ANALYSE FONCTIONNELLE D’UN VARIANT D’ÉPISSAGE DE FANCL CONTENANT UNE EXLUSION DE L’EXON 4 SUR LA RÉPARATION DE L’ADN DANS LA VOIE FANC-BRCA Mémoire Christopher St-Laurent Pedneault Maîtrise en Physiologie Endocrinologie Maître ès Sciences (M.Sc.) Québec, Canada © Christopher St-Laurent Pedneault, 2013 RÉSUMÉ L’anémie de Fanconi (FA) est une maladie congénitale rare résultant d’une mutation sur chaque allèle parental d’un gène FANC. Nous avons récemment identifié un variant d'épissage de FANCL contenant une exclusion de l'exon 4. Une analyse par minigène nous a permis de démontrer que le polymorphisme de séquence (SNP) rs7958831 augmente substantiellement le saut de l'exon 4 de FANCL, et que les porteurs de ce SNP ont une quantité significativement plus élevée de transcrits FANCL∆4. L'étude de fractions ribosomales nous a permis de confirmer que le transcrit alternatif est bel et bien traduit en protéine. Toutefois, une protéine de fusion FANCL∆4-GFP ne migre pas au noyau comme le fait FANCLwt-GFP. L'isoforme FANCL∆4 n'est pas en mesure d'accomplir la fonction principale de FANCL, soit de monoubiquitiner FANCD2. De plus, des cellules EUFA868 déficientes en FANCL complémentées avec FANCL∆4 ne retrouvent pas leur phénotype normal en test de survie et ont une proportion plus importante bloquée en phase G2/M. Ces résultats nous permettent de penser que le SNP rs7958831 pourrait moduler le risque de cancer du sein puisque l'isoforme FANCL∆4 ne semble pas fonctionnelle. iii iv TABLE DES MATIÈRES RÉSUMÉ .......................................................................................................................................... iii TABLE DES MATIÈRES................................................................................................................. v LISTE DES TABLEAUX............................................................................................................... vii LISTE DES FIGURES ..................................................................................................................... ix LISTE DES ABRÉVIATIONS ........................................................................................................ xi REMERCIEMENTS ....................................................................................................................... xv AVANT-PROPOS ....................................................................................................................... xvii CONTRIBUTION ........................................................................................................................ xvii 1 INTRODUCTION ......................................................................................................................... 1 1.1 Cancer .................................................................................................................................................. 1 1.1.1 Le cancer au Canada ................................................................................................................................ 1 1.1.2 Prédispositions génétiques au cancer.............................................................................................. 1 1.1.3 Épissage alternatif et cancer ................................................................................................................ 3 1.2 Réparation de l’ADN ....................................................................................................................... 5 1.2.1 Réparation directe.................................................................................................................................... 5 1.2.2 Réparation par excision de base......................................................................................................... 6 1.2.3 Réparation par excision de nucléotides .......................................................................................... 7 1.2.4 Réparation par jonction des bouts non-homologues................................................................. 7 1.2.5 La recombinaison homologue ............................................................................................................. 7 1.3 Anémie de Fanconi .......................................................................................................................... 9 1.3.1 Manifestations cliniques ..................................................................................................................... 12 1.3.2 Syndromes reliés ................................................................................................................................... 13 1.3.3 La voie FANC-BRCA............................................................................................................................... 14 1.3.4 Groupe 1: Le complexe cœur ............................................................................................................ 15 1.4 FANCL ................................................................................................................................................. 24 1.4.1 Les cas connus de FANCL ................................................................................................................... 27 1.4.2 Les études d’association sur FANCL .............................................................................................. 28 1.4.3 Les orthologues de FANCL ................................................................................................................. 32 1.4.4 Les trois domaines de FANCL ........................................................................................................... 34 1.4.5 L'ubiquitination ...................................................................................................................................... 39 1.5 Problématique ................................................................................................................................ 47 1.5.1 L’exemple du cancer du sein ............................................................................................................. 47 1.5.2 Gène à l'étude: FANCL .......................................................................................................................... 47 1.5.3 Objectif général de l’étude: le variant d'épissage FANCL∆4 ................................................ 48 1.5.4 Objectifs spécifiques de l'étude........................................................................................................ 48 CHAPITRE 1 ................................................................................................................................. 49 Abbreviations......................................................................................................................................... 52 Introduction............................................................................................................................................ 53 Material and methods ......................................................................................................................... 55 v Results....................................................................................................................................................... 61 Discussion ................................................................................................................................................ 66 Conclusion ............................................................................................................................................... 69 Acknowledgements .............................................................................................................................. 71 References ............................................................................................................................................... 72 Legends to Figures ................................................................................................................................ 80 DISCUSSION ET PERSPECTIVES............................................................................................. 95 BIBLIOGRAPHIE ......................................................................................................................... 98 vi LISTE DES TABLEAUX INTRODUCTION Tableau 1: Les gènes Fanconi et gènes associés et leur produit......................................... 12 en protéines ainsi que la proportion des patients associée avec chaque gène Tableau 2: Variations de séquences détectées lors d'études d'association portant............. 31 sur le cancer du sein, de l'œsophage et de l'anémie de Fanconi Tableau 3: Taux de conservation de la protéine FANCL chez les différentes................... 47 espèces en comparaison avec la protéine humaine à partir d'alignements réalisés sur le site ensembl©, version 62 CHAPITRE 1 Table 1: Sequence variations in FANCL gene and genotype frequencies in familial......... 84 breast cancer cases and controls (rs79588315) Table 2: In silico analysis of FANCL genomic regions and variants potentially ............... 85 involved in the expression of FANCL∆4 spliced transcript Supplemental Table 1A: List of oligonucleotides used for FANCL exonic.......................95 amplification and sequencing. Supplemental Table 1B: List of oligonucleotides used for FANCL mRNA..................... 95 quantification. Supplemental Table 1C: List of oligonucleotides used for FANCL minigene.................. 95 constructs. vii viii LISTE DES FIGURES INTRODUCTION Figure 1 : Réparation d’une guanine méthylée par la........................................................... 6 O6-méthylguanine-ADN-méthyltransférase. Figure 2: Réparation de bris double brin de l'ADN par recombinaison................................ 9 Figure 3: L'interaction directe entre FANCB et FANCL.................................................... 19 Figure 4: Séquence sauvage de FANCL............................................................................. 27 Figure 5: Structure secondaire des trois domaines de la protéine FANCL......................... 36 de la drosophile. Figure 6: L'arrangement typique d'un domaine RING........................................................ 43 CHAPITRE 1 Figure 1: FANCL interaction domains, FANCL splicing and mRNA expression.............. 87 Figure 2: Minigene assay.................................................................................................... 88 Figure 3: Expression of FANCL∆4 and FANCL isoforms in BRCAX cell lines.............. 90 Figure 4: Polysome analysis of FANCL∆4 mRNA............................................................ 91 Figure 5: Monoubiquitination assays.................................................................................. 92 Figure 6. Survival assay and cell cycle profiles.................................................................. 93 Figure 7: Cellular localization............................................................................................. 94 Supplemental Figure 1: Survival assay............................................................................. 96 ix x LISTE DES ABRÉVIATIONS ADN Acide DésoxyriboNucléique ADN-PKcs sous-unités catalytiques de Protéines Kinase dépendant de l'ADN FA Anémie de Fanconi AML Leucémie Myéloïde Aigue AMP Acide Monophosphate AP Site Abasique sur l'ADN ARN Acide RiboNucléique ATM Ataxia-Telangiectasia Mediated BER Réparation par Excision de Base BLM Syndrome de BLooM BRCA BReast CAncer, early onset BRIP1 BRCA1-Interacting Protein 1 DEP DiEpoxyButane ELF E2-Like-Fold ERCC* Excision Repair Cross-Complementing rodent repair deficiency, complementation group* FA-* Groupe de complémentation Fanconi * FAAP* FAnconi-Associated Protein* FANC* Gène de l'anémie de FANConi groupe* FANCL∆4 FANCL avec exclusion de l'exon 4 FEN1 Flap structure-specific ENdonucléase 1 GCD Germ Cell-Deficient GFP Green Fluorescent Protein GWAS Genome Wide Association Study HECT Homologous to the E6-AP Carboxyl Terminus HR Recombinaison Homologue LIG3 Ligase 3 MDS Syndrome MyéloDysplasique MHF1 FANCM-interacting Histone Fold protein 1 MHF2 FANCM-interacting Histone Fold protein 2 xi MMC MitoMycine C MRN Complexe Mre11/Nbs1/ Rad50 NER Réparation par Excision de Nucléotide NF1 NeuroFibromatose de type 1 NHEJ Jonction des Bouts Non-Homologues NLS Signal de Localisation Nucléaire xii NMD Dégradation des ARNm non-sens PALB2 Partner and localizer of BRCA2 PCNA Proliferating Cell Nuclear Antigen PHF9 PHD Finger protein 9 PHD Domaine Homéotique de Plante POG Proliferation Of Germ cells POL POLymérase PTEN Phosphatase and TENsin homolog RAD51C Radiation sensitivity abnormal 51C RFC Human Replication Factor RING Really Interesting New Gene RPA Replication Protein A siRNA Petit ARN interférant SNP Single Nucleotide Polymorphism STK11 Serine/Threonine Kinase 11 TFIIH Transcription factor II Human TP53 Tumor protein p53 TPR Répétition TétratricoPeptide UBC Domaine de Conjugaison d'UBiquitine URD Domaine RWD de conjugaison d'Ubiquitine VPH Virus du Papillome Humain XPA Xeroderma Pigmentosum, complementation group A XPC Xeroderma Pigmentosum, complementation group C À mon père, un modèle exceptionnel que je ne pourrai jamais remercier assez. xiii xiv REMERCIEMENTS Tout d'abord, je souhaite adresser mes remerciements les plus sincères à Dre Francine Durocher qui, suite à un stage de technique en biologie de 3 semaines, m'a fait confiance et m'a gardé dans son équipe par la suite pour toute la durée de mon baccalauréat. Merci de m'avoir fourni un horaire aussi conciliant et merci d'avoir cru en moi pour l'obtention des bourses des IRSC et du FRSQ qui me rendent si fier aujourd'hui. Merci de m'avoir permis de participer à tous ces réunions et congrès qui sont des souvenirs que je chéris et que je n'oublierai jamais. Finalement, merci de m'avoir appris à dépasser mes limites, à pousser toujours plus loin pour réaliser ce qui à mes yeux semblait impossible. Je crois maintenant être une personne beaucoup plus compétente, autant sur le plan personnel que professionnel. J'oublie un remerciement que je dois transmettre à Dre Durocher: celui de m'avoir fourni des collègues de travail aussi formidables. Commençons par mon éternel copain et coéquipier de maîtrise Simon Bélanger. Amis avant et après la maîtrise, nous formions une telle équipe d'inséparables que si par malheur je me présentais dans un lieu sans lui, on me demandait: «Mais où est Simon? Qu'est-ce qui se passe?». Nous avons traversé tous les moments difficiles ensemble et c'est ton immanquable bonne humeur qui me permettait de continuer à tous les jours. Grâce à ton ardeur et ta volonté d'apprendre, nous avons essayé des expériences en laboratoire que je m'émerveille encore aujourd'hui de voir fonctionner. Je bénis encore le jour où tu m'as demandé «Christopher, est-ce que tu penses qu'il y aurait de la place dans ton équipe au CHUL?». Sans toi, rien n'aurait été possible et je ne pense pas retrouver un aussi bon partenaire de travail un jour. Merci pour tout. Je ne saurais laisser sous le silence la contribution de Dre Karine Plourde à nos travaux en laboratoire, mais aussi à nos mauvais coups! Toujours prête à rigoler, tu ne t'es laissé démonter par la quantité incommensurable de travail que nous t'imposions avec toutes nos questions, entre autres. Tu nous as tant appris et je dois avouer que je ne saurai jamais rivaliser avec tes aptitudes techniques en laboratoire! Je souhaite également remercier du plus profond de mon cœur le Dr Frédéric Guénard, qui m'a pris sous son aile lors de mes premiers balbutiements au laboratoire. Tu as toujours pris le temps de tout m'expliquer et tu as été très patient avec moi. Tu m'as vraiment montré comment tout fonctionnait dans le xv laboratoire. C'est grâce à toi que je suis rendu à ce point aujourd'hui. Ta rigueur au travail m'a toujours beaucoup inspiré. Un gros merci au Dr Yvan Labrie. Tu as été un véritable baromètre pour moi. Tu m'as permis de m'ajuster lorsque c'était nécessaire et aussi de me sentir extrêmement fier lorsque je réalisais des bons coups en laboratoire. J'ai un respect énorme pour ton niveau d'expertise et ta maîtrise de la science. Je veux aussi remercier Geneviève Ouellette. Tu m'as tant fait rire avec toutes les histoires que tu nous racontais et les CDs que tu apportais au laboratoire. Cette équipe n'est pas complète sans toi. Merci aussi à Nadhir Lithim. Te faire découvrir Québec a été un plaisir et je me souviendrai de nos longues discussions! Je souhaite également remercier Dre Sylvie Desjardins, que j'ai côtoyée dans l'équipe Durocher à mes premières années au centre de recherche et à la plateforme de séquençage ensuite. Ta présence au laboratoire a toujours été rassurante pour moi et j'ai toujours pu compter sur toi quand j'avais besoin de conseils. J'en profite par le fait même pour remercier tous les membres de la plateforme de séquençage, dont Anne et Annie-Claude qui savent toujours mettre de l'entrain dans nos journées. Je tiens aussi à remercier Charles Joly Beauparlant, ancien membre de l'équipe Durocher, qui m'a intégré à l'équipe comme si j'y étais depuis des années. Je ne pourrais oublier la contribution de mes bons amis Jean-Michel Lévesque et Louis Marois, qui m'ont enseigné comment faire des immunoprécipitations et Jimmy Savard-Lalancette, qui m'a montré comment réaliser des qRT-PCR. Apprendre avec vous trois a été un réel plaisir. Merci aussi à tous les stagiaires qui ont permis de confirmer cette volonté que j'avais en moi de devenir professeur de Cégep. Merci à Fréderic Bouffard, Charles-Étienne Bénard, Yann Moreau, Geneviève St-Pierre et Noémie Roux-Dubois. Je veux aussi remercier tous les autres étudiants du 3e étage du bloc T, soit les équipes des Dr Gobeil, Dr Barbier, Dr Simard, Dre Guillemette et Dr Labrie, avec qui nous formions une seule grande équipe. Enfin, merci à tous nos collaborateurs qui ont rendu ce projet possible: Dr Amélie Rodrigue et Dr Jean-Yves Masson (équipe Dr Masson), Dr Marc Morisset (équipe Dre Di Paolo), Pierre Cordeau (équipe Dre Kriz) et Nathalie Paquet. Finalement, merci à toute ma famille et mes amis qui se sont toujours intéressés à ce que je faisais. xvi AVANT-PROPOS Ce mémoire est présenté avec insertion d'article. L'introduction précédant l'article a pour but d'introduire le lecteur à la problématique de recherche du présent projet. Puisque la recherche sur l'Anémie de Fanconi et la réparation de l'ADN est un sujet en pleine effervescence, l'information contenue dans ce mémoire dresse un portrait le plus à jour possible de ce que l'on connaît en date de ce jour, mais il est possible que certaines informations soient sujettes à changement au cours des années à venir. Le chapitre 1 présente les résultats obtenus durant mon projet de maîtrise et ces résultats ont été publiés dans le Journal of Genetic Syndromes and Gene Therapy le 6 juin 2013. CONTRIBUTION Le projet a été réalisé sous la supervision et la direction de Dre Francine Durocher. La mise en culture des cellules a été réalisée par Geneviève Ouellette (professionnelle de recherche) et Karine Plourde (stagiaire postdoctorale). Toutes les étapes impliquant le séquençage d'ADN ont été réalisées par la plateforme de séquençage du CHUL. Les images d'immunobuvardages ont été prises avec l'aide du Dr Marc Morissette de l'équipe du Dre Thérèse Di Paolo. La microscopie à fluorescence avec les protéines de fusion GFP a été réalisée avec l'appareil du Dre Jasna Kriz avec l'aide de Pierre Cordeau. Les qRT-PCRs ont été effectués par Nathalie Paquet du service de qRT-PCR du CHUL. Je tiens également à remercier le Dr Jean-Yves Masson pour l'aide technique qu'il m'a apportée dans mon projet. Finalement, je désire souligner l'aide que m'ont apporté Simon Bélanger et Karine Plourde, deux autres étudiants de l'équipe Durocher. xvii xviii 1 INTRODUCTION 1.1 Cancer 1.1.1 Le cancer au Canada Le cancer est une préoccupation majeure en terme de santé publique au Canada et dans plusieurs parties du monde. En 2012, le nombre de personnes qui recevront un diagnostic de cancer au Canada continue d’augmenter (Friedman, 2012). On attend un total de 186 400 nouveaux cas et environ 75 400 décès dus au cancer pour l’année à venir. Le cancer du sein continue d’être le plus fréquent chez la femme, avec 22 700 nouveaux cas prévus pour 2013 tandis que le cancer de la prostate demeure lui aussi le plus diagnostiqué chez l’homme avec 26 500 nouveaux cas attendus cette année. Homme et femme confondus, le cancer du poumon (14%) pointe au 2e rang et le cancer colorectal (13%) arrive au 3e rang. Ensemble, ces quatre cancers représenteront à eux seuls 53% de tous les cancers diagnostiqués en 2012. Le cancer du poumon est le plus meurtrier avec 27 % des décès chez l’homme et 26% chez la femme. Le cancer colorectal arrive au deuxième rang à ce chapitre chez l’homme et au troisième rang chez la femme avec un 12,7% et 11,6% de tous les décès attribuables au cancer, respectivement. Inversement, le cancer du sein arrive au deuxième rang chez la femme avec 14,7% des décès et le cancer de la prostate arrive au troisième rang chez l’homme avec 10,0% des décès. Sexe confondu, ces quatre cancers représentent 50,3% des décès dus au cancer. Il va de soi qu’une meilleure connaissance des éléments causant le cancer et des façons de le prévenir est primordiale pour réduire le taux de mortalité de cette maladie. 