UE – 9 - Immunologie JJ. Hoarau
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UE – 9 - Immunologie JJ. Hoarau Date : 22/04/2016 Promo : P2 2015-2016 Plage horaire : 8h30-9h30 Enseignant : JJH Ronéistes : CHUN HUNG KEE Jade GRUSON Kadoline Biothérapies immunologiques – immunothérapies I. Introduction II. Les biothérapies cellulaires immunologiques III. Les biothérapies moléculaires immunologiques 1. Les immunoglobulines intraveineuses (IgIV) A. Compositions des préparations des IgIV B. Les indications thérapeutiques C. Tolérance et risque infectieux D. Mécanismes d'action 2. Sérum anti-lymphocytaire 3. Les anticorps monoclonaux A. Production d'Anticorps monoclonaux : Hybridome B. Sélection des hybridomes sur le milieu HAT C. Isolement des clones D. Les premiers anticorps monoclonaux E. Anticorps monoclonaux thérapeutiques 1 I. Introduction : On va s'intéresser à la biothérapie immunologique (immunothérapie) qui fait appel soit à des thérapies cellulaires (cas des greffes de moelle osseuse), soit à des thérapies moléculaires qui font appel à des anticorps regroupant 3 grandes classes de molécules qui sont les Immunoglobulines Intraveineuses (Ig IV), les sérums anti-lymphocytaires (surtout utilisés en cancérologie) et des Anticorps monoclonaux. II. Biothérapies cellulaires immunologiques Biothérapie cellulaire immunologique = greffe de cellules souches hématopoïétiques (CSH), qui vont être principalement utilisées dans les pathologies comme les déficiences à produire des cellules immunes produisant les anticorps. Elle consiste à réimplanter chez une personne un système immunitaire complet grâce aux cellules souches hématopoïétiques provenant d’une autre personne. Les cellules souches hématopoïétiques vont intervenir dans le cas des différents déficits qui sont liés par exemple au développement de lymphome ou leucémie… ou bien pour remplacer tout simplement le SI qui est défaillant chez l’individu. Rappel : au niveau de la moelle osseuse, les cellules souches hématopoïétique sont présentes au niveau des logettes hématopoïétiques. Au niveau de ces logettes, les cellules hématopoïétiques sont en contact avec les cellules stromales, des cellules adipocytaires, des fibroblastes et des CPA. Ces derniers fournissent les facteurs de croissance orientant la différenciation des CSH. Suite à cette hématopoïèse au sein de la moelle osseuse, il existe des maladies liées au fait qu’un patient ne produit pas certains types cellulaires de l'immunité, entraînant donc une déficience immunitaire grave. 2 But de l’immunothérapie cellulaire = fournir des cellules souches hématopoïétiques à la personne malade pour lui permettre de reconstituer les cellules immunitaires qui étaient déficientes. Cela va passer par des systèmes de greffe. Lorsqu’on greffe des CSH à une personne, on élimine son système immunitaire (par d’irradiation de la moelle osseuse, on détruit ses propres cellules souches et on lui implante de nouvelles cellules souches) Principale utilisation de ces CSH : lors de défauts liés à des phénomènes prolifératifs (lymphomes, leucémies…) Risque lors de l’utilisation de CSH : incompatibilité entre donneur et receveur (rejet du receveur par le greffon) Il y a 2 possibilités pour la greffe de cellule souche : Autogreffe greffe autologue (bonne compatibilité : le patient est donneur + receveur) – Support de CSH du patient lui-même, administré après une chimiothérapie Haute Dose – Nécessaire pour une reconstitution hématologique – Pas de problème de donneur puisque la personne est son propre donneur. – mais indications limitées Ronéo de l’année dernière : cadre très précis : traitement temporaire d'un patient dont on va détruire les cellules souches. Avant de détruire ses cellules souches, on va réaliser au préalable un prélèvement de cellules souches chez ce patient pour la lui réinjecter une fois le traitement terminé. Allogreffe ou greffe allogénique : – Greffon est le traitement (thérapie cellulaire) Dans ce cas, les cellules souches vont venir aider à suppléer la déficience, ce qui veut dire que chez cette personne on va souvent détruire par irradiation la moelle osseuse de cette personne pour pouvoir remplacer son système hématopoïétique à partir de