CHAPITRE 2.1.14. INFLUENZA AVIAIRE RÉSUMÉ L'influenza aviaire (IA) est causée par des virus bien identifiés, membres de la famille des Orthomyxoviridae et placés dans le genre Influenzavirus A. Il existe 3 genres influenza : A, B et C ; seuls les virus influenza A infectent les oiseaux. Le diagnostic se fait par isolement et caractérisation du virus. En effet, l'infection chez les oiseaux peut induire un large panel de signes cliniques qui peuvent varier selon l'hôte, la souche virale, le statut immunitaire de l'hôte, l'exacerbation par tout agent secondaire et les conditions environnementales. Identification de l'agent pathogène : des suspensions en solution additionnée d'antibiotiques d'écouvillons trachéaux et cloacaux (ou de fèces) prélevés sur des oiseaux vivants, ou des suspensions de fèces ou d'échantillons d'organes en mélange provenant d'oiseaux morts, sont inoculés dans la cavité allantoïdienne d'œufs embryonnés de poule âgés de 9 à 11. Les œufs sont incubés entre 35 et 37°C pendant 4 à 7 jours. L'activité hémagglutinante des liquides allantoïdiens de tout œuf dont l'embryon vient de mourir ou est moribond, est testée au fur et à mesure, ainsi que celle de tout œuf à la fin de la période d'incubation. La présence de virus influenza A peut être confirmée par une épreuve d'immunodiffusion révélant la réaction d'un virus concentré avec un antisérum dirigé contre les antigènes de la nucléocapside et la protéine de matrice virale, lesquels sont tous deux communs à tous les virus influenza A. L'isolement sur œufs embryonnés vient d'être récemment remplacé, sous certaines conditions, par la technique de la transcription inverse couplée à l’amplification en chaîne par polymérase (RT-PCR). Pour sous-typer le virus, le laboratoire doit disposer d'antisérums monospécifiques préparés contre les antigènes séparés de chacun des 16 sous-types d'hémagglutinines H1-H16 et des 9 sous-types de neuraminidases des influenza virus A, qu'il peut utiliser par immunodiffusion. Alternativement, les nouveaux isolats peuvent être analysés par des tests d'inhibition de l'hémagglutination et de la neuraminidase, contre tout un panel d'antisérums polyclonaux vis-à-vis d'un large spectre de souches couvrant tous les sous-types. Etant donné que les termes influenza aviaire hautement pathogène et peste aviaire se réfèrent à une infection par des souches virulentes de virus influenza A, il est nécessaire d'évaluer la virulence d'un isolat pour les volailles domestiques. Tout isolat d'influenza aviaire hautement pathogène est classé comme virus influenza soumis à déclaration (IAD). Bien que toutes les souches virulentes isolées jusqu'à présent appartiennent soit à l'un ou l'autre sous-type H5 ou H7, la plupart des isolats H5 ou H7 ont présenté une faible virulence. En raison du risque de mutation des virus H5 ou H7 faiblement virulents en virus virulents après infection de volailles, tous les virus H5 et H7 ont été également classés comme des virus IAD. Les méthodes utilisées pour déterminer la virulence d'une souche pour les oiseaux, ont évolué ces dernières années, suite à une meilleure compréhension du support moléculaire du pouvoir pathogène, mais elles impliquent encore en première intention l'inoculation du virus infectieux à un minimum de 8 poulets sensibles âgés de 4 à 8 semaines ; les souches sont considérées hautement pathogènes si elles provoquent plus de 75 % de mortalité sous 10 jours ou si l’index du pouvoir pathogène par voie intraveineuse (IPIV) est supérieur à 1,2. Il est recommandé de réaliser la caractérisation des souches virales virulentes suspectes dans un laboratoire assurant la biosécurité adéquate. Tous les isolats virulents IA sont identifiés comme des virus hautement pathogènes à déclaration obligatoire (IAHPD). Quelle que soit leur virulence pour le poulet, les virus H5 ou H7 présentant un motif de clivage du fragment HAo avec une séquence en acides aminés similaire à toute séquence déjà observée chez des virus virulents, sont considérés comme des virus IAHPD. Les isolats H5 ou H7 qui ne sont pas pathogènes pour le poulet et qui ne présentent pas un motif de clivage HAo avec une séquence 290 Manuel terrestre de l’OIE 2005 Chapitre 2.1.14. — Influenza aviaire similaire à celle de tout virus IAHPD, sont identifiés comme des virus faiblement pathogènes soumis à déclaration (IAFPD) ; les isolats IA qui n'appartiennent pas aux sous-types H5 ou H7 et ne sont pas hautement pathogènes pour le poulet, sont identifiés comme des virus d'influenza aviaire de faible pouvoir pathogène (IAFP). Épreuves sérologiques : comme tous les virus influenza A possèdent des antigènes similaires au niveau de la nucléocapside et la protéine de matrice, les méthodes d'immunodiffusion en gélose (IDG) sont utilisées pour détecter les anticorps qui leur sont spécifiques. Des préparations virales concentrées contenant l'un et/ou l'autre type d'antigène, sont utilisées dans ces épreuves. Tous les oiseaux ne développent pas des anticorps précipitants détectables. Les épreuves d'inhibition d'hémagglutination ont été également employées dans le diagnostic sérologique de routine, mais il est possible que cette technique puisse ne pas détecter certaines infections particulières car l'hémagglutinine est spécifique d'un sous-type. Les méthodes immuno-enzymatiques (ELISA) ont été utilisées pour détecter les anticorps spécifiques des influenza de type A. Spécifications applicables aux vaccins et aux produits biologiques à usage diagnostique : historiquement, dans la plupart des pays, les vaccins spécifiquement conçus pour contenir ou prévenir l'influenza aviaire IAHPD ont été bannis ou déconseillés par les agences gouvernementales, car ils pouvaient interférer avec les mesures de police sanitaire par abattage. Au cours des années 1990, l'utilisation prophylactique de vaccins inactivés en émulsion huileuse a été pratiquée au Mexique et au Pakistan pour maîtriser des foyers IAD largement disséminés, de même que l'utilisation par le Mexique, le Salvador et le Guatemala d'un vaccin recombinant fowlpox exprimant le gène HA homologue. Au cours des foyers IAFPD survenus en 1999-2001 en Italie, un vaccin inactivé présentant une hémagglutinine identique au virus sauvage, mais avec une neuraminidase différente a été utilisé. Ceci a permis de différentier les oiseaux vaccinés des oiseaux infectés par le virus sauvage et a abouti à l'éradication du virus sauvage. L'utilisation de vaccins H5 et H7, à des fins de prévention des infections IAFPD, a été mise en œuvre dans certaines zones d'Italie et plusieurs pays d'Asie du Sud-Est recourent à la vaccination comme une aide pour contrôler les infections H5N1 HP. Si des virus IAHPD sont utilisés dans la production de vaccins ou lors d'épreuves expérimentales, les locaux devront répondre aux exigences OIE de confinement de pathogènes de groupe 4. A. INTRODUCTION L'influenza aviaire soumise à déclaration (IAD) résulte d'une infection par des virus de la famille des Orthomyxoviridae classés dans le genre Influenzavirus A. Les virus influenza A sont les seuls orthomyxovirus connus pour affecter les oiseaux. Beaucoup d'espèces d'oiseaux se sont montrées réceptives à l'infection par les virus influenza A ; les oiseaux aquatiques constituent un réservoir majeur de ces virus, mais la très grande majorité des isolats se sont révélés faiblement pathogènes pour le poulet et la dinde, qui sont les principales espèces d'importance économique à être affectées. Les influenza virus A présentent des communautés antigéniques au niveau de leur nucléocapside et de leur protéine de matrice, mais sont classés en sous-types sur la base des antigènes de l'hémagglutinine (H) et de la neuraminidase (N) (61). Actuellement, 16 sous-types H (H1-H16) et 9 sous-types N (N1-N9) sont reconnus. À ce jour, les virus influenza A hautement pathogènes qui induisent des signes cliniques aigus chez le poulet et la dinde, ont été associés avec les seuls sous-types H5 et H7 (avec l'exception de 2 sous-types H10 qui auraient aussi rempli la définition précitée pour les IAHPD, bien que les raisons de cette situation ne soient pas claires). Beaucoup de virus de sous-types H5 et H7 isolés d'oiseaux ont montré jusqu'à présent une faible virulence pour les volailles (1). En raison du risque pour un virus H5 ou H7 de faible virulence de devenir pathogène après mutation, tous les virus H5 et H7 ont été identifiés comme des IAD (62). En fonction de l'âge, du type d'oiseau et de facteurs liés à l'environnement, la maladie sous sa forme hautement pathogène peut varier depuis une mort brutale avec peu ou pas de signes cliniques manifestes, jusqu'à une expression plus caractéristique avec symptômes respiratoires, larmoiement excessif, sinusite, œdème de la tête, cyanose de la peau au niveau des parties non emplumées et diarrhée. Cependant, aucun de ces signes ne peut être considéré comme pathognomonique. Le diagnostic de la maladie repose par conséquent sur l'isolement du virus et la démonstration qu'il remplit un des critères définis dans la section B2. L'analyse de sérums provenant d'oiseaux suspects par des techniques de détection des anticorps peut constituer un moyen supplémentaire de diagnostic, mais ces méthodes ne sont pas adaptées pour une identification détaillée. À des fins de contrôle officiel, le diagnostic repose sur le sous-type d'hémagglutinine et la