1.1.2 Prédispositions génétiques au cancer Afin de mieux prédire et ainsi prévenir les cas de cancer, une connaissance approfondie de la génétique est requise pour identifier les individus à haut risque de cancer. Toutefois, les liens entre génotype et phénotype sont parfois difficiles à définir. Historiquement, la génétique mendélienne nous a enseigné que la transmission d’un trait se faisait sans qu’il y ait phénotype intermédiaire. Par exemple, un croisement entre une fleur blanche et une fleur rouge donnera nécessairement une fleur blanche ou une fleur rouge, et non une fleur rose. Contrairement à cet exemple, on sait maintenant que non seulement la fréquence de différents allèles peut varier, mais aussi que la pénétrance d’un allèle joue également un 1 grand rôle dans la transmission d’un phénotype. Jusqu’à tout récemment, on s’est beaucoup fié à l’identification d’allèles à haute pénétrance pour expliquer les cas de cancers dits familiaux. La découverte d’allèles rares de haute pénétrance pour des gènes comme BRCA1 (Miki et al., 1994), BRCA2 (Wooster et al., 1995) et TP53 (Li et al., 1988) a grandement contribué à améliorer notre compréhension des cancers à composante génétique. De tels gènes sont très «pratiques» puisqu’à une pénétrance de 65% pour BRCA1 à l’âge de 70 ans (Antoniou et al., 2003), l’effet est clair et relativement simple à détecter par des techniques d’analyse de liaison. Ces gènes ont souvent un patron de ségrégation mendélien, soit autosomique dominant, autosomique récessif ou lié au sexe. On peut donc fréquemment soupçonner la présence d’un tel facteur en étudiant le patron de ségrégation de la maladie dans une famille. Des études sur des cohortes de jumeaux qui avaient pour but de mesurer l’influence des facteurs environnementaux en opposition aux composantes génétiques ont permis de démontrer que le rôle des facteurs héritables était aussi élevé que 42% pour le cancer de la prostate (Lichtenstein et al., 2000). De façon similaire, toujours selon la même étude, 35% des cancers colorectaux et 27% des cancers du sein peuvent être expliqués par des facteurs héritables. Néanmoins, on pense que seulement 5 à 10% de tous les cancers du sein seraient directement héréditaires (Bradbury et al., 2007). De ce nombre, les gènes de susceptibilité connus représenteraient moins de 25% de ces cas héréditaires, ce qui laisse penser que plusieurs facteurs de susceptibilité sont encore inconnus. Alors qu’une multitude de gènes ont été séquencés sans succès à la recherche de variants de séquence conférant un haut risque de cancer, on commence de plus en plus à penser à des modèles polygéniques de susceptibilité au cancer alliant plusieurs allèles de faible pénétrance pour expliquer les cancers héréditaires (Pharoah et al., 2002). C'est entre autre le cas pour le cancer du sein. Des allèles de plusieurs gènes différents pourraient avoir un effet synergique lorsque présents chez un même individu et ainsi conférer un haut risque de cancer. En utilisant un tel modèle, et en supposant que tous les gènes de susceptibilité puissent être identifiés, on retrouverait 88% des cas de cancer du sein dans la moitié de la population la plus à risque. Mieux encore, 50% de tous les cancers se retrouveraient dans les 12% de la population les plus à risque. Un tel modèle est particulièrement applicable 2 dans un cas ou des allèles de susceptibilité confèrent un risque en mode autosomique dominant et où un nombre d’allèles de susceptibilité plus grand que 4 est en cause. Ce modèle serait aussi applicable pour les autres types de cancers les plus communs comme le cancer de la prostate et le cancer colorectal. Une récente étude à ce sujet a d’ailleurs démontré qu’une combinaison de sept SNPs de faible pénétrance était associée à une susceptibilité accrue au cancer du sein (Harlid et al., 2012). L’avènement de tels modèles, ainsi que l’accessibilité aux techniques de séquençage à haut débit nous amène de plus en plus vers la médecine personnalisée. En ce sens, un travail de taille s’impose afin de caractériser les variants de séquence dans les gènes de susceptibilité connus. Ces variants de séquence peuvent affecter les fonctions cellulaires de plusieurs façons. La façon la plus classique et par le fait même la plus étudiée est l’inactivation d’une protéine par un changement d’acide aminé encodé par un SNP dans la séquence codante d’un gène. On retrouve également des variants de séquence dans des régions promotrices, qui modifieront l’affinité de facteurs de transcription pour ledit promoteur et affecteront positivement ou négativement sa transcription en ARN messager. Les polymorphismes de séquence se situant dans les introns peuvent également modifier de façon drastique les caractéristiques cellulaires d’une cellule en ayant un impact sur l’épissage d’un gène. Ce processus est couramment appelé l'épissage alternatif. 1.1.3 Épissage alternatif et cancer Le séquençage des génomes de plusieurs espèces a mené à plusieurs découvertes inattendues. L’une des plus surprenantes en découlant est le nombre de gènes chez l’humain. En effet, la complexité de l’être humain fait en sorte que l’on s’attendait initialement à avoir de 50 000 à 100 000 gènes chez l’humain qui produisaient un nombre équivalent de protéines. Pourquoi alors est-il de seulement 25 000 (Lander et al., 2001), soit environ le même que chez la souris (Mouse Genome Sequencing Consortium et al., 2002) ou l’arabette des dames (Arabidopsis Genome Initiative, 2000), la première plante séquencée? Comment se fait-il que l’humain ait seulement 6000 gènes de plus que la drosophile (Adams, 2000) qui en a 19 000? La diversité protéique rencontrée chez l'être humain est en fait augmentée en grande partie par l’épissage alternatif. Ce processus permet d'assembler des ARN pré-messagers en différents arrangements pour produire des ARN 3 messagers et protéines variantes de structures et de fonctions différentes. La cellule fait régulièrement appel à ce processus pour remplir ses fonctions cellulaires. Un excellent exemple de l’utilisation de l’épissage alternatif pour accomplir des fonctions cellulaires est fourni par le gène bcl-x, un gène de fonction similaire à bcl-2 qui régule l’apoptose. La forme longue de bcl-x, bcl-xL, inhibe la mort de la cellule en l’absence de facteurs de croissance alors que sa forme courte, bcl-xs inhibe l’activité de la protéine bcl-2 pour favoriser la survie cellulaire en l’absence de facteurs de croissance (Boise et al., 1993). Cependant, le processus d'épissage alternatif ne semble pas toujours bien maîtrisé par la cellule, si bien que certaines formes d’épissage alternatif défectueuses peuvent être retrouvées spécifiquement dans des gènes responsables de maladies héréditaires, tel que l'ont démontré une étude sur ATM (Teraoka et al., 1999) (ataxie télangiectasie et susceptibilité au cancer du sein) et une sur NF1 (Ars et al., 2000) (neurofibromatose de type 1). Ces études ont toutes deux démontré qu’environ 50% des SNPs provoquant la maladie (ataxie télangiectasie ou neurofibromatose) causaient en fait des défauts d’épissage. On retrouve des défauts d’épissage dans plusieurs autres types de cancers : des mutations d’épissage pour le gène TP53 seulement ont été retrouvées dans plus de 12 types de cancer dont des cancers du poumon, du sein et de l’œsophage (Holmila et al., 2003). Outre TP53, des mutations d’épissage dans BRCA1 (J. D. Hoffman et al., 1998), ATM (Broeks et al., 2003) et AIB1 (Reiter et al., 2001) provoquent le cancer ou à tout le moins en augmentent le risque. D’autres mutations générant des aberrations d’épissage ont également été retrouvées dans des cancers du foie, colorectal, du poumon, du cerveau et de l’endomètre (Venables, 2004). Les polymorphismes de séquence peuvent générer deux types d’isoformes alternatives : les isoformes conservant le cadre de lecture et celles qui ont un cadre de lecture modifié. Cependant, la présence d'isoformes alternatives n'est pas systématiquement due à des mutations ou polymorphismes. Elles peuvent également être générées par des sites accepteurs d'épissage/donneurs d'épissage faibles. Il faut savoir que les sites qui régulent l'épissage sont des séquences d'ADN variées qui n'ont pas tous la même habileté ou affinité avec les protéines qui régulent l'épissage. Les isoformes qui ont un cadre de lecture modifié mènent le plus souvent à la production d’une protéine tronquée et non fonctionnelle. 4 Comme résultat, les isoformes tronquées ont souvent un effet clair et plus facile à identifier. Les isoformes alternatives qui conservent leur cadre de lecture peuvent aussi avoir un effet clair malgré le fait que seulement une partie de la protéine produite soit éliminée. Par exemple, une étude récente a montré que le saut des exons 14-15 de la protéine BRCA1 conserve le cadre de lecture mais empêche la réparation de l’ADN dans la lignée cellulaire MCF-7 (Sevcik et al., 2012). 1.2 Réparation de l’ADN Les dommages à l’ADN surviennent fréquemment lors de la vie d’une cellule. Ces dommages peuvent mener à des mutations, à la mort de la cellule ou encore même au cancer. Pour l'objet de ce mémoire, 5 voies de réparation de l'ADN seront décrites: 1) la réparation directe, 2) la réparation par excision de base (BER), 3) la réparation par excision de nucléotide (NER), 4) la jonction de bouts non-homologues (NHEJ) et 5) la réparation par recombinaison homologue (HR). 1.2.1 Réparation directe Chez l’humain, ce type de réparation de l’ADN est essentiellement limité à l’enzyme O6méthylguanine-ADN-méthyltransférase, qui est une petite protéine de 20 kDa ne requérant aucun cofacteur. Des agents chimiques peuvent parfois induire la méthylation ou l’alkylation de l’oxygène en position 6 du cycle purine des guanines dans l’ADN, ce qui peut provoquer des mutations. La O6-méthylguanine-ADN-méthyltransférase élimine ces évènements de méthylation en transférant le groupement méthyl de la guanine sur le site actif cystéine de l’enzyme (Sancar et al., 2004). 5 Figure 1: Réparation d’une guanine méthylée (bleu) par la O6-méthylguanine-ADNméthyltransférase (jaune). L’enzyme reconnaît le bris par diffusion tridimensionnelle, forme un complexe de faible affinité avec le squelette de l’ADN, puis il y a transfert du groupement méthyl de la guanine sur la cystéine de la O6-méthylguanine-ADNméthyltransférase. L’enzyme se détache ensuite de l’ADN et est dégradée par le protéasome. 1.2.2 Réparation par excision de base Une base endommagée peut être excisée par une glycosylase à ADN, ce qui génère un site abasique (AP), qui peut être apurinique ou apyrimidique (Sancar et al., 2004). Un site AP peut également être directement causé par des dommages directs à l'ADN (Memisoglu et al., 2000). Après le retrait de la base endommagée, le sucre doit être retiré par une endonucléase. Deux voies peuvent alors être empruntées selon la nature des évènements de départs, à savoir si une seule ou plusieurs bases endommagées ont été retirées par une glycosylase. Lorsqu'une seule base a été retirée, l'endonucléase APE1 clive le sucre et recrute la polymérase β pour combler l'espace vacant sur l'ADN et le complexe LIG3/ERCC1 s'occupe de la ligation de la base (short patch pathway). Lorsqu'un site AP est généré par hydrolyse spontanée de l'ADN ou par une glycosylase hydrolytique, la réparation a plus tendance à se faire par le long patch pathway. Dans cette voie de réparation, il y a d'abord clivage du sucre par APE1, puis le complexe RFC/PCNA/POL δ/ε 6 déplace et remplace plusieurs autres nucléotides adjacents. Les nucléotides déplacés sont clivés par l'enzyme FEN1 et les nouveaux nucléotides sont ligués par la ligase 1. 1.2.3 Réparation par excision de nucléotides Ce type de réparation de l'ADN est le plus souvent utilisé pour réparer les lésions à l'ADN qui perturbent sa structure. Ces lésions peuvent être causées par l'exposition à des radiations ou à des agents chimiques ou encore par le dépôt de protéines sur l'ADN (Sancar et al., 2004). Suite à la reconnaissance d'une lésion sur un nucléotide, deux incisions sont faites par un complexe nucléase pour former un oligomère d'ADN de 24 à 32 nucléotides entourant la lésion. Chez les eucaryotes, ce complexe nucléase est formé de six facteurs de réparation de l'ADN: RPA, XPA, XPC, TFIIH, XPG, et XPF•ERCC1. L'oligomère d'ADN clivé par ce complexe est ensuite relâché et dégradé pour que la polymérisation puisse se faire par le complexe RFC/PCNA/POL δ/ε tout comme lors de la réparation par excision de base. 1.2.4 Réparation par jonction des bouts non-homologues Lorsqu'il y a cassure sur les deux brins de l'ADN, la façon la plus simple de réparer le bris est la jonction des bouts non-homologues. Pour ce type de réparation, un hétérodimère des protéines Ku70 et Ku80 se lie aux extrémités de la cassure double-brin de l'ADN. Il y a par la suite recrutement de sous-unités catalytiques de protéines kinase dépendant de l'ADN (ADN-PKcs) et de l'hétérodimère ligase4-ERCC4, qui catalysent la ligation des deux duplex d'ADN indépendamment de leur provenance. Le NHEJ est donc peu spécifique, car il peut lier deux brins d'ADN provenant de deux chromosomes différents, par exemple (voir figure 2). 1.2.5 La recombinaison homologue La façon la plus fidèle pour une cellule de réparer une cassure double brin est la recombinaison homologue. La HR s'opère normalement en trois étapes. Il y a d'abord invasion d'un brin homologue par un brin cassé, migration des brins d'ADN puis formation de jonctions de Holliday. Suite à une cassure double brin, il y a reconnaissance du bris par le complexe MRN, composé de Mre11, Nbs1 et Rad50. La partie simple brin de la cassure sera protégée par la protéine RPA, qui sera par la suite délogée par RAD52 afin de 7 poursuivre la réparation. L'extrémité simple brin protégée initialement par RPA deviendra le substrat de RAD51, qui est recrutée par RAD52 et BRCA2. L'arrivée de RAD51 permettra la recherche et l'invasion d'un duplex homologue intact par le brin endommagé. L'extrémité du brin envahissant servira alors de point de départ pour qu'une polymérase puisse procéder à l'extension du brin endommagé et ainsi le compléter de façon fidèle (voir figure 2). Figure 2: Réparation de bris double brin de l'ADN par recombinaison. La réparation de ce type de dommages peut se faire par recombinaison homologue ou par jonction des bouts non-homologues. La HR, plus précise, dépend en grande partie des paralogues RAD51 pour réparer l'ADN sans créer de mutations. Le NHEJ dépend de son côté des protéines kinases Ku70 et Ku80 pour lier deux extrémités de duplex d'ADN. (Sancar et al., 2004) 8 1.3 Anémie de Fanconi Un défaut dans l'une ou l'autre des voies de réparation de l'ADN décrites ci-haut entraîne généralement certains syndromes précis. Par exemple, un défaut dans la recombinaison homologue peut causer l'anémie de Fanconi (FA). L'anémie de Fanconi est une maladie autosomique récessive rare qui a été décrite pour la première fois en 1927 par le pédiatre suisse Guido Fanconi (Fanconi, 1967). Depuis lors, plusieurs ont observé cette maladie et ont conservé l'information sur des centaines de cas dans les registres internationaux (Auerbach, 2009). On a évalué l'incidence de la maladie à environ 3 cas par million, et la fréquence des porteurs se situe à environ 1 sur 300 (Schroeder et al., 1976) (Swift, 1971). De 1981 à 1990, l'espérance de vie des patients atteints de l'anémie de Fanconi était de 19 ans seulement et a grimpé à 30 ans en l'an 2000 (Schwartz et al., 2010). Les symptômes de la maladie sont très hétérogènes autant pour divers patients avec le même gène touché que pour des patients qui sont touchés sur des gènes différents. Les cellules de patients Fanconi sont hypersensibles aux agents pontant l'ADN tels que la mitomycine C (MMC) et le diepoxybutane (DEP). En conséquence, les tests de sensibilité aux agents pontant l'ADN sont ceux le plus souvent utilisés pour diagnostiquer la maladie. Les ponts interbrins sont le type de lésion le plus toxique qui peuvent survenir durant un traitement de chimiothérapie (Su et al., 2011). Des analyses de complémentation réalisées à partir de différentes lignées cellulaires dérivées de patients ont mené à la découverte de 15 groupes de complémentation, nommés FA-A, B, C, D1, D2, E, F, G, I, J, L, M, N, O et P et de leurs gènes correspondants, nommés FANCA, FANCB, et ainsi de suite jusqu'à FANCP. Ces gènes ont été découverts par complémentation fonctionnelle, par clonage positionnel, par approche gène candidat ou par identification de nouvelles protéines à partir d'immunoprécipités avec d'autres protéines FANC (Mathew, 2006). Les protéines encodées par ces gènes forment des complexes multi-protéiques auxquels on réfère en tant que la voie Fanconi, ou la voie FANC-BRCA. Pour chaque gène FANC, un large éventail de mutations est répertorié et inclut des délétions, des décalages du cadre de lecture, des mutations des sites d'épissage, des codons stop prématurés et des mutations non-sens (Joenje et al., 2001). La haute variabilité des manifestations cliniques pour les différentes mutations qui causent l'anémie de Fanconi 9 concorde avec le fait que les différentes mutations dans les gènes FANCs ont des effets différents sur la voie FANC-BRCA (Adachi et al., 2002). Le groupe de complémentation le plus commun est le groupe FA-A, mais il arrive qu'il y ait certaines mutations présentes à une fréquence élevée dans certaines populations fondatrices. De ce fait, la plupart des juifs ashkénazes atteints d'anémie de Fanconi appartiennent au groupe de complémentation FAC et sont homozygotes pour la mutation d'un site d'épissage IVS4 + 4A>T (Whitney et al., 1993). 10 Tableau 1: Les gènes Fanconi et gènes associés et leur produit en protéines ainsi que la proportion des patients associée avec chaque gène ((Hodson et al., 2011). * FAAP: Fanconi Associated Protein 11 1.3.1 Manifestations cliniques 1.3.1.1 Anomalies congénitales Au niveau clinique, l'FA se caractérise entre autres par des anomalies congénitales (Glanz et al., 1982), une fréquence extrêmement élevée de leucémie myéloïde aiguë (AML) (Butturini et al., 1994), une prédisposition élevée au cancer (Mathew, 2006) et une insuffisance médullaire (Dokal, 2000). Les anomalies congénitales observées chez les patients atteints d'anémie de Fanconi sont variées, et une étude réalisée à l'université McGill en 1982 a rapporté 19 types d'anomalies chez 94 patients atteints d'anémie de Fanconi (Glanz et al., 1982). Parmi ces 94 cas, 77 avaient un retard de croissance, 73 avaient une hyperpigmentation, 38 avaient une anomalie aux pouces (absence de pouces ou pouces surnuméraires), 31 avaient une microcéphalie et 29 avaient un retard mental. On retrouve également des malformations squelettiques et des organes génitaux sousdéveloppés chez les garçons (Dokal, 2000). D'autres anomalies sont moins fréquentes: problèmes d'audition, malformation du système gastro-intestinal et malformation cardiaque. Cependant, malgré la présence de l'une ou plusieurs anomalies congénitales chez les patients, le diagnostic d'anémie de Fanconi n'est souvent posé qu'après l'apparition de troubles hématopoïétiques chez les patients, probablement dû au manque de connaissance de la part des médecins de l'étendue des malformations associées à la maladie (Auerbach, 2009). 