prophylactique ou thérapeutique n’a été que très peu
étudié.
En ce basant sur ces critères, on a réalisé l’interaction bactérienne entre les
souches de Lactobacillus (L. lactis, L. helveticus et L. rhamnosus) et les
Entérobactéries (E. coli, S. typhi et K. oxytoca) on passant par trois étapes :
La mise en évidence d’Entérobactéries qui repose sur l’observation
macroscopique et microscopique qui révèlent des petits bacilles à caractère Gram
négatif. La culture de ces bactéries dans des milieux sélectifs et dans des meilleures
conditions de croissance nous a permit d’isoler E. coli, S. typhi et K. oxytoca.
A la fin de cette étape on a réalisé l’antibiogramme qui a été important pour
étudier la réaction de ces bactéries vis-à-vis des antibiotiques utilisés et qui nous
conduit vers un traitement éventuel.
L’étude microbiologique des souches de Lactobacillus qui nous a montré que
ces bactéries sont des bacilles, Gram positif, les tests biochimiques et la fermentation
des sucres nous ont permit d’identifie et confirmé l’appartenance de ces souches au
genre Lactobacillus. L’étude de leurs sensibilité aux antibiotiques est un critère
important pour sélectionner les probiotiques , la résistance est recherché chez ces
souches pour qu’elles soient actif même après un traitement aux antibiotiques.
L’interaction entre Lactobacillus (L. lactis, L. helveticus et L. rhamnosus) et
les Entérobactéries (E. coli, S. typhi et K. oxytoca) a donné des résultats positifs
observés par la présence des halos d’inhibition. E. coli est inhibée par Lb1 avec un
diamètre de 19mm et de 23mm avec Lb2 et 18mm avec Lb3, tan disque S. typhi est
inhibée par Lb1avec un diamètre de 19mm et de 28mm avec Lb2 et 31mm avec Lb3,
et pour la souche K. oxytoca sa croissance est inhibée par Lb1 avec un diamètre de
17mm et de 22mm avec Lb2 et 19mm avec Lb3, et en fin on a constaté que Lb1
inhibe la croissance de E. coli ATCC 25922 avec un diamètre de 24mm et de 23mm
avec Lb2 et de 20mm pour Lb3. Des tests supplémentaires sont nécessaires pour
connaitre la nature exacte de l’agent inhibiteur. Les résultats ont montré que la
sécrétion des acides organique et la production des bactériocines sont à l’origine de
l’inhibition. A la fin on a réalisé, l’intérêt d’étudier cette interaction est de trouvé un
moyen de cont rôlé l’effet pathogène des Entérobactéries a base des propriétés
antimicrobiennes des souches de Lactobacillus.
Mots clés : Enterobactéries, Maladies intestinale, infection urinaires, Intéraction,
Lactobacillus, Probiotiques, Antagonisme, Bactériocines, infection entérique.
Abstract
For decades, the use of certain lactic acid bacteria as so-called probiotics has
been suggested in order to stabilize the intestinal microbiota and thus prevent or treat
enteric infections. Consumption of these bacteria, which are normal components of
human intestinal microbiota, is reputed to be beneficial to health. However, their
possible role as therapeutic or prophylactic agents has been studied very little.
While basing for on these criteria, we started to carry out the bacterial
interaction between Lactobacillus strains (L. lactis, L. helveticus, L. rhamnosus) and
Enterobacteria (E. coli, S. typhi and K. oxytoca) while passing by three stages:
The description of Entérobactérias which rests on the observation macroscopic
and microscopic who reveal small bacilli with character negative Gram. Culture of
these bacteria in mediums selective and in better conditions of growth us a made it
possible to insulate E. coli, S. typhi and K. oxytoca. With the end of this stage one
carried out the antibiogram which a was important for studies the reaction of
Entérobactérias with respect to the antibiotics used and which leads us towards a
possible treatment.
The study microbiological of Lactobacillus strains who showed us that these
bacteria are bacilli, positive Gram. Biochemical tests and the fermentation of sugars
us have allowed identifies and confirmed membership of these to the strains
Lactobacillus.The study of their sensitivity to antibiotics is a significant criterion to
select the probiotiques ones, resistance is required at these strains so that they are
active even after a treatment antibiotics.
The interaction between
Lactobacillus strains (L. lactis, L. helveticus, L.
rhamnosus) and Enterobacteria (E. coli, S. typhi and K. oxytoca) gave positive results
observed by the presence of the halations of inhibitions. E. coli is inhibited by Lb1
with a diameter of inhibition of 19mm and 23mm with Lb2 and finally of 18mm with
Lb3, In a second study the growth of S. typhi was inhibited by Lb1 with a diameter of
inhibition of 19mm and 28mm with Lb2 and finally of 31mm with Lb3.Thereafter
growth of K.oxytoca was inhibited by Lb1 with a diameter of inhibition of 17mm and
22mm with Lb2 and finally of 19mm with Lb3.At the end, growth of E. coli ATCC
25922 is inhibited by Lb1 with a diameter of 24mm and 23mm for Lb2 and 20mm for
Lb3 respectively. Additional tests are necessary to know the exact nature of the
inhibiting agent. The results showed that the secretion of the organic acids and the
production of the bacteriocin bactériocines is at the origin of inhibition. With the end
one carried out the interest to study this interaction of is found a means of controlled
the pathogenic effect of Entérobactéries has base of the antimicrobic properties of the
strains of Lactobacillus.
Key words: Enterobacteria, Diseases intestinal, enteric infection , Interaction,
Lactobacillus, Probiotics, Urinary infection, Antagonism , Bactoriocin.
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.(E. coli, S. typhi, K. oxytoca ) Entérobacteries ( L.lactis, L. helveticus, L. rhamnosus)
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E. coli, S. typhi, K. oxytoca
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ÑÚãæ ¡ Probiotique
.
Entérobacteries Lactobacillus
Lb2
23
31 Lb2
19
28
22 Lb 1
Lb 1
Lb 1
19
E. coli
Lb1
17
S. typhi
Lb3
K. oxytoca
E. coli ATCC 25922
. Lb3
Lb3
20 Lb2
18
Lb3
19 Lb2
23
24
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.
Infection urinaire
.Infection entérique
Entérobacteries :
Probiotique Lactobacillus
Listedes Abréviations
Liste des Abréviations
ADN
: Acide désoxyribonucleique.
ARN
: Acide ribonucleique ribosomale.
CVWT
: Centre vétérinaire wilaya de Tlemcen
C°
: Degrée celsius
CO2
: Gaz carbonique
D°
: Degrée dornic
Ec
: Escherichia cloi
g/l
: Gramme par litre
G+C
: Guanine+cytosine
H
: Heure
HCl
: Chlorure d’hydrogène
Ko
: Klebsiella oxytoca
Lb
: Lactobacillus
mg
: Milligramme.
min
ml
: Minute
: Millilitre
NaCl
: Chlorure de sodium
NaOH
: Hydroxyde de sodium
O2
: Oxygène
pH
: Potentiel d'hydrogène
St
: Salmonella typhi
Ufc
: Unité formant colonies
μ
: Micron
μg
: Microgramme
%
: Pour cent
Listedes Tableauxet Figues
Liste des tableaux
Tableau 1 : Rôles des différents groupes bactériens retrouvés dans le microbiote.
Tableau 2 : Principaux agents infectieux responsables d’infections entériques.
Tableau 3: Les Milieux d'isolement des bactéries lactiques.
Tableau 4 : Différents genres de bactéries lactiques et leurs principales
Caractéristique.
Tableau 5 : Liste d’éspéces du genre Lactobacillus.
Tableau 6: Liste des principales souches microbiennes considérées comme
probiotiques.
Tableau 7 : Principaux critères de sélection des probiotiques.
Tableau 8 : Provenance des souches.
Tableau 9 : Liste des antibiotiques testés et leurs charges.
Tableau 10: Tests biochimiques recherchés pour l’identification des souches
des étudiées.
Tableau 11 : Résultats du test de l’antibiogramme pour les souches d’E. coli.
Tableau12 : Résultats du test de l’antibiogramme pour les souches de S. typhi.
Tableau 13 : Résultats du test de l’antibiogramme pour les souches de K.oxytoca.
Tableau 14 : Résultat du test de fermentation des sucres par les souches de
Lactobacillus (Lb1, Lb2 et Lb3).
Tableau 15: Résultat de l’antibiogramme des étudies isolées Lb1, Lb2 et Lb3.
Tableau 16 : Résultats d’halos d’inhibition d’antagonisme entre Lb1, Lb2, Lb3 et
Ec1, St1, Ko1 et E. coli ATCC 25922.
Tableau 17: Résultats de la densité optique de S.typhi (St 1) et S. typhi (St1) + 1 ml de
Hcl.
Tableau 18 : Résultats de la densité optique de S.typhi et S. typhi + 1 ml de
surnageant.
Tableau 19: Contrôle de Qualité: Escherichia coli ATCC 25922.
Tableau 20 : des résultats des teste biochimiques API20E.
Liste des figures
Figure 1: Colonisation microbienne du tractus gastrointestinal humain.
Figure 2 : E. coli observés au microscope électronique
Figure 3 : Pathogénie de la souche E. coli chez l’humain
Figure 4 : S. typhi observés au microscope électronique
Figure 5: K. oxytoca observés au microscope électronique
Figure 6 : Le système immunitaire intestinal
Figure 7: Défenses antimicrobiennes de l’hôte face à l’intrusion de microorganismespathogènes au niveau du tractus intestinal.
Figure 8 : Lactobacillus rhamnosus (à gauche) et, Lactobacillus helveticus (à droite),
observés au microscope électronique.
Figure 9: Schéma représentatif de la méthodologie de prélèvement et d'identification
des souches étudiées. CVWT
Figure 10: Test de fermentation des sucres
Figure 11: méthode de la recherche des halos d’inhibition.
Figure 12 : schéma représentant la recherche de Bactériocine
Figure 13: Aspect macroscopique d’E.coli après incubation à 37°C /24h
Figure14: Aspect macroscopique d’S .typhi après incubation à 37°C /24h
Figure15 : Aspect macroscopique de K.oxytoca après incubation à 37°C /24h
Figure16 : Observation microscopique de la souche E.coli (G x100).
Figure 17 : Observation microscopique de la souche S.typhi (G x100).
Figure 18: Observation microscopique de la souche K.oxytoca (G x100).
Figure 19: Résultats de l’identification biochimique de la souche E.coli.
Figure 20: Résultats de l’identification biochimique de la souche S.typhi.
Figure 21: Résultat de l’identification biochimique de la souche K. oxytoca.
Figure 22 : Résultat de l’antibiogramme de la souche E. coli (Ec1).
Figure 23 : Résultat de l’antibiogramme de la souche S. typhi (Ec1).
Figure 24: Résultat de l’antibiogramme de la souche Klebsiella oxytoca (Ko4).
Figure 25 : L’aspect des colonies de la souche L. rhamnosus (Lb3) ensemencé par
stries sur milieu MRS gélosé, incubées à 30°C pendant 48heures en aeroanaerobiose
Figure 26: Observation microscopique de la souche L. rhamnosus (Lb3)
Figure 27 : Test de fermentation des trois souches de Lactobacillus Lb1, Lb2, Lb3
Figure 28 : Profil fermentaire de la souche L. lactis (Lb1).
Figure 29 : Profil fermentaire de la souche L. helveticus (Lb2).
Figure 30: Profil fermentaire de la souche L. rhamnosus (Lb3).
Figure 31: Résultats du test d’antibiogramme de la souche L. rhamnosus (Lb3).
Figure 32 : Cinétique d’évolution de l’acidité Dornic produite par les souches Lb1,
Lb2 et Lb3 à 30°C
Figure 33 : Variation du pH des souches de Lactobacillus, lors du suivie de l’acidité
titrable
Figure 34 : Résultat de l’interaction entre E. coli ATCC 25922 et Lb1, Lb2 et Lb3
Figure 35 : Résultat de l’interaction entre E. coli (Ec1) et Lb1, Lb2, Lb3
Figure 36: Résultat de l’interaction entre S. typhi (St1) et Lb1, Lb2, Lb3
Figure 37: Résultat de l’interaction entre K. oxytoca: (Ko1) et Lb1, Lb2, Lb3
Figure 38: Croissance de S. typhi (St1) en fonction du pH.
Figure 39: Croissance de S. typhi (St1) en présence de bactériocine produite par
Lactobacillus rhamnosus (Lb3)
Sommaire
Sommaire
Introduction
Etude bibliographique
1-Ecosystème gastro-intestinal
1.1-Description générale
1.2-Microflore intestinale
1.3- Importance de la barrière microbienne
1.4- Les infections entériques et réponses de l’hôte
1.4.1- Principales causes d’infections entériques
1.4.2- Bactéries pathogènes
1.4.2.1- Escherichia coli
1.4.2.1.1- Habitat
1.4.2.1.2- Caractérisation d’Escherichia coli
1.4.2.1.3-Caractères morphologiques
1.4.2.1.4- Caractères culturaux
1.4.2.1.5- Caractères biochimiques
1.4.2.1.6- Résistance aux agents physiques et chimiques
1.4.2.1.7- Structure antigénique
1.4.2.1.7.1-Antigène O, Antigène de la paroi ou Antigène somatique
1.4.2.1.7.2- Antigène K, antigène capsulaire ou antigène d’enveloppe
1.4.2.1.7.3- Antigène H ou antigène flagellaire
1.4.2.1.7.4- Antigène F ou antigène fimbriaire
1.4.2.1.8- Pouvoir pathogène
1.4.2.1.9- Groupes pathogènes d'E. coli
1.4.2.1.9.1- E. coli entéropathologène (ECEP)
1.4.2.1.9.2- E. coli entérotoxinogène (ECET)
1.4.2.1.9.3- E. coli entero-invasive (ECEI)
1.4.2.1.9.4- E. coli enterohemorragique (ECEH)
1.4.2.1.9.5- E. coli enteroaggrégant et enteroadhérant (ECEAgg)
1.4.2.1.10- Moyens de lutte et traitements actuels
1.4.2.2- Salmonella typhi
1.4.2.2.1-Habitat
1.4.2.2.2- Caractérisation de S. typhi
1.4.2.2.3- Caractères morphologiques
1.4.2.2.4- Caractères culturaux
1.4.2.2.5- Caractères biochimiques
1.4.2.2.6- Structure antigénique
1.4.2.2.6.1- Antigènes somatiques (ou antigène O)
1.4.2.2.6.2 -Antigènes flagellaires (ou antigène H)
1.4.2.2.6.3-Antigènes capsulaires (ou antigène Vi)
1.4.2.2.7-Pouvoir pathogène
1.4.2.2.8- Physiopathologie et symptomatologie de Salmonella typhi
1.4.2.3- Les Klebsiella
1.4.2.3.1- Habitat
1.4.2.3.2- Caractérisation de la bactérie
1.4.2.3.3- Caractères morphologiques
1.4.2.3.4- Caractères culturaux
1.4.2.3.5- Caractères biochimiques
1.4.2.3.6- Structure antigénique
1
3
3
3
4
8
8
9
9
9
9
9
10
11
12
12
12
13
13
13
14
15
16
16
16
17
17
17
18
18
18
18
19
19
19
20
20
20
20
21
22
22
22
23
23
23
24
1.4.2.3.7-Pouvoir pathogène
1.5- Modulations des mécanismes de la réponse immunitaire
1.6 Défenses de l’hôte
2- Les bactéries lactiques
2.1. Définition et caractéristiques généraux des bactéries lactiques
2.2. Les milieux naturels des bactéries lactiques
2.3-Taxonomie et classification
2.3.1. Caractère morphologique
2.3.2- Classification des bactéries lactiques
2.4-Les Lactobacillus
2.4.1- Habitat
2.4.2-Caractères morphologiques
2.4.3- Caractères culturaux
2.4.4-Caractères biochimiques
2.5- Phénomènes des interactions entre les bactéries
2.6- Production des bactériocines
3- Les probiotiques
3.1-Historique de leur utilisation et définitions
3.2-Souches à fort potentiel probiotique
3.3- Critères de sélection des probiotiques
3.4-Allégations santé
Matériel et Méthodes
1-MATERIELS
1.1-Souches étudiées
1.2-Souche de référence
1.3-Antibiotiques testés
1.4-Milieux de culture
2-METHODES
2.1-Identification des souches isolées
2.1.1-Examen bactériologique
2.1.2-Enrichissement
2.1.3-Isolement
2.1.4-Identification
2.1.4.1- Examen macroscopique
2.1.4.2 - Examen microscopique
2.1.4.3 -Identification des caractères biochimiques
2.1.4.3.1-Test des 3 sucres
2.1.4.3.2- Test mannitol-mobilité
2.1.4.3.3- Test de Simmons
2.1.4.3.4- Production d’acétone
2.1.4.3.5- Recherche de la production d’indole
2.1.4.3.6- Recherche de à ß-galactosidase
2.1.4.3.7- Recherche de l’uréase et du tryptophane désaminase
2.1.4.3.8- Recherche de nitrate réductase
2.1.4.3.9- Recherche de l’oxydase
2.1.4.3.10- Recherche de L.D.O ; O.D.C et ADH
2.1.5- Antibiogramme
2.2- Vérification de la pureté des souches de Lactobacillus sp
2.2.1-Tests enzymatiques
2.2.1.1-Recherche de catalase
2.2.1.2-Recherche de l’oxydase
2.2.2- Antibiogramme
24
24
25
27
27
30
32
32
32
34
34
34
35
35
42
44
45
45
46
47
50
52
52
53
53
54
55
55
55
55
55
56
57
57
57
57
57
58
58
58
58
59
59
59
59
60
61
61
61
61
61
2.2.3-Tests physiologiques
2.2.3.4- La production de CO2 de la fermentation du glucose
2.2.3.5-Fermentation des sucres
2.2.3.6- Suivie de l’acidité titrable
2.2.3.7- Suivi du pH
2.3-Test de l’antagonisme
2.3.1-Préparation des précultures
2.3.2-Recherche des inhibitions
2.3.3-Recherche des agents d’inhibition
2.3.3.1- Le pH
2.3.3.2 - Recherche de bactériocines
Résultats
1-Identification des entéropathogène : E.coli, S.typhi, K.oxytoca
1.1-Etude bactériologique
1.2- Identification des caractères biochimiques
1.3- Antibiogramme des souches isolées : E.coli, S.typhi, K.oxytoca
2-Vérification de la pureté des souches de Lactobacillus : Lb1, Lb2, Lb3
2.1-Etude macroscopique et microscopique
2.2- Tests physiologiques et biochimiques
2.2.1- Activités enzymatiques
2.2.2- Production de CO2
2.2.3- Identification de l’espèce par le profil fermentaire
2.3- Antibiogramme
2.4-L’acidification du lait
3- Test de l’antagonisme
3.1- Recherche des inhibitions
3.2- Recherche des ageant d’inhibition
3.2.1- Le pH
3.2.2- Recherche de bactériocines
62
62
62
63
64
65
65
65
67
67
67
69
69
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80
80
83
83
84
Discussion
1- Isolement et identification des souches d’entérobactéries
2- Identification des souches de Lactobacillus
3- Interaction bactériennes
85
88
90
Conclusion et Perspectives
Références bibliographiques
Publications scientifique
Annexe
94
96
Introduction
Introduction
Introduction
Chaque année, les infections entériques surviennent en grand nombre, ce
problème important de santé publique touche tous les groupes d’âge et
particulièrement les populations sensibles telles que les nourrissons, les enfants et les
personnes âgées.
Les bactéries pathogènes Campylobacter, Salmonella, Klebsiella et E. coli sont
les causes les plus communes d’infection entérique au niveau mondial (Fasano,
2001 ; Lamps, 2007) et l’incidence de ces micro-organismes demeure préoccupante.
De façon générale, les entéropathogènes bactériens représentent près de 15%
des cas de diarrhées dans les pays développés et plus de 50% dans les pays en voie de
développement (DuPont, 2005).
Environ 1 Enfant sur 10 en meurt avant d'atteindre l'âge de 5 ans. La diarrhée
peut être d'origine bactérienne, parasitaire ou virale (Tortora et al., 2003)
Actuellement, l’antibiothérapie est le traitement le plus commun contre les infections
à E. coli. Cependant des études cliniques récentes ont montré que leur utilisation ne
serait pas recommandée car ils peuvent être associés à un risque plus élevé de
développer un syndrome urémique hémolytique chez les enfants et les personnes
âgées en plus d’allonger la durée de la diarrhée (Molbak et al., 2002 ; Panos et al.,
2006), et vue la résistance bactérienne croissante avec l'utilisation abusive des
antibiotiques l'alternative de ce problème pourrait être la consommation de bactérie
probiotiques (Syndifrais, 2005).
Depuis quelques années, les bactéries probiotiques ayant des effets bénéfiques
sur la santé reçoivent un engouement croissant. L’utilisation des probiotiques en
thérapeutique a naturellement concerné en premier lieu les maladies de l’appareil
digestif, et en particulier les maladies de l’intestin grêle et du colon ; les travaux en
1
Introduction
pathologie digestive ont utilisé soit des « probiotiques-aliments», ou plus souvent, des
«probiotiques-medicaments» (Pelletier et al., 2007).
Plusieurs études ont montré l’effet thérapeutique des probiotiques sur les
diarrhées aigue infectieuse et diarrhée compliquant l’antibiothérapie (De-Vrese et
Marteau, 2007) sur les maladies inflammatoire chroniques intestinales (Barnich et
Darfeuille-Michaud, 2007 ; Falagas et al., 2008). Mais des études supplémentaires
sont nécessaires pour déterminer de façon précise le mécanisme d’action de chaque
souche probiotique.
Alors pourquoi ne pas essayer
de détecter la présence de substances
antimicrobiennes chez nos souches de Lactobacillus, tel est l'objectif de notre étude
qui est divisé en deux parties :
 La première partie : une étude bibliographique qui révèle plusieurs points sur
les Entérobactéries (E. coli, S. typhi et K. oxytoca) concernant les aspects
microbiologiques, épidémiologiques, physiologiques et thérapeutiques et
l’importance des bactéries lactiques comme organismes probiotiques.
 La deuxième partie : composé d’une méthodologie de travail, puis résultats et
discussion.
Le but de notre travail est :
1- Isolement et identification des entérobactéries à savoir : E. coli, S. typhi
et K. oxytoca à partir des selles et des urines des patients hospitalisés ou
CHU de Tlemcen.
2- Une vérification de la pureté des souches de Lactobacillus isolé à partir
du lait de chamelle aimablement offertes par le laboratoire de
microbiologie du centre vétérinaire de la wilaya de Tlemcen.
3- La recherche des inhibitions inter- bactériennes.
2
EtudeBibliographique
Etude bibliographique
1- Ecosystème gastro-intestinal
1.1- Description générale :
Le tractus gastro-intestinal est un écosystème complexe et ouvert aux
microorganismes exogènes. De par sa surface totale (muqueuse) estimée à 200-300
m2, il représente la plus grande surface du corps en contact avec l’environnement.
L’écosystème gastro-intestinal est généré par une alliance stable entre l’épithélium
gastro-intestinal, le système immunitaire et une importante flore microbienne. Ces
trois composants sont continuellement liés entre eux et évoluent ensemble en assurant
une fonction et une activité normales de l’écosystème. Si l’un des trois composants
de l’écosystème est défaillant, l’alliance est altérée et par conséquent diverses
pathologies s’y installent (Mc Cracken et Lorenz, 2001).
Il existe plusieurs compartiments constituant le tractus gastro-intestinal de
l’homme .Les interactions entre les microorganismes et l’hôte peuvent être de trois
types: symbiose, commensalisme et pathogénique. L’hôte est protégé contre la
microflore intestinale pathogène par les barrières chimiques et physiques formées par
l’épithélium gastro-intestinal (Hooper et Gordon, 2001).
1.2-Microflore intestinale :
La flore intestinale normale est une collection complexe et en équilibre de
microorganismes qui habitent normalement le tractus gastro-intestinal et remplissant
un rôle dans la nutrition, la physiologie et le contrôle du système immunitaire de
l’hôte. Après une colonisation complète, la microflore intestinale est considérée
comme un organe acquis après la naissance. Il est constitué d’une grande diversité
d’espèces microbiennes assurant différentes fonctions pour l’hôte. La microflore du
tractus gastro-intestinal a été estimée de 1013 à 1014 cellules microbiennes
représentant 400 à 500 espèces et sous espèces. Cette microflore représente environ
10 fois le nombre total de cellules du corps humain (Bjorksten, 2004).
3
Etude bibliographique
La prévalence des bactéries dans le tractus gastro-intestinal dépend des
conditions régnant dans le compartiment du tractus. Deux catégories de bactéries ont
été identifiées : les bactéries autochtones ou indigènes se trouvant dans des niches
particulières, et les bactéries allochtones ou transitoires rencontrées dans d’autres
habitats du tractus. La majorité des bactéries pathogènes sont allochtones et vivent
normalement en harmonie avec l’hôte, excepté lorsque l’équilibre du système est
rompu (Hao et Lee, 2004).
1.3- Importance de la barrière microbienne :
Le microbiote résident du tractus gastrointestinal humain contient diverses
populations de bactéries qui jouent un rôle essentiel dans le développement et le bienêtre de l’hôte (Liévin-Le Moal et Servin, 2006). En plus de ses effets nutritionnels et
physiologiques, le microbiote intestinal participe à la protection de l’hôte en agissant
comme une barrière microbienne contre l’infection par des pathogènes microbiens
(Servin, 2004). Ce rôle est communément appelé «l’effet barrière».
L’établissement de cet écosystème microbien complexe s’effectue dès les
premières heures de vie d’un nouveau-né, qui en est initialement dépourvu (Steer et
al., 2000). Les premiers germes rencontrés sont des entérobactéries (E. coli
essentiellement) et streptocoques (Cibik et al., 2004). Puis vers le deuxième-troisième
jour, apparaissent des espèces variées appartenant aux genres Bifidobacterium,
Lactobacillus, suivent ensuite les Bacteroides et Clostridiae (Ballongue, 1998).
Jusqu’à l’âge de deux ans, le microbiote se diversifiera et s’établira dans les
différents compartiments du tractus digestif tel qu’illustré à la Figure 1.
La connaissance des genres et des espèces dominantes, de même que leurs
concentrations et leurs activités biologiques sont utiles pour comprendre l’écologie
du tractus gastrointestinal. Le microbiote de l’estomac est peu élevée avec des
concentrations inférieures à 103 cfu/ml et sont en général des micro-organismes
Gram-positifs et aérobiques (Gibson et Beaumont, 1996).
4
Etude bibliographique
L’intestin grêle constitue une zone de transition entre la population disparate de
l’estomac et le microbiote luxuriant du côlon. En conditions normales, le microbiote
de la première partie du duodénum est similaire à celle de l’estomac. Les espèces
dominantes incluent entre autres les streptocoques et lactobacilles (Mackie et al.,
1999). Dans la dernière partie de l’intestin grêle, le nombre de bactéries Gramnégatifs dépasse celui de Gram-positifs. Les coliformes et les bactéries anaérobiques
telles que les Bacteroides, bifidobactéries et fusobactéries sont régulièrement présents
en concentrations substantielles jusqu’environ 108 cfu/ml (Mackie et al., 1999).
A la suite de l’intestin grêle, la concentration bactérienne augmente rapidement
pour atteindre 1010 à 1012 cfu/g (Conway, 1995; Macfarlane et al., 2004). Les
bactéries anaérobiques dépassent les aérobes. Les bactéries dominantes sont les
Bacteroides, bifidobactéries, coques Gram-positifs, clostridia et différentes espèces
d’entérobactéries sont aussi présentes (Guarner, 2006).
En général, les populations bactériennes à l’intérieur du tractus gastrointestinal
coexistent en ayant chacune leur niche écologique nécessaire à leur croissance (Fooks
et Gibson, 2002). Cependant, pour fonctionner de façon optimale, la balance du
microbiote bactérien doit être maintenue de façon équilibrée mais de nombreux
facteurs peuvent l’affecter. La composition globale du microbiote dans l’intestin peut
être influencée par l’âge de l’hôte, l’état de santé, l’alimentation (riche en sucres ou
en protéines) et l’adaptation de chaque espèce (Ventura et al., 2004). Ceci explique
les variations interindividuelles retrouvées dans la population en général (Hopkins et
al., 2002). Un autre facteur contributoire est la consommation de médicaments, en
particulier les antibiotiques, qui détruisent les bactéries et peuvent avoir un impact
négatif sur la balance du microbiote intestinal. Ainsi, tous ces facteurs peuvent
déplacer l’équilibre du microbiote contenant des bactéries potentiellement bénéfiques
vers des micro-organismes néfastes comme les clostridia, les réducteurs de sulphates
et les Bacteroides protéolytiques (Salminen et al., 1998).