cellules souches hématopoïétiques provenant d'un donneur. – Importance de la Sélection du donneur : Fratrie HLA identique = génoidentique (vrais jumeaux) / ou Famille non HLA identique / ou Donneur non apparenté = phénoidentique – Indications larges – mais risque de Réactions immunologiques : GVH (graft versus host : Réactivité du greffon contre l’hôte) Ronéo de l’année dernière : L'allogreffe peut suppléer à des maladies qui sont d'origines innées ou acquises et permettre de restaurer chez le receveur un système hématopoïétique complet! La problématique dans ce genre de greffe est surtout la possibilité de réaction immunologique le " GBH Greffon contre l'Hôte " le risque dans une greffe normale (exemple greffe de rein), c'est que l'hôte rejette le greffon mais dans le cas d'une greffe de cellule hématopoïétiques, le risque c'est que les cellules vont donner naissance à différents types leucocytaires et ces leucocytes peuvent attaquer l'hôte. Origines des cellules souches hématopoïétiques : La plupart du temps, CSH prélevées à partir de la moelle osseuse ponctionnée au niveau de la crête iliaque. Ce système permet de recueillir par aspiration en général 1 à 1.5L de moelle osseuse. 3 Autre possibilité : à partir du sang périphérique (- invasive, + rapide). Normalement, les cellules souches hématopoïétiques ne quittent pas leurs logettes hématopoïétiques. Donc, pour les faire sortir de la moelle osseuse, cela nécessite une injection d’un traitement particulier, pendant 5 jours chez le donneur: la cytokine G-CSF (un facteur de croissance) Le G-CSF va stimuler les cellules hématopoïétiques au niveau de la moelle osseuse (induction de leur croissance) et ces CSH vont quitter la moelle au bout de 5 jours alors que normalement elles ne le font pas. Elles vont gagner la circulation sanguine. On réalise une simple prise de sang à partir de laquelle on récupère les CSH par cytaphérèse (Procédé́ de séparation d’un ou plusieurs éléments figurés du sang). Cette technique permet de récupérer 300 ml de cellules souches hématopoïétiques en concentration très élevée. Enfin, à partir du sang de cordon : du sang placentaire dans le cordon ombilical récupéré après l'accouchement. Cette technique a l'avantage : - d’être plus facile d’accès banques de sang de cordon - de procurer des cellules immatures bien tolérées par le receveur. Le risque de rejet du receveur par le greffon est diminué. Cependant, ces cellules souches sont strictement réservées pour des greffes pédiatriques (Problème éthique). III. Biothérapies moléculaires immunologiques Elle est utilisée de façon plus classique. Les biothérapies moléculaires immunologiques comprennent l'utilisation de différentes molécules: Les anticorps : - Immunoglobulines IV anticorps polyclonaux - sérum anti-lymphocytaire - anticorps monoclonaux murins, chimériques ou humanisés Les récepteurs et les ligands chimériques Ex : récepteur au TNF. (Peuvent être solubles, cytokines par ex) Inhibiteurs naturels : IL-1 RA (Receptor Antagonist ou Anakinra) qui est antagoniste de l'IL1 (utilisé dans les cas de polyarthrite rhumatoïde) Facteurs de croissance : les interférons alpha et beta et le G-CSF L'immunothérapie comprend uniquement la partie de la biothérapie moléculaire immunologique utilisant les anticorps. Nous allons traiter cette partie dans ce cours. 1. Immunoglobulines Intraveineuses (Ig IV) A. Compositions des préparations d’Ig IV Les IgIV sont des préparations thérapeutiques (=médicaments) d'immunoglobulines G humaines normales obtenues à partir d'un pool de plasma provenant de plus de 1000 individus sains. Ces Ig ont une réactivité contre des agents d’origine infectieuse mais risque de réactivité auto-immune égaement Inconvénient : Demi-vie limitée : 3 à 4 semaines (il faut produire en en permanence des lots d’IgIV) Les IgG qui composent les préparations d'IgIV ont un large spectre de réactivité qui sont dirigées contre des antigènes exogènes (notamment viraux et bactériens), des auto-antigènes (auto-anticorps naturels pouvant se retourner contre les tissus) et des anticorps. Les IgIV peuvent contenir une faible dose d'IgA (on n’arrive pas à avoir que des IgG dans ces pools). Pose problème car risque de choc anaphylactique. 