virulence. Celle-ci est évaluée selon des critères reconnus et officiels basés sur des tests in vivo ou des tests moléculaires ciblant des marqueurs (par Manuel terrestre de l’OIE 2005 291 Chapitre 2.1.14. — Influenza aviaire exemple la présence d'acides aminés basiques multiples au site de clivage du précurseur HA0 de l'hémagglutinine). Ces définitions évoluent en même temps que la connaissance scientifique progresse. L'IAHPD et le IAD sont soumis à un contrôle officiel et il y a un haut risque de dissémination du virus à partir de laboratoires ; en conséquence, il est recommandé de conduire une analyse de risque pour déterminer le niveau de biosécurité requis pour le diagnostic et la caractérisation du virus. Les locaux devront satisfaire aux exigences de niveau de confinement approprié, résultant de l'analyse de risque ; comme souligné dans l'annexe I.1.6.1. du Chapitre I.1.6., « La biosécurité au laboratoire de microbiologie vétérinaire », du Manuel terrestre. Les pays qui ne disposent pas de l'accès à un tel laboratoire spécialisé, qu'il soit national ou régional, sont invités à adresser leurs échantillons à un Laboratoire de référence de l’OIE. B. TECHNIQUES DE DIAGNOSTIC 1. Identification de l'agent pathogène Il est recommandé que les échantillons prélevés sur des oiseaux morts soient constitués de contenu intestinal (fèces) ou d'écouvillons cloacaux et d'écouvillons oro-pharyngés. Des échantillons de trachée, poumons, sacs aériens, intestin, rate, rein, cerveau, foie, cœur peuvent être aussi prélevés et traités soit séparément, soit en mélange. Les échantillons prélevés sur oiseaux vivants devraient comporter à la fois des écouvillons trachéaux et cloacaux, bien que la charge virale de ces derniers soit probablement la plus élevée. Pour des oiseaux fragiles de petite taille, qui pourraient être blessés par l'écouvillonnage, la récolte de fèces fraîches peut constituer une alternative appropriée. Pour optimiser les chances de succès de l'isolement viral, il est recommandé qu'au moins 1 g de fèces soit traité, qu'elles aient été récoltées directement ou déposées sur un écouvillon. Il est conseillé de placer les échantillons dans une solution physiologique tamponnée au phosphate (PBS) isotonique de pH 7,0 à 7,4, contenant des antibiotiques. Ceux-ci peuvent varier en fonction des conditions locales, à titre d'exemple de la pénicilline (2 000 unités/ml), streptomycine (2 mg/ml), gentamycine (50 µg/ml) et mycostatine (1 000 unités/ml) peuvent être employés pour les tissus et les écouvillons trachéaux, mais ces concentrations doivent être multipliées par 5 pour les fèces et les écouvillons cloacaux. Il est important de réajuster le pH de la solution au pH de 7,0 à 7,4 après addition des antibiotiques. Il est conseillé de préparer des suspensions à 10–20 % (poids/volume) en solution antibiotique des fientes et tissus finement hachés. Il est également recommandé qu'à l'issue d'une période d'incubation de 1 à 2 h à température ambiante, ces suspensions soient immédiatement analysées. Si ce n'est pas possible, les échantillons peuvent être stockés à 4°C jusqu'à 4 jours. En cas de stockage prolongé, les échantillons et les isolats devraient être conservés à –80°C. La méthode de choix pour multiplier les virus influenza aviaire A consiste en l'inoculation d'œufs embryonnés de poule exempts d'agents pathogènes spécifiés (EAPS), ou indemnes d'anticorps spécifiques (SAN pour Specific Antibody Negative). Les surnageants des suspensions de fèces ou de tissus résultant de la clarification après centrifugation à 1 000 g, sont inoculés dans la cavité allantoïdienne d'au moins 5 œufs embryonnés de poule EAPS ou SAN de 9 à 11 jours d'incubation. Les œufs sont incubés entre 35 et 37°C pendant 4 à 7 jours. Il est conseillé au fur et à mesure de la mortalité embryonnaire, puis pour les embryons survivant jusqu'à la fin de la période d'incubation, que tous les œufs correspondants soient d'abord refroidis à 4°C et que l'activité hémagglutinante des liquides allantoïdiens soit testée (voir section B.3.b). La détection d'une activité hémagglutinante (HA) indique une forte probabilité de présence de virus influenza A ou de Paramyxovirus aviaire. Il est recommandé de faire un nouveau passage des liquides allantoïdiens qui se révèlent négatifs par inoculation à une nouvelle série d'œufs. La présence de virus influenza A peut être confirmée par des épreuves d'immunodiffusion en gélose (IDG) en démontrant la présence des antigènes de nucléocapside et de matrice, lesquels sont communs à tous les Influenzavirus A (voir section B.3.a). Les antigènes peuvent être préparés en concentrant les virus contenus dans les liquides allantoïdiens ou en extrayant les membranes chorio-allantoïdiennes infectées ; ceux-ci sont testés vis-à-vis d'antisérums positifs. À partir des liquides allantoïdiens, les virus peuvent être concentrés par ultracentrifugation ou par précipitation en condition acide. Cette dernière méthode consiste en l'addition de HCl 1,0 M au liquide allantoïdien infecté, jusqu'à ce qu'il atteigne un pH d'environ 4,0. Le mélange est alors placé dans un bain de glace pendant 1 h, puis clarifié par centrifugation à 1 000 g à 4°C. Le surnageant est rejeté. Les virus concentrés sont repris dans un tampon glycine/sarkosyl consistant en une solution à 1 % (poids/volume) de lauroyl/sarcosinate de sodium tamponnée à pH 9,0 avec de la glycine 0,5 M. Ces concentrés contiennent à la fois les polypeptides de la nucléocapside et de la matrice. Des préparations riches en nucléocapside peuvent être aussi obtenues à partir des membranes chorio-allantoïdiennes pour être utilisées dans l’épreuve d’IDG (6). Cette méthode implique la collecte des 292 Manuel terrestre de l’OIE 2005 Chapitre 2.1.14. — Influenza aviaire membranes chorio-allantoïdiennes à partir des œufs infectés dont les liquides allantoïdiens présentent une activité hémagglutinante. Les membranes sont ensuite homogénéisées puis broyées finement. Cette préparation est soumise à 3 cycles de congélation-décongélation, suivis d'une centrifugation à 1 000 g pendant 10 min. Le culot est rejeté et le surnageant est utilisé comme antigène après un traitement au formol à 0,1 %. L'utilisation de l’épreuve d’IDG pour démontrer la présence des antigènes de la nucléocapside et de la matrice est un moyen satisfaisant pour révéler la présence de virus influenza aviaire dans les liquides amnio-allantoïdiens, mais des méthodes immuno-enzymatiques (ELISA) sont maintenant également disponibles. Il existe un test ELISA sensible qui démontre la présence de la nucléoprotéine de virus influenza de type A au moyen d'un anticorps monoclonal dirigé contre la nucléoprotéine de type A (38, 40, 49). Il est disponible sous la forme d'une trousse de diagnostic commercial. Toute activité hémagglutinante de liquides stériles récoltés à partir d'œufs embryonnés est la plus vraisemblablement imputable à un virus influenza A ou à un paramyxovirus aviaire (quelques souches de réovirus aviaires ou des bactéries, si les liquides ne sont pas stériles, peuvent être hémagglutinants). Il existe 9 sérotypes connus de paramyxovirus aviaires. La plupart des laboratoires disposent de sérums spécifiques pour le virus de la maladie de Newcastle (paramyxovirus aviaire de type 1), et du fait de son occurrence répandue et de son utilisation presque universelle comme vaccin vivant chez les volailles, il est préférable d'évaluer sa présence par une épreuve d'inhibition de l'hémagglutination (IHA) (voir Chapitre 2.7.13., « Maladie de Newcastle »). Alternativement, la présence de virus influenza peut être confirmée par l'utilisation de la transcription inverse couplée à l’amplification en chaîne par polymérase (RT-PCR) avec des amorces conservées spécifiques de la nucléoprotéine ou de la protéine de matrice (2, 41). Aussi, la présence de virus influenza de sous-types H5 ou H7 peut-elle être confirmée par l'utilisation d'amorces H5 ou H7 spécifiques (18, 37, 41, 60). La méthode recommandée par le comité d'experts de l'Organisation mondiale de la santé (OMS) pour le sous-typage antigénique de confirmation (61), implique l'utilisation d'antisérums très spécifiques préparés chez un animal réagissant non spécifiquement de manière minimale (par exemple la chèvre) et dirigés contre les sous-types H et N (36). Une technique alternative consiste à utiliser des sérums polyclonaux dirigés contre un panel de virus d’influenza complets. Le sous-typage par cette technique est hors de portée de la plupart des laboratoires de diagnostic non spécialisés en virus influenza. Une assistance est disponible auprès des Laboratoires de référence de l’OIE (se reporter à la liste de la partie 3 de ce Manuel terrestre). 