5
Etude bibliographique
Figure 1: Colonisation microbienne du tractus gastrointestinal humain.
Adapté de Holzapfel et al. (1998).
Le concept des espèces bénéfiques existe depuis longtemps (Liévin et al.,
2000). selon ce concept, certaines bactéries formant le microbiote intestinal seraient
associées à des effets positifs sur la santé, alors que d’autres sont considérées comme
néfastes (Tableau 1).
Les bactéries potentiellement favorables pour la santé incluent principalement
les genres Bifidobacterium et Lactobacillus et leur dominance chez les nouveaux-nés
nourris au sein leur procureraient une protection contre les infections intestinales
(Picard et al., 2005).
6
Etude bibliographique
Tableau 1 : Rôles des différents groupes bactériens retrouvés dans le
microbiote
Bactéries intestinales
Bifidobactéries
Lactobacilles
Bacteroides
Rôles
Digestion/ absorption des aliments,
stimule la fonction immunitaire,
synthèse de vitamines
Effet
+
Digestion/ absorption des aliments,
stimule la fonction immunitaire
+
Synthèse de vitamines
putréfaction intestinale
+
Entérocoques
E. coli
Inhibition de bactéries exogènes
diarrhée/ constipation
+/-
Streptocoques
Stimule la fonction immunitaire
production de précurseurs cancéreux
+/-
Ps. aeruginosa
Proteus sp
Putréfaction intestinale
-
Staphylocoques
Clostridium
Production de précurseurs cancéreux
-
Veillonellae
Adapté de Salminen et al. (1998); Guarner (2006).
Tel que souligné par Servin et al. (2004), il apparaît de plus en plus évident que
les bactéries appartenant aux genres Bifidobacterium et Lactobacillus possèdent des
activités antimicrobiennes qui participent au système de défense gastrointestinal de
l’hôte. Il est ainsi intéressant d’améliorer la composition du microbiote intestinal par
les aliments en apportant des bactéries transitoires. Le but étant d’augmenter le
nombre et l’activité des microorganismes possédant des propriétés bénéfiques à la
santé.
7
Etude bibliographique
1.4- Les infections entériques et réponses de l’hôte :
1.4.1- Principales causes d’infections entériques :
Les infections entériques résultent de l’ingestion de micro-organismes
pathogènes ou de leurs toxines (Steer et al., 2000). Il existe une grande variété de
bactéries, virus et parasites à l’origine des infections entériques (Tableau 2).
Cependant, les micro-organismes d’origine bactérienne et virale sont le plus
souvent impliqués dans les cas rapportés et leur mode de transmission se fait
principalement par la voie oro-fécale (Mead et al., 1999; Tauxe, 2002). Ces
principaux entéropathogènes sont capables d’envahir le tractus intestinal pour s’y
multiplier et causer principalement des symptômes diarrhéiques mais également dans
certains cas des nausées, des vomissements et une altération générale de l’état de
santé (Steer et al., 2000).
Tableau 2 : Principaux agents infectieux responsables d’infections entériques.
Adapté de Koopmans et al. (2002); Gadewar et Fasano (2005); Lamps (2007).
Bactéries
Virus
Parasites/protozoaires
Campylobacter
Salmonella
E. coli
Shigella
Vibrio cholera
Clostridium difficile
Norovirus
Rotavirus
Astrovirus
Adenovirus entériques
(types 40, 41)
Entamoeba histolytica
Giardia lamblia
Cryptosporidium parvum
Microsporidium
Isospora belli
Cyclospora cayetanensis
Hépatite A et E
Aeromonas
Pleisiomonas
Yersinia
Klebsiella
8
Etude bibliographique
1.4.2- Bacteries pathogenes
1.4.2.1- Escherichia coli :
Théodor Escherichia, médecin Allemand fut en 1885 l'inventeur d'une bactérie
particulière bacterium coli commune qui sera appelée plus tard Escherichia coli
(Guiraud, 1998)
1.4.2.1.1- Habitat :
Depuis plus d'un siècle, il est connu que Escherichia coli est un hôte normal
de la flore digestive de l'homme et de nombreuses espèces animale souvent retrouvés
en petit nombres dans les urines saines, c’est une bactéries largement répandue dans
le milieu extérieur; elle ne semble cependant pas pouvoir y mener une vie saprophyte
authentique : sa présence en quantité importante témoigne d'une contamination fécale
récente .(Savage, 1977 ; Grimont, 1997 ; Joffin, 2002).
1.4.2.1.2- Caractérisation d’Escherichia coli :
Elle fait partie du groupe des Entérobactéries. Cette bactérie constitue une
espèce aérobie quantitativement la plus importante à raison de 107 à 109 corps
bactériens par gamme dans le caecum ou le rumen. (Pilet et al., 1981 ; Grimont,
1997 ; Phillipon, 2007).
1.4.2.1.3-Caractères morphologiques :
Bacille à bout arrondi, Gram-, mesure approximativement 2 à 4 µ de
longueur sur 0.6 µ de largeur, ne possédant ni capsule ni spores, elle se présente isolé
ou en courtes chaînettes (Figure 2), et en quelque cas, sous forme de très long
filaments. (Djelouat, 2008).
Pourvu de cils, elle est généralement mobile grâce à une ciliature péritriche
mais cette mobilité est très variable selon le milieu où la souche a été ensemencée.
9
Etude bibliographique
Certaines souches développent des capsules et cultivent sur milieux solides en
donnant des colonies muqueuses. (Le Minor et Richard ,1993).
Figure 2 : E. coli observés au microscope électronique (Ducluzeau, 2006).
1.4.2.1.4- Caractères culturaux :
Aérobie facultatif, elle cultive bien en 24 heures à 37 °C sur les milieux gélosés
en donnant des colonies rondes; lisses, à bords régulier, de 2 à 3mm de diamètre.
(Marchal et al., 1991).
La culture en bouillon ordinaire, rapide, produit un trouble avec ondes et
parfois un voile grisâtre en surface (Pasteur. 1981 ; Marchal et al., 1991).
Sur gélose ordinaire, la bactérie donne une culture blanchâtre, épaisse
crémeuse, devenant rapidement opaque, et envahissant toute la surface du milieu, et
sur milieu gélosé Mac Conkey les colonies sont lactose positif et donnent une
coloration rouge brique (Pasteur. 1981 ; Marchal et al., 1991). Toutes ces cultures
répandent, en générale, une odeur fécaloïde. (Pilet et al., 1981).
10
Etude bibliographique
1.4.2.1.5- Caractères biochimiques :
C’est sur l'étude des caractères biochimiques qui repose en pratique le
diagnostique de genre et d'espèce qui ne doit être abordé qu'après que le diagnostique
de famille ait été établai avec certitude (Pilet et al., 1981).
Toute Entérobactéries lactose positif, indole positif oriente vers une
Escherichia coli, cependant la recherche des caractères biochimiques permet de
confirmer le diagnostique (Larpent, 1997).
Selon Guechi, (2002) environ 70 % des souches mobiles donnent les
caractères suivants:
- Gaz en glucose positifs en général
- Production d'indole positif
- Lactose, mannitol, sorbitol positif
- β-galactosidase (ONPG) positive
- Phénylalanine-désaminase, uérase, oxydase, gélatinas, malonate, anoditol,
inositol, H2S, Citrate de Simmons négatifs.
- Rouge de méthyle positif
- Vogues Proskauer (VP) négative
On peut rencontrer des variant négatifs pour un caractère habituellement
positif par exemple l'indole ; ceci est consécutif à une mutation.
A l'inverse, on peut exceptionnellement rencontrer des variantes positives pour
un caractère habituellement négatif. Ce caractère peut être codé par un plasmide
dont l'existence a été démontrée dans certains cas (H2 S, citrate de Simmons) (Pilet
et al., 1981).
Les variantes immobiles et agazogènes d’Escherichia coli peuvent poser des
problèmes du diagnostic différentiel avec les Shigella (Larpent, 1997).
11
Etude bibliographique
1.4.2.1.6- Résistance aux agents physiques et chimiques :
Escherichia coli est relativement sensible aux agents physiques et chimiques,
dans la majorité des cas, une température de 55°C pendant une heure ou 60°C
pendant 20 mn est mortelle pour ces organismes et ils sont tués en autoclave à 120°C
pendant 20 mn. (Mao et al., 2003).
Elle peut survivre des semaines ou des mois dans l'eau, les matières fécales et
dans les poussières des animaux domestiques, elle est hautement sensible à l'action
léthale du phénol et du crésol, mais l'efficacité de ces désinfectants est réduite en
présence du mucus et des fèces (Guechi, 2002).
1.4.2.1.7- Structure antigénique :
Le sérotypage représente une méthode intéressante pour caractériser des
souches pathogènes
d’Escherichia coli, et n'a d'intérêt en pratique que dans la
mesure où l'on peut faire une relation entre le sérotype et le pouvoir pathogène des
souches (Nataro et Kaper, 1998 ; LeBlanc, 2003).
Il détermine la structure antigénique majeure des colibacilles notamment les
antigènes somatiques O, capsulaire K, flagellaire H, fimbriaire F (Pilet et al., 1981).
1.4.2.1.7.1-Antigène O, Antigène de la paroi ou Antigène somatique:
Sa nature est lipopolysaccharidique, chaque antigène O permet de définir un
sérotype O correspondant, grâce à des réactions d'agglutination.
Les antigènes O sont particulièrement importants, car ils conditionnent le
pouvoir pathogène des souches, ainsi que l'immunité conférée, c'est pourquoi certains
sérotypes semblent plus impliqués que d'autres dans le processus pathologiques. On a
distingué jusqu'à présent, plus de 171 antigènes O différents chez Escherichia coli
(Pilet et al., 1981).
12
Etude bibliographique
1.4.2.1.7.2- Antigène K, antigène capsulaire ou antigène d’enveloppe :
De nature polysaccharidique, ils entourent les antigènes O et se présente sous
deux types de structure: la première, capsulaire lorsqu'ils constituent une capsule
visible au microscope et la seconde, d'enveloppe quand ils ne sont pas visibles au
microscope et masquent les antigènes somatiques, si bien qu'ils inhibent
l'agglutinabilité O des bactéries par les sérums de diagnostic des Escherichia coli
préparer sur lapin.
Environ 80 antigènes K ou
antigène d’enveloppes différentes ont été
reconnus. (Joly et Alain, 2003).
1.4.2.1.7.3- Antigène H ou antigène flagellaire :
Ils sont présents dans les flagelles sous forme de flagelline, protéine fibreuse
comparable à la myosine du muscle. Les antigènes ne sont présents que chez les
souches mobiles. On en connaît 56 types.
Les antigènes O, K, H sont à la base d'un schéma de diagnostic antigénique,
notamment pour le diagnostic différentiel, ils permettent d'établir le sérotype et de
détecter les souches d’Escherichia coli, responsable de pathologie. (Joly et Alain,
2003).
1.4.2.1.7.4- Antigène F ou antigène fimbriaire :
Ils sont présents dans les structures fimbriaires de certaines adhésines de
virulence. Le terme '' fimbriae'' est utilisé pour décrire les adhésines de surface dont la
fonction est l'attachement de la bactérie à l'épithélium intestinal. Ces fimbriae sont
encore appelés pili ou facteurs de colonisation. Ils forment autour du corps bactérien
de fins filaments non flagellaires ayant une spécificité antigénique propre (Pilet et al.,
1981).
13
Etude bibliographique
Ils sont un important facteur de pathogénécité, car ils confèrent aux bactéries
des propriétés d'adhésion aux cellules, telles les cellules intestinales ou rénales et
hémagglutinantes des bactéries qui les possèdent. (Joly et Alain, 2003).
1.4.2.1.8- Pouvoir pathogène :
La propagation de l’infection à l’homme peut s’effectuer directement par
contacts de personne à personne par la route oro-fécale, indirectement par
contamination croisée ou par la consommation d’aliments ou d’eau contaminés. De
nombreux cas d’infection à E. coli ont été associés avec la consommation de bœuf
haché insuffisamment cuit, de lait cru, de fruits et légumes ou d’eau contaminée avec
des matières fécales (Le Blanc, 2003).
Les symptômes associés aux infections par E. coli sont notamment des crampes
abdominales et des diarrhées susceptibles d’évoluer vers des diarrhées sanguinolentes
(Karch et al., 2005). De la fièvre et des vomissements peuvent également être
observés (LeBlanc, 2003). La période d’incubation est de 3 à 8 jours, avec une
moyenne de 3 à 4 jours (OMS, 2005). Dans la plupart des cas, la guérison s’effectue
dans les 10 jours, mais chez un nombre restreint de patients, l’infection peut parfois
se compliquer par un syndrome urémique hémolytique qui affecte les reins (LeBlanc,
2003).
E. coli possède des facteurs de virulence lui permettant de s’attacher aux
cellules intestinales et de libérer des toxines, connues sous le nom de vérotoxines ou
toxines de type Shiga en raison de leur ressemblance avec les toxines élaborées par
Shigella dysenteriae (Figure 3). Les vérotoxines jouent un rôle important dans
l’apparition des symptômes gastrointestinaux mais l’étape cruciale dans la
pathogenèse d’E. coli est l’attachement aux cellules de l’hôte (LeBlanc, 2003). Suite
à l’infection, des hémorragies, de l’oedème et une infiltration de neutrophiles situés
14
Etude bibliographique
au niveau de la lamina propria peuvent se produire au niveau des cellules intestinales
(Nataro et Kaper, 1998).
Le diagnostic chez l’humain s’effectue soit par l’isolation de la bactérie
E. coli ou la détection de la présence des vérotoxines dans des échantillons fécaux ou
la détection d’une augmentation d’anticorps anti-E. coli dans le sérum (Nataro et
Kaper, 1998). L’incidence de ces infections varie avec la classe d’âge, mais
l’incidence maximale des cas notifiés s’observe chez l’enfant de moins de 15 ans
(OMS, 2005).
Figure 3 : Pathogénie de la souche E. coli chez l’humain. Adapté de Nataro et
Kaper (1998); EcL (2004).
1.4.2.1.9- Groupes pathogènes d'E. coli :
L'analyse des facteurs de virulence des souches a permis de reconnaître cinq
catégories d'E. coli pathogènes, agissant par des mécanismes différents. (Nataro et
Kaper, 1998).
15
Etude bibliographique
1.4.2.1.9.1- E. coli entéropathologène (ECEP) :
Ces bactéries sont responsables des diarrhées surtout chez l'enfant. Elles
peuvent être responsables d'épidémies dans les collectivités notamment en milieu
néonatal, favorisées par le manque d'hygiène. La diarrhée peut être sévère et
prolongée : selles aqueuses accompagnées d'une grande quantité de mucus, fièvre et
vomissements. Pour manifester leur pouvoir pathogène, la plupart des souches
doivent posséder des structures d'adhérence aux entractes, gérant une destruction
progressive de ceux-ci associée ou non à l'action d'une cytotoxine (Leclerc et al.,
1995).
1.4.2.1.9.2- E. coli entérotoxinogène (ECET) :
L'ECET est une cause fréquente des diarrhées du voyageur et d'enfants dans
les pays en voie de développement. Les bactéries ingérées adhèrent aux anthérocytes
et sécrètent des entérotoxines l'une protéine thermolabile, non dialysable,
antigénique, libérée dans le milieu lors de la lyse des corps bactériens; l'autre est
thermostable, dialysable, non antigénique et peut être le résultat de fragmentation de
la molécule première. Ces toxines vont être responsables d'une diarrhée aqueuse,
s'accompagnant de nausées et de vomissements, de douleurs abdominales, parfois de
la fièvre et du malaise général (Leclerc et al., 1995).
1.4.2.1.9.3- E. coli entero-invasive (ECEI) :
C'est une souche provoquant des diarrhées aigues, avec de la fièvre, myalgies
et frissons, il s'agit de syndrome de dysentériforme : la souche se fixe à la muqueuse
et l'infecte. Certaines souches ont des réactions sérologiques croisés avec les
shigelles, aussi bien morphologique que physiologique, elles sécrètent la même
vérotoxine, elles sont retrouvées surtout chez les enfants de moins de dix ans dans les
pays en voie de développement (Leclerc et al., 1995).
16
Etude bibliographique
1.4.2.1.9.4- E. coli enterohemorragique (ECEH) :
Ces germes sont responsables d'une diarrhée sanglante, de colites
hémorragiques parfois accompagnées d'atteintes rénales graves pouvant aboutir à la
mort, notamment chez l'enfant ou les personnes âgées. Ces bactéries interagissent
avec la muqueuse de l'intestin et produisent une toxine, la vérotoxine qui détruit les
vaisseaux sanguins du rein (Leclerc et al., 1995).
1.4.2.1.9.5- E. coli enteroaggrégant et enteroadhérant (ECEAgg) :
Leurs caractéristiques sont voisines de celles des ECEP. Ils provoquent des
diarrhées chez l'enfant et chez les voyageurs en milieu tropical (Leclerc et al., 1995).
1.4.2.1.10- Moyens de lutte et traitements actuels
La prévention de l’infection à E. coli exige des mesures de lutte à toutes les
étapes de la chaîne alimentaire, depuis la production jusqu’au traitement, à la
fabrication et à la préparation des aliments, tant dans les établissements commerciaux
que dans l’environnement domestique. Ainsi, les mesures d’hygiène accrues et la
cuisson des aliments demeurent des moyens efficaces pour diminuer l’incidence de
ces infections.
Actuellement, l’antibiothérapie est le traitement le plus commun contre les
infections à E. coli. Cependant, des études cliniques récentes ont montré que leur
utilisation ne serait pas recommandée car ils peuvent être associés à un risque plus
élevé de développer un syndrome urémique hémolytique chez les enfants et les
personnes âgés en plus d’allonger la durée de la diarrhée (Molbak et al., 2002; Panos
et al., 2006).
Ces auteurs ont entre autres attribué cet effet d’allongement de la diarrhée à
l’élimination du microbiote intestinal compétiteur laissant place à la multiplication
des E. coli et plus particulièrement si les souches sont résistantes aux antibiotiques
17
Etude bibliographique
administrés. De plus, en lysant les cellules les antibiotiques peuvent augmenter la
diffusion des toxines (Nataro et Kaper, 1998).
1.4.2.2- Salmonella typhi :
Salmonella a été isolée pour la première fois en 1885 par Daniel Salmon, dont
Salmonella typhi est l'agent pathogène humain à l'origine de la fièvre typhoïde
(Bergeron et Dufour, 2004).
1.4.2.2.1-Habitat :
De nombreuses espèces animales hébergent des Salmonelles pathogènes ou
non pour l'homme. On peut les retrouver dans l'eau et diverses denrées alimentaires,
et aussi, on peut les trouver également dans l'intestin d'hommes sains (Philippon,
2007).
1.4.2.2.2- Caractérisation de S. typhi :
Les Salmonella typhi font partie du groupe des entérobactéries, les bactéries
constituent une espèce aéro-anaérobie facultative (Pilet et al., 1981).
1.4.2.2.3- Caractères morphologiques :
Bacille à Gram négatif, mesure en générale de 1.5 à 3 mm après 24 heures
d’incubation à 37°C (Figure 4), elle ne forme pas d’endospore. Mobile grâce à une
ciliature péritriche (Larpent, 1997).
Figure 4 : S. typhi observés au microscope électronique (Ducluzeau, 2006).
18
Etude bibliographique
1.4.2.2.4- Caractères culturaux :
Elle cultive bien en 24 heures à 37°C sur les milieux gélosés en donnant des
colonies petites, rondes, à bords réguliers.
La culture en bouillon ordinaire, rapide, produit un trouble dense avec ondes.
Sur milieu gélosés Hektoen, les colories sont vertes à centre noir (Larpent, 1997 ;
Mao et al., 2003).
1.4.2.2.5- Caractères biochimiques :
Selon Guechi, (2002) parmi les bactéries ayant les caractères généraux des
Entérobactéries on pensera à Salmonella lorsque les réactions suivantes sont
obtenues :
- H2S positif, B galactosidose négative
- Lysine décarboxylase positif
- Production de l’indole négative
- Urease, tryptophane désaminose négatives
- Citrate de simmons négatifs
- Vages Proskauer (VP) négative
On peut rencontrer des caractères un peu particuliers d’une salmonelle
rencontrée chez l’homme : Salmonella para-typhi A est : LDC négatif, citrate de
Simmons négatifs et le plus souvent H2S négatif (Pilet et al., 1981).
1.4.2.2.6- Structure antigénique :
Le genre Salmonella possède des antigènes variés associés à trois types
19
Etude bibliographique
1.4.2.2.6.1- Antigènes somatiques (ou antigène O) :
Ce sont les antiqénes des parois ctérienne, de nature lipopolysaccharidique. Ils
sont thermostables et alcoolostables. Trois composants sont mis en évidence : le
lipide A responsable des effets toxiques, le corps ou la partie basale, et le
polysaccharide qui est le support de la spécificité et il repose sur les sucres
constitutifs (Gledel, 1988 ; Pilet et al., 1981 ; Joly et Alain, 2003).
1.4.2.2.6.2 -Antigènes flagellaires (ou antigène H) :
Les flagelles sont constitués de polymères de flagilline (protéine fibreuse).
Pour une souche donnée, il peut exister un ou deux déterminants antigéniques de
type H (Gledel, 1988 ; Pilet et al., 1981 ; Joly et Alain, 2003).
1.4.2.2.6.3-Antigènes capsulaires (ou antigène Vi) :
Ces antigènes forment une mince capsule glycolipidique qui recouvre le LPS
et donc masque les spécificités O. Cette enveloppe peut être détruite par chauffage
à 100°C pendant 10 minutes (Gledel, 1988 ; Pilet et al., 1981 ; Joly et Alain,
2003).
1.4.2.2.7-Pouvoir pathogène :
Les salmonelles sont pathogènes, soit exclusivement pour l’Homme (S typhi),
soit exclusivement pour l’animal (S. abortus ovis), soit, le plus souvent, à la fois
pour l’Homme et pour l’animal. (Lamps, 2007).
Chez l’Homme, les salmonelles peuvent être responsables :
- De la fièvre typhoïde due à S .typhi ou de fièvres paratyphoïdes
généralement provoquées par S. para A, S. para B et plus rarement
S. para C.
20
Etude bibliographique
Ces maladies, graves et souvent mortelles si elles ne sont pas traitées,
associent :
- Un état septicémique, avec fièvre et splénomégalie,
- Un état de prostation très particulier, le « tuphos »,
- Des signes digestifs graves (vomissements, diarrhée).
L’évolution peut se grever de complications atteignant le plus souvent le
tractus digestif (hémorragie, perforations). (Margairaz et al., 1975 ; De Vrese et
Marteau, 2007).
Chez l’animal : avortements chez différentes espèces, septicémies du jeune,
entérites (Pilet et al., 1981).
1.4.2.2.8- Physiopathologie et symptomatologie de Salmonella typhi :
Le réservoir de Salmonella typhi est strictement humain. La transmission peut
être interhumaine par contact direct avec une personne infectée, ou indirecte par
consommation d'aliments contaminés lors de leur préparation par une personne
malade (ou porteuse saine) ou par consommation d'aliments contaminés par de l'eau
souillée par des matières fécales. La fièvre typhoïde emprunte quatre phases, la
première se traduit par l'élimination rapide des bactéries sériques. (Mead et al., 1999 ;
Steer et al., 2000 ; Tauxe, 2002).
Durant la semaine suivant l'infection, Salmonella se réplique activement au
sein des cellules phagocytaires. Cette phase précède la reconnaissance de PAMP
(pathogen-associated molecular pattern) par les cellules de la lignée phagocytaire
mononucléaire. Il en résulte la production de nombreuses cytokines (tumor necrosis
factor , interleukines 1,6 et 12, interféron 
) et une infiltration massive de
monocytes et de polynucléaires neutrophiles dans les cites inflammatoires. (Fasano,
2001; Lamps, 2007).
21
Etude bibliographique
A la quatrième phase de l'infection s'installe la défense inflammatoire dite
acquise, c'est-à-dire faisant intervenir les cellules T et B, ainsi que les facteurs
humoraux qui en découlent. Cliniquement; la phase d'invasion associe une fièvre
élevée d'installation progressive (40°C avec dissociation du pouls), des céphalées,
une asthénie, une insomnie, des troubles digestifs de type : anorexie, nausées et
crampes abdominales avec constipation ou diarrhées; peuvent également apparaître
des myalgies et des arthralgies. (DuPont, 2005).
La phase d'état associe une fièvre qui se maintient en plateau entre 39°C et
40°C (pouls dissocié) et l'émission de selles diarrhéiques (classiquement diarrhée jus
de melon). Un état somnolant apparaît et évolue vers une prostration dans la formes
graves (tuphos), des complications peuvent apparaître à type de perforation et
d'hémorragie intestinale, ou de myocardite, d'ostéomyélite, d'encéphalite et de
glomérulonéphrite. Ces complications sont dues à la libération d'endotoxines lors de
la lyse des salmonelles (Fasano, 2001; Tauxe, 2002 ; Bergeron et Dufour, 2004 ;
DuPont, 2005).
1.4.2.3- Les Klebsiella :
1.4.2.3.1- Habitat :
Klebsiella est une espèce ubiquistes, isolées des eaux de surface, des eaux
usées, des effluents industriels (papeteries, minoteries, scieries, usines textiles), du
sol, du bois, de végétaux divers et des aliments. Elle est également retrouvée dans la
flore fécale d’environ 30%
des animaux et de l’homme et elle existe à l’état
commensal sur la peau et les muqueuses, notamment les muqueus.es respiratoires
(Podschum et al., 2001).
1.4.2.3.2- Caractérisation de la bactérie :
Ce genre forme un ensemble très homogène caractérisé par la production d’un
dérivé particulier de l’acide pyruvique : l’acétyle-méthyle-cabriole (Pilet et al., 1981).
22
Etude bibliographique
1.4.2.3.3- Caractères morphologiques :
Bacille Gram -, de 0.3 à 1.0 µm de diamètre sur 0.6 à 6.0 µm de largeur,
immobile, capsulées surtout au sortir de l’organisme, très polymorphes : de forme
coccoide (Figure 5), se présente de manière isolée, ou en groupe par deux ou groupés
en courte chaines (Le Minor et Richard., 1993).
Figure 5: K. oxytoca observés au microscope électronique (Ducluzeau, 2006).
1.4.2.3.4- Caractères culturaux :
Sur gélose : les colonies ont un aspect caractéristique, elles sont volumineuses,
bombées, brillantes, opaques et souvent confluentes. Le contact avec l’anse de platine
permet de constater l’aspect visqueux des colonies dites « en coulées de miel ». En
bouillon, on note la formation d’un trouble dense avec collerette visqueuse (Le Minor
et Richard., 1993).
1.4.2.3.5- Caractères biochimiques :
Selon Guechi, (2002) l’élément biochimique essentiel, qui caractérise
Klebsiella oxytoca est la présence d’une uréase et la production d’acétone, plus les
caractères suivants :
- Glucose positif avec production de gaz
- Oxydase, ODC, ADH négative
23
Etude bibliographique
- Tryptophane désaminase et phénylalanine désaminase négatives
- Β-galactosidase, LDC positive
- Citrate de Simmons positive
1.4.2.3.6- Structure antigénique :
Klebsiella comporte des antigènes O et R et surtout un antigène capsulaire, de
nature polysaccharidique qui est en effet le seule utilisée pour la détermination des
72 sérotypes connus (Pilet et al., 1981).
1.4.2.3.7-Pouvoir pathogène :
Klebsiella est une bactérie commensale de l’intestin et des voies respiratoires
de l’homme et des animaux.
Chez l'homme, elle est responsable d'infections diverses (infections
suppuratives, infections urinaires, infections respiratoires, infections biliaires,
infections hépatiques, septicémies) et elle est responsable d'environ 5 % des
infections nosocomiales (Margairaz et al ., 1975).