4 B. Les indications thérapeutiques L'efficacité des IgIV a été démontrée ou proposée dans un large éventail de pathologies auto-immunes et/ou inflammatoires systémiques. Il ne commente pas en détail ce tableau, il cite comme indication des IgIV : défaut de production d’Ig, TTT de pathologies auto-immunes, d’inflammations systémiques. Ce qu'il faut retenir : A quoi servent ces IgIV : Traitement substitutif de déficits immunitaires primitifs (génétiques) ou secondaires (acquis) chez des personnes souffrant d’un défaut de production d'Ac (en préventif) Traitement curatif d’infections graves chez des patients immunodéprimés adulte, nouveau-né, prématuré C. Tolérance et risque infectieux des IgIV Tolérance : ► Les IgIV sont en règle générale, bien tolérées (elles ne sont pas injectées de façon régulière) parce que les domaines constants sont très peu variables d'un individu à un autre. ► Certains effets secondaires sévères peuvent survenir, notamment un choc anaphylactique chez des patients déficitaires en IgA ayant des anticorps anti-IgA qui réagissent avec les préparations d'IgIV Risques infectieux : ► Comme tout produit stable dérivé du sang, les IgIV peuvent être responsables de la transmission d'agents infectieux. La sécurité virale des IgIV est assurée à plusieurs étapes de leur préparation par la sélection des donneurs, le fractionnement du plasma et les méthodes d'inactivation virale utilisées (pH acide, traitement par solvant-détergent, pasteurisation) Ronéo de l’année dernière : Question: Comment est ce possible de faire un choc anaphylactique avec des Ig A.? Réponse du prof : quand on a des patients qui n'ont pas la capacité à faire des IgA, lorsqu'on leur injecte une solution Ig IV. On va avoir des complexes immuns qui vont se former entre Ig G et Ig A qui auront la capacité d'activer les cellules du système immunitaire produisant les cytokines. Cette explosion cytokinique va entrainer une activation massive des cellules au niveau du corps et provoquer une dégranulation => choc anaphylactique D. Mécanismes d'action : - Blocage et modulation de l’expression des FcɣR sur les monocytes/macrophages, les lymphocytes B - Modulation du système du complément - Modulation de la synthèse et de la sécrétion des cytokines - Neutralisation est auto-anticorps circulants. 5 2. Sérum anti-lymphocytaire ► ► ► ► ► Sérum polyclonal, comme les solutions d'Ig IV (sauf qu’on ne va pas prélever du plasma chez les humains, mais on fait produire les Ac par des animaux) Produit par le sang du lapin (ou cheval…) mis au contact de lymphocytes humains. Il est utilisé en injection pour lutter contre le rejet lors des greffes. Destruction les lymphocytes T (ou B) chez les patients lymphopénie profonde dès la première injection (activation complément (lorsqu’on a des désordres lymphoprolifératifs) Restauration du SI très lente à l’arrêt (le temps que les LT soient régénérés) permet d’éviter les rejets aigus de greffons. But des sérums anti-lymphocytaires : faire produire à un animal des Ac dirigés contre des Lymphocytes humains. On va injecter des lymphocytes T humains à des lapins et ces lymphocytes vont être considérés comme étrangers au SI des lapins. Ces lapins vont développer des sérums polyclonaux et produire des Ac anti-LT, anti-LB (humains). Ils vont réagir vis a vis de ces lymphocytes comme s’ils réagissaient à n’importe quel agent infectieux d’où la production d’anticorps. Cette réponse Ac est une réponse polyclonale. Ces Ac d’origine animale, on peut les injecter à un humain et cela va provoquer une lymphopénie profonde (dès la première injection). Ces Ac se fixant de façon passive sur les lymphocytes T vont les suractiver et vont aussi activer les mécanismes de complément, donc les LT vont mourir soit par apoptose, soit par nécrose. Le système immunitaire du patient va se restaurer de facon lente. Question 2016 : Le but est donc d’affaiblir momentanément le SI ? OUI, afin d’éviter la présentation antigénique et la réactivité du SI. Le problème dans ce système réside dans le fait qu'il nous faudra faire plusieur injections, du coup le patient va commencer à produire des anticorps anti-Ig lapin. Ce qui limite le nombre d'injection, et aussi avant chaque injection, il faudra verifier que le patient n'a pas d'anticorps anti-Ig lapin (risque de choc anaphylactique). 