2. Évaluation du pouvoir pathogène Le terme influenza aviaire hautement pathogène suppose l'implication de souches virales virulentes. Ce terme est utilisé pour décrire une maladie du poulet avec des signes cliniques comme un larmoiement excessif, une détresse respiratoire, de la sinusite, un œdème de la tête et de la face, de la cyanose sur les parties cutanées non emplumées et de la diarrhée. Une mort brutale peut être le seul symptôme. Les symptômes peuvent varier énormément en fonction de l'hôte, de l'âge de l'oiseau, de la présence d'autres microorganismes et des conditions environnementales. De plus, des virus qui normalement ne causent que des symptômes cliniques modérés ou inapparents, peuvent mimer de l'influenza aviaire hautement pathogène s'il existe des conditions d'exacerbation de la maladie. Lors du premier congrès international sur l'influenza aviaire qui a eu lieu en 1981 (4), il a été convenu d'abandonner le terme « peste aviaire » et de définir les souches hautement pathogènes sur la base de leur capacité à induire au moins 75 % de mortalité en 8 jours chez au moins 8 poulets sensibles âgés de 4 à 8 semaines inoculés par voie intramusculaire, intraveineuse ou dans le sac aérien caudal. Cependant, cette définition s'est révélée non satisfaisante, lorsqu'elle a été appliquée aux virus responsables des foyers disséminés qui sont apparus chez le poulet en 1983 en Pennsylvanie et dans les États voisins des États-Unis d'Amérique (USA). Le problème résultait principalement de la présence d'un virus faiblement pathogène au laboratoire, mais qui s'est révélé tout à fait virulent après une seule mutation ponctuelle. La prise en considération de telles souches « potentiellement pathogènes » a été ultérieurement incluse dans la réflexion de plusieurs groupes internationaux chargés d'élaborer une définition. Les éventuelles recommandations qui ont été faites étaient basées sur le fait qu'à côté de l'existence de nombreux isolats faiblement pathogènes de sous-types H5 et H7, jusqu'alors toutes les souches d'influenza hautement pathogènes possédaient une hémagglutinine soit H5, soit H7. Une information supplémentaire concernant le pouvoir pathogène ou le pouvoir pathogène potentiel des sous-types H5 et H7 peut être obtenue en séquençant le génome, du fait de l’association de la virulence avec la présence d'acides aminés basiques (arginine ou lysine) multiples au site de clivage de l'hémagglutinine. Par exemple, la plupart des virus de sous-type H7 de faible virulence présentent les motifs en acides aminés suivants au niveau du site de clivage HA0 : .soit – PEIPKGR*GLF – soit – PENPKGR*GLF – tandis que les motifs en acides aminés pour des virus H7 hautement pathogènes d'influenza aviaire sont par exemple : -PEIPKKKKR*GLF-, - PETPKRKRKR*GLF-, PEIPKKREKR*GLF- et -PETPKRRRR*GLF-. Manuel terrestre de l’OIE 2005 293 Chapitre 2.1.14. — Influenza aviaire Le séquençage des acides aminés des sites de clivage des isolats d'influenza de sous-types H5 et H7 de faible virulence pour les oiseaux, devrait permettre d'identifier des virus, qui, comme les virus de Pennsylvanie, ont la capacité, suite à une simple mutation, de devenir hautement pathogènes pour les volailles. Pour classer les virus d'influenza aviaire comme hautement pathogènes, l'OIE a adopté en 1992 des critères reposant sur le pouvoir pathogène pour le poulet, la multiplication en culture cellulaire et la séquence en acides aminés au niveau du peptide de jonction (33). L'Union européenne a adopté des critères similaires en 1992 (14). Les critères ci-après, qui correspondent à une modification de la procédure OIE précédente, ont été adoptés par l'OIE pour classer un virus d'influenza aviaire comme IAHPD : a) Une des 2 méthodes suivantes visant à déterminer le pouvoir pathogène pour le poulet est utilisée. Un virus IAHPD est : i) 1 tout virus influenza qui est létal pour 6, 7 ou 8 poulets sensibles dans les 10 jours consécutifs à une inoculation par voie intraveineuse de 0,2 ml d'une dilution stérile de liquide allantoïdien infectieux. ou ii) b) tout virus dont l’index de pouvoir pathogène par voie intraveineuse (IPIV) est supérieur à 1,2. La procédure pour le test IPIV est la suivante : • 4 un liquide allantoïdien frais avec un titre HA > 1/16 (> 2 ou > log2 4 quand exprimé comme l'inverse de la dilution) est dilué au 1/10 dans une solution saline stérile isotonique ; • 0,1 ml du virus dilué est injecté par voie intraveineuse dans chacun des 10 poulets EAPS ou SAN âgés de 6 semaines ; • les oiseaux sont examinés à 24 h d'intervalle pendant 10 jours. À chaque observation, chaque oiseau est affecté d'un score de 0 s'il est normal, 1 s'il est malade, 2 s'il est sévèrement atteint, 3 s'il est mort. (L'appréciation de « malade » ou « sévèrement malade » repose sur une observation clinique subjective. En principe, des oiseaux « malades » présenteront un des signes mentionnés ci-après alors que des oiseaux « sévèrement malades » présentent plus d'un des signes suivants : manifestation respiratoire, dépression, diarrhée, cyanose des parties cutanées exposées ou des barbillons, œdème de la face et/ou de la tête, signes nerveux. Les individus morts doivent être affectés du score de 3 à chacun des jours d'observation restants après la 2 mort ) ; • l'index du pouvoir pathogène par voie intraveineuse (IPIV) est la moyenne des scores par oiseau par observation sur la période des 10 jours. Un index de 3,00 signifie que tous les oiseaux sont morts en 24 h et un index de 0,00 signifie qu'aucun oiseau n'a présenté de symptômes pendant la période des 10 jours d'observation. Pour tous les virus H5 et H7 de faible virulence chez le poulet, la séquence en acides aminés du peptide de jonction de l'hémagglutinine doit être déterminée. Si la séquence est similaire à celle observée pour les isolats IAHP, l'isolat en cours d'analyse sera considéré hautement pathogène. L'OIE a le système de classification suivant pour identifier les virus soumis à déclaration et à mesures de gestion (62) : a) tous les isolats IA qui répondent aux critères précités sont identifiés comme virus influenza aviaire hautement pathogènes soumis à déclaration (IAHP). b) les isolats H5 et H7 qui ne sont pas virulents pour le poulet et qui ne présentent pas au niveau de leur site de clivage HAo une séquence en acides aminés similaire à l'une de celles observées dans des virus IAHP sont identifiés comme virus influenza aviaire faiblement pathogènes soumis à déclaration (IAFPD). c) les isolats IA non virulents pour le poulet, de sous-types ni H5 ni H7, sont identifiés comme virus influenza aviaire faiblement pathogènes (IAFP). Une variété de stratégies et de techniques ont été utilisées avec succès pour séquencer les nucléotides situés à la portion du gène HA codant le site de clivage de l'hémagglutinine des sous-types H5 et H7 de l'influenza aviaire, ce qui permet de déduire les acides aminés à ce niveau. La méthode utilisée la plus communément a été la RT-PCR utilisant des amorces d'oligo-nucléotides complémentaires des régions du gène situées de part et 1 2 294 Quand les oiseaux sont trop malades pour manger ou boire, il est recommandé de les tuer sans souffrances. Quand les oiseaux sont trop malades pour manger ou boire, il est recommandé de les tuer sans souffrances et de les comptabiliser comme mort à l’observation suivante. Manuel terrestre de l’OIE 2005 Chapitre 2.1.14. — Influenza aviaire d'autre de la zone codant le site de clivage ; cette RT-PCR étant complétée par un séquençage (59). Différentes étapes de la procédure peuvent être facilitées par l'usage de trousses de diagnostic disponibles commercialement et des séquenceurs automatiques. Maintenant que la présence au site de clivage HA0 d'acides aminés basiques multiples est bien établie comme un marqueur précis de la virulence ou d'une virulence potentielle pour les virus influenza H5 et H7, il apparaît inévitable que la détermination du site de clivage par séquençage ou par une autre méthode va devenir la méthode de choix pour une évaluation initiale de la virulence de ces virus et être incorporée dans les définitions officielles. Ceci aura l'avantage de réduire le nombre de tests in vivo, bien qu'à présent l'inoculation d'oiseaux soit encore nécessaire pour confirmer un résultat négatif afin d’exclure la possibilité de cultures virales contenant des mélanges de sous-populations virales de haute et faible virulence. Bien que tous les virus IA réellement hautement pathogènes isolés jusqu'à présent appartiennent aux sous-types H5 ou H7, il a été rapporté au moins 2 isolats, tous deux de sous-types H10 (H10N4 et H10N5) qui auraient rempli les définitions OIE et UE de virus IAHP (57) du fait qu'ils tuaient 7/10 et 8/10 poulets avec des index IPIV > 1,2 quand les oiseaux étaient inoculés par voie intraveineuse. Cependant, ils n'induisaient ni mortalité ni signes cliniques après inoculation par voie intranasale et ces virus ne possédaient pas d'acides aminés multiples au site de clivage de leur hémagglutinine. 