Chez l’animale, on peut la retrouver dans certain métrites de la jument,
infections respiratoires du chien et mammites de la vache. (Pilet et al., 1981 ;
Tainturier et Richard, 1986
1.5- Modulations des mécanismes de la réponse immunitaire :
L’hôte possède également des défenses immunologiques lui permettant de
répondre spécifiquement aux pathogènes entériques. Lorsque ces pathogènes sont en
contact avec l’intestin, une réponse immune peut se produire à partir de sites
d’induction constitués de tissus organisés tels que les follicules lymphoïdes (Plaques
de Peyers et nodules lymphatiques mésentériques) et s’exprimer à partir des sites
24
Etude bibliographique
effecteurs représentés par un nombre élevé de cellules immunocompétentes situées au
niveau de la lamina propria et de l’épithélium mucosal (Gill, 2003) (Figure 6).
Figure 6 : Le système immunitaire intestinal. Tiré et traduit de Magalhaes et
al. (2007).
1.6 Défenses de l’hôte :
Face à l’intrusion de micro-organismes pathogènes dans le tube digestif, le
corps humain possède différents moyens de défenses. Plusieurs lignes de défenses
chimiques, mécaniques et microbiologiques participent à limiter l’accès des
pathogènes d’origines diverses (bactérienne, virale, parasitaire) à la muqueuse
intestinale qui est la plus grande partie exposée à l’environnement externe avec 200 à
300 m2 (Liévin-Le Moal et Servin, 2006). Ainsi, pour lutter contre l’établissement
infectieux d’entéropathogènes tout au long du tractus digestif, une première ligne de
défense est assurée par des barrières chimiques telles que l’acidité gastrique, l’activité
antimicrobienne d’enzymes pancréatiques, le lysozyme, les sécrétions intestinales et
bactériennes. Les défenses antimicrobiennes au niveau intestinal sont présentées à la
Figure .7
25
Etude bibliographique
Les pathogènes entériques, qui expriment des facteurs de pathogénicité tels que
facteurs d’adhésion, invasines et toxines interagissent avec les cellules des villosités
intestinales (Nauciel, 2000). En réponse à ces pathogènes indésirables, les cellules de
Paneth situées à la base des villosités sécrètent des molécules protéiques
antimicrobiennes de même que d’autres cellules situées sur les villosités. En
parallèle, les bactéries intestinales résidentes Gram-négatif et positif produisent des
molécules antibactériennes. Ces substances antimicrobiennes ont un large spectre
d’activité contre une variété de bactéries et les virus enveloppées (Liévin-Le Moal et
Servin, 2006). Cette défense chimique joue un rôle majeur lors des premières heures
suivant l’infection (Liévin-Le Moal et Servin, 2006). D’autres moyens physiques, tels
que la mobilité de l’intestin par péristaltisme, peuvent contribuer à l’élimination des
pathogènes hors de l’intestin (Ouwehand et al., 2002a; Gill, 2003).
Figure 7: Défenses antimicrobiennes de l’hôte face à l’intrusion de microorganismes pathogènes au niveau du tractus intestinal. Tiré de Liévin-Le Moal et
Servin (2006).
26
Etude bibliographique
2- Les bactéries lactiques
2.1. Définition et caractéristiques généraux des bactéries lactiques.
Le groupe des lactiques ou bactéries de l’acide lactique a été défini par Orla
Jensen, (1919). Ce sont des cellules vivantes, procaryotes, hétérotrophes et chimioorganotrophes. Leur capacité à fermenter les glucides en produisant de l’acide lactique
leur a valu l’appellation de bactéries lactiques (De Roissart et Laquet, 1994 ; Novel,
1993).
La fermentation est dite homolactique si l’acide lactique est pratiquement le
seul produit formé et hétérolactique si d’autres composés sont aussi présents : acide
acétique, éthanol, CO2 Selon le mode de fermentation obligatoire au préférentiel, on
parle de bactéries homofermentaires et hétérofermentaires.
Certaines bactéries homofermentaires sont aussi capables de fermentation
hétérolactique dans des conditions de croissance non optimales ou selon la nature du
sucre utilisé (Novel, 1993).
Certaines espèces peuvent en plus produire de l'acide formique ou de l'acide
succinique.
Aucune souche du groupe lactique n'est capable de produire des acides volatils
ayant plus de deux atomes de carbones (Dellaglio et al, 1994).
Ces bactéries forment un groupe hétérogène; leurs cellules sont soit des coques :
Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus, soit des bâtonnets : Lactobacillus, soit de
formes variées : Carnobacterium et Bifidobacterium.
Les bactéries lactiques présentent d’autres caractéristiques communes qui expliquent
leur regroupement :
27
Etude bibliographique
 Ce sont des bactéries gram positif généralement immobiles jamais sporulées
catalase négative (quelques souches de lactobacilles possèdent une pseudo-catalase)
oxydase négative et généralement nitrate réductase négative (Stiles et Holzapfel,
1997).
 Leur capacité de biosynthèse est faible, ce qui explique leurs poly-auxotrophie pour
divers acides aminés; des bases nucléiques, des vitamines et des acides gras mais
aussi leur métabolisme fermentaire (incapable de synthétiser le noyau hème des
porphyrines, elles sont normalement dépourvues de cytochrome et en conséquence
inapte à toute respiration aérobie ou anaérobie. (Stiles et Holzapfel, 1997).
 Ce sont des bactéries anaérobies facultatives : microaérophiles, uniquement
capables de fermentation en aérobiose comme en anaérobiose.
 Elles sont multi-auxotrophes pour divers acides aminés, nucléotides, vitamines et
acides gras, comme leur capacité de synthèse est faible, elles exigent des milieux de
cultures complexes pour leur croissance.
Parmi les bactéries répondant à ces caractéristiques, on distingue quatre genres
bactériens : Streptococcus, Leuconostoc, Pediococcus et Lactobacillus. Toutefois des
exceptions ont été observées concernant la production d’endospores, la mobilité de
quelques souches de lactobacilles, l’aérobiose de certains streptocoques
et
lactobacilles, la présence de réaction catalase positive chez les pediocoques et chez
quelques lactobacilles, etc..(Michael et al., 1996).
Les bactéries lactiques sont utilisées dans de nombreux produits laitiers dont
les laits fermentés, les fromages et les yogourts. Elles contribuent à la texture, à la
saveur des aliments ainsi qu’à la production de composés aromatiques. Les bactéries
lactiques inhibent la prolifération de micro-organismes par la production de
28
Etude bibliographique
Composés inhibiteurs telles les bactériocines (Piard et Desmazeaud, 1991,
1992) et en abaissant le pH par la production d’acide lactique (Gilliland, 1985).
Les bactéries lactiques sont des cellules procaryotes, hétérotrophes et chimioorganotrophes. Elles sont Gram +, généralement immobiles, asporulées et ont des
exigences nutritionnelles complexes pour les acides aminés, les peptides, les
vitamines, les sels, les acides gras et les glucides fermentescibles (Dellaglio et al.,
1994).
Onze genres bactériens figurent dans la catégorie des bactéries lactiques :
Aerococcus,
Alloicoccus,
Lactococcus, Leuconostoc,
Carnobacterium,
Enterococcus,
Pediococcus, Streptococcus,
Lactobacillus,
Tetragenococcus
et
Vagococcus. Les bactéries du genre Bifidobacterium ne sont pas considérées comme
des bactéries lactiques typiques, mais leur usage se répand en industrie laitière.
Les bactéries lactiques sont utilisées pour la fermentation d’un grand nombre
de produits d’origine animale ou végétale. Seuls les cinq genres Bifidobacterium,
Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc et Streptococcus sont communément
propagés dans les salles à ferments des industries laitières ou employés dans la
fermentation lactique des produits laitiers en Amérique du Nord (Champomier et al.,
1989). Le rôle principal des bactéries lactiques est la production d’acide lactique qui
influence la texture, le goût et la qualité microbiologique du fromage. En effet, la
production d’acide facilite la coagulation des protéines par la présure ainsi que la
synérèse. L’abaissement du pH limite aussi la croissance des bactéries indésirables
(Gilliland, 1985). Enfin, la production d’acide lactique intervient également sur le
goût des produits fermentés, soit directement dans les produits frais, soit
indirectement en agissant sur les activités enzymatiques pendant l’affinage.
Les bactéries lactiques tolèrent de petites quantités d’oxygène, mais de trop
grandes teneurs peuvent leurs êtres néfastes. Ceci peut probablement être relié au
29
Etude bibliographique
peroxyde d’hydrogène (H2O 2) qui est produit dans les cellules en présence d’air. Le
H2 O2 doit être éliminé sinon son accumulation devient toxique. Le système le plus
efficace d’élimination du H2O2 est une enzyme nommée catalase dont les bactéries
lactiques en sont déficientes. Les bactéries lactiques possèdent plutôt une peroxydase,
moins efficace que la catalase. Ainsi, comme les bactéries lactiques n’éliminent pas
facilement le peroxyde, elles sont considérées comme micro-aérophiles.
Les bactéries lactiques aromatisantes comme Lactococcus lactis ssp. lactis
biovar. diacetylactis produisent des composés aromatisants qui contribuent au goût
des produits frais et à la production de CO 2 responsable d’ouvertures dans le
fromage.
Enfin, certaines bactéries lactiques produisent des exopolysaccharides qui
influencent l’aspect et la texture des produits fermentés, ainsi que du peroxyde
d’hydrogène et des bactériocines inhibant la croissance de bactéries indésirables.
2.2. Les milieux naturels des bactéries lactiques :
Nombreux sont les biotopes qui fournissent des conditions favorables à la
croissance des bactéries du groupe lactique (Tableau 3) ; De ce fait elles colonisent des
milieux naturels riches très variés comme les végétaux (plantes, fruits), animaux et
humains (cavité buccal et vaginale, lait), les produits laitiers ( fromage, beurre), et
carnés boissons alcoolisées à base de fruits (vins, cidres, bière, ) légumes et fruits
fermentés (choucroute, olives, cornichons,) céréales fermentés (différentes variétés
de pain) .
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Etude bibliographique
Tableau 3: Les Milieux d'isolement des bactéries lactiques (De Roisart et luquet, 1994)
Espèce
Milieu d'isolement
Lc. lactis subsp. lactis
biovar diacetylactis
Lc. lactis subsp. cremoris
Lc. raffinolactis
Lc. garviae
Lc. Plantarum
Lait cru lait fermenté et flore
minoritaire du rumen
végétaux lait
uniquement lait
lait caillé
lait de mammite
pis congelés
cicadelle nommée hordniae
lait chauffé 45-50°C lait pasteurisé
yaourt levains a tisanaux
lait, produit laitier, fruit betterave
choucroute produite de panification
uniquement vin
végétaux en décomposition
matière végétale
lait, produits laitiers, saucisson
anchois salés
végétaux
yaourt, fromage
fromage
lait, acide, bouche, vagin
bouche, vagin
fromage
lait rumen
fromage, fourrage
bouche, vagin
tractus intestinal
saucisson, viande fraîche, végétale
lait, fromage, végétaux
végétaux fermentes
végétaux, fromage
ensilage, végétaux, fromage
lait fermenté : kéfir
bière
produits de panification
intestin, vagin, selle des nouveaux –nés
Lc. hordniae
Sc. thermophilus
Leuconostoc
Ln. oenos
Pediococcuspc. pentosaceus
Pc. acidilactici
Pc. halophilus
Lb. delbrueckii subsp. delbrueckii
Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus
Lb. delbrueckii subsp .lactis
Lb. acidophilus
Lb. gasseri
Lb .helveticus
Lb. caseisubsp.casei
Lb. casei subsp pseudoplantarum
Lb. casei subsp.totleans
Lb. casei subsp.rhamnosus
Lb. sake
Lb. curvatus
Lb. bavaricus
Lb. plantarum
Lb. brevis
Lb. buchneri
Lb. kefir
Lb. malefermantens
Lb. sanfrancisco
Bifidobacterium
31
Etude bibliographique
2.3-Taxonomie et classification :
2.3.1. Caractère morphologique :
Il existe dans ce groupe bactérien deux types morphologiques bien distincts : les
coccis et les bacilles :
• Les coccis [du grec kakos : grain] sont de petites sphères plus ou moins
ovoïdes, de 0.5 à 1.5μm (10-6 m) de diamètre dont la division peut engendrer des paires,
des tétrades, des chaînettes ou des amas, (Gancel et al., 1997 ; Felten et al., 1998 ;
Carmen-Collado et Hernandez, 2007 ; Tabasco et al., 2007).
• Les bacilles [du latin bacillum : bâton] sont de petits bâtonnets plus ou moins
allongés de 0.5 à 2µm de diamètre et de 1.5 à environ 10µm de long, qui se présent par
paires ou en chaînettes de longueur variable. (Gancel et al., 1997 ; Felten et al., 1998 ;
Carmen-Collado et Hernandez, 2007 ; Tabasco et al., 2007).
2.3.2- Classification des bactéries lactiques.
L’application des hybridations des acides nucléiques et des techniques de
séquençage conduit à diviser les bactéries lactiques en onze groupes principaux :
Aerococcus,
Alloicoccus,
Lactococcus, Leuconostoc,
Carnobacterium,
Enterococcus,
Pediococcus, Streptococcus,
Lactobacillus,
Tetragenococcus
et
Vagococcus. (Tableau4)
Ces bactéries seraient apparues avant les cyanobactéries photosynthétiques. Ces
dernières ayant laissé des traces fossiles datées d'au moins 2,75 milliards d'années, les
bactéries lactiques pourraient donc avoir vu le jour il y a près de 3 milliards d'années.
Leur médiocre adaptation à la vie en aérobiose concourt à penser qu'elles se seraient
plutôt développées au cours d'une période de transition entre un monde anaérobie et un
mon de micro-aérobie (Tailliez., 2001).
32
Etude bibliographique
Tableau 4 : Différents genres de bactéries lactiques et leurs principales
caractéristiques (T° opt : température optimale développement ; Nb : nombre
d’espèces connues).
Genre
Morphologie
Fermentation
T° opt
Nb espèces
Lactobacillus
bacilles
Homofermentaires
ou
Thermophiles
G.I : 23
ou
G.II :16
mésophiles
G.III :22
hétérofermentaires
Carnobacterium
bacilles
hétérofermentaires
psychrotrophes
6
Lactococcus
coques
homofermentaires
mésophiles
5
Streptococcus
coques
homofermentaires
Mésophiles
19
ou
termophiles
Enterococcus
coques
homofermentaires
mésophiles
13
Vagococcus
coques mobiles
homofermentaires
mésophiles
2
Pediococcus
coques en
tétrades
homofermentaires
mésophiles
7
Tetragenococcus
coques en
tétrades
homofermentaires
mésophiles
1
Leuconostoc
coques
hétérofermentaires
mésophiles
11
Oenococcus
coques
hétérofermentaires
mésophiles
1
D’après Schleifer, (1986); Kandler et Weiss, (1986).
33
Etude bibliographique
2.4-Les Lactobacillus :
2.4.1- Habitat :
Très répandus dans la nature, les Lactobacilles sont également des
hôtes Habituels des cavités naturelles de l’homme et des animaux. Leur pouvoir
pathogène est pratiquement nul. (Siegumfeldt et al., 2000).
Les Lactobacilles ont une place de choix en bactériologie appliquée parmi les
« microbes utiles » .Ils appartiennent aux ferments lactiques, et
à ce titre
interviennent dans l’industrie laitière et fromagère, ils sont aussi utilisés dans les
spécialités pharmaceutiques employées comme complément de l’antibiothérapie
(Tabasco et al., 2007).
2.4.2-Caractères morphologiques :
Les espèces de Lactobacillus sont caractérisées par des cellules en forme de
bâtonnet souvent groupées en chaînes ou en amas plus ou moins volumineux dans
certaines espèces on rencontre des groupements en diplobacilles (Figure 8), ils
apparaissent toujours Gram positif. .Asporulés, en général acapsulés, non
ramifies.(Gancel et al., 1997 ; Felten et al., 1998 ; Carmen-Collado et Hernandez,
2007 ; Tabasco et al., 2007).
Figure 8 : Lactobacillus rhamnosus (à gauche) et, Lactobacillus helveticus (à
droite), observés au microscope électronique. Gancel et al., (1997).
34
Etude bibliographique
2.4.3- Caractères culturaux :
Les Lactobacilles sont incapables de synthétiser les substances
indispensables à leur développement, ils exigent différents facteurs de croissance, et
ne cultive pas en milieux ordinaires. (Sutra et al., 1998).
En milieu liquide, les Lactobacilles donnent un trouble après 24 heures à
30°C. Sur milieux solide, les colonies apparaissent en 24 heures à 48 heures pour
la plupart des espèces : il s’agit de colonies opaques, lisses, blanchâtres, de 0.5 à
1mm de diamètre. (Sutra et al., 1998).
2.4.4-Caractères biochimiques :
Parmi les caractères généraux des Lactobacilles, citons : Catalase et oxydase
négative, Nitrates négatif, pouvoir protéolytique négatif.
Le métabolisme des glucides est toujours de type fermentatif. (Sutra et al.,
1998)
En tenant compte de plusieurs caractéristiques telle que les résultats
moléculaires, la détermination du type de PTG, les propriétés de certaines enzymes
dont la LDH, la détermination de l’isomère de l’acide lactique, la taille du génome et
l’hybridation ADN-ADN est répartie en trois groupes.
Groupe I : les Lactobacilles homofermentaires obligatoire, contenant les espèces de
groupe Thermobacterium et d’autres espèces nouvellement décrites.
Ils sont
incapables de fermenter les pentoses et les gluconate. Ils contiennent deux complexes :
Complexe Lb. delbrueckii et ses quatre sous espèces qui présentent une
homologie d’ADN à plus de 80% (Weiss et al., 1993) : subsp. delbrueckii, subsp.
bulgaricus, subsp. lactis, et subsp. leichmanii. Ces bactéries produisent jusqu’à
80g/l d’acide lactique.
 Complexe Lb, acidophilus hétérogène forme de trois sous groupes : Lb.
acidophilus, Lb. gasseri et Lb. helveticus.
35
Etude bibliographique
Les nouvelles données de la littérature (Leisner et al., 2000), indiquent la
présence d'une nouvelle espèce Paralactobacillus selangorensisgen, isolée a partir d'un
aliment de malaisie (le chilibo).
Groupe II : les Lactobacilles homofermentaires facultatifs : formés par trois
complexes d’espèces : Ils produisent 3 à 13g/l
les espèces.
d’acide lactique b (+) ou DL selon
Ils forment un groupe très homogène, ce groupe comprend trois
complexes d'espèces apparentées par leurs homologies ADN - ADN et plusieurs
espèces ne présentant aucune relation phylogénique connue. L'écart des contenus GC%
est plus étroit (35-47%) par rapport au groupe précédant (Dellaglio et al, 1994)
Complexe Lb. plantarum ”.Lb. plantarum et Lb. pentosus.
Complexe Lb.
casei ”
Lb.
casei,
Lb.
casei
(subsp.
casei,
subsp.
pseudoplantarum, subsp. tolerans) et Lb. casei subsp. ramnosus.
Complexe Lb. sake- Lb. curvatus- Lb. rhamnosus.”
Groupe III : les Lactobacilles hétérofermentaire obligatoires.
Ils renferment des espèces très diverses possédant par fois un GC% très voisin, peu
d’homologie entre elles. Le contenu en G+C est de 34 à 53% (Dellaglio et al, 1994) Ils
produisent une faible quantité d’acide lactique (5g/l). L’acide lactique formé est
toujours de type DL. Il contient deux complexes.
Complexs Lb. fermentum
Complexe Lb. brevis
36
Etude bibliographique
Tableau 5 : liste d’espèces du genre Lactobacillus d’après Euzéby, (2007)
Espéce
Lactobacillus acidifarinae
Lactobacillus acidipiscis
Lactobacillus acidophilus
Lactobacillus agilis
Lactobacillus algidus
Lactobacillus alimentarius
Lactobacillus amylolyticus
Lactobacillus amylophilus
Lactobacillus amylovorus
Lactobacillus animalis
Lactobacillus antri
Lactobacillus apodemi
Lactobacillus arizonensis
Lactobacillus aviarius
Lactobacillus aviarius subsp.
araffinosus
Lactobacillus aviarius subsp. aviarius
Lactobacillus bavaricus
Lactobacillus bifermentans
Lactobacillus brevis
Lactobacillus buchneri
Lactobacillus bulgaricus
Lactobacillus camelliae
Lactobacillus carnis
Lactobacillus casei
Lactobacillus casei subsp. casei
Lactobacillus casei subsp.
pseudoplantarum
Source et références
L'ensilage de blé Vancanneyt et al. (2005)
Les poissons fermentés Tanasupawat et
al. (2000)
Johnson et al. (1980)
Weiss et al. (1982)
Viande de bœuf conservé Kato et al.
(2000)
Reuter (1983)
Bierre de malt Bohak et al. (1999)
Mais fermenté Nakamura and Crowell
(1981)
Aliments de bétail Nakamura (1981)
tube digestive des animaux Dent and
Williams (1983 )
La muceuse d’estomac humaine Roos et
al. (2005)
Les selles des souris Osawa et al. (2006)
Les extraits de Jojoba Swezey et al.
(2000)
Les intestins des volailles Fujisawa et al.
(1985)
Fujisawa et al. (1986)
Fujisawa et al. (1985)
Les produits a base de viande Stetter and
Stetter (1980)
Les fromages enflés Kandler et al. (1983)
Le vin Bergey et al. (1934)
Kimchi Bergey et al. (1923)
Rogosa and Hansen (1971)
Les feuilles de thé fermentées
Tanasupawat et al. (2007)
Les produits carnés Shaw and Harding
(1986)
Orla-Jensen (1916)
Hansen and Lessel (1971)
Abo-Elnaga and Kandler (1965)
37
Etude bibliographique
Lactobacillus casei subsp. rhamnosus
Lactobacillus casei subsp. tolerans
Lactobacillus catenaformis
Lactobacillus cellobiosus
Lactobacillus ceti
Lactobacillus coleohominis
Lactobacillus collinoides
Lactobacillus composti
Lactobacillus concavus
Lactobacillus confusus
Lactobacillus coryniformis
Lactobacillus coryniformis subsp.
coryniformis
Lactobacillus coryniformis subsp.
torquens
Lactobacillus crispatus
Lactobacillus crustorum
Lactobacillus curvatus
Lactobacillus curvatus subsp. curvatus
Lactobacillus curvatus subsp.
melibiosus
Lactobacillus cypricasei
Lactobacillus delbrueckii
Lactobacillus delbrueckii subsp.
bulgaricus
Lactobacillus delbrueckii subsp.
delbrueckii
Lactobacillus delbrueckii subsp. indicus
Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis
Lactobacillus diolivorans
Lactobacillus divergens
Lactobacillus durianis
Lactobacillus equi
Lactobacillus equigenerosi
Lactobacillus farraginis
Lactobacillus farciminis
Lactobacillus ferintoshensis
Lactobacillus fermentum
Lactobacillus fornicalis
Hansen (1968)
Abo-Elnaga and Kandler (1965)
Moore and Holdeman (1970)
Rogosa et al. (1953)
Vela et al. (2008)
Source humaine Nikolaitchouk et al.
(2001)
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Endo and Okada (2007)
Tong and Dong (2005)
Sharpe et al. (1972)
Abo-Elnaga and Kandler (1965)
Abo-Elnaga and Kandler (1965)
Abo-Elnaga and Kandler (1965)
Moore and Holdeman (1970)
L’ensilage de blé Scheirlinck et al. (2007)
Abo-Elnaga and Kandler (1965)
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Weiss et al. (1984)
L’ensilage de mais Krooneman et al.
(2002)
Holzapfel and Gerber (1984)
Leisner et al. (2002)
Les selles des chevaux Morotomi et al.
(2002)
Les selles des chevaux Endo et al. (2008)
Endo and Okada (2007)
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whisky de malt Simpson et al. (2002)
Beijerinck (1901)
Dicks et al. (2000)
38
Etude bibliographique
Lactobacillus fructivorans
Lactobacillus fructosus
Lactobacillus frumenti
Lactobacillus fuchuensis
Lactobacillus gallinarum
Lactobacillus gasseri
Lactobacillus gastricus
Lactobacillus ghanensis
Lactobacillus graminis
Lactobacillus halotolerans
Lactobacillus hammesii
Lactobacillus hamsteri
Lactobacillus harbinensis
Lactobacillus hayakitensis
Lactobacillus helveticus
Lactobacillus heterohiochii
Lactobacillus hilgardii
Lactobacillus homohiochii
Lactobacillus iners
Lactobacillus ingluviei
Lactobacillus intestinalis
Lactobacillus jensenii
Lactobacillus johnsonii
Lactobacillus kalixensis
Lactobacillus kandleri
Lactobacillus kefiranofaciens
Lactobacillus kefiranofaciens subsp.
kefiranofaciens
Lactobacillus kefiranofaciens subsp.
kefirgranum
Lactobacillus kefirgranum
Lactobacillus kefiri
Lactobacillus kimchii
Lactobacillus kitasatonis
Lactobacillus kunkeei
Lactobacillus lactis
Lactobacillus leichmannii
Lactobacillus lindneri
Lactobacillus malefermentans
Charlton et al. (1934)
Kodama (1956)
Müller et al. (2000)
Sakala et al. (2002)
Fujisawa et al. (1992)
Lauer and Kandler (1980)
L’estomac humaine Roos et al. (2005)
Nielsen et al. (2007)
Beck et al. (1989)
Kandler et al. (1983)
Valcheva et al. (2005)
Les intestins des hamters Mitsuoka and
Fujisawa (1988)
Miyamoto et al. (2006 )
Morita et al. (2007)
Bergey et al. (1925)
Kitahara et al. (1957)
Douglas and Cruess (1936)
Kitahara et al. (1957)
Source humaine Falsen et al. (1999)
Les intestins des pigeons Baele et al.
(2003)
Les intestins des souris Fujisawa et al.
(1990)
Gasser et al. (1970)
Fujisawa et al. (1992)
L’estomac humaine Roos et al. (2005)
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Fujisawa et al. (1988)
Vancanneyt et al. (2004)
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Kandler and Kunath (1983)
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Les intestins des volailles Mukai et al.
(2003)
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Bergey et al. (1923)
Back et al. (1997)
Farrow et al. (1989)
39
Etude bibliographique
Lactobacillus mali
Lactobacillus maltaromicus
Lactobacillus manihotivorans
Lactobacillus mindensis
Lactobacillus minor
Lactobacillus minutus
Lactobacillus mucosae
Lactobacillus murinus
Lactobacillus nagelii
Lactobacillus namurensis
Lactobacillus nantensis
Lactobacillus oligofermentans
Lactobacillus oris
Lactobacillus panis
Lactobacillus pantheris
Lactobacillus parabrevis
Lactobacillus parabuchneri
Lactobacillus paracasei
Lactobacillus paracasei subsp.