2013-2014 : Question élèves : ça veut dire qu'un Ac peut être considéré comme Ag.? Réponse: Oui, comme je le disais au tout début, si entre nous on s'injectait des Ig d'origine humaine, elles sont très semblables aux notres donc ça va être très difficile pou nous de diriger des Ac contre les anticorps de quelqu'un d'autre par contre entre espèce animales, les différences sont beaucoup plus imporantes donc si je vous injectes des anticorps de lapin, la première fois ça passera généralement très bien mais si je vous laisse developper des Ac anti-lapin et que je vous donne encore des Ac de lapin, là vous risquez de faire un choc anaphylactique. Donc elle a une utilisation très ciblé!!!! Questions élèves: Quand vous injectez du sérum anti-lymphocytaire à un patient, ça diminue très fortement son immunité ça.? Oui. Questions élèves: Donc il sera vraiment très à risque dans ce cas là.? Alors il est très à risque donc généralement le patient est mis en chambre stérile et ça a même d'autre effets méfaste comme la réactivation des virus EBV qui peuvent provoquer des leucémies. Questions élèves : ça veut que tout les maladies opportunistes peuvent lui arriver.? oui mais il faut savoir aussi que votre immunité innée est toujours présente mais c'est juste votre immunité adaptative qui est affaibli. 6 Lors d’une réaction humorale classique, le déterminant antigénique possède à sa surface un ensemble d’épitopes. Différents Ac sont dirigés contre différents épitotes : la réponse humorale classique « normale » est une réponse polyclonale (les 2 cas précédents). Nous allons voire à présent les : 3. Les anticorps monoclonaux Les anticorps monoclonaux sont des anticorps produits par un clone unique de lymphocytes B. L'avantage des Ac monoclonaux est qu’ils sont mono spécifiques : ils reconnaissent un type unique de site antigénique (permet de cibler un seul épitope particulier), ils sont homogènes contrairement aux anticorps polyclonaux (Ig IV ou serum anti-lymphocytaire). Situation polyclonale : les déterminants antigéniques vont être reconnus par le SI et les plasmocytes produisent alors différents Ac. Situation monoclonale : un seul clone produit 1 type d’Ac. A. Production d'Anticorps monoclonaux : Hybridome Comment obtenir des Ac monoclonaux ? 2 possiblités : 1) Injection d’1 seul détermniant antigénique pour avoir une réaction monoclonale. Le SI n’aura qu’un seul épitope à reconnaître MAIS c’est très difficile à obtenir. Cette possiblité est donc rare. 2) A partir d’une situation polyclonale (= LA situation classique). Selection d’un seul clone produisant 1 seul type d’Ac, parmi les LB produisant différents Ac. Cette possiblité est la plus fréquente. Classiquement, quand quelqu'un fait une réaction immunitaire, c'est toujours un sérum polyclonal. Donc une réaction immunitaire normale est toujours polyclonale!! Quand on veut avoir des Ac monoclonaux, on cherche à avoir des anticorps qui soient tous dirigés contre un même épitope d'un antigène c'est à dire une seule espèce d'anticorps (le corps ne le fait pas naturellement). Immuniation d’une souris par injection d’un Ag portant différents épitopes. Le SI produit différents clones de plasmocytes, différentes Ig ayant différentes immunoréactivités. 7 Puis, recueil des organes lymphoïdes secondaires (chez la souris = la rate). On y récupère différents clones de LB dirigés contre chaque épitope. On récupère donc un mélange de différentes cellules plasmocytaires. Si on les laisse ensemble : produisent un antisérum dirigé contre l’Ag. Quand on veut des Anticorps monoclonaux, sur ces schémas, on voudrait par exemple isoler essentiellement un clone tel que le clone B2 où tous ces clones produisent le même anticorps dirigés contre un seul épitope. Malheureusement la nature ne le fait pas tout seul donc produire des Ac monoclonaux est une pratique qui nécessite d'isoler ces clones individuellement pour avoir des préparations d'Ac qui sont spécifiques. Comment obtient-on des Ac monoclonaux à partir de ce pool de plasmocytes ? La technique de référence : KHOLER ET MILSTEIN (1975) - Immunisation d’une souris avec