3. Épreuves sérologiques a) Immunodiffusion en gélose (IDG) Tous les virus influenza A possèdent des antigènes de nucléocapside et de matrice similaires. Cette propriété permet de détecter la présence ou non d'anticorps vis-à-vis de tout virus influenza A, par les épreuves d’IDG. Des préparations virales concentrées, comme décrites ci-dessus, contiennent à la fois des antigènes de matrice et de nucléocapside ; les antigènes de matrice diffusent plus vite que les antigènes de nucléocapside. Les épreuves d’IDG ont été largement utilisées, et ce en routine, pour détecter dans les lots de poulets et de dindes, des anticorps spécifiques témoins d'une infection. Ces épreuves ont en général mis en œuvre des préparations enrichies en nucléocapside obtenues à partir de membranes choriallantoïdiennes d'œufs embryonnés de poule (6) infectés à 10 jours d'incubation, ces membranes étant ensuite homogénéisées, subissant 3 cycles de congélation-décongélation, puis étant centrifugées à 1 000 g. Les surnageants sont inactivés par l'addition de formol à 0,1 % ou 1 % de béta-propiolactone, centrifugés à nouveau et utilisés comme antigène. Toutes les espèces aviaires ne produisent pas des anticorps précipitants après une infection à virus influenza. Les épreuves sont d'habitude réalisées à l'aide de gels d'agarose ou d'agar purifié à 1 % (poids/volume) en tampon phosphate salin à 8 % (poids/volume), pH 7,2, versés en boîte de Petri ou sur lame de microscope, de manière à former une épaisseur de 2 à 3 mm. À l'aide d'une matrice et d'un cutter, des puits d'environ 5 mm de diamètre, placés à 2 ou 5 mm de distance, sont découpés dans la gélose. La disposition des puits doit être telle qu'elle place chaque sérum suspect à côté d'un sérum connu et de l'antigène. Ceci dans le but de permettre la mise en évidence d’une ligne identique entre le sérum connu, le sérum suspect et l'antigène de nucléocapside. Environ 50 µl de chacun des réactifs devront être déposés dans chaque puits. Les lignes de précipitation peuvent être détectées après environ 24 à 48 h, mais ceci peut dépendre des concentrations en anticorps et en antigène. Ces lignes sont plus visibles par transillumination oblique sur fond noir. Un résultat positif, spécifique est enregistré lorsque la ligne de précipitation entre le puits du sérum témoin positif et l'antigène est contiguë avec la ligne formée entre le puits du sérum à tester et l'antigène. Des lignes croisées sont interprétées comme un manque d'identité entre le sérum à tester et les anticorps présents dans le puits du sérum témoin positif. b) Épreuves d'hémagglutination et d'inhibition de l'hémagglutination Des variantes dans les procédures des épreuves d’hémagglutination et IHA sont mises en œuvre dans les différents laboratoires. Les exemples recommandés ci-après s'appliquent à l'utilisation de microplaques avec fonds en V dans lesquelles le volume final pour l'une ou l'autre épreuve est de 0,075 ml. Les réactifs requis pour ces épreuves sont du PBS isotonique (0,1 M), pH 7,0-7,2, et des globules rouges (GRs) prélevés sur 3 poulets EAPS ou SAN au moins et mélangés volume à volume avec une solution d'Alsever. Les hématies doivent être lavées 3 fois en PBS, avant d'être utilisées comme une suspension (à partir du culot cellulaire) à 1 % volume à volume. Des antigènes et antisérums témoins positifs et négatifs appropriés doivent être utilisés avec chacune de ces épreuves. • Épreuve d'hémagglutination i) Distribuer 0,025 ml de PBS dans chacun des puits de la microplaque en plastique à fond en V. Manuel terrestre de l’OIE 2005 295 Chapitre 2.1.14. — Influenza aviaire ii) Déposer 0,025 ml de la suspension virale (c'est-à-dire du liquide allantoïdien infectieux) dans le premier puits. En vue d'une détermination précise du titre HA, il est recommandé de le faire à partir de séries de dilutions assez proches par exemple 1/3, 1/4, 1/5, 1/6, etc. iii) Faire des dilutions de ½ en ½ de la suspension virale sous 0,025 ml, d'un bout à l'autre de la plaque. iv) Distribuer à nouveau 0,025 ml de PBS dans chaque puits. v) Distribuer 0,025 ml d'hématies de poulet à 1 % dans chacun des puits. vi) Mélanger en tapotant doucement la microplaque, puis laisser les hématies sédimenter pendant environ 40 min à température ambiante, c'est-à-dire environ 20°C, ou pendant 60 min à 4°C en cas de températures ambiantes élevées, temps au bout duquel les hématies témoins doivent avoir sédimenté en formant une pastille nette. vii) Le titre HA est déterminé en inclinant la plaque et en observant la présence ou l'absence d'une coulée en forme de larme des hématies. Le titre doit être lu comme la dilution maximale donnant une hémagglutination complète (absence d'écoulement) ; celle-ci représente une unité HA (UHA) et peut être calculée précisément à partir des séries de dilutions initiales. • Épreuve d'inhibition de l'hémagglutination i) Distribuer 0,025 ml de PBS dans chaque puits de la microplaque à fond en V. ii) Déposer 0,025 ml de sérum dans le premier puits de la plaque. iii) Faire des dilutions de ½ en ½ du sérum, sous un volume de 0,025 ml, d'un bout à l'autre de la plaque. iv) Ajouter 4 UHA de virus ou antigène sous 0,025 ml dans chaque puits et laisser pendant au moins 30 min à température ambiante (c'est-à-dire à environ 20°C) ou 60 min à 4°C. v) Ajouter 0,025 ml d'hématies de poulet à 1 % (volume/volume) dans chaque puits, mélanger doucement puis laisser les hématies sédimenter pendant environ 40 min à température ambiante, c'est-à-dire à environ 20°C, ou pendant 60 min à 4°C si les températures ambiantes sont élevées, à l'issue de ce temps les hématies témoins devront avoir sédimenté en formant une pastille nette. vi) Le titre IHA est la dilution maximale de sérum causant une inhibition complète de 4 UHA d'antigène. L'agglutination est évaluée en inclinant la microplaque. Seuls les puits dans lesquels l'écoulement des hématies se fait à la même vitesse que celui des puits témoins (contenant seulement 0,025 ml d'hématies et 0,025 ml de PBS) devront être considérés comme présentant une inhibition. vii) La validité des résultats devra être appréciée en confrontant un sérum témoin négatif, qui ne devra pas avoir un titre supérieur à ¼ (> 22 ou > 2 log2 si exprimé comme l'inverse de la dilution) et un sérum positif témoin qui devra présenter à une dilution près, un titre égal à son titre connu. Les titres IHA peuvent être considérés comme positifs s'il y a une inhibition à une dilution d'au moins 4 1/16 (2 ou 4 log2 si exprimé comme l'inverse de la dilution) vis-à-vis de 4 UHA d'antigène. Quelques laboratoires préfèrent utiliser 8 UHA dans les épreuves IHA. Bien que ce soit permis, cela modifie l'interprétation des résultats de telle sorte qu'un titre est considéré positif s'il est d'au moins 1/8 (23 ou 3 log2). Les sérums de poulet produisent rarement des réactions positives non spécifiques dans cette épreuve, et aucun traitement préliminaire des sérums n’est nécessaire. Les sérums d'espèces autres que le poulet peuvent quelquefois causer une agglutination des hématies de poulet, aussi cette propriété devra-t-elle être déterminée préalablement et enlevée par adsorption du sérum avec des hématies de poulet. Ceci est réalisé en ajoutant 0,025 ml de culot d'hématies de poulet à 0,5 ml d'antisérum, en remuant doucement puis en laissant en contact pendant au moins 30 min ; les hématies sont alors culottées par centrifugation à 800 g pendant 2 à 5 min et les sérums adsorbés sont décantés. Alternativement des hématies de l'espèce dont proviennent les sérums, peuvent être utilisées. L’épreuve d'inhibition de la neuraminidase est utilisée pour identifier le type de neuraminidase de l'isolat et pour caractériser les anticorps chez les oiseaux infectés. La procédure requiert une expertise et des réactifs spéciaux ; par conséquent cette analyse est en général réalisée dans un Laboratoire de référence de l’OIE. La stratégie DIVA (consistant à différentier les animaux infectés des animaux vaccinés) repose également sur l'utilisation d'une épreuve sérologique de détection spécifique des anticorps anti-N ; la méthode est décrite (11). 296 Manuel terrestre de l’OIE 2005 Chapitre 2.1.14. — Influenza aviaire Des trousses de diagnostic commerciales ELISA détectant des anticorps dirigés contre la nucléocapside sont disponibles. Il existe différentes épreuves avec différentes préparations antigéniques. Ces épreuves ont en général été évaluées et validées par le fabricant, il est par conséquent important de suivre soigneusement les instructions pour leur utilisation. 4. Nouvelles techniques de diagnostic de l'influenza aviaire Pour le moment, les techniques conventionnelles d'isolement et de caractérisation du virus demeurent les méthodes de choix pour le diagnostic de l'IA, du moins pour le diagnostic initial des infections par l’IA. Cependant, les méthodes conventionnelles sont coûteuses, lourdes et lentes. Au cours de ces 10 dernières années environ, d'énormes développements et d'améliorations ont vu le jour dans les techniques de diagnostic qu'il soit ou non moléculaire et beaucoup d'entre elles ont été appliquées au diagnostic des infections par l’IA. a) Détection de l'antigène La trousse de diagnostic Directigen® Flu A commercialisé par Becton Dickinson Microbiology Systems, qui a pour principe une méthode immuno-enzymatique de capture antigénique, a été utilisé pour détecter la présence des virus influenza A chez les volailles (40), en particulier aux USA. La trousse de diagnostic recourt à un anticorps monoclonal dirigé contre la nucléoprotéine et devrait en principe permettre de détecter tout virus influenza A. Quoiqu'il ait été développé pour détecter le virus lors d'infections chez les mammifères, il a été utilisé avec succès pour détecter les virus chez les volailles et autres oiseaux, malgré une possible variabilité dans la sensibilité en fonction de la nature des échantillons. Le principal avantage du test est qu'il permet de mettre en évidence la présence du virus en 15 min. Les inconvénients sont qu'il peut manquer de sensibilité, il n'a pas été validé pour différentes espèces d'oiseaux, l'identification du sous-type fait défaut et les trousses de diagnostic sont coûteuses. Cette épreuve ne devrait être interprétée que comme une épreuve de lot et non comme une épreuve individuelle. En outre les échantillons oro-pharyngés ou trachéaux