1.3.1.2 Troubles hématopoïétiques Les manifestations cliniques les plus importantes de l'anémie de Fanconi sont de nature hématologique et sont la cause principale de morbidité et de mortalité chez les cas de Fanconi (Tischkowitz et al., 2004). À la naissance, les comptes sanguins sont normaux et la macrocytose est généralement la première anomalie détectée. Suivent ensuite la thrombopénie, l'anémie et la pancytopénie, qui apparaissent entre 5 et 10 ans (Auerbach et al., 1991). Dans une étude réalisée en 1994 sur 338 patients atteints d'anémie de Fanconi, 120 sont décédés de causes hématologiques, dont l'insuffisance médullaire, l'AML ou le syndrome myélodysplasique (MDS) (Butturini et al., 1994). Le risque d'un patient de contracter une AML ou un MDS avant l'âge de 40 ans est de 52% et le risque de décès dû à une cause hématologique est de 81% avant 40 ans. Le type de mutation et le gène muté 12 semblent également avoir une influence sur la sévérité du phénotype. Par exemple, une étude a démontré que les taux d'AML et de MDS étaient plus élevés chez les patients appartenant au groupe de complémentation FA-G (Faivre et al., 2000). 1.3.1.3 Susceptibilité au cancer Même si les troubles hématopoïétiques sont les symptômes les plus marquants de l'anémie de Fanconi, l'incidence élevée de cancers chez les patients est également l'une des caractéristiques clé de la maladie. Une revue de littérature de 1927 à 2001 ayant étudié plus de 1300 cas d'anémie de Fanconi a estimé le taux de leucémies à 9% (principalement l'AML), celui de MDS à 7%, la présence de tumeurs solides à 5% et 3% des patients avaient des tumeurs au foie (Alter, 2003). Au même titre que pour les troubles hématopoïétiques, le type de mutation ou le gène touché peuvent avoir un rôle à jouer dans la sévérité du phénotype, à savoir ici la susceptibilité à divers types de cancers. L'exemple parfait est celui de BRCA2: alors que des mutations monoalléliques de FANCD1/BRCA2 provoquent une susceptibilité au cancer du sein et à d'autres types de cancer, des mutations bialléliques causent l'anémie de Fanconi. On sait déjà que le gène FANCD1/BRCA2 provoque un phénotype très à risque de développer un cancer. Cependant, seulement une proportion donnée des individus BRCA2-/- développeront l'anémie de Fanconi. On a découvert que, pour ce même gène, au moins une mutation doit se trouver dans la région 3' du gène pour causer l'anémie de Fanconi (Howlett, 2002). En contraste, on suspecte que des mutations bialléliques dans la région 5' de BRCA2 soient létales à l'état embryonnaire, car elles le sont chez la souris (Suzuki et al., 1997). On en sait donc beaucoup sur BRCA2, qui est le gène de l'FA le plus connu et étudié. En contrepartie, on en sait peu pour les autres gènes qui ont pour la majorité été découverts assez récemment, mais les données connues sur BRCA2 nous mènent à penser que d'autres gènes FANC pourraient conférer un risque accru de cancer lorsqu'ils sont mutés. 1.3.2 Syndromes reliés D'autres syndromes sont reliés de près ou de loin à l'anémie de Fanconi. La découverte en 2003 d'un complexe multiprotéique nommé BRAFT comprenant à la fois les protéines Fanconi ainsi que la protéine responsable du syndrome de Bloom (BLM) et ses partenaires a permis de lier les deux syndromes. Les deux maladies partagent plusieurs symptômes en 13 commun. Premièrement, les personnes atteintes de l'une ou l'autre de ces maladies ont une susceptibilité accrue à plusieurs types de cancer (Goss et al., 2002) (Gruber et al., 2002). On remarque également de l'instabilité génomique pour les deux maladies. Un autre syndrome associé à l'anémie de Fanconi est le syndrome de VACTERL, ou association VACTERL. Ce syndrome comporte un ensemble d'anomalies congénitales nonaléatoires qui sont présentes à la naissance. Les malformations qui composent l'acronyme de ce syndrome peuvent être des anomalies vertébrales (V), des malformations anorectales (A), des défauts cardiaques (C), des anomalies de la trachée (T) ou de l'œsophage (de l'anglais Esophagus), des anomalies rénales (R) ou des défauts de formation des membres (de l'anglais limbs) (Umaña et al., 2011). Les caractéristiques n'ont pas besoin d'être toutes présentes pour effectuer le diagnostic (Solomon et al., 2010). Les causes de ce syndrome sont encore inconnues à ce jour. Un syndrome relié au syndrome de VACTERL a été nommé VACTERL-H, et il est une association entre les symptômes du syndrome de VACTERL et l'hydrocéphalie. Tout comme l'anémie de Fanconi, les syndromes de VACTERL et de VACTERL-H sont génétiquement hétérogènes. Environ 10% des patients atteints de l'anémie de Fanconi présentent au moins trois anomalies caractéristiques de l'association VACTERL (Herman et al., 2010). On a retrouvé ces caractéristiques dans les groupes FA-A, FA-C, FA-D1, FA-F et FA-G. Le syndrome de VACTERL-H, avec un mode de transmission lié à l'X, a quant à lui été associé avec le groupe de complémentation FA-B (Holden et al., 2006). 1.3.3 La voie FANC-BRCA Le phénotype cellulaire d'hypersensibilité aux agents pontant l'ADN et le taux accru de bris chromosomiques dans l'anémie de Fanconi a mené à la supposition que ces protéines étaient probablement impliquées dans la réparation de l'ADN. Cependant, la découverte des premiers gènes Fanconi n'a pas permis d'en connaître plus sur les caractéristiques fonctionnelles de la voie Fanconi puisqu'aucune des protéines identifiées au départ n'avait de domaine fonctionnel connu chez d'autres protéines. Seule la présence de quelques signaux de localisation nucléaire (NLS) corroborait l'existence d'une fonction accomplie au noyau pour ces protéines. La confirmation du gène BRCA2 en tant que gène FANC (FANCD1) a été la première vraie assurance que la voie était impliquée dans la réparation 14 de l'ADN. Depuis, certains autres gènes FANC découverts ont fourni quelques informations supplémentaires: la protéine FANCL possède un domaine ubiquitine ligase, FANCJ possède un domaine hélicase et FANCM possède à la fois un domaine endonucléase et un domaine hélicase. Malgré tout, il reste beaucoup d'ambiguïtés sur la fonction précise des domaines des gènes FANC et sur la raison pour laquelle un aussi grand nombre de gènes sont requis dans cette voie. Brièvement, on retrouve trois groupes dans la voie FANCBRCA: le groupe 1, communément appelé le complexe cœur, le groupe 2, ou complexe ID, et le groupe 3 formé des protéines de réparation de l'ADN, proprement dit. 1.3.4 Groupe 1: Le complexe cœur Le groupe 1 des protéines de l'FA regroupe pour l'instant huit protéines FANC (FANCA, FANCB, FANCC, FANCE, FANCF, FANG, FANCL et FANCM) et celles-ci forment le complexe-cœur (CC) de l'anémie de Fanconi. Le complexe contient également les protéines associées (FAAPs, Fanconi associated proteins) FAAP24, FAAP100, MHF1 et MHF2. Chacun de ces gènes associés pourrait éventuellement devenir un gène FANC si on découvre un patient atteint de l'anémie de Fanconi portant des mutations causant la maladie dans l'un de ces gènes. La fonction principale du complexe-coeur est la monoubiquitination de FANCD2 suite à la détection de dommages à l'ADN, une étape qui est accomplie par FANCL, mais qui nécessite obligatoirement chacune des protéines FANC pour être menée à bien. Chacun des patients atteints sur l'un des gènes du complexe cœur est le résultat d'une mutation qui empêche la formation du complexe cœur ou empêche la monoubiquitination de FANCD2. Cette étape est considérée comme l'étape clé de la voie de réparation FANC-BRCA. La détection des dommages à l'ADN est effectuée par FANCM et FAAP24, qui catalysent la formation du complexe cœur et seraient impliquées dans l'arrêt du cycle cellulaire par ATR (Collis et al., 2008). En 2006, Medhurst et collaborateurs ont montré l'existence de souscomplexes pour les protéines du complexe cœur et ils proposent que ces sous-complexes pourraient avoir d'autres fonctions que celles connues pour la voie FANC-BRCA. 15 Les sous-complexes 1.3.4.1 FANCA et FANCG Les protéines FANCA (1455 acides aminés) et FANCG (622 aa) sont responsables de 62% et 9% des cas d'anémie de Fanconi, respectivement (voir tableau 2). Ces deux protéines se stabilisent mutuellement et favorisent l'accumulation nucléaire du complexe cœur grâce au signal de localisation nucléaire de FANCA (NLS) (Garcia-Higuera et al., 2000). On pense que la fonction principale de FANCG serait de moduler l'accumulation nucléaire de FANCA et ainsi de tout le complexe. Des expériences de co-immunoprécipitation ont démontré que FANCG se lie directement à FANCA et que les 40 premiers acides aminés de FANCA sont nécessaires pour cette interaction (Garcia-Higuera et al., 1999) (Garcia-Higuera et al., 2000) (Gordon et al., 2003). Les acides aminés 18-29 de FANCA sont nécessaires pour cette interaction, et plus spécifiquement l'arginine 18, l'arginine 19 et la leucine 25 (Kruyt et al., 1999). Les études qui ont étudié la section de FANCG nécessaire pour l'interaction sont un peu plus en conflit. Hussain et collaborateurs (Hussain et al., 2006) mentionnent que par essai double hybride, les 5e et 6e motifs de répétition tétratricopeptide (TPR) situés dans les 170 derniers acides aminés de la protéine seraient requis pour l'interaction avec FANCA. Une autre étude corrobore ces données par essais de traduction in vitro et déclare que deux régions dans les 222 derniers acides aminés de FANCG sont nécessaires à la liaison de FANCA, la première région englobant les motifs TPR 5 et 6 et la deuxième se situant dans les 37 derniers acides aminés de la protéine (Kruyt et al., 1999). En contraste, Gordon et collaborateurs mentionnent que les 142 derniers acides aminés de FANCG ne sont pas essentiels pour l'interaction avec FANCA (Gordon et al., 2003). Néanmoins, on sait que les deux protéines interagissent ensemble pour former un souscomplexe stable et que l'absence de FANCG dans des lignées lymphoblastiques empêche la migration nucléaire de FANCA et ce, malgré le fait que FANCA possède son propre NLS (Garcia-Higuera et al., 2000). Tous les patients atteints sur le gène FANCA ont des mutations qui affectent la localisation nucléaire de FANCA et du complexe cœur. Toutefois, l'analyse poussée de lignées cellulaires de patients appartenant au groupe FA-A 16 démontre que dans certains cas, même si la localisation nucléaire de FANCA est défectueuse, FANCG peut encore lier FANCA. 1.3.4.2 FANCB, FANCL et FAAP100 La stabilité de ce sous-complexe est essentielle pour la fonction du complexe cœur. Des études ont démontré que FANCL était nécessaire à la stabilité de complexe cœur, et que son absence inhibait la formation de celui-ci (Medhurst, 2006). On pourrait donc penser que FANCL interagit avec plusieurs partenaires pour assurer la formation du complexe cœur, ce qui n'est cependant pas le cas. Des essais double hybride entre FANCL et les autres protéines FANC dont FANCA, FANCC, FANCE, FANCF et FANCG n'ont permis de détecter aucune interaction directe entre ces protéines (Medhurst, 2006). La seule interaction directe qui a été détectée est celle entre FANCB et FANCL, qui donnait un taux d'activation du gène rapporteur 27 fois plus élevé que les contrôles dans les essais double hybride. Il devient donc logique de penser que FANCL interagit avec le complexe par l'entremise de FANCB, et que c'est FANCB qui interagit avec les autres protéines du complexe cœur. Encore une fois, cette hypothèse a été infirmée dans la même étude par des essais double hybride entre FANCB et les protéines FANCA, FANCC, FANCE et FANCG qui n'ont détecté aucune interaction directe entre FANCB et les autres protéines du complexe cœur. Medhurst et collaborateurs proposent donc que ce soit l'interaction entre FANCB et FANCL qui leur permet d'interagir avec FANCA et les autres protéines du complexe cœur (Figure 3). Cependant, un nouveau joueur a fait surface en 2007 avec la découverte de FAAP100, qui forme un sous-complexe stable avec FANCB et FANCL (Ling et al., 2007). Selon cette étude, la formation de ce sous-complexe protège chaque membre du complexe de la dégradation protéolytique et permet la co-régulation par FANCA et FANCM de la localisation nucléaire du sous-complexe. Cela corrobore les données obtenues par Meetei et collaborateurs en 2003, qui affirmaient que la protéine FANCA était requise pour la localisation nucléaire de FANCL (Meetei, de Winter, et al., 2003a) et ce, malgré le fait que l'interaction entre FANCL et FANCA soit indirecte. Cela renforce donc la proposition de Medhurst selon laquelle ce serait l'interaction entre FANCB et FANCL qui leur permettrait d'agir avec FANCA, et cette idée a été illustrée en 2012 par Hodson (Hodson et al., 2012). 17 Figure 3: L'interaction directe entre FANCB et FANCL permet de stabiliser l'interaction entre FANCA et le sous-complexe FANCB-FANCL-FAAP100 et serait nécessaire à sa localisation nucléaire (Hodson et al., 2012). L'interaction entre les protéines FANCB et FAAP100 est directe et on a proposé que cette interaction soit possible grâce à un domaine faisceau d'hélices chez les deux partenaires (Ling et al., 2007). L'interaction entre FANCL et FAAP100 se fait quant à elle par l'intermédiaire de FANCB. La seule interaction directe entre FANCL et un autre membre du complexe réside donc toujours en celle avec FANCB. Des études plus spécifiques ont donc été poursuivies par Medhurst et collaborateurs pour évaluer quelles parties de FANCL étaient requises pour l'interaction avec FANCB (Medhurst, 2006). Comme à l'époque la connaissance des domaines de FANCL était restreinte à 3 domaines WD40 (Meetei, de Winter, et al., 2003a), ce sont ces sections qui ont été étudiées pour évaluer l'interaction entre FANCL et FANCB. Cependant, aucune des trois sections «WD40» de FANCL n'était suffisante à elle seule pour interagir avec FANCB, indiquant que toutes les parties de FANCL sont nécessaires à l'interaction avec FANCB (Medhurst, 2006). 1.3.4.3 FANCC-FANCE La stabilité de ce sous-complexe est fondée sur une interaction directe entre FANCC et FANCE, et cette interaction a été confirmée par essais double hybride (Medhurst et al., 2001) (Pace et al., 2002). La partie centrale des acides aminés 150 à 371 de FANCE est essentielle pour cette interaction (Léveillé et al., 2006) (Gordon et al., 2003), mais la portion de FANCC pour cette interaction n'a pas été identifiée à ce jour (Hodson et al., 2012). FANCE se retrouve de façon prédominante et constitutive au noyau, notamment en raison de ses deux signaux de localisation cellulaire (de Winter et al., 2000). Cependant, la 18 localisation nucléaire de FANCE dépend aussi partiellement de FANCC, car une protéine de fusion FANCE-GFP dépourvue de ses deux NLS se trouve quand même au noyau dans des fibroblastes de type sauvage, mais ne réussit pas à migrer au noyau dans des cellules déficientes en FANCC (Léveillé et al., 2006). De son côté, l'accumulation nucléaire de FANCC est elle aussi dépendante de sa protéine associée, FANCE (Taniguchi et D'Andrea, 2002a). En l'absence de FANCE, la protéine FANCC est présente en faible quantité dans les cellules, et la réintroduction de FANCE permet de rétablir les taux de FANCC, plus spécialement à l'intérieur du noyau. La localisation nucléaire de FANCC est indépendante de FANCA et très peu de FANCG. De façon similaire à l'interaction directe de FANCB et FANCL qui sert ensuite à interagir avec FANCA, ce serait un processus similaire qui permettrait à FANCC et FANCE d'interagir avec FANCF, et les 15 premiers acides aminés de FANCF sont nécessaires pour cette interaction (Léveillé et al., 2004). Ceci permettrait alors à FANCC et FANCE de se retrouver avec le reste du complexe, car FANCF et FANCG interagissent directement ensemble (Medhurst et al., 2001) et Gordon et collaborateurs ont montré par essai triple hybride que l'interaction entre FANCA et FANCF se réalisait par l'entremise de FANCG (Gordon et al., 2005). 1.3.4.4 FANCM, FAAP24, MHF1 & MHF2 Le sous-complexe FANCM, FAAP24, MHF1 et MHF2 appartient également au complexe cœur, principalement parce qu'il co-immunoprécipite avec les autres protéines du complexe coeur (Meetei et al., 2005). FANCM est l'une des deux seules protéines du complexe cœur, avec FANCL, à posséder un domaine fonctionnel connu, soit dans ce cas un domaine hélicase. Elle est aussi retrouvée chez les bactéries archéées sous le nom de HEF et possède un grand nombre de fonctions. Tout d'abord, l'une des fonctions importantes de FANCM serait de repérer les lésions à l'ADN et de localiser le complexe cœur sur la chromatine. L'absence de FANCM ou de FAAP24 empêche toute relocalisation du complexe sur la chromatine (Kim et al., 2008). Cependant, FANCM et FAAP24 ne sont pas essentielles à la stabilité du complexe cœur, d'où un débat pour savoir si ce sous complexe devrait être inclus ou non comme membre du complexe cœur. À l'intérieur du sous-complexe, FANCM et FAAP24 s'associent et se stabiliseraient l'une l'autre (Ciccia et al., 2007) (Xue et al., 19 2008). Ling et collaborateurs ont aussi proposé que FANCM soit responsable, conjointement avec FANCA, de la localisation nucléaire du sous-complexe FANCB/FANCL/FAAP 100 (Ling et al., 2007). En 2003, Meetei et collaborateurs ont découvert l'existence d'un complexe contenant à la fois les protéines du complexe coeur de Fanconi et du complexe BLM (Meetei, Sechi, et al., 2003b). Deans et collaborateurs ont ensuite montré que c'était FANCM qui liait les deux complexes, FANCM interagissant à la fois avec FANCF du complexe coeur de Fanconi et les protéines RM1 et topoisomérase IIIα (Deans et al., 2009) du complexe BLM. Les mêmes auteurs mentionnent que la région nécessaire à l'interaction entre FANCM et FANCF se situerait au niveau des acides aminés 1-158 de FANCF, ce qui relie le sous-complexe au reste du complexe cœur. FANCM a aussi été impliquée dans des fonctions de régulation du cycle cellulaire en lien avec la réparation de l'ADN (Collis et al., 2008). Les protéines MHF1 et MHF2 seraient requises pour les fonctions de remodelage de l'ADN, et la perte de ces deux protéines entraîne l'inhibition de la monoubiquitination de FANCD2 induite par les dommages à l'ADN (Singh et al., 2010). Les protéines MHF1 et MHF2 forment un hétérodimère et augmentent l'affinité de FANCM pour l'ADN. La majorité des complexes FANCM/FAAP24/MHF1/MHF2, c'est-à-dire moins de 30%, ne se lie pas au reste du complexe cœur (Yan et al., 2010). Yan et collaborateurs montrent aussi que les protéines MHF1 et MHF2 peuvent former des complexes avec FANCM sans FAAP24, et inversement que FAAP24 peut aussi former un complexe avec FANCM sans les protéines MHF. 1.3.4.5 Groupe 2: Le complexe ID Le groupe 2 des gènes causant l'anémie de Fanconi compte seulement deux composantes: FANCD2 et FANCI. Il possède une grande importance, car c'est de lui que dépend l'activation de tous les gènes de réparation de l'ADN en aval. Les deux protéines du groupe, FANCD2 et FANCI, forment un complexe, le complexe ID. FANCD2 et FANCI peuvent être monoubiquitinées sur la sérine 561 et la lysine 523, respectivement, en présence de dommages à l'ADN (Meetei et al., 2004) (Sims et al., 2007). Suite à la monoubiquitination de FANCD2 et FANCI, le complexe ID se relocalise sur la chromatine, où il interagit avec FANCD1/BRCA2 et forme des foyers de réparation de l'ADN (Garcia-Higuera et al., 20 2001). Une perte de fonction pour n'importe quelle des protéines FANC du complexe cœur empêche la monoubiquitination de FANCD2 et ainsi la formation de foyers de réparation. La protéine FANCI a la capacité de lier l'ADN grâce à un domaine de liaison contenu dans sa région C-terminale, qui lie de préférence les jonctions de Holliday et les stuctures en Y (Longerich et al., 2009). La liaison de l'ADN par FANCI semble être requise pour la monoubiquitination de FANCD2, car un