Paracasei
Lactobacillus paracasei subsp. tolerans
Lactobacillus paracollinoides
Lactobacillus parafarraginis
Lactobacillus parakefiri
Lactobacillus paralimentarius
Lactobacillus paraplantarum
Lactobacillus pentosus
Lactobacillus perolens
Lactobacillus piscicola
Lactobacillus plantarum
Lactobacillus plantarum subsp.
argentoratensis
Lactobacillus plantarum subsp.
plantarum
Lactobacillus pontis
Lactobacillus psittaci
Lactobacillus rennini
Lactobacillus reuteri
Lactobacillus rhamnosus
Lactobacillus rimae
Lactobacillus rogosae
Carr and Davies (1970)
Miller et al. (1974)
Morlon-Guyot et al. (1998)
Ehrmann et al. (2003)
Kandler et al. (1983)
Moore and Holdeman (1972)
Roos et al. (2000)
Hemme et al. (1982)
Edwards et al. (2000)
Scheirlinck et al. (2007 )
Valcheva et al. (2006)
Koort et al. (2005)
Cavité orales deshumains Farrow and
Collins (1988)
Wiese et al. (1996)
Selles de Jaguar Liu and Dong (2002)
Vancanneyt et al. (2006)
Farrow et al. (1989)
Collins et al. (1989)
Suzuki et al. (2004)
Endo and Okada (2007)
Takizawa et al. (1994)
Cai et al. (1999)
Curk et al. (1996)
Zanoni et al. (1987)
Back et al. (2000)
Hiu et al. (1984)
Bergey et al. (1923)
Bringel et al. (2005)
Bergey et al. (1923)
Vogel et al. (1994)
Lawson et al. (2001)
Chenoll et al. (2006)
Kandler et al. (1982)
Collins et al. (1989)
Olsen et al. (1991)
Selles des humains Holdeman and Moore
40
Etude bibliographique
Lactobacillus rossiae
Lactobacillus ruminis
Lactobacillus saerimneri
Lactobacillus sakei
Lactobacillus sakei subsp. carnosus
Lactobacillus sakei subsp. sakei
Lactobacillus salivarius
Lactobacillus salivarius subsp.
salicinius
Lactobacillus salivarius subsp.
salivarius
Lactobacillus sanfranciscensis
Lactobacillus satsumensis
Lactobacillus secaliphilus
Lactobacillus sharpeae
Lactobacillus siliginis
Lactobacillus sobrius
Lactobacillus spicheri
Lactobacillus suebicus
Lactobacillus suntoryeus
Lactobacillus thailandensis
Lactobacillus thermotolerans
Lactobacillus trichodes
Lactobacillus uli
Lactobacillus ultunensis
Lactobacillus vaccinostercus
Lactobacillus vaginalis
Lactobacillus versmoldensis
Lactobacillus vini
Lactobacillus viridescens
Lactobacillus vitulinus
Lactobacillus xylosus
Lactobacillus yamanashiensis
Lactobacillus yamanashiensis subsp.
mali
Lactobacillus yamanashiensis subsp.
yamanashiensis
Lactobacillus zeae
Lactobacillus zymae
(1974)
L’ensilage de blé Corsetti et al. (2005)
Sharpe et al. (1973)
Selles des porcs Pedersen and Roos
(2004)
Katagiri et al. (1934)
Torriani et al. (1996)
Katagiri et al. (1934)
Rogosa et al. (1953)
Weiss and Schillinger (1984)
Endo and Okada (2005)
Ehrmann et al. (2007)
Weiss et al. (1982)
Aslam et al. (2006)
Konstantinov et al. (2006)
Meroth et al. (2004)
Kleynmans et al. (1989)
Cachat and Priest (2005)
Tanasupawat et al. (2007)
Selle des volailles Niamsup et al. (2003)
Vin Fornachon et al. (1949)
Olsen et al. (1991)
Roos et al. (2005)
Kozaki and Okada (1983)
Embley et al. (1989)
Kröckel et al. (2003)
Rodas et al. (2006)
Niven and Evans (1957)
Sharpe et al. (1973)
Les produits laitiers Kitahara (1938)
Nonomura (1983)
Dicks et al. (1996)
L’ensilage de blé Vancanneyt et al.
(2005)
41
Etude bibliographique
2.5- Phénomènes des interactions entre les bactéries :
On a classé les interactions entre les bactéries selon leurs effets avantageux ou
désavantageux et on distingue en générale, deux types d’interaction :
Interaction positive, ou stimulation et Interaction négative, ou inhibition. Fredrickson,
(1977)
Ce type d’interaction peut résulte, sans contact physique entre les espèces
bactériennes, d’ou la notion d’interaction indirecte, dans d’autre cas l’interaction
nécessite un contact physique entre les souches, d’ou la notion d’interaction directe.
On pratique, dans un même milieu écologique, comme le lait ou le ferment
lactique, constitue de plusieurs souches de bactéries lactiques ou culture mixte, les
interactions peuvent être à double sens, et chaque une des souches peut avoir une
action stimulante ou inhibitrice sur les autres, d’où les problèmes de l’équilibre
microbiens dans les produits laitiers, on distingue d’une façon générale les cas
suivants :
Symbiose : dans se cas, deux espèces différentes, vivants ensemble, dans les
mêmes milieux de culture, stimulent d’une façon réciproque leur croissance.
Synergie : dans ce cas apparaissent des changements qui ne peuvent être
produit par une en absence de l’autre.
Commensalisme : dans ce cas l’une des deux espèces bactériennes, vit des
produits de l’autre, sans offrir quelques choses, à l’autre espèce.
Compétition : il y a un effet négatif sur les deux populations.
Antagonismes : inhibition d’une espèce par un facteur inhibiteur non
spécifique, produit par une autre espèce.
Mutualisme : dans ce cas ; l’interaction est obligatoire pour la survie des deux
populations bactérienne.
L’étude des phénomènes d’antagonismes ou d’interactions microbiennes
notamment les inhibitions entres les bactéries a paroi Gram négatif et les bactéries
42
Etude bibliographique
impliquées dans les industries de fermentation ; a permis a Pasteur et Jobert des
observations systématiques sur ces phénomènes qui caractérisent ces groupes
microbiens Jack et al.,(1995)
Les travaux de Pasteur sur les phénomènes d’antagonismes microbiens
élargissent ces champs d’application en montrant une interférence.
La croissance de la souche E.coli inoculée dans le milieu de culture avec
Bacillus anthracis causant l’anthrax (agent pathogène, de charbon). Parallèlement à
ces travaux Gratia, (1946) a parvenu a démontrer que E.coli, produit une molécule
active thermostable appelée colicine, le terme bactériocine était utilisé pour la
première fois .Jack et al., (1995).
Depuis la découverte de la nisine de nombreuses substances antimicrobienne
ont été découvertes ayant intérêt thérapeutiques ou alimentaire ; toutefois cette
substance produite par genre Lactobacillus, reconnue comme molécule inoffensive, a
large spectre d’action est actuellement utilisée comme agent de conservation et
additif dans l’industrie alimentaire .Recio et al., (2000) ; Klaenhammer.,(1988) ;
Klaenhammer eal.,(1994) ;Richard (1996).
Les bactéries lactiques sont utilisées en industrie laitière, le plus souvent sous
forme de ferments complexes, ainsi les effets d’interaction entre les souches peuvent
modifier les aptitudes manifestées en culture pures.
Il existe de nombreux phénomènes d’antagonismes ou d’antibioses à l’intérieur
des groupes de bactéries lactiques, vis-à-vis des autres groupes microbiens ; cultivés
sur même milieu, des études ont montré l’effet inhibiteur des bacteries lactiques
contre les especes Helicobacter pylori, E.coli, S.typhi ; Armuzzi et al, (2001) ;
Cocconnier et al, (1998) ; Canducci et al,(2000) ;Sakamoto et al,(2001) ;Collado et
al, (2005) .
Des effets d’inhibition par lesbacteries lactiques contre Listeria, notamment
dans les produits laitiers ; Grade et al., (1997 ; 2004.) ; Raccach et al., (1989) ;
43
Etude bibliographique
Rodriguez et al., (1998) ; Benkerroum et al., (1993 ;2000 ; 2003); Achemchem
et al., (2004) ; Teixeira de carvalho et al., (2006).
Par production des substances inhibitrices tel que : les bactériocines par des
souches de bactéries lactiques qui sont activent contre d’autres souches de bactéries
pathogènes et sur les spores de Bacillus sp et de Clostridium sp. Cependant ; d’autre
produit de métabolisme primaires des bactéries lactiques tel que l’acide lactique,
acide formique, acide acétique et peuvent avoir des effets antagoniques sur la
croissance des autre germes.
2.6- Production des bactériocines :
Les bactéries lactiques ont la faculté de produire des substances
antibactériennes ou bactériocines ; cette caractéristique de produire des agents
antimicrobiens, est sujet à d’intenses investigations scientifiques ; plusieurs revues de
littérature scientifique étaient réservées à leur égard.
D’autres travaux ont focalisées les techniques permettant la mise en évidence
et quantification des bactériocines. Tagg et Mc Given.(1971) ; Tagg et al.,(1973) ;
Daba et al.,(1994) ;Rodriguez et al., (2002) ; Savadogo et al., (2006). Cabo et al.,
(1999) ;Recio et al., (2000) ;Aslim et al .,(2004 ;2005)
De l’analyse de la littérature scientifique relative aux sujet de bactériocines, il
ressort que, les bactériocines ou agents antimicrobiens, produits par, les bactéries
lactiques thermophiles (Lactobacillus acidophilus, Lb helviticus, Enterococcus sp.)
étaient relativement
sujet a plus d’intenses investigations et d’explorations
scientifiques en comparaison aux travaux focalisant la production de ces molécules
par l’espèce Streptococcus
thermophilus. Aktypis et al., (1998) ;Aktypsis et
Kalantzopoulos, (2003).
44
Etude bibliographique
Les bactériocines sont des substances antibactériennes, de nature protéique,
produites par des bactéries lactiques, dotées d’un spectre d’action étroit, qui se limite
à des espèces proches de l’espèce productrice, à paroi Gram positif.
Klaenhammer, (1993) : avait distingué (04) classes :
Classe 1 : Les Lantibiotics : leur membranes renferme des acides aminés non
courantes comme : Lanthionines et βmethyllanthionines, exemple : la Nisine.
Classe 2 : Des bactériocines ne renferme pas de résidus « Lanthionines », sont
thermostables, ces bactériocines ont un PM supérieur à 10 Kda.
Classe 3 : Bactériocines thermolabiles ou « large haet labile » bactériocines,
(exemple : helviticin J ; Lactacines A et B).
Classe 4 : Cette classe renferme les proteines complex ou « Complexe
Bacteriocins » exemple : « Lactacin 27 », « Leucocin S ».
3- Les probiotiques :
3.1-Historique de leur utilisation et définitions
Le concept des probiotiques a été introduit pour la première fois au début du
siècle dernier par Elie Metchnikoff, un chercheur russe ayant reçu un Prix Nobel pour
ses études. Il est à l’origine de l’observation scientifique originale du rôle positif joué
par certaines bactéries sur la santé. Metchnikoff (1908) suggéra que « la dépendance
des microbes intestinaux par l’alimentation rend possible l’adoption de mesures pour
modifier la microflore du corps en remplaçant les microbes nocifs par des microbes
utiles ».
Suite à cette hypothèse, il y eut un intérêt scientifique croissant malgré le
manque de résultats positifs et d’objectivité pour certaines études. Malgré toutes les
investigations réalisées, à l’aide des techniques disponibles à l’époque, le concept
demeura sans preuve et fut mis de côté pendant de longues années. Ce n’est que
45
Etude bibliographique
depuis une vingtaine d’années que la recherche a repris dans ce domaine, il est
maintenant possible de sélectionner les souches les plus appropriées pour répondre
aux bénéfices santé recherchés.
Le terme probiotique provient de deux mots grecs, pro et bios, qui signifient
littéralement «pour la vie ». Il a été popularisé par Fuller en 1989 lorsqu’il lui donna
sa première définition officielle : « les probiotiques sont des suppléments alimentaires
à base de micro-organismes vivants qui agissent de façon bénéfique sur l’être vivant
en améliorant l’équilibre et la stabilité de sa microflore intestinale ». Cette définition
a été révisée à plusieurs reprises et actuellement, la plus acceptée est celle
recommandée par un panel d’experts mandatés par l’Organisation des Nations Unies
pour l’Alimentation et l’Agriculture et l’Organisation Mondiale de la Santé. Elle
indique que les probiotiques sont : « des microorganismes vivants qui lorsqu’ils sont
administrés en quantités suffisantes confèrent un bénéfice pour la santé de l’hôte »
(FAO/WHO, 2002). Tel qu’indiqué, la notion de viabilité est essentielle (Sanders,
2003). De plus, même s’il en est pas fait mention dans cette définition, la dose
généralement recommandée pour obtenir des effets bénéfiques se situe aux environs
de109 à 1010 bactéries par jour afin d’obtenir environ 108 cellules bactériennes
vivantes au duodénum (Sanders et Huis in’t Veld, 1999).
L’apport doit également être régulier puisque ces dernières ne colonisent pas
l’intestin de façon permanente (Ouwehand et al., 2002a). Ceci peut être dû au fait que
la composition du microbiote résident est spécifique à chaque individu et que les
bactéries exogènes ne s’établissent pas facilement (Heyman et Ménard, 2002).
Actuellement, les probiotiques sont disponibles sous différents types de
produits. Ils peuvent être consommés sous la forme de suppléments alimentaires en
capsules contenant des cultures viables lyophilisées ou sous la forme de produits
alimentaires fermentés tels que les yogourts, qui demeurent un véhicule par
excellence pour leur consommation (Sanders, 2003; Parvez et al., 2006). D’autres
46
Etude bibliographique
produits alimentaires incorporant des probiotiques sont également sur le marché tels
que les préparations infantiles, des boissons lactées, des jus de fruits, des fromages et
d’autres actuellement en cours de développement comme la gomme à mâcher. Ces
produits contiennent une ou plusieurs souches probiotiques de genres et d’espèces
différents (Fooks et Gibson, 2002).
3.2-Souches à fort potentiel probiotique
Les principales souches reconnues en tant que probiotiques chez l’humain sont
des bactéries appartenant aux genres Lactobacillus, Bifidobacterium, Enteroccocus,
Streptoccocus et des levures du genre Saccharomyces. Les espèces associées à
chacun de ces groupes sont présentées au Tableau 6
Tableau 6: Liste des principales souches microbiennes considérées comme
probiotiques.
Lactobacilles
Bifidobactéries
Autres bactéries lactiques
Autres micro-organismes
non lactiques
L. acidophilus
B. adolescentis
Enterococcus faecium
E. coli (‘Nissle 1917’)
L. casei
B. animalis
Streptococcus thermophilus
Saccharomyces
L. helveticus
B. bifidum
boulardii
L. gasseri
B. breve
Saccharomyces
L. johnsonii
B. infantis
cerevisiae
L. paracasei
B. lactis
L. plantarum
B. longum
L. rhamnosus
L. lactis
Adapté de Holzapfel et al. (2001).
Parmi
ces
micro-organismes,
les
bactéries
appartenant
aux
genres
Lactobacillus et Bifidobacterium sont les plus fréquemment utilisées avec le plus
d’applications connues à ce jour chez l’humain, a titre d’exemples, les souches
commerciales de lactobacilles ayant des propriétés fonctionnelles et des effets
47
Etude bibliographique
cliniques documentés incluent L. rhamnosus GG, L. casei, L. casei Shirota et L.
reuteri comparativement aux bifidobactéries dont la principale souche, B. lactis
Bb12, fait l’objet de plusieurs études (Pedone et al., 2000; Alvarez-Olmos et
Oberhelman, 2001; Chouraqui et al., 2004).
3.3- Critères de sélection des probiotiques
Afin de satisfaire à la définition des probiotiques, les micro-organismes doivent
posséder diverses propriétés de survie, d’activité et de persistance dans le tractus
digestif qui leurs permettront d’exercer des effets bénéfiques sur l’hôte.
Ces propriétés sont propres à chaque souche et ne peuvent pas être extrapolées
d’une souche à l’autre même au sein d’une seule espèce (Dunne et al., 2001).
Plusieurs critères majeurs de sélection in vitro et in vivo ont été établis et retenus par
différents auteurs (Tableau 7).
Tableau 7 : Principaux critères de sélection des probiotiques.
Critères de sécurité
Critères fonctionnels
Critères technologiques


Identification taxonomique précise

Origine humaine pour utilisation chez l’humain

Souche caractérisée par des techniques phénotypiques et
génotypiques

Historique de non pathogénicité et non-invasion de l’épithelium
intestinal

Pas de transmission possible de gènes de résistance aux antibiotiques


Tolérance à l’acidité, à la bile et aux enzymes digestives

Adhésion aux cellules intestinales et persistance dans le tractus
intestinal

Production de substances antimicrobiennes (bactériocines, acides
organiques, peroxyde d’hydrogène ou autres composés inhibiteurs) et
antagonisme envers les pathogènes

Immunomodulation

Aptitude à produire des effets bénéfiques sur la santé

Stabilité au cours des procédés de production et dans
le produit fini

Conservation des propriétés probiotiques après production

Non modification des propriétés organoleptiques du produit fini
48
Etude bibliographique
Adapté de Klaenhammer et Kullen (1999); Saarela et al., (2000); Ouwehand et al.,
(2002); Gueimonde et Salminen (2006).
Parmi les critères reliés à la sécurité, l’identification taxonomique de la souche
est une étape importante dans l’établissement de nouvelles souches potentiellement
probiotiques (Holzapfel et al., 2001). Chaque souche doit être identifiée par des
techniques moléculaires fiables et confrontée à une nomenclature actualisée
(FAO/WHO, 2002; Gueimonde et Salminen, 2006). Actuellement, l’hybridation
ADN-ADN est la méthode moléculaire de référence pour identifier l’espèce d’une
souche, mais cette méthode est longue et requiert une large collection de souches de
référence (FAO/WHO, 2002). Le séquençage de l’ADN codant pour l’ARN 16S
ribosomal est considéré aussi pertinent (FAO/WHO, 2002).Dans ce dernier cas, il est
recommandé que la technique soit combinée avec des tests sphénotypiques pour
confirmation.
L’origine de la souche est également une condition importante car
l’interaction spécifique avec l’hôte est maximisée lorsqu’elle provient du même
habitat (Alvarez-Olmos et Oberhelman, 2001). Les souches probiotiques doivent
également être sans effet négatif et être sécuritaires pour la santé humaine. A ce titre,
les souches potentiellement probiotiques seront évaluées afin qu’aucun des effets
secondaires suivants ne soient détectés: infections systémiques, activité métabolique
nuisible, stimulation immune excessive chez des individus susceptibles et transfert de
gènes (par exemple de résistance aux antibiotiques) (FAO/WHO, 2002).
A ce sujet, les souches de lactobacilles et bifidobactéries associées aux
aliments possèdent un historique de sécurité de longue date et très peu de corrélations
existent entre des infections systémiques et la consommation de ces probiotiques dans
la littérature (Borriello et al., 2003; Marteau et al., 2006).
Pour assurer une fonctionnalité optimale, les souches probiotiques doivent
conserver leur viabilité jusqu’à leur site d’action. Cependant, il existe une controverse
autour de ce critère notamment par rapport à l’effet sur le système immunitaire.
49
Etude bibliographique
Même s’il est reconnu que les cellules bactériennes mortes peuvent apporter
des bénéfices physiologiques (Sanders, 2003), la définition actuelle des probiotiques
insiste sur le paramètre de viabilité (FAO/WHO, 2002).
Avant d’atteindre le tractus intestinal, les probiotiques doivent résister
principalement à l’environnement acide de l’estomac (pH compris entre 2,0 et 3,4) et
à la bile sécrétée dans le duodénum (Dunne et al., 2001; Gueimonde et Salminen,
2006). Le degré de tolérance à ces conditions diffère pour chaque souche (Havenaar
et Huis in’t Veld, 1992).
3.4-Allégations santé
De nombreuses allégations santé ont été associées à la consommation de
souches probiotiques. Parmi les principaux effets bénéfiques rapportés dans la
littérature (Marteau et al., 2001; Parvez et al., 2006) nous retrouvons :
- Atténuation de l’intolérance au lactose
- Prévention et traitement des infections entériques
- Diminution des diarrhées associées à la prise d’antibiotiques
- Prévention des allergies alimentaires
- Modulation de la fonction immunitaire (stimulation ou régulation).
Un nombre croissant d’études cliniques réalisées pour vérifier ces allégations a
permis d’avancer certaines explications. Les probiotiques pourraient apporter une
quantité supplémentaire d’enzymes digestives (par exemple des β
-galactosidases
capables d’hydrolyser le lactose), créer un effet barrière contre les pathogènes,
rétablir l’équilibre du microbiote résident, dégrader des protéines allergènes et
interagir avec le système immunitaire intestinal pour produire une réponse immune
plus efficace (Sanders, 2003; Corthésy et al., 2007). Bien que les bénéfices santé
mentionnés précédemment soient supportés par plusieurs études, il en existe d’autres
50
Etude bibliographique
qui nécessitent des investigations pour confirmer certains bienfaits. Il s’agit
notamment de l’activité hypocholestérolémiante, de l’effet antihypertenseur, de la
prévention du cancer du côlon, du soulagement des maladies inflammatoires et
irritables des intestins et de la diminution des ulcères induits par Helicobacter pylori
(Parvez et al., 2006).
Parmi les allégations santé avec de fortes évidences scientifiques, l’utilisation
de microorganismes probiotiques pour la prévention et le traitement des désordres
gastrointestinaux est une mesure adaptée et constitue l’application la plus commune
des probiotiques car la plupart des effets santé leurs étant attribués sont en rapport
direct ou indirect (via le système immunitaire) avec le tractus gastrointestinal (De
Vrese et Marteau, 2007).
A ce titre, certains auteurs qualifient l’utilisation des probiotiques comme étant
un traitement d’interférence microbien contre les infections intestinales (Fooks et
Gibson, 2002).
Cependant, peu d’études sont disponibles pour confirmer l’effet prophylactique
ou thérapeutique qu’apportent les bactéries à haut potentiel probiotique contre des
pathogènes.
Il est néanmoins reconnu que les probiotiques offrent les avantages d’être
accessibles, peu coûteux et sans effet secondaire notable contrairement aux
traitements actuellement utilisés pour prévenir ou traiter ces infections (vaccination,
antibiothérapie).
51
Matérielset Méthodes
Matériels et Méthodes
1-MATERIELS
1.1-Souches étudiées :
Le travail expérimental a porté sur l’étude de vingt souches d’entérobactéries
(dont la répartition est donnée sur le Tableau 8) ; ces souches ont été prélevées sur
des selles et des urines des patients présentant séparément des diarrhées infectieuses,
des infections urinaires et de la fièvre typhoïde, pour la recherche et l’isolement des
entérobactéries .Le prélèvement des selles a été examiné dans les quatre premières
heures. (Conservation possible de 8 heures à 4°C) pour éviter tout desséchement des
prélèvements.
Alors que le prélèvement urinaire est examiné dés son arrivée au laboratoire,
par la vérification de son aspect qui peut être clair ou opaque.
Les bactéries lactiques utilisées pour l’étude de l’antagonisme à savoir:
Lactobacillus lactis (Lb1), Lactobacillus helveticus (Lb2), Lactobacillus rhamnosus
(Lb3). Ces bactéries sont isolées à partir du lait de chamelle et identifiées au
laboratoire de bactériologie au niveau du centre vétérinaire de la wilaya de Tlemcen.
52
Matériels et Méthodes
Tableau 8 : Provenance des souches
Sexe des patients
Age des patients
Source de
prélèvements
Féminin
Féminin
Masculin
Féminin
Féminin
Féminin
Féminin
Féminin
Féminin
Masculin
Féminin
Féminin
Féminin
Féminin
Féminin
Masculin
Masculin
Féminin
Masculin
Féminin
30
52
3 mois
82
22
18
5 mois
56
2 mois
34
30
17
82
30
25
33
29
13
33
17
Selles
Urines
Selles
Urines
Urines
Urines
Selles
Urines
Selles
Urines
Urines
Selles
Urines
Urines
Selles
Selles
Selles
Selles
Selles
Selles
1.2-Souche de référence :
Escherichia coli ATCC 25922 : une souche de référence de la collection du
centre vétérinaire a été utilisée pour mieux valider nos résultats lors de la réalisation
de l’antibiogramme et l’antagonisme.
1.3-Antibiotiques testés :
Tous les antibiotiques utilisés proviennent de Biorad, Marnes, La Coquette,
France. La liste figure dans le Tableau 9
53
Matériels et Méthodes
Tableau 9 : la liste des antibiotiques testés et leurs charges
Antibiotiques
Abréviation
La charge (µg)
Céfotaxime
Flumequine
Colistine
Amoxycilline Clavulanic
Acid
Gentamicine
Trimethoprime
Sulfamethoxazole
Ampicilline
Tétracycline
Enrofloxacine
Chloranphénicole
Sulfamethoxazole
Trimethoprime
Oxacillin
Neomycine
Streptomycine
Acide Nalidixique
Penicilline
Erythromycin
CTX
UB
CS
AMC
30
30
10
10
GM
SXT
10
10
AMP
TE
ENR
C
SS
TMP
OX
NE
S
NA
PEN
E
10
30
10
30
10
15
10
10
10
30
3015
1.4-Milieux de culture :
Le Rogosa Sharp liquide et solide (MRS) a été utilisés pour l’enrichissement et
le dénombrement des Lactobnacilles.
Le bouillon Trypyicase Soja Bouillon (TSB) a été utilisé pour l’enrichissement
des Entéropathogénes (E. coli, S. typhi, K oxytoca).
Milieu Hektoen et le milieu ont été utilisé pour l’isolement des Gram négétifs
entéropathogénes (E.coli, S. typhi, K. oxytoca).Le milieu Muller- Hinton a été utilisé
pour la réalisation de l’antibiogramme.
54
Matériels et Méthodes
Les souches isolées sont conservées sur Gélose Nutritive (GN) exception pour
les souches de Lactobacilles.
2-METHODES
2.1-Identification des souches isolées :
L’identification des souches a été réalisée au niveau du Laboratoire Vétérinaire
Régional de la wilaya de Tlemcen, elle a pour but la séparation des Entérobactéries.
2.1.1-Examen bactériologique :
La coproculture et l’étude cytobactériologique des urines ont pour but la mise
en culture des matières fécales et des urines afin d’isoler les bactéries responsables
des infections urinaires et digestives, la méthodologie est illustrée sur la Figure 9.
2.1.2-Enrichissement :
Une portion de selles et ajoutée à 2 ml de bouillon TSB pour l’enrichissement
après le milieu est homogénéisé pour être incubée à 37°C pendant 24heures (Le
Minor et Richard, 1993).
2.1.3-Isolement :
Une goutte du milieuTSB préalablement enrichi et ensemencé sur le milieu
gélose Hektoen par stries (Marchal et al., 1991).
Une goutte du prélèvement urinaire et ensemencé sur le milieu gélose nutritive
(Marchal et al., 1991).Les boites ensemencées sont incubées à 37°C pendant 24
heures.
55
Matériels et Méthodes
2.1.4-Identification :
L’identification est basée sur la détermination des caractères morphologiques
et biochimiques (Le Minor and Richard, 1993).
Selles
Urines
Enrichissement dans les bouillons TSB
Culture sur gélose Hektoen
Culture sur gélose nutritive
Incubation 24 H à 37°C
Résultat positif
Résultat négatif
Examen macroscopique et
microscopique
Galerie biochimique
Figure 9: Schéma représentatif de la méthodologie de prélèvement et
d'identification des souches étudiées. CVWT
56
Matériels et Méthodes
2.1.4.1- Examen macroscopique :
La lecture des ensemencements vise à noter La couleur ; l’odeur ; la taille et
l’aspect des colonies.
Cette observation à l’œil nu est une première clé d’identification (Philippon et
al., 2007).
2.1.4.2 - Examen microscopique :
La double coloration de Gram et l’observation à l’état frais sont la deuxième
étape de l’identification. (Philippon et al., 2007).
2.1.4.3 -Identification des caractères biochimiques :
En se référant aux tests préconisés par Marshall, (1982), on a procéder aux
tests suivants :
2.1.4.3.1-Test des 3 sucres :
Sur le milieu TSI (Trois Sucres à Identifier) est ensemencé avec la souche à
étudier, il est incubé à 37°C pendant 24 heures. Ce test permet la mise en évidence de
la fermentation du glucose, du lactose et du saccharose, la réaction est dite positive si
le milieu devient jaune orange.
Il met aussi en évidence la production d’H2S qui fait virer le milieu au noir ce qui
est dû à la formation du sulfure de fer (Sahl, et al.1995).
2.1.4.3.2- Test mannitol-mobilité :
L’utilisation du mannitol se traduit par une acidification entraînant un
jaunissement de l’indicateur du milieu mannitol ; la mobilité se traduit par une
diffusion à partir de la piqûre centrale vers le fond du tube (Couture, 1990 ; Joffin et
al., 2001).
57
Matériels et Méthodes
2.1.4.3.3- Test de Simmons :
Ce test permet la mise en évidence du citrate perméase : enzyme permettant à
la souche l’utilisation du citrate comme seule source de carbone ; après incubation à
37°C pendant 24heures, l’utilisation du citrate se traduit par la libération des ions
« OH- », qui alcalinisent le milieu en se traduisant par une couleur bleue après le
virage du vert de bromothymol (Gaillot, 2008).