provenant d'oiseaux malades ou morts procurent la meilleure sensibilité. b) Détection directe de l'ARN Bien que, comme en atteste les définitions actuelles de l'IAHPD, les techniques moléculaires aient été utilisées depuis quelque temps pour le diagnostic de l'IA, il y a eu récemment des développements dans leur application pour la détection et la caractérisation des virus d’IA directement à partir d'échantillons cliniques provenant d'oiseaux infectés. Les techniques RT-PCR appliquées aux échantillons cliniques, peuvent, à condition de disposer d'amorces adaptées, aboutir à une détection et une identification rapides du sous-type (au moins H5 et H7), avec en plus l'obtention d'un ADNc pouvant être utilisé pour le séquençage nucléotidique (30, 42, 43). Les résultats obtenus par Koch (24) indiquent que des précautions doivent être prises dans le choix des échantillons utilisés étant donné que les échantillons trachéaux provenant d'oiseaux infectés montrent une sensibilité et spécificité élevée par référence à l'isolement viral, alors que les échantillons fécaux manquent de sensibilité. La réelle application des RT-PCR directes peut résider dans l'identification rapide des foyers secondaires, une fois que les premiers élevages infectés ont été détectés et que le virus a été caractérisé. Cette méthode a été utilisée avec succès durant les foyers d'IAHP de 2003 aux Pays-Bas. Des modifications dans l'usage de la RT-PCR ont été appliquées de manière à réduire le délai à la fois pour l'identification du sous-type viral et le séquençage. Par exemple Spackman et al. (41) ont utilisé une RT-PCR en temps réel en une étape reposant sur le principe d'amorces et d'une sonde libérant un fluorochrome une fois hydrolysée ; cette technique permet la détection de virus d’IA et la détermination des sous-types H5 ou H7. Les auteurs ont conclu que le test présentait de bonnes performances par référence à l'isolement viral et offrait une alternative de diagnostic plus économique et beaucoup plus rapide en moins de 3 h à partir d'échantillons cliniques. Des modifications de la simple technique RT-PCR de détection de l'ARN viral ont été conçues pour réduire : [i] les effets des substances inhibitrices présentes dans les échantillons prélevés, [ii] la possibilité d'acides nucléiques contaminants et [iii] le délai d'obtention des résultats. Par exemple, l'amplification basée sur une séquence d'acide nucléique (NASBA pour Nucleic Acid Sequence-Based Amplification) suivie d'une détection par électrochimioluminescence (NASBA/ECL) est une réaction qui se déroule à température constante ne nécessitant pas un thermocycleur. Les tests NASBA ont été développés pour la détection en 5 h des virus IA de sous-types H7 et H5 dans les échantillons cliniques (13, 23). Manuel terrestre de l’OIE 2005 297 Chapitre 2.1.14. — Influenza aviaire Il paraît très vraisemblable que d'ici très peu de temps la technologie moléculaire se sera suffisamment développée pour réaliser dans l'élevage des tests de détection de la présence de virus d’IA, de la détermination spécifique du sous-type et des marqueurs de virulence. L'importance de l'utilisation de ces tests dans le diagnostic de l'IA dépendra beaucoup de l'adoption de définitions partagées sur les infections réglementées, ceci à des fins de contrôle et de commerce. C. SPÉCIFICATIONS APPLICABLES AUX VACCINS ET AUX PRODUITS BIOLOGIQUES À USAGE DIAGNOSTIQUE Expérimentalement, qu'il s'agisse de IAD ou de IAFP, il est démontré que la vaccination protège contre les signes cliniques et la mortalité, réduit l'excrétion virale et augmente la résistance à l'infection ; elle protège contre différents virus sauvages appartenant au même sous-type d'hémagglutinine, elle protège vis-à-vis d'une exposition faible à forte et réduit la transmission du virus d'épreuve par contact (12, 16, 44, 50). Cependant, le virus est encore capable d'infecter des oiseaux vaccinés et de s'y répliquer de manière inapparente. Dans certains pays, les vaccins visant à contenir ou prévenir le IAD sont spécifiquement interdits ou leur emploi est découragé par les agences gouvernementales, parce qu'elles considèrent que les vaccins peuvent interférer avec les mesures de police sanitaire et d'abattage. Cependant, la plupart des textes réglementaires concernant le contrôle de l'influenza aviaire prévoient le droit de recourir aux vaccins en situation d'urgence. Il est important que la vaccination ne soit pas considérée comme la seule solution pour contrôler les sous-types IAD ou IAFP si l'éradication est l'objectif visé. En l'absence de mise en œuvre de systèmes de surveillance, de mesures strictes de biosécurité et d'un dépeuplement en cas d'infection, il existe la possibilité que ces virus deviennent enzootiques dans les populations de volailles vaccinées. La circulation durable de virus dans une population vaccinée peut conduire à des changements à la fois antigéniques et génétiques du virus, comme ceci a été rapporté au Mexique (26). Les vaccins influenza vivants conventionnels, quel que soit le sous-type visé, ne sont pas recommandés. • Vaccins conventionnels De façon conventionnelle, les vaccins utilisés jusqu'à présent contre l'influenza IAD ou IAFP ont été préparés à partir de liquides allantoïdiens inactivés par la béta-propiolactone ou le formol et émulsifiés avec une huile minérale. L'existence d'un grand nombre de sous-types viraux, jointe à la variation connue des différentes souches à l'intérieur d'un sous-type, pose des difficultés sérieuses pour la sélection des souches destinées à la production de vaccins influenza, en particulier pour l'influenza IAFP. De plus, certains isolats ne se multiplient pas à un titre suffisant pour produire des vaccins présentant une activité adéquate sans le besoin d'une étape préalable et coûteuse de concentration. À côté d’une stratégie vaccinale basée sur la production d'auto-vaccins (c'est-à-dire préparés à partir d'isolats spécifiquement impliqués dans une épizootie), une autre consiste à utiliser des vaccins préparés à partir de virus, du même sous-type d'hémagglutinine, offrant de bons rendements au plan de la concentration en antigène. Aux USA, une standardisation de ces derniers a été menée dans la mesure où le Centre des produits biologiques vétérinaires (Center for Veterinary Biologics) a multiplié et conservé des virus influenza correspondant à différents sous-types afin qu'ils soient utilisés comme souche de semence dans la préparation des vaccins inactivés (5). Aux USA, depuis les années 1970, il y a eu quelques utilisations des vaccins inactivés commerciaux sous condition d'autorisation spécifique (21, 29, 34). Ces vaccins ont été utilisés en priorité chez la dinde, vis-à-vis de virus non hautement pathogènes, mais susceptibles de causer de sérieux problèmes, notamment en présence de conditions aggravantes. Des quantités de vaccin tout à fait notables ont été utilisées (22, 29). Une vaccination classique vis-à-vis de la souche dominante de IAFP a aussi été mise en œuvre en Italie pendant plusieurs années (15). La vaccination contre les infections à H9N2 a été utilisée au Pakistan (32), en Iran (54) et en République Populaire de Chine (27). Des vaccins à virus inactivé ont été préparés à partir du virus IAFPD de sous-type H7N3 responsable d'une série de foyers chez des dindes dans l'Utah en 1995 ; ils ont été utilisés, en accompagnement d'autres mesures, pour contrôler la situation (22). De la même manière, dans le Connecticut en 2003, la vaccination de pondeuses guéries de l'infection et des poulettes de remplacement, avec un vaccin H7N2 ou H7N3 a été mise en place après un foyer de IAFPD causé par un virus H7N2 (46). Le Mexique, suite aux foyers survenus en 1994-1995, et le Pakistan, suite aux foyers de 1995, ont recouru à la vaccination contre l'influenza IAHPD de sous-types H5N2 et H7N3 respectivement (19, 26, 31). Au Mexique le virus IAHPD a été éradiqué, mais le virus IAFPD H5N2 a continué à circuler, tandis qu'au Pakistan des virus 298 Manuel terrestre de l’OIE 2005 Chapitre 2.1.14. — Influenza aviaire IAHP hautement pathogènes proches génétiquement du virus d'origine hautement pathogène, étaient encore isolés en 2001 (51) et 2004. À Hong Kong en 2002 (39), à la suite des foyers liés à des virus H5N1 hautement pathogènes, des mesures de vaccination avec un vaccin H5N2 ont été adoptées. En 2004, la grande extension des foyers d'IA H5N1 hautement pathogènes dans quelques pays du Sud-Est asiatique a conduit la Chine et l'Indonésie à mettre en place une vaccination prophylactique. Ce type de vaccination a été aussi utilisé en Italie, dans des zones géographiques limitées, pour aider à maîtriser les virus IAFPD H5 et H7. • Vaccins recombinants Des vaccins recombinants de l'influenza aviaire ont été obtenus en insérant le gène codant l'hémagglutinine du virus influenza, dans un vecteur viral vivant ; ils ont été utilisés pour immuniser des volailles contre l'influenza aviaire. Les vaccins vectorisés recombinants vivants présentent plusieurs avantages : [1] ce sont des vaccins vivants capables d'induire à la fois une immunité humorale et cellulaire, [2] ils peuvent être administrés à de jeunes oiseaux et induire une protection précoce, par exemple le vaccin poxvirus aviaire peut être administré à 1 jour d'âge, est compatible avec le vaccin de la maladie de Marek et induit une protection