mutant de FANCI ne liant pas l'ADN réduit significativement la monoubiquination de FANCD2 in vitro (Sato et al., 2012) . De plus, lors de l'ajout d'un substrat d'ADN mimant une fourche de réplication arrêtée, FANCD2 est monoubiquitiné à environ 70%, contre moins de 1% en l'absence d'ADN. 1.3.3.6 Groupe 3: Les protéines de réparation de l'ADN Le groupe 3 des gènes de l'anémie de Fanconi est notamment marqué par la présence de gènes d'abord connus comme gènes de susceptibilité au cancer du sein, puis identifiés par la suite comme gènes Fanconi. Ce groupe contient les gènes FANCD1/BRCA2, FANCJ/BRIP1, FANCN/PALB2 et FANCO/RAD51C. S'ajoute à ce groupe la protéine la plus récemment identifiée, soit FANCP/SLX4. Contrairement aux protéines du groupe 1, l'absence ou la déficience d'une des protéines du groupe 3 n'affecte pas la monoubiquitination de FANCD2. On pense donc que ces protéines agissent en amont de FANCD2 et qu'elles servent de gènes de régulation et de remodelage dans la réparation de l'ADN. À ce jour, le rôle exact de chaque protéine du groupe 3 est encore sujet à discussion et la nature des interactions entre les protéines reste à préciser. C'est pourquoi chacune des protéines du groupe 3 sera décrite individuellement. Le premier membre du groupe 3 est l'hélicase FANCJ, originellement connu sous le nom de BRIP1, une protéine soupçonnée d'interagir à l'intersection entre la voie Fanconi et la recombinaison homologue (Deakyne et al., 2011) (Niedernhofer et al., 2005). Présentement, le rôle exact de FANCJ dans la réparation de l'ADN demeure inconnu. On sait toutefois que FANCJ est l'une des seules protéines Fanconi à interagir directement avec l'ADN endommagé (Hiom, 2010). FANCJ est également capable de déloger les boucles D. La protéine interagit physiquement avec BRCA1 et colocalise avec lui aux sites de dommages à l'ADN (Y. Wu et al., 2009), mais la perte de l'interaction avec BRCA1 n'empêche pas la réparation de l'ADN, puisqu'un autre sentier de réparation semble alors 21 emprunté (Xie et al., 2010). Des analyses de recombinaison homologue ont montré un taux de recombinaison homologue 10 fois inférieur en absence de FANCJ ou de BRCA1. De plus, les cellules privées de FANCJ sont incapables de compléter leur réplication (Hiom, 2010). FANCJ semble donc impliquée directement dans la recombinaison homologue. Cependant, de récentes études suggèrent que FANCJ pourrait être impliquée dans la formation de foyers de réparation de l'ADN avec FANCD2 (Fan Zhang et al., 2010a). Le gène FANCN était originellement connu sous le nom de PALB2 (partenaire et localisateur de BRCA2) puisqu'il interagit et régule le gène BRCA2. Tout comme pour FANCJ, l'absence de FANCN n'entraîne pas la perte de monoubiquitination de FANCD2, mais cause une hypersensibilité aux agents pontant l'ADN et ultimement l'anémie de Fanconi (Dorsman et al., 2007). FANCN contient deux répétitions WD40 en portion Cterminale et une superhélice en portion N-terminale (Feng Zhang et al., 2009). Les répétitions WD40 servent à interagir avec la portion N-terminale de BRCA2, une interaction qui régule la liaison à la chromatine de BRCA2, sa fonction dans le cycle cellulaire et sa fonction dans la recombinaison homologue (Xia et al., 2006). De ce fait, l'absence ou la défectuosité de PALB2 empêche la formation de foyers BRCA2 et RAD51 (Dorsman et al., 2007). FANCN interagit aussi avec BRCA1, et des mutations dans le domaine superhélice de BRCA1 empêchent la liaison avec FANCN, ce qui diminue l'affinité d'interaction entre BRCA1 et BRCA2 (Feng Zhang et al., 2009). Un knockout des deux allèles FANCN est létal au niveau embryonnaire chez la souris et des problèmes de différenciation de cellules du mésoderme ont été remarqués avant la mort desdites souris (Rantakari et al., 2010). Selon nos connaissances actuelles, FANCN/PALB2 se localiserait donc aux sites de dommages à l'ADN et servirait de protéine d'échafaudage pour réguler et recruter les autres protéines de réparation de l'ADN, en l'occurrence BRCA1 et BRCA2. FANCD1 a d'abord été connu sous le nom de BRCA2, le deuxième gène de susceptibilité majeur au cancer du sein et gène suppresseur de tumeurs. Les porteurs d'une mutation sur le gène BRCA2 ont en effet une probabilité de 50% de développer un cancer du sein avant l'âge de 60 ans (Thorslund et al., 2007). Contrairement à BRCA1, le premier gène de susceptibilité au cancer du sein, BRCA2 augmente aussi la susceptibilité au cancer du sein, de la prostate et du pancréas chez l'homme (O'Donovan et al., 2010). En 2002, Howlett et 22 collaborateurs ont montré que la complémentation de fibroblastes déficients en FANCD1 avec BRCA2 restaurait la résistance des cellules à la MMC, démontrant ainsi que FANCD1 et BRCA2 formaient une seule protéine (Howlett, 2002). À 3418 acides aminés, FANCD1 est la plus grosse protéine FANC connue à ce jour. FANCD1 interagit directement avec la recombinase RAD51 grâce à ses répétitions BRC et régule la recombinaison homologue en réponse aux ponts interbrins dans l'ADN (Thorslund et al., 2007). BRCA2 se lie également avec une recombinase spécifique à la méiose, DMC1, et aurait donc un rôle critique à jouer dans la recombinaison méiotique. DMC1 est un homologue de RAD51 spécifique à la méiose. Considérant ces deux interactions, il a été proposé que FANCD1 agisse en tant que régulateur universel de la recombinaison. RAD51C est elle aussi une protéine reconnue pour augmenter la susceptibilité au cancer du sein (Somyajit et al., 2010). RAD51 et ses paralogues, dont RAD51C, agissent dans des voies de réparation de l'ADN liées à la recombinaison homologue. Plus particulièrement, RAD51C participe à la résolution des jonctions de Holliday et à la migration de branches, un processus important pour le traitement des intermédiaires de recombinaison homologue dans la réparation de l'ADN (Badie et al., 2009). Elle participe également au contrôle du cycle cellulaire, puisqu'elle est requise pour l'activation de CHK2 et l'arrêt du cycle cellulaire en réponse aux dommages à l'ADN. En 2010, Vaz et collaborateurs ont identifié des mutations non-sens de RAD51C à l'état homozygote dans une famille consanguine dont les membres souffraient de multiples anomalies congénitales sévères caractéristiques de l'anémie de Fanoni, conduisant ainsi à l'identification de RAD51C en tant que gène FANCO (Vaz et al., 2010). L'absence de RAD51C confère une susceptibilité accrue aux ponts interbrins et des accumulations de cellules en phase G2/M, des phénotypes Fanconi classiques (Somyajit et al., 2012). En 2009 l'implication de SLX4 en tant que possible gène FANC a d'abord été mise en évidence par trois groupes qui ont démontré que la déplétion de FANCP sensibilisait les cellules aux agents pontant l'ADN (Svendsen et al., 2009Muñoz et al., 2009) (Fekairi et al., 2009). Suite à ces études, Stoepker et collaborateurs ont entrepris de séquencer le gène SLX4 chez plusieurs patients Fanconi de groupes de complémentation non-répertoriés dans les groupes connus (Stoepker et al., 2011). Le séquençage de ces individus a permis de 23 rapporter 4 patients Fanconi avec des mutations bialléliques de SLX4, confirmant ainsi le statut de SLX4 en tant que gène FANCP. Lorsqu'il y a mutation de SLX4, il est tout de même possible d'observer des foyers FANCD2, ce qui exclut un défaut dans la partie en amont de la monoubiquitination de FANCD2. SLX4 sert de protéine d'échafaudage pour les nucléases de réparation de l'ADN ERCC1-XPF, MUS81-EME1 et SLX1 (Muñoz et al., 2009). Lorsqu'elle est présente, SLX4 augmente l'activité nucléase de ces protéines, ce qui laisse penser qu'elle joue un rôle de traitement des intermédiaires de recombinaison. Le gène FAN1 est l'un des candidats en lice pour devenir le prochain gène FANC à être identifié de par son rôle dans la voie FANC-BRCA. Lorsque le complexe ID est monoubiquitiné, il y a relocalisation sur la chromatine et recrutement de FAN1 pour amorcer la formation de foyers de réparation de l'ADN (Liu et al., 2010). FAN1 interagit principalement avec la forme monoubiquitinée de FANCD2, mais peut aussi interagir plus faiblement avec sa forme native ainsi qu'avec FANCI. La lysine 561 de FANCD2 est essentielle à l'interaction avec FAN1. Pour que la réparation des ponts interbrins ait lieu, il doit y avoir clivage nucléolytique de l'ADN pour générer un substrat approprié qui peut être réparé par recombinaison homologue (W. Wang, 2007). Ce sont ces fonctions qui laissent penser que l'absence de FAN1 chez un individu pourrait conduire à l'FA. 1.4 FANCL La protéine FANCL est officiellement reconnue sous ce nom depuis 2003, année qui marque l’identification du premier patient du groupe de complémentation FA-L (Meetei, de Winter, et al., 2003a). Au préalable, la protéine était connue sous le nom de PHF9 (PHD finger protein 9) et FAAP43 (Fanconi associated protein 43) sans que l’on ait pu établir que ces deux protéines n’étaient en fait qu’une seule. C’est en purifiant le complexe cœur de Fanconi suivi d’une analyse par spectrométrie de masse que FAAP43 a pu être identifiée en tant que PHF9, et la découverte de patient appartenant au groupe de complémentation FA-L a ensuite mené à l’appellation FANCL. L’homologue de FANCL chez la souris était également connu avant la découverte de FANCL. Il a initialement été découvert en tant que Pog (proliferation of germ cells) comme le gène responsable du phénotype gcd (germ celldeficient) (Agoulnik et al., 2002). Les souris affichant ce phénotype sont moins fertiles et ont des problèmes de prolifération des cellules germinales. Chez l’humain, la protéine 24 FANCL a une taille de 43 kDA, tel que le suggère l’appellation FAAP43, et est encodée par un ARN messager de 1128 nucléotides et un gène de 82 138 paires de bases. FANCL est la sous-unité catalytique du complexe cœur de Fanconi en raison de sa fonction ubiquitine-ligase. Elle est d’ailleurs la seule sous-unité du complexe coeur possédant une activité catalytique connue. La protéine est constituée de trois domaines distincts : le ELF (E2-like fold) des acides aminés 1 à 108, le domaine URD (ubiquitin conjugating-RWD domain) des acides aminés 109 à 293 et le domaine RING (really interesting new gene) des acides aminés 294 à 375 (Figure 4). 25 Figure 4: A) Séquence sauvage de l'ADNc FANCL. B) La séquence sauvage de la protéine FANCL. L'exon 4 de FANCL est en gras; la mutation Leu38Phe est surlignée en jaune; le domaine ELF est en caractères rouges, le domaine URD en caractères verts, le domaine RING en caractères bleus; les jonctions exon-exon sont en caractères turquoise. 26 1.4.1 Les cas connus de FANCL En date de 2012, seulement deux cas d’anémie de Fanconi associés au groupe de complémentation FA-L ont été rapportés. Le premier cas est celui qui a permis la découverte de FANCL en 2003 (Meetei, de Winter, et al., 2003a). Des cellules dérivées du patient ont permis d’obtenir la lignée cellulaire EUFA868, la lignée déficiente en FANCL la plus utilisée en recherche. L'ADN de cette lignée contient une insertion homozygote de 177 paires de bases tout juste avant l’exon 11, causant le saut de ce même exon lors de l’épissage de FANCL et la perte de la fin du domaine URD et du domaine RING en entier. C'est à partir de cette étude qu'il a été possible d'identifier PHF9 en tant qu'un gène FANC et de connaître son rôle dans la voie Fanconi. Les cellules dérivées du patient appartenant au groupe de complémentation FA-L ont permis d'établir dès lors que l'intégrité du domaine terminal de FANCL est essentielle à la protéine et que son absence confère l'anémie de Fanconi chez des porteurs qui n'ont qu'une forme tronquée de FANCL. Le deuxième cas, rapporté en 2009, est le deuxième et plus récent à ce jour (Ali et al., 2009). Plusieurs symptômes cliniques ont été rapportés pour ce cas, mais ils sont en général moins prononcés que les cas classiques d'anémie de Fanconi. Le jeune garçon a été suivi à partir de l'âge de 15 mois après avoir présenté un retard de croissance et une faible alimentation. Un test d'instabilité chromosomique induit au diepoxybutane a montré un taux de bris chromosomique 10 fois plus élevé que la normale. Toujours à 15 mois, un examen d'imagerie par résonance magnétique a montré un léger retard de myélinisation au cerveau. Il a plus tard été diagnostiqué avec un trouble déficitaire de l'attention avec hyperactivité. À 8 ans, l'enfant présentait une stature (15%) et un poids (50%) normaux avec aucune marque physique apparente de l'anémie de Fanconi, à l'exception d'une petite tache café au lait sur l'abdomen. La seule caractéristique notoire d'histoire familiale est un cousin du côté paternel qui avait eu une leucémie infantile. Un test d'hématopoïèse n'a décelé qu'une légère hypocellularité de la moelle osseuse et les comptes sanguins du patient étaient normaux. Des tests de cycle cellulaire au melphalan ont toutefois démontré un arrêt marqué en G2/M, ce qui a ouvert la porte aux tests de complémentation et aux autres tests fonctionnels. Les tests de monoubiquitination obtenus à partir d'une lignée de fibroblastes dérivés du 2e 27 patient montraient que la monoubiquitination de FANCD2 était réduite, sans pour autant être abolie. Les tests de survie, tout comme les tests de cycle cellulaire, montraient que les cellules du deuxième patient, appelées RA3056 avaient un phénotype désavantageux en comparaison aux cellules contrôles, mais moins marqué que pour les cellules du premier patient FA-L. Le séquençage de l'ADN génomique a mené à la découverte de mutations bialléliques dans le gène FANCL. La première mutation était une délétion de 3 paires de bases conservant le cadre de lecture: c.1007_1009delTAT (p.Ile336_Cys337delinsSer) et était présente chez la mère. Cette mutation, située dans l'exon 12, entraîne la substitution des acides aminés isoleucine 336 et cystéine 337 par une sérine dans le domaine RING de FANCL. La deuxième mutation était une duplication de 4 paires de bases dans l'exon 14 de FANCL: c.1095_1098dupAATT (p.Thr367AsnfsX13) provenant du père, donc du côté appartenant au cousin ayant eu une leucémie infantile. Cette duplication mène à un changement du cadre de lecture et entraîne une série de 12 acides aminés non-sens et une protéine plus longue de 4 acides aminés que la protéine sauvage. Cette mutation affecte également le domaine RING de FANCL. La mutation la plus sévère s'est avérée être la mutation c.1007_1009delTAT. Les cellules EUFA868 complémentées avec cette forme montraient 43,6% de cellules en G2/M et aucune monoubiquitination de FANCD2, contre 32,0% et une légère monoubiquitination de FANCD2 pour les cellules complémentées avec la forme contenant la mutation c.1095_1098dupAATT. 1.4.2 Les études d’association sur FANCL Lorsqu'il a été démontré que les gènes FANC interagissaient dans une voie de réparation commune avec les gènes de susceptibilité au cancer du sein BRCA1 et BRCA2, plusieurs de ces gènes sont devenus des candidats populaires pour les études d'association au cancer. Plusieurs équipes se sont donc intéressées à FANCL comme gène de susceptibilité à plusieurs types de cancer: cancer du sein, cancer de l'œsophage et cancer du col de l'utérus. Premièrement, une étude réalisée sur 95 familles espagnoles à haut risque de cancer du sein a écarté FANCL comme un joueur important dans la susceptibilité à haut risque de cancer du sein (García et al., 2009). Des 14 variants de séquence identifiés, deux se trouvaient dans la séquence codante de FANCL (S327S et C359C) mais ne provoquaient aucun changement d'acides aminés. Parmi les 12 mutations trouvées dans les régions introniques 28 et non traduites (5'UTR et 3'UTR), la mutation la plus près d'un exon, c.217 - 11T > C, soit 11 paires de bases avant l'exon 4 de FANCL, avait un effet improbable sur l'épissage, tout comme les 11 autres mutations analysées. 29 Tableau 2: Variations de séquences détectées lors d'études d'association portant sur le cancer du sein, de l'œsophage et de l'anémie de Fanconi a b : (García et al., 2009) : (Akbari et al., 2011) 30 L'analyse de ces 95 familles espagnoles n'a pas été un succès pour FANCL puisque, tel qu'en concluent les auteurs, aucun variant conférant potentiellement un haut risque n'a pu être identifié. Une autre équipe a tenté d'associer FANCL au cancer du col de l'utérus par l'utilisation de marqueurs SNPs (tag SNPs) (Juko-Pecirep et al., 2011). Malgré l'utilisation de 30 marqueurs pour FANCL, aucune association n'a pu être décelée. FANCL avait pourtant été préalablement significativement associé à des infections persistantes chez des femmes infectées par le virus du papillome humain (VPH) de type «oncogène» (S. S. Wang et al., 2010). Il est à noter que dans l'étude de Juko-Pecirep et al., les gènes FANCA et FANCC n'ont pu être associés au cancer du col de l'utérus. L'étude d'association au cancer la plus récente concernant FANCL a été réalisée en 2011 au près de 281 cas turkmènes et porte sur le cancer de l'œsophage (Akbari et al., 2011). Une mutation déjà répertoriée a été retrouvée à l'état hétérozygote chez un patient avec une forte histoire familiale de carcinome épidermoïde de l'œsophage: la mutation p.Thr367AsnfsX13 qui avait été identifiée chez le deuxième patient du groupe de complémentation FA-L connu. Cette mutation est donc probablement responsable de l'histoire familiale de cancer de l'œsophage dans cette famille, mais l'effet fonctionnel de ce SNP n'a pas été démontré à ce jour. L'étude a aussi recensé deux nouveaux variants potentiellement délétères, soit p.36Phe>Leu et p.208Asp>Asn qui ont été retrouvés chez 3,6 et 1,8% des cas, respectivement. À première vue, FANCL ne semble donc pas un joueur aussi important pour la susceptibilité au cancer que les gènes BRCA1 et BRCA2 ne le sont pour le cancer du sein. Il est lié à des infections persistantes chez les porteuses du VPH de type «oncogène», mais n'a pu être lié directement au développement du cancer du col de l'utérus. La mutation p.Thr367AsnfsX13 identifiée chez un patient Fanconi du groupe FA-L a toutefois été retrouvée à l'état hétérozygote chez un cas familial de cancer de l'œsophage. L'association entre la mutation p.Thr367AsnfsX13 et le cancer n'a pas été démontrée comme exclusivement attribuable à FANCL, mais ce résultat suggère tout de même que le gène FANCL a un potentiel oncogénique réel. Les autres variants identifiés pourraient également avoir un effet plus subtil et agir sous forme polygénique tel que décrit à la section 1.1.2 de 31 ce mémoire. Un moyen efficace d'évaluer l'intérêt que ces variants pourraient avoir pour une étude fonctionnelle est de vérifier leur taux de conservation chez d'autres espèces. Section 1.4.3 Les orthologues de FANCL Le gène FANCL est l'un des joueurs clés du complexe cœur de l'anémie de Fanconi en raison de sa fonction catalytique E3-ubiquitine ligase. Tel que résumé au Tableau 3, le gène FANCL a été identifié chez plusieurs autres espèces et le taux de conservation de la séquence d'acides aminés est supérieur à 75% chez la plupart des mammifères étudiés sauf le cochon, pour lequel le domaine N-terminal de FANCL est supprimé. Il est également conservé chez des espèces aussi distantes de l'homme que la drosophile et le tunicier. Le réseau de gènes Fanconi est également bien préservé chez les vertébrés. Une étude réalisée en 2006 a démontré que les neufs gènes FANC connus alors (FANCA, FANCB, FANCC, FANCD1, FANCD2, FANCE, FANCF, FANCG et FANCL) ont des orthologues chez le poisson zèbre (Titus et al., 2006). Cette étude conclut que la voie de réparation de l'ADN FANC-BRCA est demeurée intacte depuis le dernier ancêtre commun entre le poisson zèbre et l'humain. Plus particulièrement, le gène FANCL est le mieux conservé de tous les gènes FANC avec 57% d'identité. La protéine, qui comporte 375 acides aminés chez l'humain, compte 371 acides aminés chez le poisson zèbre et des analyses d'hydrophobicité montrent que les deux molécules ont une structure semblable. Comme le démontre la figure 6, la protéine contient les mêmes acides aminés qui forment le domaine de plante à homéodomaine (doigt PHD: sept résidus cystéines et un résidu histidine (caractéristiques des doigts PHD) et un résidu tryptophane (caractéristique des domaines