2.1.4.3.4- Production d’acétone :
La souche à identifier est ensemencé dans un tube qui contient le milieu Clark
et Lubs, après incubation à 37°C, pendant 24 heures une goutte de VP1 et une goutte
de VP2 (VP : Vogs Proakauer), sont ajoutées ; si après 10 min la couleur rouge au
préalable devient rose la réaction est dite alors positive (Marchal et al., 1991).
2.1.4.3.5- Recherche de la production d’indole :
Le milieu d’urée indole (couleur orange) est ensemencé avec la souche à
tester, après incubation à 37°C, pendant 24 heures,on ajoute quelques gouttes de
réactif Kovacs ,s’il ya formation d’un anneau rouge la réaction est dite indole positif
(Guillaume, 2004).
2.1.4.3.6- Recherche de à ß-galactosidase :
La souche étudiée est ensemencée dans un tube de 2 ml d’eau physiologique
auquel on ajoute un disque d’Ortho-Nitro-Phenyl-Galactopyranoside (ONPG).
Après incubation à 37°C, pendant 24heures la réaction positive se traduit par une
coloration jaune due à la libération d’orthonitrophenol dans le milieu (Richard,
1978).
58
Matériels et Méthodes
2.1.4.3.7- Recherche de l’uréase et du tryptophane désaminase :
Après 24 heures d’incubation à 37°C Sur milieu urée indole la souche à
tester produit la réaction suivante :
NH2 +
COOH
→ CO2 +
NH3
La combinaison des produits CO2 et NH3 entraîne la formation du carbonate
d’ammonium qui alcalinise le milieu et entraîne un virage au rouge violacé, le
tryptophane désaminase est détectée par addition du perchlorure du fer qui entraîne
une coloration brunâtre (Sigleton, 2005).
2.1.4.3.8- Recherche de nitrate réductase :
Le bouillon nitrate est ensemencé avec la souche à tester, après incubation à
37°C 24 heures on ajoute une goutte de nitrate 1 et une goutte de nitrate 2, si la
coloration vire vers le rouge le teste est dit positif (Joly et Alain, 2003).
2.1.4.3.9- Recherche de l’oxydase :
La bandelette d’oxydase est déposée sur une lame propre et imbibé avec une
goutte d’eau distillée stérile. Une colonie est prélevée à partir du milieu gélose
nutritive à l’aide d’une pipette pasteur puis déposer sur la bandelette.
En présence de l’oxydase la coloration violet foncé apparaît immédiatement
ou en quelque secondes, puis noircit (rose violette puis elle devient brun foncé)
(Grath et al., 1977).
2.1.4.3.10- Recherche de L.D.O ; O.D.C et ADH:
Les milieux liquides : Lysine décarboxylase, Ornithine décarboxylase,
Arginine décarboxylase de couleur violette pour la recherche des décarboxylase et
dihydrolase bactériennes.
59
Matériels et Méthodes
Dans trois tubes différents on ensemence la souche a étudier, on incube à 37°C,
pendant 24 heures, si la couleur reste violacée, la réaction est dite positive et si elle
devient jaune la réaction est dite Négative (Djelouat, 2008).
2.1.5- Antibiogramme
Nous avons utilisé la méthode par diffusion de disques imprégnés, décrite pour
la première fois par Kirby-Bauer (1966) et utilisée actuellement par différents
organismes de recherche avec des modifications mineures.
- A partir d’une culture pure de18 heures, on prélever 3 à 4 colonies ayant le
même aspect.
- on décharge la pipette dans un tube d’eau physiologique à 9 ‰
- on homogénéise la suspension bactérienne, la mettre dans le densitomètre
pour avoir une opacité de 0.5 mcfarland ; puis on trempe un écouvillon
stérile dans la suspension, et on élimine l’excédent en pressant l’écouvillon
sur la paroi du tube. Ensuite on ensemence en stries sur toute la surface
gélosée à trois reprises en faisant tourner la boite et l’écouvillon de 60°
après chaque application.
- on applique les disques d’antibiotiques à l’aide d’un distributeur ou d’une
pince stérile.Il ne faut pas mettre plus de 6 disques dans une même boite de
90 mm.
- La lecture se fait par la mesure du diamètre d’inhibition à l’aide d’un pied
a coulisse, pour comparer les diamètres obtenus aux valeurs critiques
figurant dans la référence (NCCLS).
- Dans notre étude on a complété avec une lecture interprétative, c’est à dire
en comparant les diamètres des souches étudiées avec celui de la souche de
référence E. coli ATCC 25922 pour la validité du procédé.
- L’antibiogramme de la souche de référence est réalisé dans les mêmes
conditions, le même jour (Denteil, 1996).
60
Matériels et Méthodes
2.2- Vérification de la pureté des souches de Lactobacillus sp
La pureté des souches de Lactobacillus (Lb1, Lb2 et Lb3) est obtenue par
repiquage successif sur milieu MRS gélose et incubé à 30°C pendant 24 à 48 heures.
Puis on réalise une coloration de Gram et plus des tests suivants :
2.2.1-Tests enzymatiques :
2.2.1.1-Recherche de catalase :
Sur une lame on dépose une goutte d’eau oxygénée puis on ajoute un peu de
culture prélevé des boites, un résultat est considérés positif par un dégagement de
bulles gazeuses. Il est souhaitable d’éviter toute recherche de la catalase sur gélose au
sang (cause d’erreur), du fait de la présence de cette enzyme dans le sang (Marchal et
al., 1991).
2.2.1.2-Recherche de l’oxydase :
Sur une lame on dépose un disque d’oxydase et une goutte d’eau distillé, un
peu de culture est prélevé et déposer sur le disque. Résultat positif se manifeste par
une coloration rose violette. (Marchal et al., 1991).
2.2.2- Antibiogramme :
La sensibilité et la résistance des souches de Lactobacillus été réalisé par la
technique de diffusion sur milieu MRS solide en utilisant des disques d’antibiotiques
suivants : acide nalidixique , gentamicine, chloramphénicol, pénicilline, néomycine,
erythromycine, tétracycline, oxacillin , cefoxitin, streptomycine, sulphametaxazole,
trimethoprime. Les boites sont incubées en aeroanaerobiose à 30°C pendant 24à 48h.
La lecture s’effectue par la mesure de la zone d’inhibition (Goppola et al., 2005 ;
Delgado et al., 2005).
61
Matériels et Méthodes
2.2.3-Tests physiologiques :
2.2.3.4- La production de CO2 de la fermentation du glucose :
Pour déterminer la production de CO2 de la fermentation de glucose par les
souches de Lactobacillus, nous avons ensemencé des colonies d’une culture pure
dans le bouillon MRS contenant une cloche de Durham et incubé à 30°C pendant 24 à
48h en aeroanaerobiose. La présence de gaz dans la cloche indique qu’il y a
production de CO2. (Garvie, 1984).
2.2.3.5-Fermentation des sucres :
Un tube de 10 ml de milieu MRSc a été ensemencé avec une colonie de
Lactobacillus et incubé en aeroanaerobiose à 30ºC pendant 24 à 48h.On a procédé
une centrifugation 3000g/15 mn.Le culot une fois récupéré est rincé 3 fois à l’eau
physiologique puis une suspension épaisse est réalisée avec 20 gouttes d’eau
physiologiques (Collins et Hall 1984).
Le milieu MRSc sans sucre additionné d’indicateur de pH pourpre de
Bromocrésol à raison de 0.0004% et auquel on ajoute les sucres testés à une
concentration finale de 2% puis le milieu est ensemencées avec 1% de la suspension
bactérienne.Les cultures sont incubées en aeroanaerobiose en présence d’huile de
vaseline stérile à30ºC pendant 24 à 48h. Figure 10.
La fermentation d’un sucre donné par la souche de Lactobacillus testée se
traduit par la formation d’acide qui se manifeste par le virage de la coloration rouge
en jaune.
62
Matériels et Méthodes
2.2.3.6- Suivie de l’acidité titrable :
Les souches de Lactobacillus (Lb1, Lb2 et Lb3), ont été inoculé dans des
flacons de 250ml avec une concentration de 5% d’inoculum .A partir des flacon de
250ml on a préparé des tubes de 10ml pour suivre l’acidité titrable pendant 6h
d’incubation a 42 ºC.
Le titrage s’effectue à l’aide d’une burette avec de la soude dornic sous
agitation, on a utilisé le phénophtaleine comme indicateur. Le résultat est considéré
positive quand le virement de la couleur blanche du lait au rose dure quelques
secondes.
Les résultats sont exprimés en degrée dornic n×10
n : volume de la soude dornic
1 D° dornic=0.1 g d’acide lactique
L’acidité titrable été suivie en milieu lait écrémé +0.05% cystéine Hcl.
63
Matériels et Méthodes
2.2.3.7- Suivi du pH :
L’acidité développée dans le lait est suivie aussi par la mesure du pH.
10 ml de bouillon MRS ensemencé par Lactobacillus Lb1
Centrifugation du contenu du tube à 3000 tours/min pendant 15 min
2 ml de
MRS BCP
Culot
1 ml de sucre
0.1 ml
Huile de paraffine
5 ml de MRS
BCP
Incubation à 30°C pendant 24 heures
La fermentation du sucre se traduit par une couleur jaune
Figure 10: Test de fermentation des sucres (Collins et Hall, 1984)
64
Matériels et Méthodes
2.3-Test de l’antagonisme
2.3.1-Préparation des précultures
On a ensemencé les souches Lactobacillus (Lb1, Lb2 et Lb3) dans des tubes
contenant 5ml de bouillon MRS, puis sont incubés à 30°C pendant 24 heures, alors
que les souches pathogènes E.coli, S.typhi et K.oxytoca sont ensemencées dans un
bouillon d’enrichissement TSB à 37°C pendant 24heures.
2.3.2-Recherche des inhibitions
On ensemence les souches de Lactobacillus (Lb1, Lb2 et Lb3) par touche à la
surface du milieu MRS solide (Gagnon, 2007), après séchage à la température
ambiante pendant 30mn, les boites de Pétri sont mises à l’étuve à 30°C pendant 12
heures.
On couvre alors la culture avec 7ml de gélose molle maintenue en surfusion
45°C contenant 500µl d’une culture pathogène de 12 heures.
Après solidification du milieu, les boites sont incubées à 37°C /24 à 48h
Un résultat positif de l’antagonisme se traduit par la présence des halos clairs
autours des souches de Lactobacillus (Lb1, Lb2 et Lb3) ensemencées en touches.
Figure11 (un résultat est positif si le diamètre est supérieur à 2mm) (Abeet et al.,
1995).
65
Matériels et Méthodes
-
5 ml de MRS bouillon
Incubation à 30°C pendant 48 h
-
Ensemencement des souches
Lb1, Lb2 et Lb3 par touche
Incubation à 30°C pendant 12 h
-
-
-
5 ml de bouillon TSB
Incubation à 37 °C pendant 24 h
Ensemencement des souches sur gélose
nutritive semi solide
Incubation à 37 °C pendant 12h
Incubation à 37°C pendant 48 heures
Halo d’inhibition
Figure 10: méthode de la recherche des halos d’inhibition. (Gagnon, 2007)
66
Matériels et Méthodes
2.3.3-Recherche des agents d’inhibition :
2.3.3.1 - Le pH :
La recherche des inhibitions inter bactériennes est réalisée selon la technique
de Fleming et al., 1983.
On prépare deux tubes de bouillons nutritifs contenant une souche de
Lactobacillus ( Lb3) qui a présenté la plus grande zone d’inhibition pour s’assurer
d’avoir de bon résultas , les tubes sont ensuite incubés à 37°C pendant 18 heures .On
note la croissance des Entérobactéries dans les deux tubes .
Le pH des deux tubes est de 7, après 6 heures d’incubation on ajoute à l’un
des tubes (pour comparer) 1ml de HCL 0.9% ; les tubes sont incubés à 37°C , la
croissance bactérienne est suivie par la mesure de la densité optique chaque deux
heures pendant 20 heures ( Fleming et al , .1983)
2.3.3.2 - Recherche de bactériocines
La recherche des bactériocines se fait sur milieu liquide. Elle est réalisée
seulement sur la souche bactérienne présentant le plus grand halo d’inhibition.
Une culture jeune de 12 heures de la souche Lactobacillus (Lb3) est introduite
dans 50ml de bouillon MRS à 37°C pendant 16 heures (Kleanhammer, 1986). Après
incubation on centrifuge à 8000 t/m pendant 7mn et on récupère le surnageant, qui est
ajusté avec du NaOH (5N) à pH 7 pour éliminer l’effet de l’acidité (Hutt et al., 2006).
On prépare deux tubes contenant 10ml de bouillon nutritive ensemencée avec
la souche
pathogène (St1) .Les tubes sont incubés à 37°C pendant 20h h, la
croissance bactérienne est suivie par la mesure de la densité optique chaque les deux
heures, à la 6
éme
heure après l’incubation le surnageant est ajouté a l’un des deux
tubes. (Asperger, 1985).voire Figure 12.
67
Matériels et Méthodes
1- On prépare un pré culture de la souche Lactobacillus helveticus dans le bouillon MRS
Incubation à 30°C pendant 24 heures
Centrifugation du contenu du tube à 8000 tours/mn pendant 7 minutes
On récupère le surnageant, que l’on ajuste à pH= 7
NaOH
2- On prépare deux tubes de 10 ml du bouillon TSB ensemencé par Salmonella typhi
Le surnageant (Après
6 heures d’incubation)
Incubation à 37 °C pendant 20 heures
La croissance bactérienne est suivie par la mesure
de la densité optique chaque 2 heures
Figure 12 : schéma représentant la recherche de Bactériocine (Asperger, 1985).
68
Résultats
Résultats
1-Identification des entéropathogène : E.coli, S.typhi, K.oxytoca :
1.1-Etude bactériologique :
L’aspect macroscopique sur milieu solide Héktoen des souches ensemencées
montre :
 Des colonies rondes, saumons lisses et laiteuses, suspectées d’être E.coli
Figure 13
Figure 13: Aspect macroscopique d’E.coli après incubation à 37°C/24h
• Des colonies fines, vertes au centre noir suspecté d’être S.typhi. Figure14
Figure 14 : Aspect macroscopique d’S .typhi après incubation à 37°C/ 24h
69
Résultats
• Des colonies volumineuses, saumons, bombées, brillantes et souvent confluentes
suspectées d’être K.oxytoca Figure15.
Figure15 : Aspect macroscopique de K.oxytoca après incubation à 37°C /24h
La double coloration de Gram des souches apparentés à E.coli, se révèlent en
bacilles de couleur rose donc Gram (-) Figure16.
Figure16 : Observation microscopique de la souche E.coli (G× 100).
Celles apparentés d’être S.typhi sont en forme de petits bacilles Gram- Figure 17
Figure 17 : Observation microscopiquede la souche S.typhi (G× 100).
70
Résultats
Alors que des formes coccoides, de groupements en diplobacilles ou en courtes
chaînettes correspondent à K.oxytoca Figure 18
Figure 18: Observation microscopique de la souche K.oxytoca (G×100).
1.2- Identification des caractères biochimiques :
Les Figures19, 20 et 21 représentent les résultats des tests biochimiques dont
les détails sont donnés par le Tableau 10.
Figure 19: Résultats de l’identification biochimique de la souche E.coli.
1: Milieu TSI, 2: Citrate de Simmons, 3: Mannitol- Mobilité, 4: Test ONPG,
5: Urée-Indole, 6: Milieu ADH, 7: Milieu ODC, 8: Milieu LDC,
9: Test d’Acétone VP, 10: Nitrate Réductase.
71
Résultats
Figure 20: Résultats de l’identification biochimique de la souche S.typhi.
1: Milieu TSI, 2: Citrate de Simmons, 3: Mannitol- Mobilité, 4: Test ONPG,
5: Urée-Indole, 6: Milieu ADH, 7: Milieu ODC, 8: Milieu LDC,
9: Test d’Acétone VP, 10: Nitrate Réductase.
Figure 21: Résultat de l’identification biochimique de la souche K. oxytoca.
1: Milieu TSI, 2: Citrate de Simmons, 3: Manitol- Mobilité, 4: Test ONPG,
5: Urée-Indole, 6: Milieu ADH, 7: Milieu ODC, 8: Milieu LDC,
72
Résultats
Tableau 10: Tests biochimiques recherchés pour l’identification des souches
des étudiées.
Tests biochimiques
Résultats obtenus
E.coli
S.typhi
K.oxytoca
Fermentation des sucres
TSI
(Glu, Sac, Lac)
Glu : +
Sac : +
Lac : +
Glu : +
Sac : +
Lac : +
Glu : +
Sac : +
Lac : +
Citrate de Simmons
-
-
+
Manitol
+
+
+
Mobilité
+
+
-
Β-galactosidas ONPG
+
-
+
H2S ou Gaz
Gaz
H2S
Gaz
Uréase
-
-
+
Indole
+
-
+
Production d’acétone VP
-
-
+
Tryptophane
DésaminasTDA
Oxydase
-
-
-
-
-
-
Arginine Dihydrolase
ADH
Lysine Décarboxylase
LDC
Ornithine Décarboxylas
ODC
-
-
-
+
+
+
+
-
-
1.3- Antibiogramme des souches isolées : E.coli, S.typhi, K.oxytoca :
L’étude de la sensibilité et la résistance de ces souches est utile dans le choix
thérapeutique. Figures 22,23 et 24. Tableaux 11, 12 et 13 (voire annexe).
73
Résultats
Figure 22 : Résultat de l’antibiogramme de la souche E. coli (Ec1).
Figure 23 : Résultat de l’antibiogramme de la souche S. typhi (Ec1).
1
2
3
4
5
6
8
9
10
7
2
9
4
2
2
9
4
11
2
2
4
2
4
2
9
4
12
2
2
4
Figure 24: Résultat de l’antibiogramme de la souche Klebsiella oxytoca (Ko4).
1: Cefotaxim, 2: Flumequine, 3: Colistine, 4: Amoxicillin clavulanic acid,
5: Gentamicine, 6: Trimethoprime Sulfamethoxazole, 7: Ampicillin,
8: Tetracycline, 9: Enrofloxacine, 10: Chlorenphenicol, 11: Sulfamethoxazole
12: Trimethoprime
74
Résultats
2. Vérification de la pureté des souches de Lactobacillus : Lb1, Lb2, Lb3 :
2.1-Etude macroscopique et microscopique :
• Sur milieu MRS gélosé, les colonies apparaissent après 24h à 48h d’incubation à
30°C, de couleurs blanches, petites, bien isolées.
Figure 25: L’aspect des colonies de la souche L. rhamnosus (Lb3 ) ensemencé par
stries sur milieu MRS gélosé, incubées à 30°C pendant 48heures en eroanaerobiose
• L’observation sous microscope après coloration de Gram, indique qu’il s’agit de
bacilles bien apparents, Gram positive. Figure 26
Figure 26 : Observation microscopique de la souche L. rhamnosus (Lb3)
(grossissement × 100)
75
Résultats
2.2- Tests physiologiques et biochimiques :
2.2.1- Activités enzymatiques :
Les activités des enzymes catalase et oxydase ont été étudiées. Les résultats
nous montrent que les souches de Lactobacillus (Lb1, Lb2et Lb3) sont catalase et
oxydase négatifs.
2.2.2- Production de CO2 :
La culture des souches de Lactobacillus (Lb1, Lb2 et Lb3) dans des tubes
contenant le milieu MRS bouillon et la cloche de Durham incubés à 30°C en
aeroanaerobiose, n’a montrée aucune production de gaz dans la cloche.
Ce résultat nous démontre que ces souches fermentent le glucose sans production du
CO 2 donc elles ont un métabolisme homofermentaire Figure 27.
Figure 27 : Test de fermentation des trois souches
de Lactobacillus Lb1, Lb2, Lb3.
2.2.3- Identification de l’espèce par le profil fermentaire :
L’identification au niveau de l’espèce des souches de Lactobacillus (Lb1, Lb2
et Lb3) été réalisée par l’étude de leurs profils fermentaires, 10 sucres ont été utilisés
(Tableau 14). Les résultats obtenus nous ont montrés que les souches fermentent 04
sucres Figure 28,29 et 30.
76
Résultats
Figure 28 : Profil fermentaire de la souche L. lactis (Lb1).
Figure 29: Profil fermentaire de la souche L. helveticus (Lb2).
Figure 30 : Profil fermentaire de la souche L. rhamnosus (Lb3).
77
Résultats
De gauche à droite Témoin, Sorbitol, Saccharose, Mannitol, Maltose, Lactose
Glucose, Galactose, Fructose, Arabinose, Amidon.
Tableau 14 : Résultat du test de fermentation des sucres par les souches de
Lactobacillus (Lb1, Lb2 et Lb3)
Sucres testés
Mannitol
Maltose
Lactose
Glucose
Fructose
Arabinose
+
-
+
-
-
-
+/-
-
+
+/-
Lb2
+
-
+
-
-
-
-
-
+
+
Lb3
+/-
-
+/-
-
-
-
-
-
+
+/-
Amidon
Saccharose
Lb1
Galactose
Sorbitol
Code de la
souche
(+) : réaction positive, (-) : réaction négative
2.3- Antibiogramme :
Les résultats obtenus du test d’antibiogramme sont représentés dans le
Tableau15 et la Figure 31 montre la sensibilité et la résistance des souches de
Lactobacillus (Lb1, Lb2et Lb3) aux antibiotiques.
1
2
2
4
5
2
2
3
6
2
2
7
2
4
2
4
2
4
2
4
2
4
2
4
2
8
2
9
2
9
4
2
4
4
10
2
9
4
11
2
2
2
4
2
4
2
2
2
2
4
4
2
9
4
2
4
12
4
2
Figure 31: Résultats du test d’antibiogramme de la souche L. rhamnosus (Lb3).
1 : Oxacillin, 2 : Cefoxitin, 3 : Néomycine, 4 : Gentamicine, 5 : Acide nalidixique, 6 :
Pénicilline, 7 : Chloramphénicol, 8 : Erythromycine,
9 : Sulphamethoxazole, 10 : Tétracycline, 11 : Trimethoprime,
12 : Streptomycine.
78
Résultats
Tableau 15: Résultat de l’antibiogramme des étudies isolées Lb1, Lb2 et Lb3
Lb1
R
R
R
R
R
R
R
R
S
S
S
S
Antibiotique
Néomycine
Streptomycine
Gentamicine
Sulphamethoxazole
Acide nalidixique
Oxacillin
Cefoxitin
Trimethoprime
Pénicilline
Chloramphénicol
Erythromycine
Tétracycline
S : sensibilité
Lb2
R
R
R
R
R
R
R
R
S
S
S
S
Lb3
R
R
R
R
R
R
R
R
S
S
S
S
R : résistance
2.4-L’acidification du lait :
Les résultats montrent que les souches Lb1, Lb2 et Lb3 ont un pouvoir
acidifiant cela est constaté a partir d’acidité titrable acquise et du pH observé
après 6h d’incubation a 42°C les résultats sont représentés dans les Figure
32 et 33. La production d’acide entre les trois souches est peut proche, elle atteint
29°D après 3h d’incubation et entre 40 et 46°D après 6h d’incubation pour les trois
souches Lb1, Lb2 et Lb3 en milieu lait écrémé.
Figure 32 : Cinétique d’évolution de l’acidité Dornic produite par les souches à 30°C
79
Résultats
La fermentation du lait provoque un abaissement de pH qui est proportionnelle
à l’acidité produite .Le pH varie de 6 à 6.5 en milieu lait écrémé. Figure 33.
Figure 33 : Variation du pH des souches de Lactobacillus, lors du suivie de
l’acidité titrable
3- Test de l’antagonisme :
3.1- Recherche des inhibitions :
Les résultats de l’interaction obtenue, révèlent la présence d’halos clairs au tour
des souches de Lactobacillus Lb1, Lb2 et Lb3 ensemencées en touches.
Ces résultats indiquent l’existence des agents d’inhibitions produites par les
souches de Lactobacillus (Lb1, Lb2 et Lb3).
80
Résultats
• Les résultats de l’interaction entre la souche de référence E. coli ATCC 25922 et
Lb1, Lb2, Lb3 sont mentionné dans la Figure 34 et le Tableau 16.
Figure 34 : Résultat de l’interaction entre E. coli ATCC 25922 et
Lb1, Lb2 et Lb3
• Les résultats de l’interaction entre la souche E. coli (Ec1) et Lb1, Lb2, Lb3 sont
mentionné dans la Figure 35 et le Tableau 16
Figure 35 : Résultat de l’interaction entre E. coli (Ec1) et Lb1, Lb2, Lb3
81
Résultats
• Les résultats de l’interaction entre la souche S. typhi (St1) et Lb1, Lb2, Lb3 sont
mentionné dans la Figure 36 et le Tableau 16
Figure 36: Résultat de l’interaction entre S. typhi (St1) et Lb1, Lb2, Lb3
• Les résultats de l’interaction entre la souche K. oxytoca (Ko1) et Lb1, Lb2, Lb3
sont mentionné dans la Figure 37 et le Tableau 16
Figure 37: Résultat de l’interaction entre K. oxytoca: (Ko1) et Lb1, Lb2, Lb3
Tableau 16 : Résultats d’halos d’inhibition d’antagonisme entre Lb1, Lb2, Lb3 et
Ec1, St1, Ko1 et E. coli ATCC 25922.
Souches
Lb1
Diamètre d’halos
d’inhibition
Lb2
E. coli (Ec1)
19
23
18
S. typhi (St1)
19
28
31
K.oxytoca (Ko1)
17
22
19
E. coli ATCC25922
24
23
20
Lb3
82
Résultats
En observant ce tableau, on remarque que les souches d’Entérobactéries Ec1,
St1, Ko1 et la souches deréférence ATCC 25922 ont été inhibées par l’activité
d’antagonisme que posséde les souches de Lactobacillus Lb1, Lb2 te Lb3, et on
remarque que S. typhi (St1) a été la plus sensible à L. rhamnosus (Lb3) avec un halo
d’inhibition de 31mm.
3.2- Recherche des ageant d’inhibition :
3.2.1- Le pH :
Les résultats obtenus par la mesure de la densité optique des deux souches de
S. typhi cultivées dans deux tubes qui contient le milieu TSB liquide dont le pH est
ajusté à 7 avec de la soude NAOH afin d’éviter l’effet de l’acide lactique on
démontré que :
Dans les six premières heures d’incubation à 37°C et en aérobiose on note une
croissance des deux souches de S. typhi (St1) Tableau 17 (annexe).
Dans un des deux tube on ajouté 1ml de HCL après 6h d’incubation. On a
observée une décroissance de
S. typhi (St1), qui indique que cette bactérie est
sensible et ne peut pas survivre dans un milieu acide. Par contre dans l’autre tube ou
le pH est ajusté à 7, on a noter une croissance progressive de S. typhi (St1).
Figure 38
Densité Optique (DO)
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
+1 ml de HCL
0,1
0
0
2
4
6
8
12
18
20
Temps (H)
Figure 38: Croissance de S. typhi (St1) en fonction du pH.
S.typhi
S.typhi +1 ml of HCl
83
Résultats
3.2.2- Recherche de bactériocines :
Aprés incubation à 37°C pendant 20h. La croissance bactérienne est suivie par
la mesure de la densité optique, les résultats sont indiquées dans le Tableau18
(annexe).
Les résultats sont tradiutente par une courbe qui montre une décroissance de
S.typhi (St1) cultivé dans le milieu TSB qui contient le surnageant de L.rhamnosus
(Lb3), sachan que les bactérie ont été cultivée dans un milieu à pH 7. Ces résultats
s’éxpliquent par la présence de bactériocines produite par la souche probiotique
L.rhamnosus (Lb3).Figure 39
densité Optique (OD)
0,6
0,5
0,4
0,3
+
0,2
1 ml de surnageant de Lb3
0,1
0
0
2
4
6
8
12
18
20
Temps (H)
Figure 39: Croissance de S. typhi (St1) en présence de bactériocine
produite par Lactobacillus rhamnosus (Lb3)
S.typhi (St1)
S.typhi (St1) +1 ml de surnageant de Lb3
84
Discussion
Discussion des résultats
Discussion des résultats
1-Isolement et identification des souches d’entérobactéries :
Les informations obtenues à partir des résultats des tests réalisés sur 20 souches
prélevées des selles et des urines des patients présentant séparément des diarrhées
infectieuses, des infections urinaires et de la fièvre typhoïde nous ont permit de les
apparenter aux Entérobactéries (Escherichia coli, Salmonella typhi et Klebsiella
oxytoca) selon Pilet et al., (1981) ; Pardier et al., (1998).