significative 1 semaine plus tard, [3] ils permettent de différencier les oiseaux infectés des oiseaux vaccinés, étant donné, par exemple qu'ils n'induisent pas de production d'anticorps vis-à-vis des antigènes de la nucléoprotéine ou de la protéine de matrice communs à tous les virus d'influenza aviaire. Par conséquent, seuls les oiseaux infectés naturellement présenteront des anticorps par les tests d’IDG ou ELISA ciblant la détection des anticorps d'influenza de groupe A (nucléoprotéine et/ou protéine de matrice). Cependant ces vaccins ont des limites du fait qu'ils se multiplient peu et n'induisent qu'une immunité protectrice partielle chez des oiseaux ayant été déjà exposés au virus utilisé comme vecteur (soit par une infection naturelle soit par une exposition préalable à ce même vecteur lors d’une vaccination antérieure). Les virus de la variole aviaire ou de la laryngotrachéite infectieuse sont les virus actuellement utilisés comme vecteurs dans les vaccins recombinants disponibles (28, 47). Si ces vaccins sont utilisés chez des oiseaux d'un jour ou de jeunes poussins, l'interférence des anticorps maternels vis-à-vis du vecteur sur l'efficacité du vaccin, diffère selon le type de vecteur. En ce qui concerne le vaccin recombinant poxvirus aviaire, il a été rapporté qu'une immunisation effective était obtenue en vaccinant des poussins avec différents niveaux d'immunité maternelle (3). Cependant il serait souhaitable de confirmer l'efficacité du vaccin recombinant de la variole aviaire chez des poussins d'un jour présentant des niveaux d'anticorps maternels très élevés, qu'ils résultent d'une infection antérieure ou d'une vaccination. De plus, du fait que les vecteurs sont des virus vivants, il peut exister une barrière d'espèce (par exemple le virus de la laryngotrachéite infectieuse ne se réplique pas chez la dinde), aussi l'utilisation de ces vaccins doit-elle être restreinte aux espèces pour lesquelles une efficacité a été démontrée. L'utilisation de vaccins recombinants est limitée aux pays dans lesquels elle est légalement autorisée. Le vaccin recombinant poxvirus aviaire contre l'influenza aviaire H5 a une autorisation au Salvador, au Guatemala, au Mexique et aux USA (44). Ces vaccins recombinants poxvirus AI-H5 ont été évalués dans des essais sur le terrain (7, 20, 35, 48), mais la seule expérience de terrain avec ce vaccin a eu lieu au Mexique, au Salvador et au Guatemala, du fait de son utilisation dans des campagnes de vaccination contre le virus H5N2. Entre 1995 et 2001, le Mexique a utilisé plus de 1,423 milliard de doses de vaccin inactivé H5N2 (55). Entre 1997 et 2003, le Mexique, le Guatemala et le Salvador ont en outre utilisé plus de 1 milliard de doses de vaccin recombinant pox aviaire IA-H5 pour contrôler l'influenza IAFPD H5N2. • Autres nouveaux vaccins Le système d'expression en baculovirus a été utilisé pour produire des antigènes recombinants H5 et H7 destinés à être incorporés comme vaccins (56). L'ADN codant l'hémagglutinine H5 a été évalué comme vaccin potentiel chez les volailles (25). • Détection de l'infection dans les lots vaccinés et chez les oiseaux vaccinés Une stratégie permettant de différencier les animaux infectés des animaux vaccinés (DIVA), est apparue comme une solution possible à l'éradication éventuelle du IAD sans recourir à un abattage et en évitant les conséquences économiques dommageables qui en résulteraient, en particulier dans les pays en développement (17). Cette stratégie bénéficie des avantages de la vaccination (du fait de la présence moindre de virus dans l'environnement), tout en laissant la possibilité d'identifier les lots infectés ce qui donne encore de la latitude pour d'autres méthodes de contrôle, dont l'abattage. Au niveau d'un lot, une méthode simple consiste à suivre régulièrement des oiseaux sentinelles non vaccinés laissés dans chaque lot vacciné, mais cette approche rencontre des problèmes de mise en œuvre notamment en ce qui concerne l'identification des sentinelles dans des grands lots. Comme alternative, ou comme adjonction, il est possible de tester les animaux vaccinés pour repérer une infection naturelle. À cette fin, il est recommandé d'utiliser des stratégies vaccinales adéquates. Plusieurs d'entre elles ont été utilisées ces dernières années. Elles incluent l'utilisation d'un vaccin contenant un virus du même sous-type d'hémagglutinine mais de sous-type de neuraminidase différent de celui correspondant au virus du terrain. Les anticorps spécifiques de la neuraminidase du virus sauvage tiennent lieu de marqueurs de l'infection. Ce système a été utilisé en Italie en 2000 à la suite de la réémergence du virus H7N1 IAFPD. De Manuel terrestre de l’OIE 2005 299 Chapitre 2.1.14. — Influenza aviaire manière à renforcer les mesures de contrôle, une stratégie DIVA a été mise en œuvre, elle utilise un vaccin H7N3 pour lutter contre une infection naturelle H7N1. Les oiseaux vaccinés sont différenciés des oiseaux infectés naturellement au moyen d'une épreuve sérologique consistant à détecter les anticorps spécifiques anti-N (9, 10). La même stratégie a été utilisée pour contrôler l'influenza IAFPD dû à un virus H7N3 en 2002-2003, en Italie (8), dans ce cas en recourant à un vaccin H7N1. Dans les 2 cas, la vaccination jointe à l'abattage sanitaire et à la stratégie DIVA a abouti à l'éradication du virus sauvage. Les défauts de ce système tiennent au fait qu'il ne permet pas de repérer l'émergence d'un virus sauvage présentant une neuraminidase N différente de celle du virus circulant, ni la co-circulation de plusieurs sous-types (avec différentes neuraminidases). Une alternative réside dans l'utilisation de vaccins contenant seulement HA, c'est-à-dire de vaccins recombinants ; cette stratégie permet d'employer les tests classiques IDG et ELISA basés sur la nucléoprotéine et la protéine de matrice, afin de détecter l'infection chez des oiseaux vaccinés. En ce qui concerne les vaccins inactivés, un test basé sur la détection des anticorps spécifiques de la protéine non structurale a été décrit (52). Ce système reste encore à valider sur le terrain. • Production de vaccins conventionnels L'information donnée ci-dessous est d'abord basée sur les expériences acquises aux USA ainsi que sur les recommandations et réglementations s'appliquant à l'autorisation des vaccins influenza aviaires dans ce pays (53). Les principes de base pour la production des vaccins, en particulier des vaccins inactivés, sont communs à plusieurs virus par exemple celui de la maladie de Newcastle (Chapitre 2.7.13.). Les recommandations pour la production des vaccins vétérinaires sont décrites au Chapitre I.1.7., « Principes de fabrication des vaccins à usage vétérinaire ». Les recommandations détaillées ci-après ainsi que dans le Chapitre I.1.7. ont un caractère général par essence et peuvent être complétées par des exigences à portée nationale et régionale. Les locaux dédiés à la production de vaccin doivent fonctionner selon des procédures et pratiques de biosécurité appropriées. Si du virus IAHPN est utilisé pour la production de vaccin ou des études de vaccination/épreuve, la partie des locaux affectée à ce travail doivent répondre aux exigences de confinement propres aux pathogènes de groupe 4 comme souligné dans l'annexe I.1.6.1. du Chapitre I.1.6., « La biosécurité au laboratoire de microbiologie vétérinaire » de ce Manuel terrestre. 1. Gestion des semences virales a) Caractéristiques de la semence virale Quel que soit le sous-type, il est recommandé de n'utiliser, à des fins de constitution d'un lot de semence destiné à la production de vaccins inactivés, que des virus influenza A bien caractérisés, en particulier en ce qui concerne leur faible pouvoir pathogène, et acquis de préférence auprès d'une collection internationale ou nationale. b) Méthode de culture Un lot de semence est constitué et permettra de générer un lot de travail. Les lots de semence et de travail sont produits sur œufs EAPS ou SAN. L'établissement d'un lot de semence peut consister en la seule production d'un volume d'au moins 100 ml de liquide allantoïdien qui peut être stocké sous formes de fractions aliquotes (0,5 ml) lyophilisées. c) Validation de la semence candidate comme semence vaccinale Après obtention, le lot de semence doit être vérifié au plan de la stérilité, de l'innocuité, de son activité et de l'absence d'agents étrangers. 2. Méthode de fabrication Pour la production de vaccin, un lot de travail, à partir duquel les lots de vaccin sont produits, est d'abord constitué sur œufs embryonnés EAPS ou SAN, par multiplication d'une fraction aliquote du lot de semence, en quantité suffisante pour permettre une production de 12 à 18 mois. Il est préférable de stocker le lot de travail sous forme congelée en dessous de –60°C, étant donné que les virus lyophilisés ne se multiplient pas toujours à titre élevé au premier passage suivant. Les vaccins influenza inactivés préparés à partir d'un virus non modifié sont produits sur œufs embryonnés de poule. La méthode de production consiste à multiplier le virus stérilement ; toutes les procédures sont réalisées en conditions stériles. 