un Ag possédant plusieurs épitopes induisant une réponse polyclonale - Obtention des différents LB producteurs d’Ac. MAIS problème : ces LB ont une durée de vie limitée. - Les cellules de myélome (lignée de cellules B tumorales) sont capables de se répliquer à l’infini mais ne produisent pas d’Ac. - Fusion de ces LB naturels avec les cellules de myélome (lignée maligne de LB) immortelles. - Formation d’un hybridome = cellules multi nucléées ayant 2 propriétés : immortalité et capacité de produire des Ac. [Un hybridome est une cellule qui provient de l’hybridation entre des cellules lymphoïdes normales de mammifères et des cellules myélomateuses de tumeurs malignes du système immunitaire. L’intérêt est de cumuler les propriétés des deux cellules de départ : production spécifique d’anticorps pour le lymphocyte et immortalité pour la cellule cancéreuse. Les hybridomes donnent des lignées immortalisées stables productrices d’anticorps.] - Sélection de la souche de myélome de façon particulière - Fusion membranaire grâce au PEG (polyéthylène-glycol). - On veut obtenir les hybridomes uniquement (fusion LB-myélome) - MAIS problème : le LB ne fusionne pas uniquement avec la cellules de myélome. Un LB peut fusionner avec un autre LB (production d’Ac différents, ce n’est pas monoclonal), et une cellule de myélome avec une autre. - Il faut donc trier ces cellules fusionnées. Les hybrides LB-LB : ont heureusement une durée de vie limitée. On va utiliser cette propiété pour les éliminer : on attend qu’elles meurent. - Les cellules somatiques fusionnées entre myélome et myélome sont immortelles, mais ne produisent pas d’Ac. Elles sont déficientes dans un gène : le gène HGPRT (Hypoxanthine Guanine Phospho Ribosyl Transférase). Elles sont HGPRT – (alors que les hybridomes sont HGPRT +) HGPRT intervient dans la voie de sauvetage des Acides nucléiques. (2 voies pour la synthèse des acides nucléiques : voie de novo (normale) et de sauvetage (supplée la voie de novo lorsque celle-ci est bloquée)). Pour cela on spécifie encore plus les myélomes utilisés, on utilisera des myélomes HGRPT – (Hypoxanthine Guanine PhosphoRibosyl Transférase) ce qui nous permettra de sélectionner les hybridomes sur le milieu HAT (hypoxanthine aminopterine thymidine) 8 B. Sélection des hybridomes sur le milieu HAT: - La voie de sauvetage utilise l’hypoxanthine et la thymidine comme précurseurs des bases puriques. L’aminoptérine : bloque la voie classique En milieu HAT (Hypoxanthine, Aminoptérine, Thymidine) : on force les cellules à utiliser la voie de sauvetage. Seules les cellules capable d’utilise l’hypoxanthine et la thymidine (HGPRT +) vont croître. Les autres (HGPRT -) mourront les myélomes qui ont fusionné avec un myélome mourront. Cette voie est appelée voie de sauvetage car c'est une voie qui est activé quand le milieu ne contient pas les acides aminées ou sucres nécessaires pour la synthèse normale de ses nucléotides puriques et pyrimidiques. (voie de novo). Finalement seuls les hybridomes ont la capacité de se multiplier sur ce milieu HAT puisque: les hybrides somatiques MM sont HGPRT - et les hybrides somatiques BB ont une durée de vie limitée (1 à 2semaines) ! C. Isolement des clones Elle se fait par "dilution limite" des hybridomes sur des microplaques. A partir du pool de lymphocytes, on réalise des dilutions successives (d’un facteur 2 : ½ puis ¼ puis 1/8e …) de façon a ce qu’il ne reste qu’1 clone dans un puits (1 seule cellule d’hybridome par puits). Cette dilution nécessite environ 5 plaques successives. Enfin, on réalise un criblage sur les puits par un test Elisa avec le surnageant (teste la réactivité du surnageant dans lequel les Ac ont été produits, vis à vis de l’Ag contre lequel la souris a été immunisée au début). 