L’identification
préliminaire
des
souches
est
basée
sur
des
aspects
morphologiques : macroscopiques et microscopiques.
Macroscopiquement
les souches d’E. coli qui poussent sur milieu Héktoen
forment des colonies rondes, saumons, lisses et laiteuses, alors que les souches de S.
typhi sont des colonies fines, vertes au centre noire, tandis que les colonies de K.
oxytoca ont un aspect caractéristique, elles sont volumineuses, bombées, brillantes,
opaques et souvent confluentes, ces résultats sont aussi obtenus par Izard et al.,
(1983) ; Gulian et al., (1994) ; Grimont (1998) ; Joly et Reynaud (2003).
Microscopiquement ce sont des Gram (-) se révèlent en bacilles fins pour E. coli,
en forme de petits bacilles pour S. typhi et enfin de forme coccoides, de groupements
en diplobacilles ou en courtes chainettes correspondant à K.oxytoca. (Le Minor et
Richard , 1993 ; Grimont, 1998 ; Sutra et al., 1998 ; Larpent, 1997 ; Djelouat, 2008).
Les résultats biochimiques viennent confirmer l’appartenance de ces souches au
Entérobactéries, ces tests ont démontré que :
 Escherichia coli a pu fermenter l’indole, le mannitol et les sucres du milieu TSI
(glucose, lactose et saccharose) avec production de gaz. Elle contient les enzymes
suivantes : Lysine décarboxylase (LDC), Ornithine décarboxylase (ODC) et βgalactosidase, par contre elle ne possède pas d’oxydase, d’uréase, Tryptophane
85
Discussion des résultats
désaminase (TDA), Arginine dihydrolase (ADH) et l’acétone, elle est mobile et
n’utilise pas le citrate comme seule source de carbone. (Richard, 1978 ; Pilet et al.,
1981 ; Leclerc et al., 1995 ; El Ouardi et Chami, 2001 ; Podschum et al., 2001 ;
Joffin, 2002 ; Tortora et al., 2003 ; Gaillot, 2006 ; Djelouat, 2008).
 Salmonella typhi représente les mêmes caractères biochimiques que ceux d’E.coli,
sauf qu’elle ne fermente pas l’indole, le saccharose et le lactose, elle produit du
H2S lors de la fermentation du TSI. Elle n’utilise pas le citrate comme seule
source de carbone, elle possède de la Lysine décarboxylase (LDC), mais elle n’a
ni Ornithine décarboxylase (ODC) ni Arginine dihydrolase (ADH), elle n’a pas
aussi l’oxydase, le Tryptophane désaminase (ADH), l’uréase, l’acétone et la βgalactosidase. (Richard, 1978 ; Pilet et al., 1981 ; Leclerc et al., 1995 ; El Ouardi
et Chami, 2001 ; Podschum et al., 2001 ; Joffin, 2002 ; Tortora et al., 2003 ;
Gaillot, 2006 ; Djelouat, 2008).
 Enfin Klebsiella oxytoca a fermenté l’indole, le manitole et les sucres du milieu
TSI avec production de gaz, elle contient les enzymes suivantes : uréase, Lysine
décarboxylase (LDC) et la β- galactosidase, elle produit l’acétone et utilise le
citrate comme source de carbone. Par contre ne possède pas : d’oxydase,
Tryptophane désaminase (TDA), l’Arginine dihydrolase (ADH) et l’Ornithine
décarboxylase. (Richard, 1978 ; Pilet et al., 1981 ; Leclerc et al., 1995 ; El Ouardi
et Chami, 2001 ; Podschum et al., 2001 ; Joffin, 2002 ; Tortora et al.,2003 ;
Gaillot, 2006 ; Djelouat, 2008).
L’implication croissante des Entérobactéries dans les infections hospitalière est un
fait marquant des deux dernières décennies, qui semble associée à l’usage des
antibiotiques, à la multiplication des interventions chez les malades et à l’apparition
des souches multi résistantes (Filand, 1971).
86
Discussion des résultats
Pour cette raison on a étudié la sensibilité de nos souches (Escherichia coli,
Salmonella typhi et Klebsiella oxytoca) aux différents antibiotiques.
 Pour la Céfotaxime (CTX) : toutes les souches de E. coli sont sensibles sauf
Ec 10, Ec11 et Ec12 qui sont résistantes, K. oxytoca
résiste à cet
antibiotique,les souches de S typhi en sont sensibles.
 Pour la Flumequine (UB) : on remarque que Ec2, Ec7, Ec11 et Ec12 sont
résistantes
tandis que les souches de K. oxytoca et S .typhi sont toutes
sensibles.
 Pour la Colistine (CS) : l’ensemble des ces souches est sensible, exception
faite pour la souche Ec4.
 Pour l’Amoxycilline Clavulanic Acid (AMC) : l’ensemble de ces souches est
sensible à l’exception d’Ec10 et Ec12 qui ont une sensibilité intermédiaire et
Ko2 qui est résistante.
 Pour la Gentamicine (GM) : les souches d’E. coli (sauf Ec10, Ec11 et Ec12)
présentent une sensibilité à cet antibiotique ainsi que les k. oxytoca et S. typhi.
 Pour la Trimethoprime Sulfamethoxazole (SXT), on remarque que la majorité
des E. coli sont résistantes ; exception faite pour Ec3 ; Ec5 ; Ec8 et Ec10; de
même que pour les Klebsielles qui sont résistantes, sauf pour Ko1et Ko4.
Enfin pour les S.typhi sont toutes sensibles.
 Pour l’Ampicilline (AMP) : les E. coli présentent une résistance à cet
antibiotique. Ec3 ; Ec4 ; Ec5 ; Ec8 et Ec9 ne suivent pas cette règle. Alors que
les Klebsielles sont résistantes et les Salmonelles sont sensibles
 Pour la Tétracycline (TE) : l’ensemble de ces souches est sensible à cet
antibiotique, exception faite pour Ec8, Ko4 qui sont résistantes.
 Pour l’Enrofloxacine (ENR) : Toutes les souches d’E. coli sont sensibles sauf
Ec5 et Ec11qui sont résistantes. Ko1 résiste à cet antibiotique, les souches de
S.typhi en sont sensibles.
87
Discussion des résultats
 Pour le Chloranphénicole (C) : Toutes les souches sont sensibles sauf pour
Ec3 qui est résistante.
 Pour le Sulfamethoxazole (SS) : Les E. coli présentent une résistance à cet
antibiotique sauf pour Ec3, Ec5, Ec8, Ec9 et Ec10 qui sont sensibles. Ko2 et
Ko3 sont résistantes et les Salmonelles sont sensibles.
 Pour la Trimethoprime (TMP) : On remarque que la majorité des E. coli sont
résistantes, exception faite pour Ec3, Ec5, Ec8, Ec9 et Ec10 de même que pour
les Klebsielles qui sont résistantes sauf pour Ko1 et Ko4.Enfin pour les
Salmonelles, elles sont toutes sensibles.
La résistance des Entérobactéries aux antibiotiques citée au dessus est signalée
par plusieurs auteurs (Marshall et al., 1991 ; Nijsten et al., 1996 ; Manges et al.,
2001 ; Guenot et al., 2002 ; Zouatni, 2006 ; May, 2007).
Dans cette étude, on a complété par une lecture interprétative c'est-à-dire en
comparant les diamètres des souches étudiées avec celui de la souche de référence
E.coli ATCC 25922 pour la validité du procédé (Denteil, 1996).
2- Identification des souches de Lactobacillus :
D’après l’observation macroscopique faite sur les souches de Lactobacillus
(Lb1, Lb2 et Lb3) développée sur milieu MRS solide (De Man et al., 1960),on a
remarqué que les colonies sont de couleurs blanches, petites, bien isolées, et
l’observation sous microscope après coloration de Gram, indique qu’il s’agit de
bacilles bien apparents Gram (+). (Gancel et al., 1997 ; Felten et al., 1998 ; CarmenCollado et Hernandez, 2007 ; Tabasco et al., 2007).
Le test de la catalase et l’oxydase sur les souches Lb1, Lb2 et Lb3 se révèle
négatif. (Collins et al., 1987).
88
Discussion des résultats
Les souches de Lactobacillus Lb1, Lb2 et Lb3 fermentent le glucose sans
production du CO2, et donc nos souches sont homofermentaire. (Larpent, 1996).
La différenciation des espèces de Lactobacillus repose sur la fermentation des
sucres, les souches Lb1, Lb2 fermentent l’arabinose, sorbitol, mannitol et la souche
Lb3 fermente l’arabinose et l’égermant le sorbitol, le mannitol et l’amidon. (De
Bruyn et al., 1988 ; Tan et al., 1994 ; Sutra et al., 1998 ; Fasoli et al., 2003 ;
Syndifrais, 2005).
Les Lactobacilles supportent un pH inferieur à 5, elles préfèrent les milieux
neutres ou légèrement acides. (Pilet et al., 1981 ; Rommonond et al., 1992).
La température optimale de développement varie suivant les espèces et fait
partie des critères de classification, les souches Lb1, Lb2 et Lb3 ont montré une
croissance à la température 30°C. (Fasoli et al., 2003).
La composition du lait utilisé influence sur la croissance et aux taux d’acidité
produite par les Lactobacillus. (Hadadji et Bensoltane 2006).
La fermentation du lait par les Lactobacillus conduit à la production d’une
acidité titrable qui détermine les propriétés technologiques de ces bactéries. En
revanche la production de l’acidité dépend de plusieurs paramètres tels que la
température d’incubation, l’état physiologique des bactéries, la concentration de
l’inoculum et le lait utilisé. (Chekroun et al., 2006 ; Chekroun et Bensoltane, 2007).
La production d’acide entre les trois souches est peut proche, elle atteint 29°D
après 3h d’incubation et entre 40 et 46°D après 6h d’incubation pour les trois souches
Lb1, Lb2 et Lb3 en milieu lait écrémé.
La résistance des Lactobacillus à l’acidité est importante pour avoir de bon
effet thérapeutique et pour garder sa viabilité dans les produits fermentés. (Takiguchi
et al., 2000).
89
Discussion des résultats
L’étude de la sensibilité aux anti biotiques c’est un critère important pour
sélectionner les probiotiques (Zhou et al., 2005). La résistance reste une condition
controversé, d’un côté elle est recherché chez les probiotiques pour qu’ils soient actif
même après un traitement aux antibiotiques et d’un autre côté elle est redouté qu’elle
soit transmise au d’autre bactéries indésirable dans l’intestin pourrait mener au
développement de nouveaux microbes pathogènes résistant aux
antibiotiques
(Salminen et al., 1998; Saarela et al., 2000).
Toutes les souches de Lactobacillus Lb1, Lb2 et Lb3 ont montrées des
résistances à l’acide nalidixique, streptolmycine et gentamicine. Ces résultats sont
conformes aux résultats précédemment rapportés pour la même espèce. (Charteris et
al., 1998 ; Coppola et al., 2005 ; Zhou et al., 2005). Les Lactobacillus sont aussi
résistante à l’oxacillin, cefoxitin, neomycine, sulphamethoxazole et la trimethoprime.
(Charteris et al., 1998 ; Danielsen et Wind, 2003 ; Delgado et al., 2005 ; Florez et al.,
2005). Cette résistance été observé chez les souches étudies (Lb1, Lb2 et Lb3).
La résistance des Lactobacillus aux antibiotiques cités au dessus est signalée
par plusieurs auteurs. (Charteris et al., 1998 ; Klein et al., 2000 ; Katla et al., 2001 ;
Delisle et Perl, 2003 ; Moubareck et al., 2005 ; Masco et al., 2006 ; Ammor et al.,
2007).
Par contre comme toutes les espèces de Lactobacillus les souches Lb1, Lb2 et
Lb3 sont sensible à la pénicilline, chloramphénicol, érythromycine et la tétracycline.
Ces résultats sont aussi obtenus par Danielsen et Wind, (2003) Coppola et al., (2005).
3- Interaction bactériennes :
Les résultats obtenus de l’antagonisme révèlent l’inhibition des Entérobactéries
(E. coli, E. coli ATCC 25922, S. typhi et K. oxytoca) par les souches de Lactobacillus
(L. lactis, L. helveticus et L. rhamnosus). Cette interaction positive indique
l’inhibition de la croissance des Entérobactéries, et montre une activité
90
Discussion des résultats
d’antagonisme élevée, qui est traduite par l’apparition des halos d’inhibition dans les
souches isolées E. coli, S. typhi et K. oxytoca (Tabak et al., 2007).
Des études effectuées par Bernet et al., (1993) ont démontré que des souches
de bactéries lactiques adhérant fortement aux cellules intestinales Caco-2 inhibent
l’adhésion de micro-organismes pathogènes comme E. coli et Salmonella typhi à ces
mêmes cellules lorsque elles sont placées en compétition. Parmi les souches ayant fait
l’objet d’études préalables sur Caco-2, L. rhamnosus GG, L. casei, L. helveticus
.Elles adhèrent fortement au tissu provenant du côlon, une inhibition complète d’E.
coli est remarqué par l’ajout préalable de ces souches. (Coconnier et al., 1993; Bernet
et al., 1994 ; Mack et al. 1999).
Ces auteurs ont proposé, que l’adhésion préalable des probiotiques aux cellules
intestinales contribuerait à limiter l’accès des pathogènes aux entérocytes en plus
d’augmenter la sécrétion du mucus qui pourrait lui aussi empêcher l’adhésion des
pathogènes aux cellules intestinales.
Ces souches probiotiques étaient capables d’exclure et d’entrer en compétition
avec les pathogènes de façon significative sur le mucus (Lee et al., 2003). Le degré
de compétition était dépendant de chaque souche et probablement déterminé par
l’affinité respective des adhésines présentes sur la surface des bactéries aux
glycoprotéines du mucus (Lee et al., 2003).
La compétition sur le mucus peut se produire même durant des épisodes de
diarrhée. En effet, Karch et al., (2005) ont observé que l’adhésion des souches
probiotiques B. lactis, L. rhamnosus, L. casei Shirota, L. paracasei , L. acidophilus
aux mucus intestinaux isolés d’enfants en santé et d’enfants ayant une diarrhée à E.
coli était similaire. Ainsi selon ces auteurs les probiotiques pourraient agir même
après que l’infection soit déclenchée. (Guandalini et al., 2000).
91
Discussion des résultats
Dans notre étude on a remarqué que la croissance d’E. coli est inhibée par
L.lactis (Lb1) avec un diamètre d’inhibition de 19mm et de 23mm par L.helveticus
(Lb2) et enfin de 18mm par L. rhamnosus (Lb3).
Pour la souche de référence E. coli ATCC 25922 sa croissance est inhibée par
L.lactis (Lb1) avec un diamètre d’inhibition de 24mm et de 23mm par L.helveticus
(Lb2) et enfin de 20mm par L. rhamnosus (Lb3).
On a constaté que L. lactis (Lb1) inhibe la croissance de S. typhi , ceci avec un
diamètre de 19mm et de 28mm par L. helveticus (Lb2) et de 31mm pour L.rhamnosus
(Lb3).
Enfin la croissance de K. oxytoca est inhibée par L.lactis (Lb1) avec un
diamètre d’inhibition de 17mm et de 22mm par L.helveticus (Lb2) et de 19mm par L.
rhamnosus (Lb3).
Des résultats similaire ont été trouvées par, Alm, (1983) ; Dupont, (1997) ;
Hilton et al., (1997) ; Reid et al., (2003) ; Annuk et al., (2003) ; Michalkiewicz et al.,
(2003) ; Monack et al., (2004) ; Labioui et al., (2005) ; Songisepp et al., (2005) ;
Hutt et al., (2006).
Le mécanisme d’action des probiotiques concerne l’inhibition de la croissance
des bactéries pathogènes grâce à des composés antimicrobiens (Cotter et al., 2005).
Le résultat du test de l’antagonisme nous a permis la recherche des agents
inhibiteurs chez le genre Lactobacillus (Servin, 2003), telles que les acides
organiques, qui sont actives in vitro et in vivo contre les micro-organismes
pathogènes impliqués dans les cas de diarrhées (Servin, 2004).
L’acide lactique et acétique sont produits pendant la fermentation des hexoses
par les lactobacilles et bifidobactéries. Ces acides organiques peuvent diffuser
passivement à travers la membrane bactérienne sous leur forme non dissociée, ils
92
Discussion des résultats
acidifient le cytoplasme après dissociation et inhibent l’activité enzymatique
cellulaire des pathogènes acidosensibles (Deng et al., 1999). Cette diminution du pH
peut donc affecter la viabilité des pathogènes bactériens (Bruno et Shah, 2002;
Servin, 2004).
Comme la présence d’anneau d’inhibition ne signifie pas forcement production
de bactériocine, (Kleanhammer, 1993) des tests supplémentaires sont nécessaires
pour connaitre la nature exacte de l’agent inhibiteur.
Les résultats de ces tests nous ont permis de constater la présence des
bactériocines produite par les souches de Lactobacillus (Aymerich et al., 2000 ;
Fooks et Gibson, 2002) qui ont provoquées une nette diminution de la densité optique
après leurs adjonctions directes dans le milieu de culture.
Ces substances ont été caractérisées par plusieurs chercheurs comme étant des
composés protéiques ayant une activité inhibitrice contre un large spectre de souches
bactériennes (Klaenhammer, 1993 ; Bogovic-Matijasic et al., 1998 ; Cleveland et al.,
2001 ; Chen and Hoover, 2003 ; Cotter et al., 2005 ). Elles agissent principalement
sur la membrane externe des bactéries cibles en formant des pores qui mènent à la
libération du contenu intracellulaire et à la mort de la bactérie affectée
(Klaenhammer,
1993).
Laissant
suggérer
que
les
substances
protéiques
antibactériennes ne sont pas uniquement responsable de l’inhibition et qu’elles
agissent de concert avec l’acide produit. Selon Servin et al. (2004) ceci s’expliquerait
par une diminution du pH qui provoque une perméabilisassions de la membrane
externe des bactéries Gram-négatif facilitant ainsi la pénétration d’autres substances
antimicrobiennes telles que les bactériocines.
93
Conclusionet Perspectives
Conclusion et Perspectives
Conclusion
Les infections entériques constituent actuellement un des problèmes majeurs
dans le domaine de la santé au niveau mondial. Le manque de vaccins effectifs et
l’émergence de micro-organismes résistants aux antibiotiques ont stimulé la
recherche de méthodes alternatives pour contrôler ces infections. Des études cliniques
récentes ont fourni des évidences
que la consommation de certaines souches
probiotiques peut être efficace dans la prévention en diminuant l’incidence des
diarrhées et/ou dans le traitement en affectant la durée et la sévérité des diarrhées lors
d’infections entériques.
Dans notre étude on a isolées des Entérobactéries (Escherichia coli, Salmonella
typhiet et Klebsiella oxytoca) à partir des selles et des urines des patients présentant
séparément des diarrhées infectieuses, des
infections urinaires et de la fièvre
typhoïde , leurs culture sur milieu spécifique Héktoen permet à l’étude
bactériologique proprement dite de s’orienter vers ces bactéries, leurs taille, formes
,contour , odeurs et aspects sont spécifiques et donc permettent de les différencier des
autres groupes de bactéries., leurs mobilités, leurs pouvoir fermentatif des sucres
(glucose, saccharose et lactose) et leurs équipement enzymatiques (ODC, ADH,
LDC, tryptophane désaminase, uréase……) sont les éléments de l’étude biochimique
qui apportent plus de confirmation quand à leur identification. Pour mettre en relief
l’importance de l’antagonisme des bactéries lactiques probiotiques, il était utile de
vérifier la réaction des Entérobactéries à un certaines nombres d’antibiotiques.
Pour les souches de Lactobacillus on a vérifié leur pureté on passant par
l’étude macroscopique et microscopique et des tests tel que : la catalase, oxydase,
production de Co2, profil fermentaire, et en fin l’étude de la sensibilité aux
antibiotiques qui est un critère important pour sélectionner les probiotiques et elle est
recherché chez ces souches pour qu’elles soient actif même après un traitement aux
antibiotiques.
94
Conclusion et Perspectives
Le test de l’antagonisme a montré l’effet inhibiteur de nos souches de
Lactobacillus (Lb1, Lb2 et Lb3) vis-à-vis des Entérobactéries (E. coli, S. typhi, K.
oxytoca et E. coli ATCC 25922) cette interaction positif est traduite par l’apparition
des halos d’inhibition dans le cas des souches d’Entérobactéries isolées.
La recherche des agents d’inhibition révèlent la présence de deux facteurs le
premier est les acides organiques libérées par les souches de Lactobacillus qui
diminue le pH. Le second facteur est l’existence des bactériocines qui ont un effet
d’antagonisme sur la croissance des Entérobactéries.
Ce qui fait aujourd’hui que les Lactobacillus nous poussent à réaliser de
nombreuses études sur le plan taxonomique, écologique et sur le plan médical.
Perspective
Ce travail aura donc permis d’améliorer nos connaissances sur le rôle des
probiotiques dans la prévention des infections entériques.Cela nous a permis de
conclure avec ces perspectives :
1- Production d’un lait fermenté à base de Lactobacillus.
2- Application du génie génétique pour la sélection des souches améliorées afin
de produire des cultures probiotiques thérapeutique.
3- L’identification des bactériocines produite par les Lactobacillus.
4- Approfondir le mécanisme d’action de ces souches.
5- Évaluer l’impact de l’ajout de Lactobacillus transitoires sur le microbiote
intestinal résident.
95
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Annexe
Annexe
Gélose nutritive (G N)
Peptone …………………………………………………. ..5 g
Extrait de viande ……………………………………..…...1 g
Extrait de levure …………………………………………. 2 g
Chlorure de sodium ……………………………………….5 g
Agar ……………………………………………….……. 15 g
Eau distillée…………………………………….…… .1000ml
PH = 7,4
Autoclavage 121°C pendant 15 min.
Gélose Hektoen
Protéase peptone………………………………………… 12g
Extrait de levure……………………………………………..3g
Chlorure de sodium………………………………………….5g
Thiosulfate de sodium……………………………………….5g
Sels biliaires…………………………………………………9g
Citrate de fer ammoniacal…………………………………1.5g
Salicine………………………………………………………2g
Lactose…………………………………………………… 12g
Saccharose………………………………………………… 12g
Fuschine acide…………………………………………… .0.1g
Bleu de bromothymol……………………………………0.065g
Agar……………………………………………………… .14g
Eau distillée…………………………………………… .1000ml
PH=7.5
Autoclavage 121°C pendant 15 min.
Gélose Mueller – Hinton
Macération de viande de bœuf …………………………300ml
Hydrolysat caséine……………………………………… 17,5 g
Amidon…………………………………………………….1,5 g
Agar..................................................................................... 10 g
Eau distilée…………………………………………… 1000ml
PH = 7,4
Autoclavage 121 °C pendant 15 min
Annexe
Gélose M. R. S (Man Rogosa Sharp)
Peptone.................................................................................10 g
Extrait de viande ....................................................................8 g
Extrait de levure .....................................................................4 g
Acétate de sodium ………………………………………… 5 g
Phosphate bipotassique ………………………………….… 2 g
Citrate d’ammonium ………………………………………. 2 g
Sulfate de magnésium 7 H 2O.............................................. 0,2 g
Sulfate de manganèse 4 H2O………………………...… 0,05 g
Glucose ………………………………………………...… 20 g
Agar……………………………………………………...…10g
Tween 80………………………………………………...…1ml
Eau distilée……………………………………………..1000ml
PH = 6,2
Autoclavage 121°C pendant 15 min.
Bouillon TSB (Trypticase Soja Bouillon)
Peptone de viande.................................................................20g
Glycerol..............................................................................10ml
Potassium sulfate................................................................105g
Agar ……………………………………………………....20g
PH = 7,3
Autoclavage 121°C pendant 15 min.
Lait écrémé
Lait écrémé………………………………………………. ..10 g
Extrait de levure…………………………………………... 0,5 g
Eau distillée ……………………………………………..100 ml
pH=7
Autoclavage : 110 °C pendant 10 mn.
Eau physiologique
Chlorure de sodium ………………………………………….8.5g
Peptone………………………………………........................ 0.5 g
Eau distillé ……………………………………………….1000ml
pH= 7
Autoclavage à 120°C pendant 20 minutes.
Annexe
Lait écrémé UHT Candia silhouette
Eau
Poudre de lait écrémé
Vitamines C E B1 B6 B9 D
Vitamine E………………………………………… 0.13 mg/100ml
Vitamine B1……………………………………….. 0.05 mg/100ml
Vitamine B6………………………………………. 0.03 mg/100 ml
Vitamine B9……………………………………………. 7μ
g/100ml
Annexe
Tableau 11 : Résultats du test de l’antibiogramme pour les souches d’E. coli
code des souches
Ec1
Ec2
Ec3
Ec4
Ec5
Ec6
Ec7
Ec8
Ec9
Ec10
Ec11
Ec12
ATCC
25922
30/S
28/S
30/S
30/S
30/S
34/S
28/S
34/S
30/S
<6/R
<6/R
<6/R
30/S
30/S
<6/R
33/S
34/S
36/S
34/S
<6/R
30/S
29/S
29/S
<6/R
<6/R
28/S
26/S
26/S
30/S
<6/R
30/S
21/S
21/S
28/S
30/S
26/S
26/S
28/S
28/S
20/S
20/S
28/S
26/S
18/S
19/S
22/S
25/S
23/S
17/I
18/S
16/I
24/S
27/S
29/S
29/S
30/S
30/S
26/S
29/S
28/S
29/S
11/R
12/R
<6/R
30/S
<6/R
<6/R
20/S
<6/R
34/S
<6/R
<6/R
30/S
29/S
25/S
<6/R
<6/R
25/S
<6/R
<6/R
23/S
20/S
22/S
<6/R
<6/R
21/S
21/S
<6/R
<6/R
<6/R
20/S
25/S
28/S
20/S
29/S
19/S
25/S
27/S
27/S
28/S
24/S
17/S
29/S
24/S
20/S
27/S
25/S
27/S
<6/R
24/S
29/S
26/S
29/S
24/S
19/S
27/S
23/S
24/S
20/S
<6/R
26/S
25/S
28/S
30/S
25/S
27/S
23/S
20/S
26/S
28/S
<6/R
<6/R
21/S
<6/R
30/S
<6/R
<6/R
29/S
27/S
26/S
<6/R
<6/R
<6/R
<6/R
<6/R
24/S
<6/R
29/S
<6/R
<6/R
28/S
26/S
28/S
<6/R
<6/R
27/S
antibiotiques
Cefotaxime
Diamètre/résultat
Flumequine
Diamètre/résultat
Colistine
Diamètre/résultat
Amoxycillin
glavulanic acid
Diamètre/résultat
Gentamicine
Diamètre/résultat
Trimethoxime
sulfamethoxazole
Diamètre/résultat
Ampicilline
Diamètre/résultat
Tetracycline
Diamètre/résultat
Enrofloxacine
Diamètre/résultat
Chlorenphenicole
Diamètre/résultat
Sulfamethoxazole
Diamètre/résultat
Trimethoprime
Diamètre/résultat
Annexe
Tableau 12 : Résultats du test de l’antibiogramme pour les souches de S. typhi
code des souches
St 1
St 2
St 3
St 4
ATCC
25922
32/S
32/S
30/S
31/S
30/S
28/S
28/S
27/S
25/S
28/S
30/S
32/S
29/S
30/S
28/S
30/S
30/S
29/S
27/S
24/S
26/S
30/S
25/S
25/S
30/S
28/S
30/S
30/S
27/S
25/S
30/S
29/S
27/S
30/S
20/S
29/S
27/S
28/S
27/S
28/S
28/S
29/S
32/S
29/S
30/S
30/S
30/S
31/S
25/S
31/S
31/S
31/S
26/S
27/S
30/S
27/S
27/S
29/S
30/S
28/S
antibiotiques
Cefotaxime
Diamètre/résultat
Flumequine
Diamètre/résultat
Colistine
Diamètre/résultat
Amoxycillin
glavulanic acid
Diamètre/résultat
Gentamicine
Diamètre/résultat
Trimethoxime
sulfamethoxazole
Diamètre/résultat
Ampicilline
Diamètre/résultat
Tetracycline
Diamètre/résultat
Enrofloxacine
Diamètre/résultat
Chlorenphenicole
Diamètre/résultat
Sulfamethoxazole
Diamètre/résultat
Trimethoprime
Diamètre/résultat
Annexe
Tableau13 : Résultats du test de l’antibiogramme pour les souches de K.oxytoca
code des souches
Ko 1
Ko 2
Ko 3
Ko 4
ATCC
25922
<6/R
<6/R
<6/R
<6/R
30/S
30/S
28/S
28/S
31/S
28/S
32/S
31/S
29/S
31/S
28/S
23/S
<6/R
24/R
22/S
24/S
11/R
22/S
20/S
19/S
30/S
28/S
<6/R
<6/R
27/S
25/S
<6/R
<6/R
<6/R
<6/R
20/S
25/S
24/S
25/S
<6/R
24/S
26/S
27/S
24/S
28/S
27/S
22/S
26/S
27/S
27/S
26/S
27/S
<6/R
<6/R
<6/R
24/S
28/S
<6/R
<6/R
27/S
25/S
antibiotiques
Cefotaxime
Diamètre/résultat
Flumequine
Diamètre/résultat
Colistine
Diamètre/résultat
Amoxycillin
glavulanic acid
Diamètre/résultat
Gentamicine
Diamètre/résultat
Trimethoxime
sulfamethoxazole
Diamètre/résultat
Ampicilline
Diamètre/résultat
Tetracycline
Diamètre/résultat
Enrofloxacine
Diamètre/résultat
Chlorenphenicole
Diamètre/résultat
Sulfamethoxazole
Diamètre/résultat
Trimethoprime
Diamètre/résultat
Annexe
Tableau 17: Résultats de la densité optique de S.typhi (St 1) et S. typhi (St1) + 1ml de
Hcl
Temps
Souches
0
2
4
6
8
12
18
20
S. typhi (St1 )
0,15 0,263 0,385 0,498 0,556 0,562 0,571 0,589
S. typhi (St1 ) + 1 ml
de Hcl
0,13 0,21
0,35
0,428 0,375 0,351 0,245 0,12
Tableau 18 : Résultats de la densité optique de S.typhi et S. typhi + 1 ml de
surnageant
Temps
Souches
0
2
4
6
8
12
18
20
S. typhi (St1 )
0,15
0,26
0,379
0,49
0,55
0,56
S. typhi + sur
nageant de LB3
0,13 0,243 0,357 0,456 0,445 0,446 0,356 0,334
0,559 0,565
Annexe
Tableau 19: Contrôle de Qualité: Escherichia coli ATCC 25922
Antibiotiques testés
B- Lactamines
Ampicilline
Cefalexine X
Ceftiofin
Aménosides
Gentamicine
Sulfamides
Trimethoprime
sulfamethoxazole
Tétracyclines
Tétracycline
Quinolones
Acide nalidixique
Flumequine**X
Ennfloxacine
Polyptides
Colistins X
Furanes
Nitrofurontoine
Chloramphéricol
Charge
des
disques
(µg)
Diamètres critiques (mm)
Résistant
Intermédiaire
sensible
10
30
30
≤13
≤12
≤17
14-16
13-17
18-20
≥17
≥18
≥21
10
≤12
13-14
≥15
10
≤10
11-15
≥16
30
≤14
15-18
≥19
30
30
5
≤13
≤21
≤16
14-18
17-20
≥19
≥25
≥21
10
-
-
≥15
300
30
≤14
≤12
15-16
13-17
≥17
≥18
Annexe
Les galeries référence d'identifications biochimiques d’entérobactérie API20E
(bio Mérieux sa, France, version 04/98) :
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12 13 14 15 16 17 18 19 20
Tableau 20 : des résultats des teste biochimiques API20E :
Résultats
Teste
1 : ONPG
Substrats
2 : ADH
Ortho-nitrophénylβ-Dgalactosidase.