300 Manuel terrestre de l’OIE 2005 Chapitre 2.1.14. — Influenza aviaire Il est habituel de diluer le lot de travail dans du tampon isotonique stérile (c'est-à-dire du PBS pH 7,2) de manière 3 4 à ce que 10 – 10 DIE50 (doses de virus infectant 50 % des oeufs) sous 0,1 ml soient inoculées dans la cavité allantoïdienne de chaque œuf embryonné EAPS ou SAN de 9 à 11 jours. Les œufs ainsi inoculés sont ensuite incubés à 37°C, ceux dont les embryons meurent dans les 24 h sont éliminés. La durée de l'incubation dépend de la souche virale utilisée et doit être optimisée pour garantir les meilleurs rendements avec le minimum de mortalité embryonnaire. Les œufs infectés sont refroidis à 4°C avant d'être récoltés. La partie supérieure de l'œuf est enlevée et les liquides allantoïdiens sont collectés par succion. L'incorporation de tout matériel vitellin ou d'albumen doit être évitée. Tous les liquides allantoïdiens doivent être immédiatement stockés à 4°C et testés pour détecter une contamination bactérienne. Dans la fabrication de vaccins inactivés, les liquides allantoïdiens récoltés sont traités avec soit du formol (la concentration finale habituelle est de 1/1 000) soit de la béta-propiolactone (la concentration finale habituelle est de 1/1 000 – 1/4 000). La durée requise doit être suffisante pour garantir l'absence de virus résiduel vivant. La plupart des vaccins inactivés sont formulés avec des liquides allantoïdiens inactivés non concentrés (qui constituent le principe actif). Cependant, les principes actifs peuvent être concentrés pour une meilleure conservation de l'antigène. Le principe actif est en général émulsifié avec une huile minérale ou végétale. Les formulations précises constituent en général des secrets industriels. 3. Contrôles en cours de fabrication Pour les vaccins inactivés, l'efficacité du procédé d'inactivation devra être vérifiée en utilisant des œufs embryonnés EAPS ou SAN et en testant 2 fois au moins 10 fractions aliquotes de 0,2 ml à partir de chaque lot. 4. Contrôles des lots La plupart des pays ont publié des spécifications incluant la définition des tests obligatoires pour les contrôles en cours de production et les tests sur les vaccins en fin de production. a) Stérilité Les tests pour vérifier la stérilité et l'absence de contaminants dans les matières biologiques, peuvent être trouvés au Chapitre I.1.5., « Contrôle de la stérilité ou de l’absence de contamination des matériels biologiques ». b) Innocuité Pour les vaccins inactivés, une double dose est administrée par la voie recommandée à 10 oiseaux âgés de 3 semaines ; ceux-ci sont observés pendant 2 semaines pour vérifier l'absence de signes cliniques et de lésions locales. c) Activité L'activité d'un vaccin de l'influenza aviaire est en général évaluée en testant la capacité du vaccin à induire un titre IHA significatif chez des oiseaux EAPS ou SAN. Classiquement, un test d'activité impliquant l'utilisation de 3 doses diluées et d'une épreuve avec un virus virulent (voir Chapitre 2.7.13.) peut aussi être utilisé pour tester les vaccins destinés à induire une protection vis-à-vis des sous-types IAHPN et IAFPD. En ce qui concerne les vaccins inactivés ciblant les autres sous-types pour lesquels des virus virulents ne sont pas connus, les tests d'activité peuvent reposer sur la mesure des réponses immunitaires ou sur une épreuve suivie de l'évaluation de la morbidité et de la réduction quantitative de la réplication virale au niveau respiratoire (oropharynx et trachée) et intestinal (cloaque). L'évaluation de la concentration en hémagglutinine (58) pourrait permettre d'extrapoler in vitro l'activité pour les lots de vaccins ultérieurs. d) Stabilité Une fois stocké dans les conditions recommandées, le vaccin final devra conserver son activité pendant au moins 1 an. Les vaccins inactivés ne doivent pas être congelés. e) Agents de conservation Il est possible d'utiliser des agents de conservation pour les vaccins formulés en doses multiples. f) Précautions d'emploi et mise en garde Il convient que le manipulateur fasse attention à éviter de s'injecter les vaccins en émulsion huileuse. 5. Contrôles du produit fini Manuel terrestre de l’OIE 2005 301 Chapitre 2.1.14. — Influenza aviaire a) Innocuité Voir section C.4.b ci-dessus. b) Activité Voir section C.4.b ci-dessus. RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES 1. ALEXANDER D.J. (1993). Orthomyxovirus infections. In: Viral Infections of Vertebrates, Volume 3: Viral Infections of Birds, McFerran J.B. & McNulty M.S., eds. Horzinek M.C., Series editor. Elsevier, Amsterdam, The Netherlands, 287–316. 2. ALTMULLER A., KUNERL M., MULLER K., HINSHAW V.S., FITCH W.M. & SCHOLTISSEK C. (1991). Genetic relatedness of the nucleoprotein (NP) of recent swine, turkey and human influenza A virus (H1N1) isolates. Virus Res., 22, 79–87. 3. ARRIOLA J.M., FARR W., URIBE G. & ZURITA J. (1999). Experiencias de campo en el uso de vacunos contra influenza aviar. In; Proceedings Curso de Enfermedades Respiratorias de las Aves, Asociacion Nacional de Especialistas en Cienvias Avicelase, 3–13. 4. BANKOWSKI R.A. (1982). Proceedings of the First International Symposium on Avian Influenza, 1981. Carter Comp., Richmond, USA. 5. BANKOWSKI R.A. (1985). Report of the Committee on Transmissible Diseases of Poultry and Other Avian Species. Proceedings of the 88th Annual Meeting of the U.S. Animal Health Association, 474–483. 6. BEARD C.W. (1970). Demonstration of type-specific influenza antibody in mammalian and avian sera by immunodiffusion. Bull. WHO, 42, 779–785. 7. BEARD C.W., SCHNITZLEIN W.M. & TRIPATHY D.N. (1991). Protection of chickens against highly pathogenic avian influenza virus (H5N2) by recombinant fowlpox viruses. Avian Dis., 35, 356–359. 8. CAPUA I. & ALEXANDER D.J. (2004). Avian influenza: recent developments. Avian Pathol., 33, 393–404. 9. CAPUA I., CATTOLI G., MARANGON S., BORTOLOTTI L. & ORTALI G. (2002). Strategies for the control of avian influenza in Italy. Vet. Rec., 150, 223. 10. CAPUA I. &. MARANGON S. (2000). Review article: The avian influenza epidemic in Italy, 1999–2000. Avian Pathol., 29, 289–294. 11. CAPUA I., TERREGINO C., CATTOLI G., MUTINELLI F. & RODRIGUEZ J.F. (2003). Development of a DIVA (Differentiating Infected from Vaccinated Animals) strategy using a vaccine containing a heterologous neuraminidase for the control of avian influenza. Avian Pathol., 32, 47–55. 12. CAPUA I., TERREGINO C., CATTOLI G. & TOFFAN A. (2004). Increased resistance of vaccinated turkeys to experimental infection with an H7N3 low-pathogenicity avian influenza virus. Avian Pathol., 33, 47–55. 13. COLLINS R.A., KO L.S., SO K.L., ELLIS T., LAU L.T. & YU A.C.H. (2002). Detection of highly pathogenic and low pathogenic avian influenza subtype H5 (Eurasian lineage) using NASBA. J. Virol. Methods, 103, 213–225. 14. COUNCIL OF THE EUROPEAN COMMUNITIES (1992). Council Directive 92/40/EEC of 19th May 1992 introducing Community measures for the control of avian influenza. Off. J. European Communities, L167, 1–15. 15. DAPRILE P.N. (1986). Current situation of avian influenza in Italy and approaches to its control. In: Acute Virus Infections of Poultry, McFerran J.B. & McNulty M.S., eds. Martinus Nijhoff, Dordrecht, The Netherlands, 29–35. 16. EUROPEAN UNION (EU) SCIENTIFIC COMMITTEE ON ANIMAL HEALTH AND ANIMAL WELFARE (SCAHAW) (2003). Food Safety: Diagnostic Techniques and Vaccines for Foot and Mouth Disease, Classical Swine Fever, Avian Influenza and some other important OIE List A Diseases. Report of the Scientific Committee on Animal Health and Animal Welfare. http://europes.eu.int/comm/food/fs/sc/scah/out93. 302 Manuel terrestre de l’OIE 2005 Chapitre 2.1.14. — Influenza aviaire 17. FOOD AND AGRICULTURE ORGANIZATION OF THE UNITED (FAO) (2004). FAO, OIE & WHO Technical consultation on the Control of Avian Influenza. Animal health special report. http://www.fao.org/ag/againfo/subjects/en/health/diseases-cards/avian_recomm.html. 18. GARCIA A., CRAWFORD J.M., LATIMER J.W., RIVERA-CRUZ E. & PERDUE M.L. (1996). Heterogeneity in the haemagglutinin gene and emergence of the highly pathogenic phenotype among recent H5N2 avian influenza viruses from Mexico. J. Gen. Virol., 77, 1493–1504. 19. GARCIA A., JOHNSON H., KUMAR SRIVASTAVA D., JAYAWARDENE D.A., WEHR D.R. & WEBSTER R.G. (1998). Efficacy of inactivated H5N2 influenza vaccines against lethal A/chicken/Queretaro/19/95 infection. Avian Dis., 42, 248–256. 20. GARCIA-GARCIA J., RODRIGUEZ V.H. & HERNANDEZ M.A. (1998). Experimental studies in field trials with recombinant fowlpox vaccine in broilers in Mexico. Proceedings of the Fourth International Symposium on Avian Influenza, Athens, Georgia, USA. Swayne D.E. & Slemons R.D., eds. U.S. Animal Health Association, 245–252. 21. HALVORSON D.A. (1998). Strengths and weaknesses of vaccines as a control tool. Proceedings of the Fourth International Symposium on Avian Influenza, Athens, Georgia, USA. Swayne D.E. & Slemons R.D., eds. U.S. Animal Health Association, 223–227. 22. HALVORSON D.A., FRAME D.D., FRIENDSHUH A.J. & SHAW D.P. (1998). Outbreaks of low pathogenicity avian influenza in USA. Proceedings of the Fourth International Symposium on Avian Influenza, Athens, Georgia, USA. Swayne D.E. & Slemons R.D., eds. US Animal Health Association, 36–46. 23. KO L.S., LAU L.T., BANKS J., AHERNE R., BROWN I.H., COLLINS R.A., CHAN K.Y., XING J. & YU A.C.H (2003). Nucleic acid sequence-based amplification methods to detect avian influenza virus. J. Virol. Methods, (in press). 