PHD de type ligase E3). On pense donc que FANCL accomplit aussi son rôle d'ubiquitine ligase E3 chez le poisson zèbre. Comme 9 homologues FANC ont été retrouvés chez le poisson zèbre et que peu d'homologues ont été trouvés chez la drosophile, on pense présentement que le complexe cœur de Fanconi pourrait être une caractéristique spécifique des vertébrés. Chez les invertébrés, une équipe japonaise a récemment pu identifier un gène orthologue de FANCL chez le ver à soie (Bombyx mori), une espèce qui ne possède pas le compexe coeur de Fanconi (Sugahara et al., 2012). Chez le ver à soie, les seuls membres FANCs présents 32 sont FANCD2 (BmFANCD2), FANCI (BmFANCI) et FANCL (BmFANCL). Cette étude a entre autres démontré que le gène BmFANCL a un effet sur la prolifération cellulaire en présence de MMC et que la monoubiquitination de BmFANCD2 par BmFANCL est nécessaire pour le chargement de BmFANCD2 sur la chromatine. Cette fois, la protéine fait 325 acides aminés pour un poids de 37 kDa, en comparaison avec 43 kDa pour FANCL chez l'humain. Encore une fois, les résidus cystéines et le résidu tryptophane du doigt PHD sont conservés, en plus d'un résidu isoleucine servant hypothétiquement à interagir avec une enzyme de type E2. Sugahara et collaborateurs ont ensuite démontré que BmFANCL est essentiel à la monoubiquitination de FANCD2, confirmant de ce fait que le rôle de FANCL est préservé chez le ver à soie. En remontant plus loin au niveau évolutif, on a également identifié une voie de réparation de l'ADN fonctionnant dans la réparation des ponts interbrins chez le nématode C.elegans et un homologue de FANCD2 a été trouvé (Collis et al., 2006). Un gène portant certaines similarités avec FANCL, K01G5.1, est présent chez cette espèce de ver mais l'homologie avec FANCL est encore incertaine. En comparaison avec le poisson zèbre qui possède des gènes homologues pour tous les gènes du complexe cœur, la drosophile, elle, n'a d'homologues que pour FANCM, FANCD2 et FANCI. Comme les homologues de FANCD2 et FANCI sont connus chez le ver à soie et même chez C.elegans pour FANCD2, il n'est pas surprenant de les retrouver aussi chez la drosophile. De son côté, FANCM est un orthologue de la protéine de réparation de l'ADN Hef chez les archées et MPH1 chez la levure (Meetei et al., 2005). FANCL se retrouve aussi chez la drosophile et il est probablement le gène orthologue de FANCL le mieux étudié, puisque sa structure cristallographique a été publiée en 2010 (Cole et al., 2010). La protéine de la drosophile a été préférée à celle de l'humain puisque sa solubilité permet d'en purifier des milligrammes, alors que la solubilité de la protéine humaine ne le permet pas. Les différences entre la protéine humaine et la protéine de la drosophile affectent donc la solubilité de la protéine. La protéine est toutefois bien conservée, tel que l'indique la similarité d'environ 60% et les 23% d'identité entre les deux protéines. Une analyse approfondie de la structure de FANCL chez la drosophile a permis de séparer la protéine en trois domaines distincts, dont il sera question dans la prochaine 33 section. 1.4.4 Les trois domaines de FANCL La protéine FANCL de la drosophile a été purifiée et cristallisée en 2010 (Cole et al., 2010) et une structure a été proposée pour celle-ci (Figure 5). Jusque là, on avait identifié deux domaines: un domaine homéotique de plante (PHD) avec activité E3 ubiquitine ligase et un domaine de répétitions WD40 (Gurtan et al., 2006). Ce modèle a récemment été écarté au profit d'un modèle qui attribue trois domaines à FANCL chez la drosophile: un domaine E2-like-fold (ELF), un domaine double DRWD, et un domaine RING. Cependant, une étude a récemment montré que le domaine central de FANCL contient un feuillet beta à un endroit qui est normalement occupé par une hélice alpha dans les domaines RWD (Hodson et al., 2011). Cela met le domaine central de FANCL à mi-chemin entre un domaine de type E2 avec un feuillet beta au lieu du domaine catalytique et un domaine RWD avec une hélice alpha à un endroit inusité. Puisqu'il est unique et qu'aucun domaine du genre n'a été rencontré auparavant, le domaine central a donc été renommé URD, pour ubiquitinconjugating RWD. Des alignements de séquences ont montré que cette caractéristique est fort probablement présente chez tous les vertébrés, ce qui en fait une différence clé entre les orthologues FANCLs de vertébrés et d'invertébrés. 34 Figure 5: Structure secondaire des trois domaines de la protéine FANCL de la drosophile. Le domaine N-terminal ELF est représenté en mauve et bleu foncé, le domaine central DRWD est représenté en bleu pâle, vert et jaune et le domaine RING est représenté en orange et rouge. 1.4.4.1 Le domaine ELF Le domaine ELF fait référence à sa ressemblance aux enzymes de type E2 ubiquitine ligase comme UBE2T ou UBE2W. Le domaine ELF comporte d'ailleurs 22% de similarité à ces deux protéines. Cependant, le domaine catalytique des enzymes de type E2 ne se retrouve pas chez FANCL et en conséquence, on ne pense pas que ce domaine puisse remplacer UBE2T ou UBE2W, les enzymes E2 associées à FANCL (Cole et al., 2010). Le domaine comprend les acides aminés 1 à 108 et est encodé par les 5 premiers exons du gène FANCL. Tel qu'illustré à la figure 5, le domaine ELF fait bande à part chez la drosophile, mais il serait plus rapproché chez l'humain pour permettre une interaction plus intime entre les domaines. Originellement, le domaine ELF avait été identifié par Gurtan et collaborateurs en tant que première de trois répétitions WD40 et c'est le modèle qui a prévalu jusqu'en 2010. La suppression du domaine WD40-1, donc d'une bonne partie de l'ELF, n'avait pas réussi à complémenter des cellules EUFA868, des cellules déficientes en 35 FANCL, dans un test de survie à la mitomycine C, indiquant que ce domaine est essentiel à la fonction de la protéine chez l'humain (Gurtan et al., 2006). Toutefois, la fonction précise du domaine ELF est encore inconnue, puisqu'aucune interaction n'a été identifiée jusqu'à maintenant pour ce domaine. On sait cependant que l'absence de ce domaine empêche l'interaction avec FANCB (Medhurst, 2006). Il a d'ailleurs été démontré que l'ELF de drosophile n'interagit pas avec FANCD2 ni avec FANCI (Cole et al., 2010). Conjointement avec les deux domaines RWD, le ELF et le DRWD forment trois domaines de la superfamille des domaines de conjugaison d'ubiquitine. L'article de Cole et collaborateurs en 2010 a néanmoins ciblé des acides aminés importants pour des interactions protéine-protéine conservés de la drosophile à l'humain. Ainsi, chez la drosophile, les acides aminés Leu53, Phe56 et Leu76, qui forment une pochette hydrophobe entre l'hélice alpha 2 et le feuillet beta 5 pourraient agir dans des interactions protéiques. On note aussi un chemin hydrophobe entre les acides aminés Val33 du deuxième feuillet beta et Trp40 du troisième feuillet beta ainsi qu'une autre pochette hydrophobe formée des acides aminés Val7, Leu10 et Leu82, qui connectent aussi le feuillet beta 5 à l'hélice alpha 2. Comme ces pochettes sont aussi impliquées dans des interactions protéiques dans d'autres membres de la famille des domaines de conjugaison d'ubiquitine et que ces acides aminés sont bien conservés chez les différents homologues de FANCL dont l'humain, il est fort probable que ces acides aminés aient un rôle important à jouer dans la protéine. D'ailleurs, les acides aminés essentiels pour l'interaction avec FANCB sont encore inconnus à ce jour. 1.4.4.2 Le domaine URD Le domaine URD est un domaine extrêmement intéressant de par son unicité. Ce domaine est en fait un intermédiaire entre un domaine E2 et un domaine double RWD. Il diffère donc du domaine double RWD de la protéine de la drosophile, puisqu'il contient un domaine de conjugaison d'ubiquitine (UBC) et un seul RWD. Chez l'humain, ce domaine s'étend des acides aminés 109 à 293 et forme environ la moitié de la protéine. Malgré le taux de similarité assez élevé entre la protéine humaine et celle de la drosophile, l'identité entre les deux séquences est basse à 21% ce qui pourrait résulter en des différences fonctionnelles chez l'humain et chez la drosophile (Hodson et al., 2011),. 36 Chez l'humain, il a été démontré que ce domaine est non essentiel et dispensable pour la liaison à UBE2T mais qu'il est indispensable pour interagir avec FANCD2 et FANCI. Deux pochettes hydrophobes situées à la fin du domaine sont essentielles à ces interactions, et des mutations dans chaque pochette Leu248Ala / Phe252Ala / Leu254Ala / Ile265Ala et Trp212Ala / Leu214Ala réduisent significativement la liaison à FANCD2. En plus d'être essentiels à l'interaction avec FANCD2 et FANCI chez l'humain, ces acides aminés sont conservés à travers les espèces. La région a également été identifiée comme essentielle à la stabilité du complexe cœur de Fanconi (Gurtan et al., 2006). En effet, une version tronquée de FANCL contenant les acides aminés 1-306 est capable de lier le complexe de façon stable, alors qu'une version contenant seulement les acides aminés de 1-275 en est incapable. Les acides aminés 275306 ne forment pourtant aucun domaine précis mais assurent la liaison entre les domaines URD et RING. On pense que cette région ne serait probablement pas impliquée fonctionnellement dans l'interaction avec FANCD2 et FANCI mais qu'elle serait requise pour la stabilité du RWD. Cependant, aucune des versions 1-275 ou 1-306 n'est capable de complémenter la monoubiquitination de FANCD2, laissant cette fonction spécifiquement au domaine RING. Plus précisément encore, les mutations spécifiques R226E, W201A, et W274A empêchent la formation du complexe cœur lorsqu'elles sont présentes (Hodson et al., 2011). Le domaine URD est également spécifiquement impliqué dans une interaction avec PCNA (Geng et al., 2010). La version tronquée 1-306 de FANCL permet d'immunoprécipiter PCNA; plus spécifiquement, le domaine URD permet l'immunoprécipitation PCNA, alors que le domaine ELF ne le permet pas. De plus, cette interaction est directe puisqu'une protéine GST-PCNA immobilisée sur billes d'agarose réussit à immunoprécipiter une version de FANCL traduite in vitro. La même étude a démontré que la monoubiquitination de PCNA par RAD18 n'est pas nécessaire pour l'interaction entre PCNA et FANCL, mais que la version ubiquitinée de PCNA stimule la monoubiquitination de FANCD2 et FANCI par FANCL. La monoubiquitination de PCNA ne peut pas être réalisée par FANCL, car la déplétion de FANCL ne réduit pas le taux de monoubiquitination de PCNA 37 1.4.4.3 Le domaine RING Le premier domaine RING a été défini par Freemont et collaborateurs en 1991 (Freemont et al., 1991). Le domaine RING de FANCL s'étend des acides aminés 294 à 375 et accomplit la principale fonction catalytique de FANCL, soit le transfert d'une molécule d'ubiquitine de 7 kDa d'une enzyme E2, UBE2T ou UBE2W, à l'une ou l'autre des protéines FANCD2, FANCI ou la beta-caténine (Machida et al., 2006) (Zhang et al., 2011). Cette fonction est essentielle pour l'activation du recrutement des gènes de réparation de l'ADN, et lorsque le domaine RING de FANCL n'est pas présent dans son intégralité, il ne peut y avoir réparation complète des ponts interbrins. Originellement, le domaine catalytique prédit de FANCL a été catégorisé en tant qu'un doigt domaine de plante à homéodomaine (doigt PHD). Il y a toutefois un débat afin de savoir si les doigts PHD ne seraient pas mieux classés comme des variants des domaines RING E3 (Gurtan et al., 2006) (Lipkowitz et al., 2011). L'appellation RING semble maintenant prévaloir sur l'ancienne nomenclature. L'importance du domaine RING est entre autre soulignée par le fait que ce domaine était non fonctionnel dans les deux cas d'anémie de Fanconi attribués à FANCL à ce jour. Dans le premier cas, le domaine RING était complètement supprimé et dans le deuxième, les mutations p.Ile336_Cys337delinsSer et p.Thr367AsnfsX13 inactivaient FANCL, la première mutation étant la plus grave. Cela nous renseigne que l'un des acides aminés 336 et/ou 337 est essentiel; la cystéine en position 337 a probablement une importance dans la structure tertiaire de FANCL en formant un pont disulfure. On sait aussi que les mutations C307A et W341G ne permettent pas de complémenter des cellules déficientes (Gurtan et al., 2006) (Hodson et al., 2011). Il a récemment été prouvé que le domaine RING est nécessaire et suffisant pour lier l'enzyme E2 UBE2T (Hodson et al., 2011), même s'il avait été montré auparavant que pour la protéine de poulet, les domaines WD40 et RING étaient nécessaires pour cette interaction (Alpi et al., 2008). Il en va de même pour UBE2W, qui interagit aussi spécifiquement avec le domaine RING de FANCL chez l'humain (Yingying Zhang et al., 2011), mais qui nécessite le domaine WD40 chez le poulet. UBE2W était déjà connue pour interagir avec le domaine RING de BRCA1. Il a été démontré de façon élégante que FANCL et UBE2T colocalisaient ensemble dans le noyau lorsqu'elles étaient surexprimées 38 en même temps. De plus, UBE2W semble spécialement impliquée avec FANCL lorsque les dommages à l'ADN sont causés par des radiations UV. Jusqu'à présent aucune étude n'a montré de monoubiquitination in vitro de FANCD2 par FANCL avec la protéine humaine (Gurtan et al., 2006), probablement parce qu'il y a nécessité d'avoir un complexe cœur assemblé et/ou simplement parce que la protéine est insoluble dans la plupart des tampons (Alpi et al., 2008) (Cole et al., 2010). La protéine est en fait difficile à purifier, alors qu'il est possible d'obtenir des quantités en milligrammes pour celle de la drosophile et que la protéine de poulet est beaucoup plus facile à purifier. 1.4.5 L'ubiquitination Une voie de signalisation majeure pour réguler les fonctions des protéines réfère à l'attachement d'une molécule d'ubiquitine de façon covalente. Ce mécanisme de modification post traductionnelle est entre autre présent dans la division cellulaire, la réponse immunitaire et le développement embryonnaire (Schulman et al., 2009). L'ajout de 4 molécules d'ubiquitine ou plus à partir de leur lysine 48 marque les protéines cellulaires pour la dégradation par le protéasome 26S (Chau et al., 1989) (Thrower et al., 2000). En contraste, la monoubiquitination ou la polyubiquitination avec des chaînes liées par la lysine 63 de l'ubiquitine sert de signal intracellulaire pour la modification de la fonction d'une protéine. Chacune des 7 lysines de l'ubiquitine peuvent être utilisées pour la formation de chaîne de polyubiquitine, conférant ainsi une grande variété de signaux moléculaires distincts par lesquels les protéines peuvent être modifiées (Tauriello et al. 2010). La monoubiquitination est utilisée dans la réparation de l'ADN, avec des protéines qui jouent des rôles centraux telles que BRCA1, FANCL et RAD18. Les ubiquitines sont généralement attachées à d'autres protéines par une cascade d'enzymes E1, E2 et E3 qui catalysent cette réaction. 1.4.5.1 Les enzymes de type E1 Au début de chaque réaction d'ubiquitination se trouve une enzyme E1, ou enzyme d'activation, qui active l'ubiquitine et dirige celle-ci vers les sentiers métaboliques en aval. Les réactions impliquant les enzymes E1 sont probablement celles les mieux caractérisées. L'activation d'une molécule d'ubiquitine se fait en 2 étapes. Rapidement, l'activation d'une 39 molécule d'ubiquitine débute par l'adénylation de celle-ci par une adénine monophosphate conjuguée à un ion magnésium (AMP•Mg2+). Ensuite, l'activation de l'ubiquitine mène à la formation d'un lien thioester à haute énergie entre la portion C-terminale adénylée de l'ubiquitine et la cystéine catalytique de l'enzyme E1. Ce conjugué permet ensuite d'interagir avec des enzymes E2 pour la suite de la réaction. Chez l'humain, on connaît huit enzymes E1 qui peuvent initier des réactions d'ubiquitination (Schulman et al., 2009). Toutes les enzymes E1 ont une cystéine catalytique en commun située dans un domaine d'adénylation lui aussi conservé entre les enzymes E1. 1.4.5.2 Les enzymes de type E2 Les enzymes de type E2 sont des enzymes dites de conjugaison d'ubiquitine. Initialement, les enzymes E2 étaient considérées seulement comme des transporteurs qui transféraient une molécule d'ubiquitine d'une enzyme E1 à une enzyme E3. Les avancées dans ce domaine ont démontré que les enzymes E2 doivent accomplir plusieurs fonctions. En plus d'interagir avec une enzyme E1 pour former un lien thioester avec la portion C-terminale de l'ubiquitine activée, elles peuvent interagir avec plusieurs enzymes E3 (Wenzel et al., 2011). Elles peuvent de plus déterminer si le produit de la réaction sera une monoubiquitination ou une polyubiquitination (Windheim et al., 2008). Aussi, une même enzyme E2 peut interagir avec plusieurs enzymes E3, tel que UBE2W interagit avec BRCA1 (Christensen et al., 2007) et FANCL (Yingying Zhang et al., 2011), et une même enzyme E3 peut interagir avec plusieurs enzymes E2, tel que FANCL interagit avec UBE2T (Machida et al., 2006) et UBE2W. Les enzymes E2 sont facilement reconnaissables de par un domaine de 150 acides aminés qui est très bien conservé autant entre les différentes enzymes E2 qu'à travers les espèces. Ce domaine contient une pochette hydrophobe qui abrite, tout comme chez les enzymes E1, une cystéine catalytique qui sert à lier l'ubiquitine et à catalyser le transfert de celle-ci au substrat. Un élément notoire est un motif «HPN», formé de trois résidus histidine-proline-arginine généralement trouvés à 10 résidus du côté N-terminal de la cystéine. On pense que l'histidine joue un rôle de structure dans la formation du site actif de l'enzyme E2 alors que l'arginine catalyserait le transfert de l'ubiquitine sur la lysine du substrat (P.-Y. Wu et al., 2003). Deux enzymes de type E2 interviennent spécifiquement dans le complexe 1 de la voie 40 FANC-BRCA: UBE2T et UBE2W. Cette dernière a d'abord été identifiée en tant que partenaire de BRCA1 en compagnie de 5 autres enzymes E2: UbcH6, Ube2e2, UbcM2, Ubc13 et Ube2k (Christensen et al., 2007). Alpi et collaborateurs ont ensuite découvert qu'UBE2W interagissait avec la protéine FANCL de poulet (Alpi et al., 2008) et récemment cette interaction a été démontrée chez l'humain (Yingying Zhang et al., 2011). Le transfert d'ubiquitine se fait sur la cystéine en position 91 de la protéine, et la mutation de cet acide aminé en sérine abolit la fonction d'UBE2W. Zhang et collaborateurs ont par ailleurs observé que la diminution du taux d'UBE2W diminue la monoubiquitination de FANCD2 induite par les rayons UV mais ne diminue pas la monoubiquitination de FANCD2 induite par la MMC, laissant cette fonction à UBE2T. Cette dernière est considérée comme la partenaire E2 principale de FANCL. L'absence d'UBE2T mène à un phénotype similaire à celui de cellules déficientes en FANCL ou en FANCA et entraîne une grande diminution de la monoubiquitination de FANCD2 (Machida et al., 2006). 1.4.5.3 Les enzymes de type E3 Chez les eucaryotes, on rencontre majoritairement deux types d'enzymes E3, définies principalement par la présence d'un domaine HECT ou RING. FANCL, quant à elle, appartient à la famille des ubiquitines ligases RING. Chez l'humain seulement, on dénombre environ 616 domaines ubiquitines ligases RING potentiellement exprimés (Deshaies et al., 2009). La séquence type d'un domaine RING est la suivante: Cys-X2-CysX(9-39)-Cys-X(1-3)-His- X(2-3)-Cys-X2-Cys-X(4-48)-Cys-X2-Cys, où X peut représenter n'importe quel acide aminé. Les domaines PHD partagent un patron similaire de résidus Cys et His (Borden et al., 1996), mais ils se replient différemment et ne sont généralement pas impliqués dans l'ubiquitination (Scheel et al., 2003) (Aravind et al., 2003), ce qui renforce l'idée que le domaine C-terminal de FANCL appartient au groupe RING plutôt qu'au groupe PHD. Les cystéines et l'histidine conservées sont généralement logées au cœur des domaines RING, où elles servent à maintenir l'intégrité du domaine en formant des liaisons en liant deux atomes de zinc (Figure 6). 