Arginine
3: LDC
Lysine
4 : ODC
Ornithine
5 : CIT
Citrate de sodium
6 : H2S
7 : URE
Thiosulfate de
sodium
Urée
8 : TDA
Tryptophane
Réactions /
Enzymes
Négatif
Positif
β-galactosidase
incolore
jaune
Arginine
dihydrolase
Lysine
décarboxylase
Ornithine
décarboxylase
Utilisation du
citrate
Production d’ H2S
jaune
rouge / orangé
jaune
orangé
jaune
rouge / orangé
vert pâle / jaune
bleu-vert / bleu
incolore / grisâtre
Uréase
jaune
dépot noir / fin
liseré
rouge / orangé
Tryptophane
désaminase
TDA / immediat
jaune
9 : IND
10 : VP
Tryptophane
Production
d’indole
Pyruvate de
Production
sodium
d’acétoine
marron foncé
JAMES / immédiat ou IND / 2 min
JAMES : incolore JAMES : rose.
vert pâle / jaune.
IND : anneau
IND : jaune
rouge
VP 1+ VP 2 / 10 min
incolore
rose / rouge
Annexe
Coloration de Gram :
Technique
 Préparer un frottis d’une culture bactérienne pure ;
 Recouvrir le frottis avec de cristal violet ; laisser agir une minute ; rincer à
l’eau distillée ;
 Verser du Lugol et le laisser agir pendant une minute ; rincer à l’eau distillée ;
 Décolorer à l’alcool à 950 entre 15 et 30 secondes ; rincer à l’eau distillée
 Recolorer avec de la fuchsine phénique ; pendant 10 seconde si elle est
concentrée ou 1 minute si elle est diluée. Rincer à l’eau distillée ;
 Sécher au dessus de la flamme d’un bec Bunsen ;
 Observer à l’objectif à immersion (objectif x 100) et à pleine lumière.
Les bactéries « Gram-positif » apparaissent en violet foncé, les bactéries« Gram
négatif » en rose ou rouge.
Publications Scientifique
Publications Scientifique
Egypt. J.of Appl.Sci
INTERACTION BETWEEN ENTEROBACTERIA RESPONSIBLE FOR
DISEASES DIGESTIVE SYSTEM INFECTIONS AND
LACTOBACILLUS SP.
Bey*1, F.; A. Abdelmalek1; A. Ait Abdeslam1; A. Meribai1; L. Medouakh1; A. Lakhal 2; B.
Boudilmi 3 and A. Bensoltane1
1
Laboratory of Food and Industrial Microbiology
Faculty of Science. Department of Biology. University Es-Senia Oran Algeria.
2
Laboratory of Food and Industrial Microbiology
Faculty of Science. Department of Biology. University Aboubaker belkaid Tlemcen Algeria.
3
Veterinary Laboratory Regional. Tlemcen Algeria.
*Bey, F. corresponding author. E.mail: [email protected]
Key words: antagonistic, enterobacteria, gastrointestinal and urinary infection, Lactobacillus,
probiotic bacter
ABSTRACT
The enterobacterias are responsible for the infectious diseases of the digestive system and
appear by acute diarrhoeas. Lactobacillus sp. plays an important part in biotechnological fields,
medical and in the agro alimentary like a better conservative by the production of the antimicrobial
metabolites. The enterobacterias (Salmonella tiphy (St1) , Escherichia coli (Ec1) and Klebsiella
oxytoca (Ko1) used in this work are insulated from the feces and of the urines of twenty patients
urinary infections and infectious diarrhoeas. The identification is made by a microbiological and
biochemical studies. An antibiogram was carried out for possible antibiotherapy .The interaction
between Lactobacillus strains ((Lb1: Lactabacillus lactis, Lb2: Lactobacillus helveticus, Lb3:
Lactobacillus rhamnosus) and enterobacteria gave positive results observed by the presence of
inhibition zones, the growth of E. coli ATCC 25922 is inhibited by Lb1 with a diameter of 24mm
and 23mm for Lb2 and 20mm for Lb3 respectively. In a second study the growth of (Ec1) is
inhibited by Lb1 with a diameter of inhibition of 19mm and 23mm with Lb2 and finally of 18mm
with Lb3 Thereafter, the growth of (St1) was inhibited by Lb1 with a diameter of inhibition of
19mm and 28mm with Lb2 and finally of 31mm with Lb3 At the end , this growth, of (Ko1) was
inhibited by Lb1 with a diameter of inhibition of 17mm and 22mm with Lb2 and finally of 19mm
with Lb3 .
,. Additional tests were necessary to know the exact nature of the inhibiting agent. The
results showed that the secretion of the organic acids and the production of the bacteriocin are
probably the origin of inhibition.
INTRODUCTION
The enterobacteria infection is an excellent example of a discovery that has led to improved
treatment of a wide variety of upper gastrointestinal diseases. They cause infectious diseases of the
digestive system that appear by acute diarrhoeas, (Margairaz et al., 1975; pilet et al., 1981) and
represent the first cause of infant mortality in the third World, approximately 1 child out of 10 dies
about it before reaching the 5 years old (Tortora et al., 2003) .The Lactobacillus is probiotic
bacteria exerting various beneficial effects on the health of the host (Shah, 1999). Indeed, among
these effects we note: the control of the intestinal flora, regulation of the intestinal transit,
Publications Scientifique
improvement of lactose intolerance (Gionchetti et al., 2000; Gupta et al., 2000; Gopal et al.,
2001) and the inhibition of the growth many pathogenic bacteria (Callewaert and De Vuyst, 2000).
The limitation or the inhibition of growth is also due to the production of Lactobacillus H2O2 and
bacteriocins. Many researchers have reported the potential health and nutritional benefits of
Lactobacillus strains (Chekroun and Bensoltane, 2007). The objective of this work was to
investigate the interaction between Lactobacillus and enterobacteria in order to determine the
inhibition effect of Lactobacillus against the growth of enterobacterias.
MATERIALS AND METHODS
1-Organisms:
The experimental work concerned by the study of twenty strains of enterobacterias
(Salmonella tiphy (St1), Escherichia coli (Ec1) and Klebsiella oxytoca (Ko1)). These strains were
taken from the feces and of the urines of patients presenting an infectious diarrhoeas, urinary
infections as well as typhoid fever. We work also on Escherichia coli ATCC 25922. Lactobacillus
(Lb1: Lactabacillus lactis, Lb2: Lactobacillus helveticus and Lb3: Lactobacillus rhamnosus) used
in this study were isolated from the chamelle milk and identified at the laboratory of bacteriology
on the veterinary center of Tlemcen Algeria. The identification of isolated strains of enterobacteria
is based on the morphological, physiological and biochemical characteristics according to the
methods of Couture, (1990); Larpent and Gourgaud, (1997); Singleton, (1999); Joffin and
Leyral, (2001).The identification of isolated strain of Lactobacillus was based on the
morphological, physiological and biochemical characteristics according to the published work by
Chekroun, (2005); Hadaji and Bensoltane, (2006).
2-Antibiogram:
The sensitivity study of isolated culture of enterobacteria strains tested with antibiotic. This
test was based on the diffusion agar techniques of Fleming et al. (1975) on Muller-Hinton medium
by using following antibiotics : Ampicilline, Amoxicilline, Colistine, Tetracycline, Flumequine,
Enrofloxacine, Ceftiofur, Gentamicine, Chlorophenicole, Amoxicillin+clavulanic acid,
Sulfamethoxazole, Trimethoprime Incubation was carried out at 37°C during 24h in aeroanaerobic
conditions. The readings of the results were carried out by the measurements of diameters of
inhibition zones and compared with references strains ATCC 25922 (Denteil, 1996).
3- Antagonism Test:
3-1- Cultures preparation
We cultured our strains of Lactobacillus ( Lb1, Lb2, Lb3) in a liquid medium of MRS the
culture was incubated at 30°C during 24h to 48h aero-anaerobically. In parallel, the cultures of
isolated enterobacteria (St1, Ko1, Ec1, and E.coli ATCC 25922) were cultured in nutritive broth at
37°C during 24 hours in aeroanerobic conditions.
3-2- Inhibitions test
We cultured Lactobacillus strains (Lb1, Lb2 Lb3) in Petri-dishes on Agar medium in touch by
the multi-points inoculator (Tabak et al 2007). Incubation was carried out at 30°C during 24 to 48
hours aero-anaerobically. Thereafter,the plates were covered with a layer of 10 ml soft agar
inoculated with 0.1 ml of enterobacteria (St1, Ko1, Ec1, and E.coli ATCC 25922) after
solidification, the plates were aero-anaerobically incubated at 37°C during 24h. (Fuller, 1991;
Hove et al., 1994). The positive results of antagonism test showed the presence of clear zones
around of the Lactobacillus strains, the result is positive if the diameter of the inhibition zone is
higher 2 mm. (Abeet et al., 1995).
Publications Scientifique
4-Research of inhibition agents:
4-1- pH
The research of inhibition between strains Lactobacillus and enterobacteria was carried out
according to the technique of Fleming et al. (1975) we prepared two tubes of nutritive broth
containing Salmonella tiphy (St1) which presented the largest inhibition zones to ensure a good
result. Tubes were then incubated at 37°C during 24 h. After incubation, we noted that growth of
Salmonella tiphy (St1) in the two tubes. The pH of the two tubes was adjusted at pH 7 with 5N HCl
after 6 hours of incubation at 37°C .The bacterial growth was measured optically each hour during
20 hours (Fleming et al., 1983).
4-2- Bacteriocins:
The research of the bacteriocin is carried out in liquid medium. It is done only with the bacteria
which gave the largest inhibition activity against Salmonella tiphy (St1). Culture of Lactobacillus
rhamnosus (Lb3) was inoculated in 50 ml of MRS liquid at 30°C during 18 hours (Kleanhammer,
1986). After incubation we centrifuged at 8000 rpm for 7 minute and the supernatant was adjusted
with 5N NAOH to eliminate the effect of acidity. We prepared two tubes containing 10ml of
nutrient broth with Salmonella tiphy (St1) the tubes were incubated at 37°C during 24 hours
aerobically. The bacterial growth was followed by the measurement of the optical density each two
hours. At the 6th hour of incubation the supernatant was added to one of the tubes.
RESULTS
1-Antibiogram:
The study of the sensitivity on the growth of enterobacteria is sometimes very useful in the
therapeutic choice (Figure: 01)
Figure 01: Test of antibiotics in Muller Hinton medium.
1:Ampicilline (AMP)
2:Amoxicilline (AMX)
3:Colistine (CS)
4:Tétracycline (TE)
5:Flumiquine (UB)
6:Enrofloxacine (ENR)
7:Ceftiofur (CF)
8:Gentamicine (GN)
9:Chlorenphenicole ©
10:Ampicilline+clavulanic ac
11:Sulfamethaxazol (SS)
12:Trimethoprime (TMP)
2-Antagonism activity of Lactobacillus sp. against enterobacteria
Growth inhibition of enterobacteria isolated shows the existence of some inhibition agents
produced by Lactobacillus species and do not indicated the nature of these agents. (Table: 02),
(Figure: 02).
Publications Scientifique
Table 02: Results of diameter of antagonism between Lactobacillus (Lb1, Lb2, and Lb3)
and enterobacteria (S.typhi (St1), K. oxytoca (Ko1), E.coli (Ec1) , E.coli ATCC 25922 )
Strains
E.coli (Ec1)
S.typhi (St1)
K.oxytoca (Ko1)
E.coli ATCC25922
Klebsiella oxytoca (Ko1)
Escherichia coli (Ec1)
diameter of antagonism (mm)
Lb1
Lb2
Lb3
19
23
18
19
28
31
17
22
19
24
23
20
Salmonella typhi (St1)
Escherichia coli ATCC 25922
Figure 02: Result of antagonism test between Lactobacillus Lb1: Lactabacillus lactis,
Lb2: Lactobacillus helveticus, Lb3: Lactobacillus helveticus
and enterobacteria ( (St1), (Ko1), (Ec1) and E.coli ATCC 25922 )
From the obtained results resumed in the table above we can see that enterobacteria species
(Salmonella tiphy (St1), Escherichia coli (Ec1), Escherichia coli ATCC 25922 and Klebsiella
oxytoca (Ko1)) were inhibited by the antagonism activity of Lactobacillus species (Lb1, Lb2, Lb3).
The growth of E. coli ATCC 25922 is inhibited by Lb1 with a diameter of 24mm and 23mm for
Lb2 and 20mm for Lb3 respectively. In a second study the growth of E. coli (Ec1) is inhibited by
Lb1 with a diameter of inhibition of 19mm and 23mm with Lb2 and finally of 18mm with Lb3
Thereafter, the growth of S.typhi (St1) was inhibited by Lb1 with a diameter of inhibition of 19mm
and 28mm with Lb2 and finally of 31mm with Lb3 At the end , this growth, of K.oxytoca (Ko1)
was inhibited by Lb1 with a diameter of inhibition of 17mm and 22mm with Lb2 and finally of
19mm with Lb3 .
Publications Scientifique
3-Research of the agents of inhibition:
3-1- pH
Results obtained by the measurement of the optical density of isolated Salmonella tiphy
cultivated in the nutrient broth whose pH was adjusted to 7 with NAOH and incubated at 37°C
during 24 hours that in the first six hours of incubation at 37°C and in aerobic conditions, there was
a normal growth of the two Salmonella tiphy (St1) (the control and the test). In the test tube we
added 1ml of (HCl 0.9%). We observe a decrease of S. tiphy (St1) .which indicated that this
bacterium is sensitive to HCl .On the other hand, in the control tube where the pH was adjusted to 7,
we noted progressive growth of Salmonolla tiphy (St1) .The resulted are represented in Figure 03
Optical Density (DO)
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
+
0
2
4
6
8
12
18
20
Times (H)
Figure 03: Growth of S. typhi (St1) according to the pH.
S.typhi
S.typhi +1 ml of HCl
3-2- Search for bacteriocin:
After incubated at 37°C during 24 hours .The bacterial growth is measured. the results are
indicated in Figures 02 and 04.in order to know the existence of bacteriocin and its effect on the
growth of Salmonella tiphy (St1) .The results are translated by a curve which contains the
supernatant by Lb3 in wells, knowing that this bacterium have to develop in a medium with pH
7.These results are explained maybe by the presence of bacteriocin production by Lactobacillus
species (Lb1, Lb2, Lb3).
Optical density (OD)
0,6
0,5
0,4
0,3
+
0,2
1 ml of supernatant to Lb3
0,1
0
0
2
4
6
8
12
18
20
Times (H)
Figure 04: Growth of S. typhi (St1) in the presence of bacteriocin
produced by Lactobacillus rhamnosus (Lb3)
S.typhi (St1)
S.typhi (St1) +1 ml of supernatant to Lb3
DISCUSSION
Publications Scientifique
The sensitivity of enterobacteria to antibiotics showed that S. typhi (St1) and
E. coli ATCC25922 is sensitive to all antibiotics. K. oxytoca (Ko1) and E. coli (Ec1) are sensitive to
Amoxicilline, Colistine, Tetracycline, Flumequine, Enrofloxacine, Gentamicine, Chlorophenicole,
Amoxicillin+ clavulanic acid. Therefore a remarkable resistance to: Ampicilline, Ceftiofur,
Sulfamethaxazol, Trimethoprim. It is important to note that any infection by enterobacteria has to
test the antibiotic sensitivity for their uses in the therapeutic field (Margairaz et al., 1975).
The results obtained by the antagonism test suggested and revealed that inhibition of
S. typhi (St1), E. coli (Ec1), E. coli ATCC25922 and K.oxytoca (Ko1) by strains of Lactobacillus
(Lb1, Lb2, Lb3). This positive interaction indicated the growth inhibition of enterobactria and
showed an antagonism activity which is translated by the appearance of halos in the enterobacteria
isolated. Lactobacillus rhamnosus (Lb3) inhibits the E. coli (Ec1) with a diameter to 18 mm and E.
coli ATCC 25922 with a diameter to 20 mm , 31mm for S.typhi (St1) and 19mm for K.oxytoca
(Ko1) same results were showed by ; Alm, (1983); Dupont, (1997); Hilton et al., (1997); Reid et
al., (2003); Annuk et al., (2003); Michalkiewicz et al., (2003); Monack et al., (2004); Labioui et
al., (2005); Hutt et al., (2006); Songisepp et al., (2005).
The results of the antagonism test allowed us to push deeply the research and to look for the
agents of inhibition that produce Lactobacillus species.
The presence of halations due to secretion of the organic acids which have an effect to lower the
pH in the medium. And thus, the presence of the Lactobacillus species and enterobacteria in the
same medium causes inhibition of S.typhi (St1), E.coli (Ec1), and E.coli ATCC 25922 and
K.oxytoca (Ko1) growth. On the other hand strains of Lactobacillus have continued to grow,
because they are bacteria which have acidophilic character (Ouwehand and Vesterlund, 2004).
The examination of antagonism test explains the action of the acids in general on the
cytoplasmic membrane of the bacteria (Blom and Mortvedt, 1991) these acids touch with the
maintenance of the membrane potential and inhibit to molar acid concentration (Chekroun and
Bensoltane, 2007).The acetic acid is more inhibiting than the lactic acid, it can inhibit yeasts,
mould and the bacteria pathogenic (Caplice et al., 1999; Gerald and Fitzerald, 1999) the
propionic acid inhibits mushrooms and certain bacteria the inhibiting activity is higher in
associations of two or several strains of lactic bacteria (Chekroun and Bensoltane, 2007).
As the presence of ring of inhibition does not mean forcing production of bacteriocin
(Kleanhammer, 1986) of the additional tests are necessary to know the exact nature of the
inhibiting agent. The results of these tests enabled us to note the presence of the bacteriocins-like
produced by strains of Lactobacillus which caused a clear reduction in the optical density after their
direct addition in the culture medium. Similar results were found according Carmen et al. (2000)
which confirmed the inhibiting presence of bacteriocin of enterobacteria.
These substances were characterized by other researchers. The molecule is of proteinic
nature (Delvis-Broughton, 1990) are sensitive to the action of the varied proteolytic enzymes or
having a proteinic part and consequently, they are inactivated by these enzymes (Devuyest, and
Vandamme, 1994). The strain of Lactobacillus can naturally produce more than a bacteriocin. Hutt
et al., (2006).
Publications Scientifique
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Lactobacillus Ê?Ó?ÓÖÚÈæ íãÖå áÇ ÒÇåÌáÇ ÖÇÑãà ÊÇÈÈÓã entrobacteria
3
2
.
1
.
1
.
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.
(Klebsiella oxytoca (ko1), Escherichia coli (EC1), Salmonella tiphy (St1) ) entrobacteria
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enterobacteria
Lb3
18
20 Lb2
Lb2
23
31 Lb2
28
Lb2
23
22
17
24
19
19
Lb1
E.Coli ATCC 25922
Lb1
Lb1
Lb1
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Escherichia coli (Ec1)
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Klebsiella oxytoca (ko1)
Lb3
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.
:
enterobacteria
Lb3
Lactobacillus Probiotic bacteria.
19
Publications Scientifique
Egypt. J.of Appl.Sci
Viability and resistance to acidity of Bifidobacterium sp
in Algerian’s bio-yogurts
Abdelmalek.A*1; F.Bey1; Y.Gheziel2; K.Krantar1; A. Ait Abdeslam1; A. Meribai1;
L. Medouakh 1 and A. Bensoltane1
1
Laboratory of Food and Industrial Microbiology
Faculty of Science. Department of Biology. University Es-Senia Oran 31000 Algeria.
2
Hygiene laboratory. Wilaya of Oran . Algeria.
*Abdelmalek,A. corresponding author. E.mail: [email protected]
Key Words: Bifidobacterium sp. ,bio-yogurt, viability, resistance,storage.
ABSTRACT
Fermented milk products are the most popular means of delivering probiotic bacteria in
food.Among them strains of Bifidobacterium sp predominate in commercial probiotic products.
Four commercial bio-yogurt products which claimed to include bifidobacteria, were obtained from
local Algerian markets. These products were examined at 0,7,14 and 21 days for the viability of
bifidobacteria and yogurt culture L. delbrueckii spp.bulgaricus and S. thermophilus during storage
at 4°C.All yogurts contained bifidobacteria at levels > 6.2 log cfu/ml at the time of purchase,the
viability decreased during storage and on expiry counts were variable, ranging from 4.8 to 6.1 log
cfu/ml. The average yogurt culture counts ranged from 6.7 to 7.2 log cfu/ml for L. delbrueckii
spp.bulgaricus and 7.8 to 8.2 log cfu/ml for
S. thermophilus.Specific growth rate(µ) and
generation time of Bifidobacterium strains were determined. Acid tolerance was determined by
introducing the strains of Bifidobacterium in skimmed milk at pH=4.3 and enumerating during
storage at 4°C.B.animalis showed superior survival abilities and resistance to acidity.
INTRODUCTION
Probiotics are defined as ‘live micro-organisms’ which confer a health benefit on the host
when administered in adequate amounts .Fermented dairy products containing probiotic bacteria
such as Bifidobacteria, are generally considered as functional foods (O’sullivan, 2001). Production
of fermented milks containing bifidobacteria is increasing because of their beneficial effects on
health(Crittenden, 1999). The reported health benefits of bifidobacteria include stabilizing the gut
mucosal barrier, modulation of immune response, modulation of intestinal microbiota, prevention of
traveller’s diarrhoea in children,reduction of necrotizing endocarditis in neonates, alleviation of
atopic dermatitis symptoms in children, improvement of constipation, and antibacterial and
anticarcinogenic activities ( Kailsapathy and Rybka, 1997; Ouwehand et al., 2002; Reid et al.,
2003).In order to provide health beneficets, fermented dairy product should contain a minimum
level of life and active cultures at the time of consumption.It has been argued that a minimum level
of 10 8 cfu/ml should be present in order to promote human health(Shah, 2000).The international
Standard of federation Internationale de Laiterie/ International Dairy federation(FIL/IDF) require
107cfu/ml of Lactobacillus acidophilus in product such as acidophilus milk and 106 cfu/ml of
Bifidobacteria in fermented milks containing Bifidobacteria at the time of sale(IDF 1992). Several
factors affect the survival of Bifidobacterium spp. in yogurts. These include strains of probiotic
bacteria, pH, hydrogen peroxide, storage atmosphere, concentration of metabolites such as lactic
acid and acetic acids, dissolved oxygen, and buffers such as whey proteins (Kailasapathy and
Rybka, 1997). Among the various milk products, yogurts are regarded as the ideal vector for the
delivery of probiotic bacteria to consumers. A growing number of yogurt manufacturers are
therefore incorporating Bifidobacterium spp. in their products (Lourens-Hattingh and Viljoen,
2001).In Algeria five manufactures claimed to include bifidobacteria in their products.The objective
Publications Scientifique
of this study was to determine the viability of bifidobacteria and yogurt culture, and to determine
resistance of bifidobacteria to acidity in Algerian’s commercial bio-yogurt products.
MATERIALS AND METHODS
Yogurt samples :
Four bio-yogurt made by two different manufacturers that claimed to include bifidobacteria
in addition traditional yogurt culture L. delbrueckii spp.bulgaricus and S. thermophilus.
Bacterial cultures :
Strains of Bifidobacterium B1,B2,B3 and B4 were isolated from Algerian commercially bioyogurt. Strains were cultured on MRS-raffinose and incubated under anaerobic
conditions(anaerocult, Merck Germany) at 37 °C for 72 h (Tabasco et al 2007).Strains were
identified on the basis of the colony morphology, Gram positif , pleomorphic fermentative rods
often Y-shaped ,negative reaction in biochemical test (catalase, urease, oxydase) (Marchal et al.,
1991) and sugar fermentation(Scardovi,1986). Bifidobacterium species for strains B1 and B2 were
Bifidobacterium.animalis, B3 and B4 were identifind at Bifidobacterium sp.(Abdelmalek, 2008).
Specific growth rate (µ) and generation time of strains:
Samples of UHT skim milk were inoculated with strain B1,B2,B3 and B4 ( c.108 CFU/ml
for each strain).During 6 h of incubation, sampling and dilutions in sterile Ringer solution with
0.05% cysteine HCl were made. Strains of bifidobacteria were cultured on MRS- agar with 0.05%
cysteine HCl( De man et Sharpe, 1960) under anaerobic conditions using anaerocult(Merck,
Germany) at 37°c for 72h.Specific growth rate (µ) for each culture was calculated using this
equation µ= ( log10 Xt – log10 Xt0 )/ ( t1 – t 0) where Xt and X 0 are counts (cfu/ml) at time tt and
t 0.Generation time (Tg) was calculated as Tg= ln(2/µ) ( Shin et Ustunol, 2000b).