24. KOCH G. (2003). Laboratory issues: Assessment of the sensitivity and specificity of PCR for NDV on cloacal and tracheal swabs compared to virus isolation. Proceedings of the Joint Eighth Annual Meetings of the National Newcastle Disease and Avian Influenza Laboratories of Countries of the European Union, Padova, Italy, 2002. Commission of the European Communities, pp 114–117. 25. KODIHALLI S. & WEBSTER R.G. (1998). DNA vaccines for avian influenza – a model for future poultry vaccines? Proceedings of the Fourth International Symposium on Avian Influenza, Athens, Georgia, USA. Swayne D.E. & Slemons R.D., eds. U.S. Animal Health Association, 263–280. 26. LEE C.W, SENNE D.A. & SUAREZ D.L. (2004). Effect of vaccine use in the evolution of Mexican lineage H5N2 avian influenza virus. J. Virol., 78 (15), 8372–8381. 27. LIU H.Q., PENG D.X., CHENG J., JIA L.J., ZHANG RK. & LIU X.F. (2002). Genetic mutations of the haemagglutinin genes of H9N2 subtype avian influenza viruses. J. Yangzhou University, Agriculture and Life Sciences Edition, 23, 6–9. 28. LYSCHOW D., WERNER O., METTENLEITER T.C. & FUCHS W. (2001). Protection of chickens from lethal avian influenza A virus infection by live-virus vaccination with infectious laryngotracheitis virus recombinants expressing the hemagglutinin (H5) gene. Vaccine, 19, 4249–4259. 29. MCCAPES R.H. & BANKOWSKI R.A. (1985). Use of avian influenza vaccines in California turkey breeders – medical rationale. Proceedings of the Second International Symposium on Avian Influenza, Athens, Georgia, USA. U.S. Animal Health Association, 271–278. 30. MUNCH M., NIELSEN L., HANDBERG K. & JORGENSEN P. (2001). Detection and subtyping (H5 and H7) of avian type A influenza virus by reverse transcription-PCR and PCR-ELISA. Arch. Virol., 146, 87–97. 31. NAEEM K. (1998). The avian influenza H7N3 outbreak in South Central Asia. Proceedings of the Fourth International Symposium on Avian Influenza, Athens, Georgia, USA. Swayne D.E. & Slemons R.D., eds. U.S. Animal Health Association, 31–35. 32. NAEEM K., ULLAH A., MANVELL R.J. & ALEXANDER D.J. (1999). Avian influenza A subtype H9N2 in poultry in Pakistan. Vet. Rec., 145, 560. 33. OFFICE INTERNATIONAL DES EPIZOOTIES (OIE) (1992). Chapter A15, Highly Pathogenic Avian Influenza (Fowl Plague). In: Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines, Second Edition. OIE, Paris, France. Manuel terrestre de l’OIE 2005 303 Chapitre 2.1.14. — Influenza aviaire 34. PRICE R.J. (1982). Commercial avian influenza vaccines. In: Proceedings of the First Avian Influenza Symposium, 1981. Carter Comp., Richmond, USA, 178–179. 35. QIAO C.L., YU K.Z., JIANG Y.P., JIA Y.Q., TIAN G.B., LIU M., DENG G.H., WANG X.R., MENG Q.W. & TANG X.Y. (2003). Protection of chickens against highly lethal H5N1 and H7N1 avian influenza viruses with a recombinant fowlpox virus co-expressing H5 haemagglutinin and N1 neuraminidase genes. Avian Pathol., 32, 25–31. 36. SCHILD G.C., NEWMAN R.W., WEBSTER R.G., MAJOR D. & HINSHAW V.S. (1980). Antigenic analysis of influenza A virus surface antigens: considerations for the nomenclature of influenza virus. Arch. Virol., 83, 171–184. 37. SENNE D.A., PANIGRAHY B., KAWAOKA Y., PEARSON J.E., SUSS J., LIPKIND M., KIDA H. & WEBSTER R.G. (1996). Survey of the haemagglutinin (HA) cleavage site sequence of H5 and H7 avian influenza viruses: amino acid sequence at the cleavage site as a marker of pathogenicity potential. Avian Dis., 40, 425–437. 38. SHAFER A.L., KATZ J.B. & EERNISSE K.A. (1998). Development and validation of a competitive enzyme-linked immunosorbent assay for detection of Type A influenza antibodies in avian sera. Avian Dis., 42, 28–34. 39. SIMS L.D. (2003) Avian influenza in Hong Kong. Proceeding of the Fifth International Symposium on Avian Influenza, Athens, Georgia, USA, 14–17 April 2002. Avian Dis., 47, 832–838. 40. SLEMONS R.D. & BRUGH M. (1998). Rapid antigen detection as an aid in early diagnosis and control of avian influenza. In: Proceedings of the Fourth International Symposium on Avian Influenza, Athens, Georgia, USA. Swayne D.E. & Slemons R.D., eds. US Animal Health Association, 313–317. 41. SPACKMAN E., SENNE D.A., MYERS T.J., BULAGA L.L., GARBER L.P., PERDUE M.L., LOHMAN K., DAUM L.T. & SUAREZ D.L. (2002). Development of a real-time reverse transcriptase PCR assay for type A influenza virus and the avian H5 and H7 hemagglutinin subtypes. J. Clin. Microbiol., 40, 3256–3260. 42. STARICK E., ROMER-OBERDORFER A. & WERNER O. (2000). Type- and subtype-specific RT-PCR assays for avian influenza viruses. J. Vet. Med. [B], 47, 295–301. 43. SUAREZ D. (1998). Molecular diagnostic techniques: can we identify influenza viruses differentiate subtypes and determine pathogenicity potential of viruses by RT-PCR? Proceedings of the Fourth International Symposium on Avian Influenza, Athens, Georgia. US Animal Health Association, Pennsylvania, USA, 318– 325. 44. SWAYNE D.E. (2003). Vaccines for list A poultry diseases; emphasis on avian influenza. Dev. Biol. (Basel), 114, 201–212. 45. SWAYNE D.E. (2005). Application of new vaccine technologies for the control of transboundary diseases. Dev. Biol. In press. 46. SWAYNE D.E. & AKEY B. (2004). Avian influenza control strategies in the United States of America. In: Proceedings of the Frontis Workshop on Avian Influenza Prevention and Control, Wageningen, The Netherlands, 13–15 October 2003, R.S. Schrijver & Koch G., eds. http://www.wur.nl/frontis/. 47. SWAYNE D.E., BECK J.R. & KINNEY N. (2000). Failure of a recombinant fowl poxvirus vaccine containing an avian influenza hemagglutinin gene to provide consistent protection against influenza in chickens preimmunized with a fowl pox vaccine. Avian Dis., 44, 132–137. 48. SWAYNE D.E. & MICKLE T.R. (1997). Protection of chickens against highly pathogenic Mexican-origin H5N2 th avian influenza virus by a recombinant fowlpox vaccine. Proceedings the 100 Annual Meeting of the US Animal Health Association, Little Rock, USA, 1996, 557–563. 49. SWAYNE D.E., SENNE D.A. & BEARD C.W. (1998). Influenza. In: Isolation and Identification of Avian Pathogens, Fourth Edition, Swayne D.E., Glisson J.R., Jackwood M.W., Pearson J.E. & Reed W.M., eds. American Association of Avian Pathologists, Kennett Square, Pennsylvania, USA, 150–155. 50. SWAYNE D.E. & SUAREZ D.L. (2000). Highly pathogenic avian influenza. Rev. sci. tech. Off. Int. Epiz., 19, 463–482. 304 Manuel terrestre de l’OIE 2005 Chapitre 2.1.14. — Influenza aviaire 51. SWAYNE D.E. & SUAREZ D.L. (2001). Avian influenza in Europe, Asia and Central America during 2001. In: Proceedings of the 104th annual meeting of the US Animal Health Association, USAHA, Richmond, Virgina, USA, 465–470. 52. TUMPEY T.M., ALVAREZ R., SWAYNE D.E. & SUAREZ D.L. (2005). A diagnostic aid for differentiating infected from vaccinated poultry based on antibodies to the nonstructural (NS1) protein of influenza A virus. J. Clin. Microbiol., 43, in press. 53. UNITED STATES DEPARTMENT OF AGRICULTURE (USDA) (1995). Memorandum No. 800.85. Avian influenza vaccines. USDA, Veterinary Biologics, Animal and Plant Health Inspection Services. 54. VASFI MARANDI M., BOZORGMEHRI FARD M.H. & HASHEMZADEH M. (2002). Efficacy of inactivated H9N2 avian influenza vaccine against non-highly pathogenic A/chicken/Iran/ZMT-173/1999. Arch. Razi Institute, 53, 23– 32. 55. VILLAREAL-CHAVEZ C. & RIVERA CRUZ E. (2003). An update on avian influenza in Mexico. In: Proceedings of the 5th International Symposium on Avian Influenza. Georgia Center for Continuing Education, University of Georgia, Athens, Georgia, USA, 14–17 April 2002. Avian Dis., 47, 1002–1005. 56. WILKINSON B.E. (1998). Recombinant hemagglutinin subunit vaccine produced in a baculovirus expression vector system. Proceedings of the Fourth International Symposium on Avian Influenza, Athens, Georgia, USA. Swayne D.E. & Slemons R.D., eds. US Animal Health Association, 253–262. 57. WOOD G.W., BANKS J., STRONG I., PARSONS G. & ALEXANDER D.J. (1996). An avian influenza virus of H10 subtype that is highly pathogenic for chickens but lacks multiple basic amino acids at the haemagglutinin cleavage site. Avian Pathol., 25, 799–806. 58. WOOD J.M., KAWAOKA Y., NEWBERRY L.A., BORDWELL E. & WEBSTER R.G. (1985). Standardisation of inactivated H5N2 influenza vaccine and efficacy against lethal A/chicken/Pennsylvania/1370/83 infection. Avian Dis., 29, 867–872. 59. WOOD G.W., MCCAULEY J.W., BASHIRUDDIN J.B. & ALEXANDER D.J. (1993). Deduced amino acid sequences at the haemagglutinin cleavage site of avian influenza A viruses of H5 and H7 subtypes. Arch. Virol., 130, 209– 217. 60. WOOD G.W., PARSONS G. & ALEXANDER D.J. (1995). Replication of influenza A viruses of high and low pathogenicity for chickens at different sites in chickens and ducks following intranasal inoculation. Avian Pathol., 24, 545–551. 61. WORLD HEALTH ORGANIZATION EXPERT COMMITTEE (1980). A revision of the system of nomenclature for influenza viruses: a WHO Memorandum. Bull. WHO, 58, 585–591. 62. WORLD ORGANIZATION FOR ANIMAL HEALTH (OIE) (2005). Chapter 2.7.12 Avian Influenza. In: Terrestrial Animal Health Code, Fourteenth Edition. OIE, Paris, France (In Press). * * * NB : Il existe des Laboratoires de référence de l’OIE pour l’influenza aviaire (se reporter à la liste de la partie 3 de ce Manuel terrestre ou consulter le site internet de l’OIE pour une liste actualisée : www.oie.int). Manuel terrestre de l’OIE 2005 305