41 Figure 6: L'arrangement typique d'un domaine RING (a) La séquence primaire de l'enzyme E3 HC. La première cystéine qui coordonne un atome de Zinc est notée C1 et ainsi de suite, l'histidine qui forme le ligand est notée H1 et les résidus formant l'espace entre les résidus liant un atome de Zinc sont notés Xn. (b) La structure tridimensionnelle cristallisée de cCbl. (c) Des variations de séquences dans des enzymes E3 ligases (rouge) ressemblant à des domaines RING, mais qui ont un autre résidu remplaçant une cystéine pour former un lien avec un atome de zinc. Les domaines PHD et LIM ne forment pas un domaine RING et en comparaison aux autres enzymes présentées, ne possèdent pas d'activité E3 ligase. (Deshaies et al., 2009). Historiquement, lorsque le premier motif RING a été découvert, 27 autres protéines contenant ce motif ont pu être identifiées. Plusieurs de ces protéines avaient des fonctions impliquant l'ADN. Ainsi, il a d'abord été suggéré que les domaines RING servaient à lier l'ADN. On sait maintenant que ces domaines servent à réguler le transfert d'ubiquitine à un substrat en se liant à une enzyme E2. La liaison semble aussi «activer» l'enzyme E2. La 42 première démonstration d'une interaction entre une enzyme E2 et une enzyme E3 RING a été réalisée en 2000, alors que Zheng et collaborateurs ont établi la structure cristallographique de l'enzyme E3 c-Cbl liée à l'enzyme E2 UbcH7 (Zheng et al., 2000). Les enzymes E3 peuvent être régulées de plusieurs façons. Tout d'abord, la phosphorylation intervient dans presque tous les sentiers métaboliques, et l'ubiquitination ne fait pas exception. Les substrats des enzymes E3 peuvent effectivement être phosphorylés pour activer l'interaction entre les deux protéines. À l'inverse, c'est parfois les enzymes E3 et/ou E2 qui peuvent être phosphorylées pour activer l'interaction. Dans d'autres cas, l'ubiquitination peut être régulée par la liaison à d'autres partenaires qui vont activer l'enzyme E3. Le rôle d'une enzyme E3 ligase est principalement d'amener l'enzyme E2 et le substrat à proximité l'un de l'autre et de catalyser le transfert de l'ubiquitine. L'apposition d'une molécule d'ubiquitine peut se faire par le transfert direct de l'ubiquitine de l'enzyme E2 au substrat ou, pour un sous-groupe d'enzymes, de l'enzyme E2, à l'enzyme E3 puis au substrat. Dans le cas de FANCL, c'est la première situation qui prévaut. 1.4.5.4 L'ubiquitination de FANCD2, FANCI et de la beta-caténine par FANCL La monoubiquitination de FANCD2, 1451 acides aminés, est l'étape clé de la voie FANCBRCA. Un défaut dans n'importe quel des gènes FANC du complexe cœur empêche la monoubiquitination de FANCD2 et par conséquent l'activation de la réparation de l'ADN. La première enzyme proposée en tant qu'ubiquitine ligase pour accomplir cette fonction a été BRCA1 (Garcia-Higuera et al., 2001). Cette idée était supportée par le fait que BRCA1 interagit directement avec FANCA (Folias et al., 2002) et que la monoubiquitination de FANCD2 était défectueuse en réponse à des radiations ionisantes dans une lignée déficiente en BRCA1 (Garcia-Higuera et al., 2001). Malgré tout, cette hypothèse n'arrivait pas à expliquer que la monoubiquitination de FANCD2 ait quand même lieu dans des lignées déficientes en BRCA1 mais pas dans des lignées déficientes en n'importe quel des gènes FANC du complexe cœur. La découverte de FANCL a permis de découvrir que ce dernier était un membre à part entière du complexe cœur de Fanconi et qu'il était la seule protéine du complexe cœur à posséder une fonction E3 ubiquitine ligase. La réduction de l'expression de FANCL par siRNA abolit complètement la monoubiquitination basale de FANCD2 et réduit drastiquement celle induite par la MMC (Meetei et al., 2004). D'autre 43 part, la mutation d'une des 7 cystéines catalytiques de FANCL, C307A, abolit la capacité de FANCL d'interagir avec UBE2T et par le fait même sa capacité d'ubiquitiner FANCD2. L'activation de FANCD2 se fait par l'attachement d'une seule molécule d'ubiquitine sur la lysine 561 de FANCD2 par FANCL et UBE2T. Cet évènement se produit suite à des dommages à l'ADN ou simplement lors de la réplication normale de l'ADN (GarciaHiguera et al., 2001) (Taniguchi, Garcia-Higuera, et al., 2002b). Quoiqu'il soit essentiel, le rôle individuel des autres protéines du complexe cœur dans la monoubiquitination de FANCD2 est encore mal compris. FANCI, un gène paralogue de FANCD2 est une partie intégrante de la voie Fanconi (Smogorzewska et al., 2007). On reconnaît principalement cette protéine de 1328 acides aminés pour son association avec FANCD2, avec laquelle elle forme un complexe hétérodimérique: le complexe ID décrit précédemment. Les fonctions de FANCI étaient jusqu'à tout récemment inconnues, et malgré certaines découvertes à son sujet, ses fonctions exactes restent encore peu claires. De récentes études ont permis d'éclaircir la situation. FANCI peut être monoubiquitiné sur sa Lysine-523, et cela se produit lorsqu'il y a dommage à l'ADN (Sims et al., 2007). Ces dommages peuvent entre autres être induits par l'hydroxyurée, les UV-C et la MMC. L'ubiquitination de FANCI lui permet de se relocaliser sur la chromatine en compagnie de FANCD2 monoubiquitiné pour favoriser ensuite la réparation de l'ADN (Longerich et al., 2009). La monoubiquitination de FANCD2 est requise pour que la relocalisation puisse avoir lieu. FANCI colocalise alors dans les foyers de réparation avec FANCD2 et l'histone H2AX phosphorylée. On sait également que dans des lignées cellulaires déficientes en FANCA ou FANCG, la monoubiquitination de FANCI est déficiente, mais qu'elle peut être rétablie lorsqu'on restaure le phénotype sauvage des cellules. Tout comme FANCD2, FANCI requiert donc un complexe cœur intact pour être monoubiquitiné. De façon intéressante, FANCI nécessite la présence de FANCD2 pour être activé à son tour. L'absence ou la diminution du taux de FANCD2 empêche FANCI d'être monoubiquitiné. FANCI est monoubiquitiné par la paire FANCL-UBE2T. La forme défectueuse de FANCL C307A ou une forme déficiente d'UBE2T C86A sont incapables de mener à l'ubiquitination de FANCI (Machida et al., 2006). 44 Tout récemment, un nouveau substrat pour FANCL a été identifié en la beta-caténine (Dao et al., 2012). On avait déjà prédit que FANCL avait potentiellement d'autres partenaires, et il est fort probable qu'il en reste d'autres à découvrir. Comme mentionné plus tôt, l'un des symptômes caractéristiques de l'anémie de Fanconi est l'insuffisance médullaire. Alors que les fonctions des gènes FANC dans la réparation de l'ADN sont relativement bien étudiées, certains faits suggéraient des fonctions alternatives pour ces protéines dans les cellules souches hématopoïétiques (HSC). La voie de Wnt avait été préalablement ciblée de par son importance dans le développement des HSC et dans le destin des cellules et parce que cette voie est entre autre régulée par l'ubiquitination (Tauriello et al., 2010). De plus, de récentes études ont démontré que la poly-ubiquitination de la beta-caténine sur une lysine autre que la 48 augmentait l'activité fonctionnelle de celle-ci (Shekhar et al., 2008) (Hay-Koren et al., 2011). Dao et collaborateurs ont démontré que la formation de chaînes d'ubiquitines peut être faite par FANCL sur les lysines 11 et 63 de l'ubiquitine et proposent que cette modification post-traductionnelle augmente l'affinité de son interaction avec la chromatine pour favoriser l'activation de la voie de Wnt. La surexpression de FANCL conduit à une augmentation de la beta-caténine en général. À l'inverse, une suppression de FANCL inhibe de façon marquée la signalisation de la voie de Wnt. Plus encore, ces défauts mènent à une expression génique réduite des éléments de réponse de la voie de Wnt Cycline D1, c-Myc et Axine2. La perte de c-Myc est particulièrement importante parce qu'il est un facteur clé de pluripotence dans les cellules souches de tissus spécifiques, incluant les HSC (B. Hoffman et al., 2002) (Reya et al., 2003) (Smith et al., 2010). Il est également suggéré que d'autres membres du complexe cœur pourraient mener à ces résultats lorsqu'inactivés. 45 Tableau 3: Taux de conservation de la protéine FANCL chez les différentes espèces en comparaison avec la protéine humaine à partir d'alignements réalisés sur le site ensembl©, version 62 (www.ensembl.org) * L'exon 4 seulement n'est pas présent chez le dauphin ** Le domaine en portion N-terminale de FANCL n'est pas présent chez le cochon 46 1.5 Problématique 1.5.1 L’exemple du cancer du sein Le cancer su sein est l'un des cancers pour lequel une composante familiale est le plus facilement détectable. La présence de deux gènes de susceptibilité à haute pénétrance, BRCA1 et BRCA2, compte pour moins de 25% des cancers du sein héréditaires. Cependant, malgré la facilité à identifier une composante génétique pour certains cancers du sein, l'origine génétique de plus de 50% des cancers du sein reste inexpliquée (Ripperger et al., 2009). Il est peu probable que d'autres gènes de susceptibilité conférant un risque élevé de cancer comme STK11, CDH1, PTEN et TP53, conjointement à BRCA1 et BRCA2, soient responsables pour plus de 25% des cancers du sein de type familial (Antoniou et al., 2006) et l'existence d'un gène BRCA3 est maintenant exclue à toute fin pratique (Nathanson et al., 2001) (Turnbull et al., 2008) (Stratton et al., 2008). Il est donc présentement assez largement accepté qu'il ne reste plus de gènes de susceptibilité à haute pénétrance responsables d'une portion significative de cancers du sein à découvrir. Il faut donc se tourner vers d'autres avenues pour tenter d'expliquer la proportion restante de cancers du sein héréditaires. C'est pourquoi un bon nombre de chercheurs se tournent de plus en plus vers des variants génétiques plus communs à pénétrance modérée ou faible pour tenter d'expliquer cette proportion restante de cancers du sein. Des candidats de choix pour ce type d'étude sont les gènes FANC, puisqu'ils fonctionnent de pair avec BRCA1 et BRCA2 dans la voie de réparation de l'ADN FANC-BRCA. Les gènes BRCA2/FANCD1, PALB2/FANCN, BRIP1/FANCJ et RAD51C/FANCO sont tous des gènes de susceptibilité au cancer du sein qui ont plus tard été identifiés en tant que gènes FANC. Inversement, il est raisonnable de penser que d'autres gènes FANC puissent avoir un effet faible ou modéré sur la susceptibilité au cancer du sein. 1.5.2 Gène à l'étude: FANCL La fonction E3 ubiquitine ligase du gène FANCL est l'élément clé de la voie FANC-BRCA, puisqu'elle permet de monoubiquitiner FANCD2 et ainsi activer le recrutement des gènes de réparation de l'ADN. Il va donc sans dire que FANCL joue un rôle central dans cette voie. Une malfonction de FANCL cause l'anémie de Fanconi et pourrait avoir une incidence sur la susceptibilité à plusieurs types de cancers. Comme mentionné à la section 47 1.4.2, au moins trois études d'association se sont intéressées à FANCL jusqu'à maintenant: une sur le cancer du sein (García et al., 2009), une sur le cancer de l'œsophage (Akbari et al., 2011) et l'autre sur le cancer du col de l'utérus (Juko-Pecirep et al., 2011). Ces études ont examiné principalement les sections exoniques de FANCL et ont obtenu certains résultats intéressants qui laissent penser que certaines mutations de FANCL pourraient augmenter la susceptibilité au cancer. L'étude portant sur le cancer du sein est celle qui s'est le plus penchée sur les régions introniques et sites d'épissage de FANCL. Des analyses informatiques ont été réalisées pour les variants de séquence trouvés, mais aucune démarche n'a été entreprise pour évaluer l'effet fonctionnel de ces variants dans l'épissage des exons de FANCL. 1.5.3 Objectif général de l’étude: le variant d'épissage FANCL∆4 Un variant d'épissage de FANCL a été observé dans l'équipe de la Dre Francine Durocher. Dans ce variant d'épissage, le 4e exon de FANCL est omis, générant ainsi une protéine plus courte de 19 acides aminés. Ce variant d'épissage n'a jamais été rapporté auparavant, mais il a déjà été démontré que des variants d'épissage de FANCL pouvaient mener au développement de cancers (Jun Zhang et al., 2010b). De plus, l'exon 4 de FANCL est très bien conservé à travers les espèces (Tableau 3). Mon projet de maîtrise consistera donc à étudier ce nouveau variant d'épissage afin d'en évaluer les fonctions, caractéristiques et effets potentiels dans la cellule. Je devrai également évaluer si FANCL∆4 est retrouvé de façon importante ou seulement sporadique dans la population québécoise. Ultimement, cette étude a pour but de mieux connaître les variants d'épissage qui peuvent avoir une implication dans le risque développer un cancer. 1.5.4 Objectifs spécifiques de l'étude 1. Évaluer l'effet de différentes variations de séquence (SNP) sur l'épissage de l'exon 4 de FANCL 2. Quantifier le variant d'épissage FANCL∆4 dans différentes lignées cellulaires et dans une cohorte de patientes atteintes de cancer du sein 3. Vérifier la traduction de l'ARN messager de FANCL∆4 en protéine 4. Évaluer l'effet fonctionnel du saut de l'exon 4 dans la protéine FANCL 48 CHAPITRE 1 Regulated expression of a FANCL splicing variant as a potential modifier of DNA repair activity Christopher St-Laurent Pedneault, Karine Plourde, Simon Bélanger, Geneviève Ouellette, Frédérick Bouffard, Yvan Labrie, Francine Durocher* Published on June 06 2013 in Journal of Genetic Syndromes & Gene Therapy Cancer Genomics Laboratory, Centre de Recherche du CHU de Québec, CHUL, and Laval University, Québec, G1V 4G2, Canada; *Corresponding author: Dr Francine Durocher Cancer Genomics Laboratory Centre de Recherche du CHU de Québec, CHUL 2705 Laurier Boulevard, T2-53 Québec City, Québec, Canada, G1V 4G2 Tel: 418-654-2296 Fax: 418-654-2278 e.mail: [email protected] Keywords: FANCL, Fanconi Anemia, Splicing, DNA repair 49 Résumé Quinze protéines de l'Anémie de Fanconi travaillent de concert afin de réparer des ponts interbrins, en réponse aux dommages à l'ADN. Des mutations monoalléliques associées à une prédisposition au cancer du sein ont été trouvées pour les gènes FANCD1/BRCA2, FANCJ/BRIP1, FANCN/PALB2 et FANCO/RAD51C. La monoubiquitination de FANCD2, qui représente l'évènement clé de la voie de réparation FANC/BRCA, est catalysée par FANCL, qui est la seule protéine FANC connue à posséder une activité ubiquitine ligase. Nous avons identifié et étudié l'expression et l'impact d'une isoforme d'épissage alternative du gène FANCL (FANCL∆4) sur le processus de réparation de l'ADN ainsi que sa localisation cellulaire. Une isoforme de FANCL affichant une exclusion de l'exon 4 a été isolée chez des patientes de cancer du sein non-BRCA1/2 et est présente dans plusieurs lignées cellulaires humaines. L'efficacité de la traduction de l'isoforme FANCL∆4 en une protéine fonctionnelle a été démontrée en utilisant les fractions ribosomales. Malgré le fait que les analyses in silico n'aient pas révélé d'implication potentielle au niveau de la variation de la séquence, le contrôle de l'expression de l'isoforme par un variant génomique spécifique situé 11 nucléotides en amont de l'exon 4 a été démontré. Des expériences menées dans des cellules déficientes en FANCL transfectées avec l'isoforme FANCL∆4 démontraient une survie cellulaire réduite, un blocage en G2/M et l'absence de monoubiquitination de FANCD2. La protéine FANCL∆4 reste dans le cytoplasme suite au traitement à la mitomycine C dans des cellules HEK293T transfectées, contrairement à la protéine FANCL qui migre au noyau sous les mêmes conditions. Une isoforme d'épissage alternatif d'un gène FANC donné peut avoir un impact sur la sévérité des manifestations cliniques lorsqu'elle est combinée à d'autres mutations FANC, comme c'est le cas pour les patients atteints d'anémie de Fanconi et de cancer du sein. L'évaluation de la sensibilité de l'isoforme FANCL∆4 aux agents chimiothérapeutiques fréquemment utilisés dans le traitement du cancer serait d'intérêt dans un contexte de suivi à long terme d'individus atteints et de leur famille. 50 Abstract Fifteen Fanconi Anemia (FA) proteins work altogether to repair DNA interstrand crosslinks (ICLs) in response to DNA damage. Monoallelic mutation associated with breast cancer predisposition has been demonstrated for the FANCD1/BRCA2, FANCJ/BRIP1, FANCN/PALB2 and FANCO/RAD51C genes. The monoubiquitination of FANCD2, which represents the key event of the FANC/BRCA repair pathway is catalyzed by FANCL, which is the only FA protein known to possess an ubiquitin ligase activity. We have identified and studied the expression as well as the impact of a splicing isoform of the FANCL gene (FANCL∆4) on DNA repair processes as well as its cellular localization. A FANCL splicing isoform showing the skipping of exon 4 has been isolated in nonBRCA1/2 breast cancer patients and is expressed in several human cell lines. The efficient translation of the FANCL∆4 isoform into a functional protein has been shown using the polyribosomal fractions. Although in silico analyses did not reveal any potential implication of any sequence variation, the expression of this isoform has been demonstrated to be under the control of a specific genomic variant localized 11 nucleotides upstream of exon 4. Experiments performed in FANCL-deficient cells transfected with the FANCL∆4 isoform demonstrated a decreased cell survival, G2/M cell cycle blockade and absence of FANCD2 monoubiquitination. The FANCL∆4 protein remains localized in the cytoplasm in transfected HEK293T cells following mitomycin C treatment, unlike the FANCL protein that migrates to the nucleus under such conditions. A splicing isoform of a given FA gene may impact on the severity of the clinical manifestations when occurring in a FA mutation background, such as what is seen with FA and breast cancer patients. Evaluation of the sensitivity of this FANCL∆4 isoform to chemotherapeutic agents commonly used in cancer treatment would be of interest in the context of long-term management of affected individuals and their families. 51 Abbreviations FBS: Fetal bovine serum DNA: deoxyribonucleic acid cDNA: complementary deoxyribonucleic acid DAPI: 4’, 6-diamidino-2-phenylindole ELF: E2-Like-Fold HWE: Hardy-Weinberg equilibrium INHERIT: Interdisciplinary health research international team on breast cancer susceptibility kb: kilobase MMC: Mitomycin C PBS: phosphate buffered saline PBS-T: phosphate buffered saline supplemented with 0,1% triton PLB: polysome lysis buffer RIN: RNA Integrity Number RING: really interesting new gene RIPA: radioimmunoprecipitation assay buffer RNA: ribonucleic acid SDS-PAGE: sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis URD: Ubiquitin-Conjugating-RWD 52 Introduction Breast cancer susceptibility has been demonstrated to be modified by germline mutations in several genes such as BRCA1, BRCA2, TP53, ATM, CHEK2, BRIP1, PALB2 and RAD51C. These breast cancer susceptibility genes represent the major heritability portion of familial breast cancer, and mutations in these genes are found in less than 25% of breast cancer families showing a clear pattern of inheritance [1-3]. Thus, other susceptibility alleles remain to be identified to explain the increased susceptibility in the remnant high-risk families. Of interest, among the genes recently associated with an increased susceptibility to breast cancer, four are Fanconi Anemia (FA) genes: FANCD1/BRCA2, FANCJ/BACH1/BRIP1, FANCN/PALB2 and FANCO/RAD51C [4-13]. It is noteworthy that most of the genes associated with breast cancer susceptibility, including FA genes, are involved in DNA repair mechanisms. Until now 15 distinct complementation groups of FA proteins have been described by cell fusion, cell transduction studies or protein complex purification (FA-A, -B, -C, -D1, -D2, E, -F, -G, -I, -J, -L, -M, -N, -O, -P) [14-16]. FA is a rare autosomal or X-linked (FANCB) recessive disease associated with congenital abnormalities, progressive bone marrow failure and increased susceptibility to cancer [17-21] such as Acute Myeloid Leukemia, aerodigestive and gynaecological cancers [22-25]. The sensitivity of FA cells to cross-linking agents such as mitomycin C (MMC) is used to determine if two distinct cell lines belong to the same complementation group. The FANCL protein through its E3 ubiquitin ligase domain, is the only FANC protein to exhibit the catalytic function needed for FANCD2 and FANCI monoubiquitination [26,27], and this represents the key event in DNA repair of interstrand cross-link (ICL) damages. Following this monoubiquitination, the activated FANCD2-FANCI proteins recruit or interact with DNA repair proteins such as FAN1, BRCA1/2, FANCN, FANCJ, RAD51C as well as diverse nucleases and polymerases, to accurately repair ICL and double-strand DNA breaks (DSBs) by homologous recombination (HR). 