Viability of bifidobacteria strains at 4°C in skimmed milk:
The UHT skimmed milk was used as the survival medium.Strains of bifidobacterium was
introduced into 500 ml portion of sterile skimmed milk in Durran bottles to have a final population
of c. 108 cfu/ml.The pH was adjusted to 4.3 using 88% lactic acid.the bottles were stored at 4°C for
21 days.The viability of Bifidobacteria was determined in samples at 0,7,14 and 21 days.The counts
were made on MRS-agar with 0.05% cysteine Hcl after anaerobic incubation at 37°C for 72h.
Enumeration of bifidobacteria and yogurt culture in commercial product during storage:
We tested viable bifidobacteria and yogurt cultures L. delbrueckii spp. bulgaricus and
Streptococcus thermophilus in four commercial bio-yogurt (P1, P2, P3 and P4) every week until 21
days past the expiry date.At each sampling, 1 ml of bio-yogurt was dissolved in 9 ml of Ringer
solution with 0.05% cysteine HCl.Serial dilutions were made to 10-7.A volume of 100µl was spread
on to triplicate plates of selective media. MRS- agar ( De man et Sharpe, 1960) was used for
enumeration of L. delbrueckii spp. bulgaricus , M17-agar (Tersaghi et Sandine, 1975) was used
for enumeration of Streptococcus thermophilus and MRS-raffinose (Tabasco et al., 2007) was used
for the enumeration of bifidobacteria. The inoculated plates were then incubated under anaerobic
conditions at 37°C for 72h.
Measure of pH:
The pH of the bio-yogurt samples was measured using a pH meter. Between samples the
electrode was rinsed with distilled water.
RESULTS
B1 and B2 Strains showed the highest µ followed by B3 and B4,the specific growth rates µ
were ranged between 0.45 and 0.38.Generation time (Tg) was ranged between 1.54 and 1.48.
Table1 shows specific growth rates(µ) and generation time Tg of four bifidobacteria strains in
skimmed milk after 6 h of incubation.
Publications Scientifique
Table 1:Specific growth rates(µ) and generation time(Tg) of four strains of bifidobacteria
Strains
B1
B2
B3
B4
µ(h-1)
0.45
0.40
0.35
0.38
Tg
1.54
1.50
1.45
1.48
B1 and B2 survived for more than 21 days above 106cfu/ml, B3 and B4 declined numbers
and decreased below 106 cfu/ml in 21 days of storage at 4°C in pH adjusted skimmed milk(Fig1).
log cfu/ml
10
8
6
4
2
0
Day 0
B1
Day 7
Day 14
B2
B3
Day 21
B4
Figure 1 Viability of bifidobacteria strains at 4°C with pH=4.3 in skimmed milk
Yogurt culture counts ranged from 6.7 to 7.2 log cfu/ml for Lactobacillus delbruckii spp.
bulgaricus and 7.8 to 8.2 log cfu/ml for Streptococcus thermophilus during storage period in all
products tested.The levels of L. delbruckii spp. bulgaricus and S. thermophilus remained relatively
stable. All bio-yogurt contained >106 cfu/ml of bifidobacteria when purchased. All product showed
a steady decline in viable numbers during storage, P1 and P2 contained > 106 cfu/ml of
bifidobacteria on expiry day, whereas the two other products P3 and P4 contained > 105 cfu/ml of
bifidobacteria. Figures 2-5 show the viability of bifidobacteria and yogurt culture L. delbruckii spp.
bulgaricus and S. thermophilus in commercial bio-yogurt products P1;P2;P3 and P4 respectively
during refrigerated storage at 4°C.
log cfu/ml
10
5
0
Day 0
Day 7
Streptococcus
Day 14
Day 21
Lactobacillus
Bifidobacteria
Figure 2: Viability of bifidobacteria and yogurt culture in P1 during 21 days of storage at 4°C
log cfu/ml
Publications Scientifique
10
5
0
Day 0
Day 7
Streptococcus
Day 14
Day 21
Lactobacillus
Bifidobacteria
log cfu/ml
Figure 3: Viability of bifidobacteria and yogurt culture in P2 during 21 days of storage at 4°C
10
5
0
Day 0
Day 7
Streptococcus
Day 14
Day 21
Lactobacillus
Bifidobacteria
log cfu/ml
Figure 4: Viability of bifidobacteria and yogurt culture in P3 during 21 days of storage at 4°C
10
5
0
Day 0
Day 7
Streptococcus
Day 14
Day 21
Lactobacillus
Bifidobacteria
Figure 5: Viability of bifidobacteria and yogurt culture in P4 during 21 days of storage at 4°C
Publications Scientifique
DISCUSSION:
Bacteria B1 and B2 strain isolated from Algerian bio-yogurt were Bifidobacterium
animalis.The technological properties of B.animalis make it suitable for inclusion in bio-yogurt
(Jayamanne et Adams, 2006).Two product tested in this study, claimed to contain B.animalis spp
lactis.Specific growth rates (µ) and generation time of four strains of bifidobacteria ranged from
0.38 to 0.45 and 1.45 to 1.54 respectively .Similar results were found with B. lactis and B.breve(
Martinez-Villaluenga and Gomez, 2007).The acid tolerance of bifidobacteria is important as the
organism has to withstand the acidity in yogurts and gut, it has been reported to have health
benefits.For digestion of food, the pH of gastric juice has to be around 3-4(Takiguchi and Suzuki
,2000) and the pH of yogurt varies from 3.8 to 3.36(Shah et al., 1995).The results in the present
study showed that B.animalis (B1 and B2) survived longer in high acid environements over other
strains B3 and B4.Matsumoto et al.,(2004) reported that of 17 Bifidobacterium strains, B.animalis
spp lactis had highest acid tolerance.In their study,Hcl was used as the acidulent. A same result
were found by Jayamanne and Adams, (2006) but they used lactic acid as the acidulent.In our
study the acid lactic was used to simulate the acidic environment in the product.Bifidobacteria
should be present at > 106 cfu/ml in bio-yogurts on expiry to have health benefits (Kurmann and
Rasic, 1991).Microbial interactions could contribute to the ability of bifidobacteria in bio-yogurts.
Different combinations of yoghurt starter and probiotic bacteria, and these combinations could have
mutualistic and antagonistic effects on bifidobacteria(Jayamanne and Adams ,2006).Our results
revealed that all the bio-yogurt products contain this level when purchased, but this number increase
during storage. A similar study showed adequate bifidobacteria counts and a high viable counts of
L. delbruckii spp. bulgaricus and S. thermophilus in bio-yogurts on expiry (Shin et al., 2000a ;
Jayamanne and Adams, 2006; Ibrahim and Carr, 2006). Our results revealed that two Algerian
bio-yoguerts contain viable B.animalis >106 cfu/ml on expiry but two others contain level> 105 on
expiry. Results obtained from this study can help the food industry to develop new technologies to
ensure consumers receive quality and beneficial products.
Acknowledgments:
We would like to express our thanks to Mr Merahi, A.E.K.for her technical help.
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Publications Scientifique
Egypt. J.of Appl.Sci
UTILIZATION OF EWE’S MILK FOR THE PRODUCTION OF
PROBIOTIC YOGHURT
1
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1
1
1
1
1
Ait-Abdeslam, A.* ; A. Chekroun ; L. Medouakh ; K. krantar ; F. Bey ; A. Abdelmalek ; A. Meribai ;
1
1
M. Mahi and A. Bensoltane.
1: Laboratory of Food and Industrial Microbiology, Department of Biology, Faculty of
science, University of Oran, Es-Senia Oran-31000. Algeria.
2: Laboratory of Physiology of the nutrition and Food Safety, Department of Biology, Faculty of
science, University of Oran, Es-Senia Oran-31000. Algeria.
*Ait-Abdeslam A. corresponding author, E-mail address: [email protected]
Key words: Ewe's milk; Bifidobacterium; Yoghurt starter bacteria, Growth, Fermentation.
ABSTRACT
In this study the ewe’s milk was used for probiotic yoghurt production. The physico-chemical analyze of
the ewe's milk showed that is rich in proteins (6.15% ± 0.12), fat (5.27% ± 0.09) and total solids (17.35% ± 0.2).
The strains of Bifidobacterium animalis (Bif3), Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (Lb1) and
Streptococcus thermophilus (Strp1) isolated from commercial probiotic- fermented milks products in Algeria were
used to inoculate the ewe's milk. The growth of Bifidobacterium animalis (Bif3) was studied in ewe’s milk and
reconstituted skim-milk in pure culture at 37°C and in mixed culture with Lactobacillus delbrueckii subsp.
bulgaricus (Lb1) and
Streptococcus thermophilus (Strp1) at 42°C. The specific growth rate (µ) of Bifidobacterium animalis
-1
(Bif3) in pure culture was estimated at 0.33 h
-1
in ewe's milk and at 0.47 h
-1
in reconstituted enriched skim-milk,
-1
and in mixed culture it is equal at 0.90 h in the ewe's milk and at 0.53 h in reconstituted skim-milk. The pH
reached the value of 5.21 at the end of 24 hours of fermentation for ewe's milk whereas, 4.26 for reconstituted
enriched skim-milk , and a concentration of total acidity products 73.5 D° and 117.75 D°, respectively in pure
culture. However, in mixed culture the acidification of two milks was very fast. After 4 hours of fermentation, the
pH of ewe's milk and reconstituted skim-milk are decreased from 6.6 to 4.6 and from 6.8 to 4.5, respectively.
INTRODUCTION
In recent years, much research was done on yoghourt and probiotic-fermented milk manufactured with
the ewe’s milk (Bonczar et al., 2002; Bonczar and Reguł
a, 2003; Chougrani et al., 2008; Papadimitriou et al.,
2007). Because of problems of the affliction of people with cow’s milk allergies (Kaddouri et al., 2008) and
other gastro-intestinal ailments (Chekroun and Bensoltane, 2007), ewe’s and goat milk products are demanded.
This demand is also growing because of a greater awareness of problems with traditional medical treatments for
such afflictions, especially in developed countries (Haenlein, 2004). Furthermore, the demand for functional
foods has been boosted as a result of growing awareness among consumers of the link between diet and health
(FitzGerald et al., 2004). Fermented milk has proved to be an excellent vehicle for the production of such
functional food, especially when it contains probiotic bacteria. Probiotics are defined as living microorganisms
that upon ingestion in certain numbers exert health benefits (Guarner and Schaafsma, 1998). Among the most
often used probiotic bacteria in dairy products are species of the genus Bifidobacterium (Masco et al., 2005;
Meile et al., 2008).
Bifidobacteria behave in a different manner compared to the common lactic acid bacteria that are used in
fermented dairy products (e.g., yoghurt), since they require long fermentation time, anaerobic conditions, low
redox potential and exhibit weaker growth and acid production in cows’ milk (Gomes and Malcata, 1999; Janer
et al., 2004; Lourens-Hattingh and Viljoen, 2001).
The purpose of this study was to produce probiotic-yoghurt from ewe’s milk using probiotic
bifidobacteria and yoghurt starter bacteria such as Streptococcus thermophilus and Lactobacillus
Publications Scientifique
delbrueckii subsp. bulgaricus, and to determine the effect of ewe’s milk characteristics on the growth of
bifidobacteria in pure and mixed cultures with yoghurt starter bacteria.
MATERIALS AND METHODS
1- Bacterial strains, isolation and identification
Strains used in this study were Bifidobacterium anmalis (Bif3), Streptococcus thermophilus
(Strp1) and Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (Lb1). The Strains were isolated from commercial
fermented milk products with yoghurt starter (Streptococcus thermophilus and Lactobacillus delbrueckii subsp.
bulgaricus) and bifidobacteria, commercialized in Algeria.
For the strains isolation 1ml of commercial fermented milks products were dissolved in 9 ml of 1/4
-1
strength Ringer’s solution supplemented with 0. 3 g l cysteine-HCl (Merck). A 10 fold dilution series was
prepared and pour plated in duplicate onto suitable isolation medium. Streptococcus was isolated on M-17 agar
-1
medium containing 5 g l lactose (Terzaghi and Sandine 1975). MRS agar medium (De Man et al., 1960)
adjusted to pH 5. 2 according to (Shah, 2000), was used for isolated Lactobacillus. Beerens medium contained
Bacto Columbia blood agar (per liter) (42 g; Difco), glucose (5 g; Merck), cysteine hydrochloride (0. 5 g; Merck)
and propionic acid (5 ml; Merck) and the final pH was (5.0) (Beerens, 1990) and TPY agar medium (Scardovi,
-1
1986) supplemented with 5% (v/v) filter-sterilised antibiotic solution (LiCl (60 g l ; Sigma) and neomycin
-1
sulphate ( 2 g l ; Sigma)) were used for isolated Bifidobacterium. All plates were incubated at 37 °C for 72 h.
M17 was incubated aerobically, whereas all other media plates were incubated anaerobically. Anaerobic
conditions were created using Anaerocult A sachets (Merck). Subsequently, all isolated bacteria were re-identified
after their isolation from the Gram stain reaction, colony appearance, and cell morphology and carbohydrate
fermentation patterns.
Each strain was grown in his specific medium at 37 °C for 24 h and maintained as frozen stock cultures at
- 20°C, by mixing the fresh subculture with 20% glycerol as a cryoprotective agent and 20% (w/v) sterile
reconstituted skim milk in a 2:5:5 ratio (Bolduc et al., 2006). Before all uses of the strains, Frozen cultures were
sub-cultured twice overnight at 37 °C in sterile reconstituted skim milk.
2- The ewe's milk and reconstituted skim milk
Ewe’s milk was collected during the summer period of 2007 in June from the small farms located in the
Western area of Algeria (Ain-Temouchent). Milking was made under aseptic conditions and milk was collected in
bottles of 250 ml sterile and transported to the laboratory in a refrigerator at temperature 4°C.
Reconstituted skim milk was prepared by dissolving powder of the skimmed milk (Paulina, Molfino hnos,
Argentina) in water distilled to 10% (w/v) and autoclaved at 110°C for 10 min.
3- Treatment of the ewe's milk Pasteurization
of the ewe's milk
The ewe's milk was heated to 85°C for 30 min in a bain-marie (Memmert, Germany) before being cooled
to inoculation temperature.
Physicochemical analyses of the ewe's milk after thermal process
The pH of ewe's milk samples was measured with a pH meter (Inolab pH Level1 WTW, Germany) and
total solids were determined by drying ewe's milk samples at 105°C for 24h (AOAC, 1984). Fat content was
determined using van Gulik’s method (Schwarz et al, 1950). Nitrogen content was determined by the Kjeldahl
method (AOAC, 1990) and the total protein was calculated as follows: Kjeldahl N x6.38.
4- Process experimental from probiotic-Yoghurt production
Preparation of inocula
Lactobacillus, Streptococcus and Bifidobacterium species were first sub-cultured in MRS broth, M17 broth and
TPY broth, respectively at 37 °C overnight. All strains were then sub-cultured twice in reconstituted skim milk
sterile (10%, w/v) supplemented with (0.5 %, w/v) yeast extract (Difco) (and
Publications Scientifique
Cysteine hydrochloride (0.05%, w/v; Merck) for culturing B. animalis) (Frank et al., 1993), Followed by a final
subculture in full fat sheep milk, previously pasteurized, in order to be better adapted to the ewe’s milk
environment. All the subcultures were done at 37 °C for 18 h.
Inoculation of the milk
Two bottles contains each one 200 ml of the ewe's milk and 200 ml of the reconstituted skim- milk (10%,
w/v) enriched with (0.5 %, w/v) yeast extract (Difco) and (0.05%, w/v) Cysteine hydrochloride (Merck), were
inoculated with 3% (v/v) pure culture of Bifidobacterium. After a light agitation, inoculated milks were aseptically
distributed in tubes sterile at a rate of 10 ml each one and incubated at 37°C for 0–24h. One tube was prepared for
each sampling time and was used for all analyses. For the experiments with the mixed cultures, inoculum of 5%
(v/v) (3% of Bifidobacterium, 1% of S. thermophilus and 1% of L. delbrueckii subsp. bulgaricus.) was used, and
the tubes were incubated at 42 °C for about 4-6 h, until pH 4.6 was reached.
5- Microbiological analyses
Viable counts were determined in fermented milks samples (1 ml), after the fermentation process by
using serial decimal dilutions prepared in 1/4 strength Ringer’s solution supplemented with 0.3 g l
-1
cysteine-HCl.
One ml aliquot dilutions were poured onto plates of the various selective and differential agar in triplicate. Counts
of S. thermophilus were enumerated on M-17 agar and incubated aerobically at 37°C for 48 h. For enumeration of
L. delbrueckii subsp. bulgaricus, appropriate dilutions were spread out on MRS agar pH 5.2, plates incubated
anaerobically at 37°C for 72h. A medium Beerens was adapted from bifidobacteria selective media described in
the literature (Bonaparte et al., 2001) to differentiate Bifidobacterium from the other two strains in the starter
culture (S. thermophilus and L. delbrueckii subsp. bulgaricus). Plates were incubated for 3 days at 37°C under
anaerobic conditions (Anaerocult A, Merck). Plates containing 20–200 colonies were counted and the results
-1
expressed as colony-forming units per ml (cfu ml ) of sample.
6- Kinetics acidifying
The pH value was measured during fermentation using a digital pH-meter with a combined glass
electrode and temperature probe (Inolab pH Level1 WTW, Germany). The pH meter was calibrated using
standard buffer solutions (Merck) at pH 4.0 and 7.0.
Acidity was titrated with N/9 NaOH solution. The volume of NaOH was multiplied by 10 to calculate titratable
acidity in degree Dornic (D°). Where 1D° = 0, 1 g of lactic acid in 1 liter of milk (Guiraud,
1998).
RESULTS
1- Identification of strains
All fermented milks with bifidobacteria tested contained L. delbrueckii, S. thermophilus and
Bifidobacterium sp., and we could isolate the three strains in each product tested. All lactobacilli isolates (Lb1,
Lb2 and Lb3) were identified as L. delbrueckii subsp. bulgaricus by cell morphology and biochemical tests and all
streptococci isolates (Strp1, Strp2 and Strp3) were identified as S. thermophilus by means of microscopic
appearance (coccoide form, completely different from lactobacilli and bifidobacteria) (fig.1) and then by use of
biochemical tests. Bifidobacteria isolates (Bif1, Bif2 and Bif3) were identified as being Bifidobacterium animalis
by cell morphology (polymorphing forms) (fig.1) and carbohydrate fermentation patterns.
Publications Scientifique
(a)
(b)
(c)
(d)
Fig. 1:: Microscopic observations after the Gram stain reaction.
(a): S. thermophilus (Strp1). Cultivation on M-17 agar, incubation at 42°C. (x120).
(b): L. delbrueckii subsp . bulgaricus (Lb1). Cultivation on MRS agar, incubation at 42°C. (x120). (c) and (d): B.
animalis (Bif3). Cultivation on M-17
M
agar, incubation at 37°C. (x600).
2- Composition of ewe’s milk
The mean composition of ewe’s milk after heating is given in (Table 1). Physico -chemical Analyze
showed that the ewe's milk is rich in proteins, fat and total solids.
a.
Table 1: Composition of ewe’s milk after heating at 85°C for 30 min
Physico-chemical
chemical parameters
ewe’s milk pasteurized
fat (%)
5.27± 0.09
b
Protein (%)
6.15 ± 0.12
total solids (%)
17.35 ± 0.2
pH
6.6 ± 0.03
a Analyses were performed in triplicate. Values are means ± SD. b
Protein = total nitrogen x 6.38.
3- Growth and kinetics acidification of Bifidobacterium animalis (Bif3) in the pure culture
The results of growth and acidification kinetics of Bifidobacterium animalis (Bif3) in the pure culture are
shown in (fig. 2 and 3). The specific growth rate (µ) of Bifidobacterium animalis (Bif3) was estimated at 0.33 h
-1
-1
in ewe's milk and at 0.47 h in reconstituted enriched skim -milk.The
milk.The pH reached the value of 5.21 at the end of
24 hours of fermentation for ewe's milk whereas, 4.26 for reconstituted enriched skim -milk,
milk, and a concentration
of total acidity products 73.5 D° and 117.75 D°, respectivel y.
Publications Scientifique
Fig. 2: Growth and acidification kinetics of
Bifidobacterium animalis (Bif3) in
the ewe's milk
(Incubation at 37°C).
(
) Evolution of the pH
(
) Curve of growth
Fig. 3: Growth and acidification kinetics of
Bifidobacterium animalis (Bif3) in
the reconstituted enriched skim-milk
(Incubation at 37°C).
(
) Evolution of the pH
(
) Curve of growth
4- Growth and acidification kinetics of Bifidobacterium animalis (Bif3) in the mixed culture
According to the curves of pH evolution (fig. 4), we note that the acidification of two milks was very fast.
After 4 hours of fermentation, the pH of ewe's milk and reconstituted skim-milk are decreased from 6.6 to 4,6 and
from 6.8 to 4,5, respectively.
Fig. 4: Curve of pH evolution of milks during
fermentation by Lactobacillus delbrueckii subsp.
bulgaricus (Lb1) Streptococcus thermophilus (Strp1)
and Bifidobacterium animalis (Bif3)(Incubation at
42°C).
(
) ewe's milk.
(
) reconstituted skim-milk
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The results of Growth studies of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (Lb1),
Streptococcus thermophilus (Strp1) and Bifidobacterium animalis (Bif3) in ewe's milk and reconstituted skimmilk are shown in (fig. 5 and 6). All the strains grew better in the ewe's milk than in reconstituted skim-milk. The
-1
initial viable cell counts were between 6.3 log cfu ml
-1
and 6.6 log cfu ml in ewe's milk and reconstituted skim-
milk. All strains attained viable cell numbers between 7.11
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DISCUSSION
According to Collado et al. (2006); Collado and Hernandez (2007); Gueimonde et al., (2004), the
morphological and biochemical tests were excellent (>90%) and sufficient for identification S. thermophilus and
L. delbrueckii subsp. bulgaricus used in the production of fermented milks. But this identification is unreliable
for Bifidobacterium sp., because the strains showed variable use of carbohydrate fermentation patterns at
different times. Consequently, a final identification at specie level is practically impossible without the
application of the techniques using molecular methods (Masco et al., 2004; Ward and Roy, 2005).
The results obtained of the Physico-chemical analyzes of ewe's milk used for the production of
probiotic-yoghurt are in agreement with the data reported by Park et al. (2007); Raynal-Ljutovac et al.(2008)
and Rouissat and Bensoltane (2006). Ewe’s milk contains higher levels of total solids (17.35% ± 0.2) and
proteins (6.15 % ± 0.12). According to Chougrani et al. (2006) and Haenlein and Wendorff (2006), these
characteristics are particularly suitable for the production of yoghourt and cheese.
The most important properties for commercial utilization of a starter composed of probiotic strains include rapid
growth and acidification of milk, and good acid oxygen tolerance (Rasic and Kurman 1983). Likewise, it is
important to consider the characteristics of the raw materials, the safety product, the ability to exert a beneficial
effect and the desired characteristics of the final product (Gomes et Malcata, 1998). Bifidobacterium animalis
(Bif3) grew better in reconstituted enriched skim-milk (µ = 0.47 h
-1
-1
) compared to the ewe's milk (µ = 0.33 h ).
-
These growth rates are higher than those observed by Hadadji and Bensoltane (2006) for B. longum (µ = 0.18 h
1
) during growth in the goat's milk. Several authors noted that milk and its drifts do not constitute an optimal
medium of growth for bifidobacteria (Murti et al., 1992; Rasic and Kurmann, 1983; Zbikowski and Ziajka,
1986). This said, the growth of Bifidobacterium animalis (Bif3) in reconstituted skim-milk is stimulated by (0.5%)
yeast extract and (0.05%) of cysteine previously added with milk. The yeast extract is regarded as a factor
bifidogene which stimulates the growth of bifidobacteria (Roy et al., 1990). Cysteine is a reducing agent and is an
essential amino acid required for the growth of the bifidobacteria (Ravula and Shah, 1998). This ingredient can
be used in the production of probiotic- fermented milks. Guler-Akı
n and Akı
n (2007), produced a probiotic
fermented milk (bio-yoghourt) starting from the goat's milk by using the starters of yoghourt (St. thermophilus and
L. delbrueckii subsp. bulgaricus and probiotic bacteria (L acidophilus, Bifidobacterium bifidum BB12 and
Lactobacillus paracasei subsp. casei) , with or without the addition of cysteine (0,5%). Authors noted that the
concentration of the bifidobacteria is stronger in bio-yoghourt these which is supplemented with cysteine than in
bio-yoghourt without cysteine. The higher content of proteins in ewe's milk (61.5g/l) cannot explain the
significant number of B. animalis (Bif3) reach after 24h fermentation at 37°C (8.47 log cfu ml
-1
-1
for initial viable
cell counts was 6.3 log cfu ml ). Because bifidobacteriea have a very weak proteolytic activity when compared to
other lactic acid bacteria (Abu-Tarbaoush et al., 1998; Shihata and Shah, 2000). More recently, various
assumptions were proposed to explain the behavior of the bifidobacteria in the ewe's milk. Some of them being
based on the higher concentration of β–lactoglobuline, α-lactalbumine and of the complexes of vitamins B
(pantothenic acid, biotine and riboflavin) in ewe's milk (Gomes and Malcata, 1998; Kehagias et al., 2008).
These compounds are regarded as good growth promoters for the bifidobacteria (Ibrahim and Bezkorovainy,
1994; Petschow and Talbott, 1990; 1991; Poch and Bezkorovainy, 1988).The evolution of titratable acidity
showed a very slow speed of acidification in two fermented milks. This weak acidification by Bifidobacterium in
pure culture was announced by several authors (Bennama, 1999; Chekroun et al.,
2006; Hadadji and Bensoltane, 2006; Mahi et al., 2006; Samona et al., 1996).
Follow myth growth B. animalis (Bif3) in association with Streptococcus thermophilus (Strp1) and
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (Lb1) in the ewe's milk and reconstituted skim-milk shows us to a
quite significant growth rate compared to that observed in pure culture. Indeed, a certain of number authors
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mentioned that there has been an active synergy between the strains in mixed cultures (Altieri et al., 2008;
Bensoltane et al., 2004; Chekroun et al., 2006; Cheriguene et al.,
2006; 2007).
Klaver et al. (1993) showed the growth rate of the bifidobacteria in milk could be increased by the presence of
proteolytic strains such as Lactobacillus acidophilus, L. delbrueckii subsp. bulgaricus or L. casei. The use of the
association of B. animalis (Bif3) with Streptococcus thermophilus (Strp1) and Lactobacillus delbrueckii subsp.
bulgaricus (Lb1) in fermentation is benific for the three strains. That is explained by the different requirements in
growth promoters from the three species. the strains of Streptococcus thermophilus and of bifidobacteria are often
proteolytique compared to the strains of L. delbrueckii subsp. bulgaricus (Chekroun, 2005; Shihata and Shah,
2000). So their growth is limited, the amino acids and the peptides present initially in milk being insufficient to
meet their needs. In the other hand, L. delbrueckii subsp. bulgaricus possesses a membrane protease which to
allow the libiration of the amino acids and small peptides from degradation the caseins of milk. Those being then
used by Streptococcus thermophilus and bifidobacteria equipped with intracellular peptidase (Marshall, 1987;
Shihata and Shah, 2000). As for Streptococcus thermophilus, this species has the capacity to use the oxygen
dissolved in the milk of the kind to reduce that concentration rate very low, but non zero (Altieri et al., 2008),
thus making it possible to increase the viability of the bifidobacteria. It produces also formic acid and carbon
dioxide stimulating thus the growth of L. delbrueckii subsp. bulgaricus (Radke-Mitchell and Sandine, 1984;
Veringa et al, 1968). The result of this protocooperation or symbiosis has like consequence the good
-1
development of these three species, where B. animalis (Bif3) a reach the cell number of 7.11 log cfu ml in the
-1
-1
ewe's milk and of 6.96 log cfu ml in the reconstituted skim-milk for a initial cell number of 6.3 log cfu ml
after 6 hours of fermentation to 42°C and a fast acidification of two milks which have reach pH (4,6 – 4,5) after
only 4 hours of fermentation.
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