9 Si le test ELISA détecte la présence de l’Ag : on a bien un hybridome qui produit un unique exemplaire d’Ac monospécifique vis à vis de l’Ag. A la fin on obtient donc un clone d'hybridome synthétisant un type d'anticorps monoclonal. Possibilité de produire ce clone en grande quantité par des bioréacteurs. D. Les premiers anticorps monoclonaux 3 principaux modes d’action des Ac monoclonaux : - Blocage de l’action de molécules ou de récepteurs spécifiques (comme les IgIV) - Cible des cellules spécifiques : opsonisation ou activation - Fonction de molécule de signalisation A quoi servent ces Ac monoclonaux ? En transplantation pour diminuer la réactivité et risque de rejet en phase aigue (comme les sérums antilymphocytaires). On utilise les Ac anti-CD3 ou CD25. Trois Ac dirigés contre le CD3 et le CD25 sont utilisé pour supprimer la réponse immune après transplantation. L’effet obtenu permet d’éviter le rejet de greffe en induisant une tolérance aux organes transplantés. Ces anticorps monoclonaux sont administrés en complément de produits immunosuppresseurs telles que la cyclosporine et les corticoïdes. C’est un traitement immuno-suppressif qui va pouvoir se répéter. Néanmoins, il faut vérifier que le patient ne developpe pas d’Ac anti-murins pour eviter un choc anaphylactique chez le patient. Les Ac anti-CD3 : inactivent les LT. Les Ac anti-CD25 : inactivent les LB Premiers anticorps monoclonal autorisé chez l’homme : anticorps monoclonaux anti-CD3. (1986) =MUROMOMAB-CD3 (nom de référence) (le prof dit muromonab aussi) ou ORTHOCLONE OKT3 (nom commercial) : Indication : dans le traitement de l'allogreffe rénale, hépatique ou cardiaque. La puissance immunosuppressive de ce traitement est responsable d’une augmentation de l’incidence des complications virales chez les patients, dont l’infection à cytomégalovirus (CMV) et surtout de celles des désordres lymphoprolifératifs EBV (Epstein Barr Virus) induits. (Développement de mononucléoses) 10 a) Cible de l'anticorps monoclonal Muromomab-CD3 : Muromomab-CD3 = anticorps monoclonal murin dirigé contre l’antigène CD3 des LT humains Le récepteur CD3 est couplé au TCR. La liaison de cet anticorps anti-CD3 entraîne une activation de la cellule LT production de CK. Apres cette fixation au récepteur, l’ensemble des récepteurs TCR seront internalisés et disparaissent de la surface de la cellule. b) Mode de fonctionnement du Muromomab-CD3 /OKT3: - - Après injection, Muromomab reste dans la circulation pour une durée courte (demi vie = 10h) il agit rapidement (20 à 60 min), entraîne une disparition du complexe CD3/TCR de la surface des LT donc tous les lymphocytes T vont devenir CD3- pendant 72h modulation CD3/TCR empêche les LT d'interagir avec les CPA ce qui permet d’éviter le rejet des Ac du greffon. Si l'arrêt du traitement ou immunisation : il y a réapparition des CD3+ donc nécessité de combinaison avec d'autres immunosuppresseurs. Dosage des Anticorps anti-OKT3 en ELISA au 10ème jour. Là aussi le patient peut développer des Ac anti-murins (car OKT3 est d'origine murine). Donc nécessité de doser à partir du 10ème jour des anticorps anti-antiOKT3 pour voir si on peut continuer le traitement. Quand les Ac anti-OKT3 apparaissent arrêt des injections d’anticorps monoclonaux OKT3. c) Effets secondaires du Muromomab-CD3 - Fièvre, frisson, tremblements, diarrhée, vomissements sont fréquents à la première injection. - Liés à l’activation des lymphocytes T et libération de cytokines. - Prévenus par corticoïdes (anti-inflammatoires) - Fréquence accrue des infections à CMV, EBV et herpès après 1 à 3 mois. E. Anticorps monoclonaux thérapeutiques Les premiers anticorps venaient de souris. Utilisation thérapeutique des ACm (Ac monoclonaux) : Problème de l’utilisation chez l’homme : risque de développer des Ac anti-murins. Il faut donc réduire l’immunogénicité des ACm. Rapidement, l’homme va montrer une réponse immune contre ces anticorps avec 2 types de conséquences : 1) L'élimination des AC monoclonaux bloque l'effet thérapeutique: Réponse "HAMA" (Human Anti Mouse Antibody)= anticorps anti-murin observé chez 50% de patients. 2) Le développement de réactions allergiques: choc anaphylactique observé chez 10% de patients. Ce n’est pas l'idéal d'utiliser des anticorps monoclonaux murins chez l'humain. 