53 In addition, FANCL has been demonstrated to have a key role in foci formation and additional data suggest that FANCL would also own a FANCD2-independant role in ICL repair [28,29]. Cytosolic extracts depleted of FANCL showed a defect in the extent of nucleotide incorporation, (i.e. replication restart) in the presence of MMC and further analysis indicates that the defect is primarily due to the inability of replication forks to elongate past lesions caused by MMC [30]. FANCL mutation may also disrupt the core complex by affecting particularly the mobilization of FANCM into sites of cross-link damage [29]. Given the key function of FANCL and the close connection between the FANC and BRCA1/2 proteins in DNA repair, the coding sequence and intron-exon boundaries of the FANCL gene were analyzed in a cohort of BRCA1/2-negative (BRCAX) breast cancer families and healthy controls from the French Canadian population. We identified a splicing variant that could eventually modulate breast cancer risk and DNA repair efficiency. 54 Material and methods Ascertainment of families and genomic DNA extraction All 96 BRCAX individuals from high-risk French Canadian breast and ovarian cancer families participating in this study were originally part of a larger interdisciplinary program termed INHERIT BRCAs [31,32]. All participants were at least 18 years of age, mentally capable and had to sign an informed consent. Ethics approval was obtained from the participating institutions. The details regarding selection criteria of the breast cancer cases as well as the experimental and clinical procedures have been described previously [33-35]. Lymphocytes from breast cancer individuals were isolated and immortalized as previously described [34,35] and genomic DNA was isolated using the QIAamp DNA Blood kit (Qiagen, Santa Clara, CA). Genomic DNA from peripheral blood of healthy individuals was isolated using Gentra kits (Minneapolis, MN, USA). PCR amplification, direct sequencing and variant characterization PCR amplification of the 14 coding exons of the FANCL gene (NM_001114636.1), as well as the flanking intronic regions, was performed on breast cancer cases using a set of 12 primers pairs listed in Supplemental Table 1A. The PCR products were sequenced with an ABI3730XL automated sequencer using the Big Dye 3.1 kit (Applied Biosystems, Foster City, USA) following the manufacturer’s instructions. Sequence analyses were performed using Staden preGAP4 and GAP4 programs (http://staden.sourceforge.net/). The frequency of the rs79588315 variant was also determined in healthy individuals. Amplification of the alternative spliced isoform FANCL∆4 was performed on complementary DNA (cDNA) from BRCAX individuals and human cell lines using primers listed in Supplemental Table 1B. Deviation from Hardy-Weinberg equilibrium (HWE) and allelic difference of the rs79588315 variant between both series, were evaluated by two-sided Chi Square test with 1 degree of freedom using a web-based software program located at: http://ihg2.helmholtzmuenchen.de/cgi-bin/hw/hwa2.pl. The prediction of the effect of a given variant on exonic and intronic splicing modulators was assessed using the Human Splicing Finder (HSF) [36] which contains all available matrices from auxiliary sequence prediction softwares such as 55 ESEfinder 3.0 program [37,38] for binding sites of the 9G8, Tra2-b and hnRNP A1 proteins. Cell culture maintenance and plasmids HEK293T cells were grown in DMEM (Wisent Inc, St-Bruno, Qc,CAN) with 10% fetal bovin serum (FBS) and 1% penicillin/streptomycin. EUFA868 (FANCL-deficient) cells were obtained from the FA Research Fund and maintained in RPMI-1640 medium supplemented with 15% FBS, 1% L-glutamine and 1% penicillin/streptomycin. All other cell lines are routinely cultured in our laboratory and the conditions have been optimized as recommended by the American Type Culture Collection (ATCC). Concerning MMC treatments, given that the concentrations used was dependent on the experiment, values are indicated in each respective section. pcDNA3 plasmid (Invitrogen) was modified by inserting a HA tag (YPYDVPDYASL) and stop codon using the Apa1 restriction site. Plasmids pEGFP-N3 and pMSCVneo were obtained from Clontech. FANCL WT or FANCL∆4 cDNAs were inserted into EcoR1 and Xho1 restriction sites for pcDNA3-HA and pEGFP-N3, and EcoR1 for pMSCVneo. Plasmid transfection was performed using ExGen 500 (Fermentas) according to manufacturer’s protocol. RNA isolation and qRT-PCR Total RNA from cell lines was extracted using TRI Reagent® (Molecular Research Center inc, Cincinnati, OH, USA) according to the manufacturer’s instructions as previously described [34]. The quality of the RNA samples was verified using a Bioanalyser (Agilent Technologies). Thereafter, reverse transcription of 2.5 mg of standardized RNA samples was performed using 250 ng random hexamers and 200 U of SuperScript™ II RNase HReverse Transcriptase (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) following the supplier’s protocol. Quantification of mRNA levels were performed using the SyBr Green method as described previously [39]. The reactions were carried out using the amount of cDNA corresponding to 20 ng of initial total RNA. Specific splice-junction oligoprimer pairs (Supplemental Table 1B) that allow the amplification of ~200 bp of indicated specific mRNA were 56 designed by GeneTools software and their specificity were checked by blasting the GenBank database. Data calculation and normalization were performed using the secondderivative and double-correction method [39], and three housekeeping genes. The mRNA levels were expressed as number of copies/µg of total RNA calculated using corresponding standard curves. The spliced/WT mRNAs expression ratio were then determined to compare minigene construct expression. Minigene assays The minigene constructs were assembled into the pcDNA3 (Invitrogen Life Technologies, Burlington, ON) vector. The genomic regions containing the exons 3 to 5, which include large flanking intronic sequences (~6.5 kb) were PCR-amplified from BRCAX genomic DNA. The integrity of the total insert was then confirmed by sequencing. Sequence variations observed in our cohort of French Canadian BRCAX breast cancer families were then introduced into the WT minigene construct by directed mutagenesis using the QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit (Agilent Technologies, Mississauga, ON) following manufacturer's recommendations. Primers used for minigene contructs are listed in Supplemental Table 1C. For minigene construct transfection, HEK293T cells were plated at 350 000 cells in 6-wells culture plates (BD Biosciences, Mississauga, ON), and 48 hours after plating, cultures were transfected with 3 µg of minigene plasmid. Cells were harvested 24 hours later for RNA extraction. Cells were rinsed with cold phosphate-buffered (PBS) and then suspended in Tri-Reagent. RNA extraction and cDNA synthesis were processed as described above. For PCR amplification, specific primers for FANCLΔ4 and FANCL mRNA isoforms in combination with a primer specific to the transcribed region of the minigene vector (5’ACGACTCACTATAGGGAGACCCA-3’) [40,41] were designed with the GeneTools (Biotools Inc., Madrid, Spain) software. Ribosomal fractions T47D cells (approximately 4x107 cells per fraction) were grown and then collected at 70% confluency. Cycloheximide (CHX 50µg/ml) was added to cell cultures, incubated for 30 minutes and cells were then rinsed with phosphate-buffered (PBS) - CHX (100µg/ml) and 57 trypsin. Cells were resuspended in PBS- CHX (100µg/ml) at a concentration of 107 cells/ml. The total of 12 ml of cells was then split into 3 samples (-EDTA, +EDTA, protein extraction sample). Cells were centrifuged at 1 600 rpm for 5 minutes and then resuspended in lysis buffer and NP40 (0,5%) was then added. After 10 min on ice, cells were centrifuged at 750 g at 4°C and the supernatant was harvested, kept on ice and subsequently used in the sucrose gradient. Sucrose gradients were prepared with gradient Maker (CBS Scientific Compagny inc, model GM-100). Each fraction counts 3 samples, including the one adjusted at 20mM ethylenediaminetetraacetic acid (+EDTA sample). Samples were separated on a 15%-45% sucrose gradient in lysis buffer (without NP40), and centrifuged 2 hours 15 minutes at 36 000 rpm at 4°C. Gradients were fractionated using the Programmable Density Gradient System (Teledyne Isco incorporated, Lincoln, NE) from the top and measured at A260 to determine the polysome profile. Fractions were then selected for RNA extraction. RNA extraction and qRT-PCR were then performed as described above. Fluorescence microscopy HEK293T cells were transfected with FANCL- or FANCLΔ4-EGFP vectors. Cells were then treated (or not) with MMC. Cells (3.5x105 cells per well) were seeded on microscopic slides coated with L-lysine. HEK293T cells were grown in 15% FBS DMEM medium (Wisent Inc, St-Bruno, Qc, CA) and 16 hours later cells were washed in PBS and then fixed with 4% paraformaldehyde at room temperature (RT). Unspecific binding sites were blocked with 1% BSA and 0,02% sodium azide for 1 hour at RT. Cells were rinsed twice with PBS and then incubated for 15 min with DAPI (4’,6-diamidino-2-phenylindole). Cells on cover slides were rinsed again twice with PBS and then mounted on slides with mounting medium (Sigma-Aldrich). Pictures were taken using a Leica DM5000B microscope with the DFC350x camera with the 40x lens, and imported with Photoshop Professional 5 (Adobe Systems Inc., Seattle, WA). Retroviral transduction HEK293T G/P cells (5x106) were plated in 10 cm petri dishes and incubated at 37°C with 5% CO2 for 8 hours. The pMSCVneomycin (with or without the cDNA of interest), G/P and VSVG vectors were co-transfected using ExGen500 (Fermentas, Fisher Scientific 58 Limited, Nepean, ON) and then incubated overnight in the same conditions. The day after, the medium was replaced with fresh DMEM and cells were incubated for 48 hours under the same conditions, after what the virus were harvested through filtration, aliquoted and kept at -80°C. For infection, EUFA868 cell line was transduced with pMSCVneo retroviral constructs containing FANCLwt or FANCL∆4 cDNA and with empty vector as negative control. The transduced cells were selected with neomycin for approximately 2 months. The complemented cell lines were next analyzed for FANCD2 monoubiquitination, cell cycle arrest and cell survival assay upon MMC treatment. Western Blotting Proteins were extracted from approximately 40x106 cells using standard RIPA buffer protocol. Protein concentrations were measured with the Bradford protein assay using an Infinite M1000 microplate reader and the Megellan program. Protein samples were migrated on a 8% acrylamide gel, using the Mini-Protean Tetra Cell kit (BIO-RAD, Life Science Research, Mississauga, ON) and then transferred onto an Amersham Hybond-ECL nitrocellulose membrane (GE HealthCare, Mississauga, ON). After blocking with 5% milk/PBS, the blot was incubated with the FANCD2 antibody (overnight rocking at 4°C) and secondary antibody (1 hour rocking at RT) diluted in 5% milk/PBS. The primary antibodies used were rabbit anti-FANCD2 (Novus Biologicals, 1:10 000) and rabbit antiCalnexin (Enzo (Life Sciences), 1:1 000) while the secondary antibody was the ECL antirabbit IgG horseradish peroxidase-linked antibody (GE HealthCare, 1:10 000). Blotted proteins were detected using Lumiglo reserve chemiluminescent substrate (KPL). Flow cytometry For cell cycle analysis, EUFA868 cells were grown at a concentration of 350 000 cells/ml and either treated (50 ng/ml) or not with MMC for 24 h. Cells were pelleted at 1500 rpm and washed in PBS twice, and then fixed in ice cold 70% ethanol overnight at -20°C. Fixed cells were pelleted, resuspended in 4°C PBS, pelleted again and resuspended in DNA staining solution (1µg/mL DAPI in PBS) for 15 minutes, after which measurements were taken. Stained cells were sorted on a BD SORP LSR II FACS with a 20 mW Coherent® Solid State UV laser 355 nm w/z PMT with a BP 450/50 filter and data were analyzed using the DIVA (BD Biosciences) and FlowJo (Three Star Inc.) programs. 59 Survival assays An average of 3x105 EUFA868 cells per 10 ml were grown in RPMI medium containing 15% FBS in T-25 flasks. To perform the test, cells were first centrifuged, counted and then diluted to 1.5x104 cells/100µl/well. The 100µl contained the adjusted concentrations of crosslinking agent. The readings were performed after 1, 2, 3, 4, and 5 days. Alamar Blue assays (Invitrogen, Carlsbad CA) were performed according to the manufacturer’s instructions. 10 µl of Alamar Blue was added to each well, and after 4 hours the plate was analyzed using an Infinite M1000 (Tecan Systems inc., San Jose, CA) microplate reader with the Megellan program (Tecan). The negative background was subtracted using the measurements obtained from the negative controls (medium and selective agents alone). For the latter, a number of 1.5x104 EUFA868 cells were plated in a volume of 100 µL in a 96-well plate with corresponding MMC concentrations (0 to 300 nM). Cell survival percentage was measured at day 1 to 5 using Alamar Blue assays according to manufacturer’s protocol. 60 Results In an attempt to identify deleterious or truncating mutations of the FANCL gene that could be associated with breast cancer susceptibility, we sequenced all 14 exons and adjacent intronic sequences in a cohort of 96 breast cancer cases coming from high-risk families. Although no deleterious mutation was found in the FANCL coding region of our French Canadian breast cancer cases, we identified 18 variants in exonic and flanking intronic sequences, including one novel sequence variation (c.375-120insATTA) not reported in the NCBI single nucleotide polymorphism database (dbSNP Build 137) (Table 1). Among the 18 variants, 15 were intronic variants and 3 were located in exonic regions. Two of these coding variations were synonymous changes (c.999C/T and c.1092T/C), while the missense change was a rare variant leading to a Leucine/Phenylalanine amino acid substitution (c.112C/T; Leu38Phe). The Leu38 residue was fully conserved in mammals, therefore suggesting that this amino acid was under strong functional constraint or may have a specific role on protein conformation (data not shown). This amino acid change was predicted to be probably damaging by the Polyphen software with a score of 0.967 (data not shown). This sequence variation was observed in only one breast cancer case (Table 1), and it is located in the E2-like fold protein domain (Figure 1A). All other 15 variants were intronic variations located near intron/exon junctions, including rs79588315, which is located 11 base pairs upstream of exon 4. Again the c.217-11T nucleotide is conserved in all mammalian species and given its location, this position could be involved in splicing regulation. This c.217-11T/C variant was therefore further genotyped in a cohort of healthy individuals from the same origin, and no significant difference of MAF between both sample sets was identified (Table 1). cDNA amplification in BRCAX individuals revealed a significant expression of an alternative spliced isoform of the FANCL gene lacking the exon 4 (FANCL∆4). As illustrated in Figure 1A, this deletion disrupted the E2-like fold and WD-40 protein domains of the FANCL protein. This FANCL∆4 isoform is significantly expressed in leukemia, breast and ovarian cancer cell lines as demonstrated by semi-quantitative PCR (Figure 1B), whereas accurate qRT-PCR revealed high expression of this isoform in most of the breast cancer cell lines expressing the estrogen receptor (ER+) (Figure 1C). Of interest, this isoform is expressed at low levels in ER- (BT-549, MDA-231, BT-20, 61 SKBR3, SUM149 and Hs578T) and non-cancerous cell lines (MCF10A and 12A), while T47D cells expressed higher levels of the FANCL∆4 than of the FANCLwt isoform. Following the identification and expression of the FANCL∆4 isoform in BRCAX individuals and cancer cell lines, the putative impact of the relevant FANCL periexonic and exonic variants (i.e. located in the vinicity of the exon 4 genomic region) on mRNA splicing was assessed by in silico methods and is represented in Table 2. To characterize the putative impact of exonic and intronic variations on splicing, we used the HSF web program, which allows the identification of enhancer and silencer splicing sites as well as branch point sequences. In addition to the two variations identified in our cohort (rs17049422 and rs79588315), we also analyzed variants referenced in dbSNP database which have not been genotyped in our cohort given their deep intronic location. As described in Table 2, most sequence variations could have a significant effect on binding of RNA-binding proteins such as serine/arginine-rich (SR) proteins and heterogeneous nuclear ribonucleoproteins (hnRNP). Only two variations (rs79588315 and rs115418265) did not seem to exert any potential effect on splicing of exon 4 as predicted by in silico analyses. Nevertheless, we analyzed the individual effect of these intronic variants on exon 4 inclusion/exclusion using the minigene assay. Including a WT version, eight minigene constructs of the FANCL gene were transfected into HEK293T cells for 24 hours, and levels of FANCL∆4/FANCLwt transcripts encoded by the minigene vector were quantified by qRT-PCR. As described in Figure 2A-B, rs79588315 (c.217-11T/C) triggered a 14.5-fold increase of the FANCL∆4 mRNA expression and decreased significantly the expression of the FANCLwt transcript when compared to other minigene versions. All the other variants did not alter the FANCL∆4/FANCLwt expression ratio (Figure 2A). To assess the reliability of the experiment and to verify that no other random mutation in the minigene construct could be involved in this effect, a revertant was generated by restoring the WT genotype on the rs79588315 minigene. As illustrated in Figures 2C and 2D, the experiment confirmed that the increase of FANCL∆4 expression seems to be almost exclusively dependent on the presence of the rs79588315 variant. 62 To examine further the effect of this rs79588315 variant on exon 4 exclusion in an in vivo context, immortalized lymphoblastoid cell lines (LCLs) RNA of 11 BRCAX WT individuals, 9 heterozygotes and 2 rare homozygote carriers were evaluated regarding the FANCL∆4/FANCLwt expression ratio according to their genotype. RNA samples were normalized according the heterozygotes, given that the FANCL∆4 isoform is barely expressed in the WT individuals. FANCL∆4 mRNA is only expressed at basal levels in WT homozygote individuals, while it represents 25,0 and 40,1% of FANCL transcripts in heterozygotes and rare homozygotes, respectively (Figure 3A). Considering the FANCL∆4/FANCLwt expression ratio (Figure 3B), the WT individuals demonstrated an expression ratio of 0.02, while heterozygotes and rare homozygote carriers of the rs79588315 variant have a relative FANCL∆4/FANCLwt expression ratio of 1.0 and 2.01, respectively. These results indicated that the expression of the FANCL∆4 isoform is dependent on the number of alleles carrying this c.217-11T/C variation in BRCAX individuals. In order to confirm the efficient translation of this FANCL∆4 mRNA transcript into a functional protein, the action of nonsense-mediated decay (NMD) was first tested by treating (or not) several immortalized LCLs of BRCAX individuals with puromycin, an agent known to inhibit NMD. Given that mRNA extracted from puromycin-treated cells did not show any modulation of the FANCL∆4 mRNA expression, this suggested that this isoform was not subject to NMD (data not shown). In addition, the polysome analysis allows to determine whether a given mRNA isoform is recruited by the polyribosomes, which drive the translation of mRNAs into functional proteins. Therefore, as illustrated in Figure 4, the ribosomal fractions demonstrated that the FANCLΔ4 mRNA transcript, being significantly detected in late fractions (fractions 11-15), was associated with multiple ribosomes (polysomes), which confirms its efficient translation. As negative control, each fraction was duplicated and treated with EDTA, which is known to dissociate mRNA from ribosomes. Thereafter, to further evaluate the effect of the expression of the FANCLΔ4 protein on DNA repair mechanisms, several DNA repair-related assays such as monoubiquitination, survival, cell cycle as well as cell localization analyses have been performed. 