11 Ce qui a amené à développer de nouveaux AC monoclonaux, le but étant d’humaniser les AC monoclonaux pour les injecter à des humains et finalement avoir le moins d'effets secondaires possible. Ingénierie des AC monoclonaux : réduire l’immunogénicité des ACm o AC chimérique : des régions variables d'origine murine sont fusionnées à des régions constantes humaines, impliqués dans la reconnaissance des déterminants antigéniques d’origine murine. Ce sont des anticorps anti-humains et anti-souris. Réduit l’immunogénicité (conservation de 30% de la séquence Ac d’origine murique). Ceci limite énormément la réactivité du receveur vis-à-vis de ses Ig. Les anticorps chimériques sont issus de technique de biologie moléculaire, Le but est de conserver tout ce qui est responsable de la spécificité de l'anticorps, c'est à dire toutes les régions variables des chaînes lourdes et légères et ensuite faire fusionner les régions variables avec les régions constantes des Ig humain (surtout IgG) pour obtenir des anticorps chimériques. o AC humanisés : la spécificité de reconnaissance et d'interaction avec l'Ag dépend des régions CDRs. Le clonage des séquences codant pour des CDRs de souris permet de générer une immunoglobuline de fusion sur un fond humain. Les régions CDRs étant des régions hypervariables. L’Ac conserve de 10% de la séquence d’origine murique. Modification de génome de souris qu’elles produisent des Ac d’origines humaines, mais ne conservant que les régions variables impliquées dans la reconnaissance spécifique de l’Ag = régions CDR. On essaye d'aller plus loin dans la formation d'anticorps, en ne conservant que les régions hypervariables, responsables de la haute spécificité de la liaison à la cible, c'est ce qu'on appelle CDR. Ensuite, on fait fusionner les régions variables (contenant les régions hypervariables) avec les régions constantes des IgG humaine. o AC humain par des souris transgéniques : des souris déficientes pour les gènes des Ig sont rendues transgéniques pour des Ig humaines (YAC : yeast artificial chromosome). Les LB de ces souris expriment un BCR (Récepteur des cellules B) humain et permettent de développer des ACm humains reconnaissant des épitopes humains (peu de tolérance). 0% de la séquence est d’origine murique (pas de CDR murin) C’est la technologie ultime : on inactive le SI responsable de la production des Ig (souris déficientes pour les gènes qui codent pour leur propre Ig). On transforme ces Ig en leur ajoutant un chromosome artificiel de levure (qui contient le gène codant pour les Ig humaines) produit des Ig humaines. On injecte un Ag à ces souris ces souris transgéniques produisent des Ac humains ! (dirigés contre des épitopes humains). 12 AC monoclonaux thérapeutiques : classification Dénominations : les suffixes Anticorps monoclonaux Murins : Portent le suffixe : - MOMAB (MOuse Monoclonal AntiBody) (Ac monoclonaux produits directement par la souris). Ex : OKT3 (Muromomab) = anti-CD3 Les Anticorps chimériques : Portent le suffixe - XIMAB: (Il y a 2 cas d’Anticorps chimériques) Un anti TFN-α qui est infliximab (nom commercial Rémicade) Un anti CD20 qui est le rétuximab (nom commercial Maptéra) Les Anticorps humanisés : Portent le suffixe –UMAB. Et plus particulièrement : - ZUMAB: Ac humanisé (partie CDR murin) - MUMAB: Ac humain d'origine souris transgénique (100% humanisé, pas de CDR murin) L'anticorps TNFα est présent à la fois dans la classe des Ac chimérique et à la fois dans celle des humanisés. Anti CD20 (RITUXIMAB ou nom commercial MabthéraTM) Le CD20 est un marqueur retrouvé chez les lymphocytes B Fonction de l’anti-CD20: - Activation des LyB - Lie le CD20 qui a une Homologie structurale avec des canaux calciques - Influence probable sur les flux calciques Cytotoxicité complément dépendante : ● Inhérente à la nature du fragment Fc (IgG1) ● Par l'intermédiaire de la voie classique ● Régulée par des protéines membranaires inhibitrices du complément L'anti-CD20 est donc un -XIMAB: on a conservé les régions variables murines et tout le reste est d'origine humaine. 13 Schéma: ce que l'on conserve généralement au niveau de la région humaine, ce sont des immunoglobulines de type G1. L'anti-CD20 est un Ac chimérique issu de la fusion de région variable des 2 types de chaînes avec la région constante des Ig humaine notamment IgG C'est donc un -XIMAB : on a conservé les régions variables murines et tout le reste est d'origine humaine. Le fonctionnement de cet anticorps anti-CD20 il est bizarre puisqu’ initialement on pensait induire la mort des LyB par le fait que lorsque l'anticorps va se fixer au niveau des boucles externes qui constituent le récepteur CD20, en fait on va tout simplement faire agir l'anticorps via sa région Fc pour activer la voie classique du complément pour entraîner la formation de complexe membranaire pour entraîner la lyse osmotique des LyB. C'était en surestimant les capacités des cellules à réguler cette voie classique via les facteurs d'inhibition du complément. Ce mécanisme ne marque donc pas, et pourtant on voyait néanmoins les LyB mourir. Ac anti-CD20 lie le Récepteur CD20 : induit un signal intracellulaire On pensait que l’Anti-CD20 activait les LB et le système du complément pour éliminer les LB. Mais cette théorie est fausse : Lorsque l’Ac lie le récepteur, cela entraine la formation de radeau lipidique (agrégation de ces récepteurs à la surface de la cellule). Ces radeaux lipidiques induisent l’apoptose. Les LB vont donc mourir, mais pas par l’action du complément. Apoptose : ● Fixation au niveau de la grande boucle externe ● In vitro provoque l'apoptose des cellules sans intervention du complément ou d'autres cellules. La fixation entraîne le recrutement du CD20 dans les microdomaines apoptose. On induit la mort des LyB non pas par action du complément mais par l'apoptose. 14 Ronéo de l’année dernière : L'anti-CD20 va venir se fixer sur le CD20 et entraîner une cascade d'activation qui a pour finalité la formation d'un complexe d'attaque membranaire (MAC) et entraîne une destruction des lymphocytes B. Dans ce schéma, lorsque l'anti-CD20 se lie au CD20 cela entraîne une signalisation intracellulaire, notamment l'activation des lymphocytes B, à la surface des lymphocytes B se forment des radeaux lipidiques (agrégation de récepteurs à la surface de la cellule), c'est le fait que les récepteurs du CD20 s'assemblent à l'intérieur de structures lipidiques membranaires et à ce niveau là des activateur de l’apoptose vont se mettre en place et les lymphocytes B vont mourir par apoptose sans que le complément intervienne. En fait, ce n'est pas le complexe d'attaque membranaire via les facteurs du complément qui entraîne la lyse du lymphocyte B, c'est le phénomène Apoptose qui entraîne la mort des lymphocytes B. Généralement lorsqu'on utilise des anticorps pour agir sur des récepteurs, la réponse de la signalisation sera un effet bloquant du récepteur. Cela entraîne l'activation de la voie classique du complément qui aboutira à la formation d'un complexe d'attaque membranaire. Mais dans le cas d’anti-CD20 son action sur les récepteurs CD20 a plutôt un effet activateur du récepteur et permet le déclenchement de l'apoptose. Question d'élève: Dans votre cours vous avez précisez que le complexe d'attaque membranaire via le facteur C9 provoque la formation de pore au niveau de la membrane et entraîne la lyse de la cellule. Donc est ce que le complexe d'attaque membranaire ne participerait pas à la mort du lymphocyte B ? Réponse du prof: Le complexe d'attaque membranaire agit effectivement de cette façon. Mais dans le cas des lymphocytes B, on se rend compte que la cellule ne meurt pas par le complexe d'attaque membranaire mais bien par apoptose. Car lors du contact Anti-CD20/CD20, avant même d'activé le système du complément il lance une signalisation cellulaire et permet la formation de radeaux lipidique à la surface de lymphocyte B, ce qui permet d'activer l'apoptose. Sans même avoir recours au complément le lymphocyte B meurt. Question d'élève: Le mode d'action du complexe d'attaque membranaire repose bien sur l'action du facteur complément C9 avec la formation de pores au niveau membranaire ? Réponse du prof: Oui tout à fait, mais ici dans le cas du lymphocyte B, la mort sera induite par Apoptose car la voie du complément sera court-circuitée par un autre système qui est la voie de l'apoptose. Indications dans l'utilisation des anticorps Anti-CD20 : Polyarthrites rhumatoïdes Lupus érythémateux systémique Neuropathies périphériques avec anticorps anti-myéline Thrombopénies auto-immunes Anémies hémolytiques Purpura Thrombotique Thrombocytopénique Hémophilie acquise par anti-facteur VIII Lymphoprolifération EBV+ Lymphomes L'utilisation des Ac anti-CD20 permet une élimination sélective des lymphocytes B. 15