63 FANCD2 monoubiquitination is the key event in the FANC-BRCA DNA repair pathway and this activation is performed by the FANCL protein. As seen in Figure 5, the transduction of FANCL-deficient EUFA868 cells with retroviral vector pMSCV containing the FANCL WT or Δ4 cDNAs clearly indicated that following a MMC treatment for 12 hours, only cells complemented with the plasmid pMSCVneomycin-FANCL showed the capacity to monoubiquitinate the FANCD2 protein. Neither in the cells infected with the variant Δ4 nor the empty virus could we observe the long form (monoubiquitinated) of the FANCD2 protein. In order to assess the ability of the FANCLΔ4 isoform to support high fidelity DNA repair, cell survival assays were performed. The infected EUFA868 cells were treated with 6 different doses of MMC for five days. As shown in Figure 6A, only the EUFA868 cells infected with the FANCL cDNA demonstrated a clear advantage of cell survival when compared with the cells not infected or infected with the empty vector or FANCLΔ4 cDNA. The whole experiment is shown in Supplemental Figure 1. These data suggest that unlike FANCL, FANCLΔ4 was unable to support cell survival and viability. Being a hallmark of the FA disease, cell cycle analysis is a standard method used to determine whether cells harbor the FA phenotype [42,43]. As displayed in Figure 6B, in absence of treatment with the DNA crosslinking agent MMC, all three EUFA868 cell samples not infected (identified as EUFA) or infected with FANCL or FANCLΔ4 showed a similar cell cycle profile. However, following 24 hours of MMC treatment, a significant G2/M accumulation can be observed in FANCLΔ4 (27.4%) and EUFA (23.0%) samples, while the one infected with the FANCL cDNA, showed a regular transition of the G2/M phase (17.8% of cells accumulated in the G2/M phase). Moreover, based on cell cycle analyses, not only did these results demonstrate that FANCL∆4 does not complement EUFA868 cells, but also that cells infected with FANCL∆4 showed a higher cell accumulation in G2/M phase than uncomplemented cells (44,8% in G2/M for FANCL∆4 cells vs 32,9% for Neo cells) (data not shown). The same trend was observed in survival assays after five days of MMC treatment (Supplemental Figure 1), suggesting a disadvantage caused by the expression of the FANCL∆4 protein. The FANCL protein has been reported to be an intracellular protein that localizes in both the cytoplasm and the nucleus [44-46]. Given the alteration of the protein structure of the 64 FANCLΔ4 protein, it was therefore interesting to compare the localization profile of the FANCL and FANCLΔ4 proteins in normal conditions and under MMC treatment. HEK293T cells were therefore transfected with either FANCL-EGPFP or FANCLΔ4EGFP and then treated (or not) with MMC for a period of 12 hours. As shown in Figure 7, in the absence of MMC treatment, both the FANCL and FANCLΔ4 proteins were present mostly in the cytoplasm of cells. However, following 12 hours of MMC treatment, the recruitment of the FANCL-EGFP protein is strongly enhanced in the nucleus of the cell, while the FANCLΔ4-EGFP spliced protein clearly remains in the cytoplasm. 65 Discussion In order to increase the power to possibly find genetic variants involved in breast cancer susceptibility, we selected individuals from our cohort of FC non-BRCA1/2 high-risk breast cancer families (one individual per family). Given that this population is considered a founder population, this allowed us to increase the likelihood of potentially identifying deleterious mutations associated with breast cancer [47]. Sequencing of the exonic and neighboring intronic regions led to the identification of 18 variants including one novel variation. None of them has been reported to be causative of a FA diagnostic or any other manifestation. Despite the key role of FANCL in DNA repair and its close connection with other FANC genes already known to be associated with an increased breast cancer susceptibility, to our knowledge only one study investigated the potential involvement of the FANCL gene in breast cancer predisposition. Mutation analysis performed in a cohort of 95 BRCA1/2-negative index cases from Spanish high-risk breast cancer families, did not identify any FANCI, FANCL or FANCM deleterious mutation [48]. In that study, among the variants identified in breast cancer cases, three have been found in our cohort including c.-67-54C/G, c.217-11T/C and c.374+34delT, which showed a slight higher MAF than those found in our cohort. Particularly, the c.217-11T/C variant was described to have no significant effect on splicing regulation following in silico analyses [48]. In other studies the FANCL gene has also been excluded as a major player in esophageal and cervical cancer susceptibility [49,50]. Abnormal expression of the FANCL gene has been observed in Calu-6 lung cancer cells resulting in an increased MMC sensitivity [51]. Although no coding mutation was identified, a splicing variant of FANCL mRNA lacking exons 10 and 11 was found, resulting in a shorter FANCL protein of 272 amino acids. One of the rare FANCL patients identified so far was carrier of an in-frame 3-bp deletion mutation (p.Ile336_Cys337delinsSer) located in exon 12 and a 4-bp duplication (p.Thr367AsnfsX13) in exon 14. These alleles were demonstrated to be unable or correct only partially FANCL-deficiency and G2/M arrest in EUFA868 cell line [52]. This EUFA868 cell line has been shown to express FANCL transcripts lacking the exon 11, thus removing the conserved PHD finger and part of the third WD40 repeat [53]. The genomic 66 DNA from this individual showed a homo- or hemizygous insertion of 177 bp into a pyrimidine-rich sequence at the splice junction between intron 10 and exon 11. Our cDNA sequencing analyses revealed the significant expression of the FANCL∆4 isoform. The deletion of exon 4 (aa 72-91) located in the N-terminal region resulted in a disruption of the E2-Like-Fold (ELF) domain (aa 1-90) as well as the first of the three WD40 domains (aa 75-275) of the FANCL protein [54]. Although no specific function or interaction has been reported to date for the ELF domain, this domain shares 67% similarity with the Drosophila FANCL [55] and among the 11 amino acids perfectly conserved in other species 4 are encoded by exon 4, indicating the importance of this coding region in protein function or conformation. The ELF domain (aa 1-90) is always found in combination with WD-40 and RING domains and is suspected to be involved in protein binding [56]. WD-40 proteins are involved in multiple functions such as signal transduction, transcription regulation, cell cycle control and apoptosis while the WD-40 domain is known to be involved in protein interaction [57]. Therefore, the deletion of exon 4 located at the beginning of the first WD-40 domain could affect protein folding and interactions. Even though in silico analyses did not predict any significant effect of the c.217-11C/T variant (rs79588315) described herein (Table 2) and in a previous study [48], our minigene and expression analyses clearly identified a major role for this variant in the deletion of exon 4 of the FANCL mRNA. Indeed this expression is almost exclusively dependent on the heterogygous or homozygous state of rs79588315 in the individuals (Figure 3). Splicing mutations reported so far to be involved in several syndromes or cancers are often located in a minimal exon-intron region (5-6 nucleotides), in the polypyrimidine tract or in exons [58], and softwares used for in silico analyses could identify significant nucleotide changes for splicing regulation. Given the importance of the c.217-11C/T variant, on exon 4 exclusion, further experiments would be required to identify the splicing factor proteins, for which mRNA binding is impaired. Considering that reduced levels of FANCL can increase cancer susceptibility [51,59], combined with the effect of the c.217-11C/T variant on FANCL∆4/FANCL mRNA expression ratio, the frequency of rs79588315 should be tested in larger cohorts and for other cancer types. 67 It is well recognized that variation of the spliced/WT expression ratio could have dramatic effects on cell physiology. Candidate genes influencing the susceptibility to complex diseases such as asthma, Alzheimer’s and autoimmune diseases have been found to produce alternative spliced isoforms of specific genes, with the expression ratio fluctuating between normal and affected individuals [60]. There is also convincing evidence that in several cancers including breast cancer, the ratio of spliced variants is significantly altered and correlates with disease severity [61-74]. The expression of spliced proteins can exert a dominant negative effect on the function of the WT protein by several mechanisms such as opposite function of the WT and spliced proteins [75,76]; different cellular localization or cytoplasmic solubility [59,77]; heterodimerization between the spliced and the WT protein [59,78-80], or binding of the spliced protein with interactors or DNA response elements which prevents the binding of the WT protein [81,82]. Particularly, a spliced protein encoded by the FANCL gene, dubbed FAVL, has been demonstrated to be highly expressed in sporadic bladder cancer as an oncoprotein capable of promoting cancer formation and rendering cells resistant to cisplatin [59,83]. It is therefore suggested that the FA-BRCA-suppressive pathway can be switched to an oncogenic mechanism through alternative splicing of a key component [84]. In contrast to FANCL infection, which leads to normal DNA repair, complementation of EUFA868 FANCL-deficient cells with FANCL∆4 did not allow monoubiquitination of FANCD2 protein, and displayed a cell cycle blockade as well as deficient cell survival rate. It indicates that the intra-FA pathway step of monoubiquitination [53] does not occur in the presence of the protein FANCLΔ4, and therefore that the FANC-BRCA pathway is dysfunctional and may not be able to remove efficiently ICLs present in the DNA. When such lesions are not properly repaired, they can lead to chromosomal breakage, chromosomic instability and ultimately cell death [85]. Ubiquitination is a mechanism of protein modification and is involved in many cellular pathways, including signal transduction and DNA repair [86,87]. In addition to FANCD2, FANCI is also monoubiquitinated by the FANCL protein, which serves as the catalytic ubiquitin E3 ligase [88,89]. FANCI monoubiquitination is critical for activation of the FA pathway and required for the formation and the localization of the FANCI/D2 complex to 68 nuclear foci [89-92]. Two E2 proteins namely UBE2T and UBE2W have been shown to interact with FANCL by yeast two hybrid experiments, and the C-terminal RING domain is necessary and sufficient for FANCL binding of UBE2T [93,94]. This protein complex in combination with E1, has been shown to be sufficient for FANCD2 monoubiquitination in an in vitro context [93]. A hallmark of the FA phenotype is the disturbance of the cell cycle. The FA alteration in the cell cycle was first described three decades ago where a prolongation of the G2 phase was observed in short-term cultures of FA peripheral blood lymphocytes [95]. Cell cycle blockade and the decrease of surviving cells in EUFA868/FANCLΔ4 cells supported the inefficiency of the FANCLΔ4 protein to promote DNA repair. It is reported in the literature that FA cells defective in the core complex have a S-phase checkpoint defect that appears to be specific for ICL damage [96,97]. Although to our knowledge its nuclear localization was not previously demonstrated, it is well assumed that FANCL must be translocated to the nucleus to exert its function of FANCD2/FANCI monoubiquitination, given that the whole FA protein complex is recruited at the DNA damage sites. Our results demonstrated that the FANCL protein is indeed translocated to the nucleus following MMC treatment in EUFA868 cells, while FANCL∆4 protein remains in the cytoplasm. This strongly suggests a defect in the recruitment of FANCL∆4 protein to the nucleus when DNA damage is induced, and points toward the presence of potential nuclear localization signal, post-translation protein modification site or protein binding domain (e.g. FANCB and FAAP100) [98] located in the region of exon 4. FANCC, FANCG and FANCL proteins have been demonstrated to be required for chromatin binding of monoubiquitinated FANCD2 following cisplatin exposure [99]. A missing or dysfunctional protein of the core complex may cause a defect in the mononubiquitination of FANCD2/FANCI [100], and restrict the recruitment of the complex III, thus preventing the assembly of the proteins responsible for DNA repair [101]. Conclusion In conclusion, new isoforms of the FANC gene family are identified and new roles are discovered. Studying the splicing isoforms of FANC genes unravels a completely new dimension to the complexity of this gene family. This study confirmed the required 69 integrity of the ELF domain of the FANCL protein for its nuclear translocation and efficient DNA repair. The FA pathway inactivation is considered a predictive biomarker of chemotherapeutic response. Given that a DNA repair defect involves a balance between accumulation of DNA damage and chromosomal instability causing cancer predisposition and, on the other hand, apoptosis reduction resulting in the depletion of hematopoietic stem cells [102], an increased expression of the FANCL∆4 isoform could have significant modifier effects on DNA repair efficiency and therefore on action of chemotherapeutic agents used in breast cancer treatment. In the case of alteration of DNA repair efficiency, the causal rs79588315 genomic variant of the FANCL∆4 isoform expression could thus be genotyped in large cohort of cancer patients as a predictive biomarker of treatment response. 70 Conflict of interest statement The authors declare that they have no competing interests. Acknowledgements The authors would like to thank all individuals and families who participated in this study. We thank all the research personnel and research nurses of the Cancer Genomics Laboratory for genetic counseling, sample management and mutation screening. We also thank Charles-Etienne Bénard for skillful technical help and Dr. D. Labuda and C. Moreau at the Centre de Cancérologie Charles Bruneau of Ste-Justine Hospital for help with control DNA samples. We kindly thank the Dr Jean-Yves Masson as well as Dre Amélie Rodrigue at the Centre de recherche de l’Hôtel-Dieu de Québec for their precious help regarding immunofluorescence experiments and numerous constructive discussions. We thank Dr. Stéphane Gobeil for his precious help with the retroviruses. We would also like to thank Dr Serge Rivest for the use of their confocal microscope and the research professional Paul Préfontaine for his support. We give our thanks to Dre Jasna Kriz for the use of their microscope. Financial support: This work was supported by the Canadian Institutes of Health Research (CIHR) and Institute of Cancer and Institute of Gender and Health for the INHERIT BRCAs research program, the Fond de la Recherche en Santé du Québec (FRSQ)/Réseau de Médecine Génétique Appliquée (RMGA), the Canadian Breast Cancer Research Alliance (CBCRA), the CURE Foundation and Fanconi Canada. C.St-L.P. holds a M.Sc. studentdship from FRQS, S.B and F.B. are recipients of a studentship from foundation Rene Bussieres. 71 References 1. Ripperger T, Gadzicki D, Meindl A, Schlegelberger B (2009) Breast cancer susceptibility: current knowledge and implications for genetic counselling. Eur J Hum Genet 17:722-731. 2. Lalloo F, Evans DG (2012) Familial breast cancer. Clin Genet 82:105-114. 3. Stratton MR, Rahman N (2008) The emerging landscape of breast cancer susceptibility. Nat Genet 40:17-22. 4. Somyajit K, Subramanya S, Nagaraju G (2010) RAD51C: a novel cancer susceptibility gene is linked to Fanconi anemia and breast cancer. Carcinogenesis 31:2031-2038. 5. Cantor SB, Bell DW, Ganesan S, Kass EM, Drapkin R, et al. (2001) BACH1, a novel helicase-like protein, interacts directly with BRCA1 and contributes to its DNA repair function. Cell 105:149-160. 6. Cantor S, Drapkin R, Zhang F, Lin Y, Han J, et al. 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(A) Schematic representation of FANCL interaction domains based on the literature. FANCL exon structure and schematic representation of the putative protein of the FANCLΔ4 isoform located in the genomic region of exons 3-5 (B) Expression levels of FANCL∆4 isoforms in cell lines as detected by semi-quantitative PCR experiments (C) Expression levels of FANCL∆4 and FANCL isoforms in cell lines as measured by quantitative real-time PCR experiments. Relative expression levels of the FANCL∆4 isoform were calculated as E(ΔCt wild-type allele – ΔCt splice form) in twelve breast cancer and noncancerous cell lines where E is primer efficiency. Figure 2: Minigene assay. (A) Expression of FANCL∆4 and FANCL isoforms obtained from 8 different plasmids (constructs) containing specific genomic variants. (B) Based on data observed in (A), FANCL∆4/FANCL expression ratios are normalized in respect to the wildtype (WT) plasmid. (C) and (D) show the result of the reverse mutagenesis on the c.217-11T/C variation (rs79588315) to reestablish the WT sequence illustrated in copy number and FANCL∆4/FANCL expression ratios, respectively. Figure 3: Expression of FANCL∆4 and FANCL isoforms in BRCAX cell lines. mRNA expression levels of FANCL∆4 and FANCL isoforms in BRCAX cell lines as measured by quantitative real-time PCR experiments. Expression levels are expressed in (A) copy number and (B) FANCL∆4/FANCL expression ratios. In (A) the numbers at the top of the columns indicated the relative expression of each isoform (%), while in (B) the number indicated the fold change based on the Heterozygotes (Het) normalized at 1.0. Figure 4: Polysome analysis of FANCL∆4 mRNA. 80 Fractionation of monosomes and polysomes (with or without EDTA) as measured by A260. q-RT PCR of the FANCL∆4 isoform was performed on T-47D cells and relative expression values for each fraction were calculated by the equation R = (E)(Ctref-Ct), where Ctref is the average cycle threshold of all the fractions for this isoform. The square line is the data acquired from the +EDTA sample whereas the circle line is the data from the -EDTA sample, which illustrates the binding of the FANCL∆4 transcript with polysomes. Figure 5: Monoubiquitination assays. Western blotting of the FANCD2 protein in whole cell lysate of EUFA868 cells infected with either the FANCL or FANCLΔ4 cDNA, or not infected (ø). Cells were treated or not with 100ng/ml of MMC for 16 hours. FANCD2 associated with an ubiquitin is found at 162 kDa whereas FANCD2 alone weights 155 kDa. Calnexin is used as loading control. Figure 6: Survival assay and cell cycle profiles. (A) MMC-induced cell death. Differential survival of EUFA868 (diamond), EUFA868/pMSCVneo (circle), EUFA868/FANCL (triangle) and EUFA868/FANCCΔ7 (square) cells after 5 days of incubation in escalating concentrations of MMC. The fraction of surviving cells was measured by the Alamar Blue assay. Untreated cells are shown in the right panel. (B) FACs analysis of the EUFA868 FANCL-deficient cell line infected with FANCL cDNA, FANCLΔ4 cDNA or not infected at all. Cells were treated with MMC (50 ng/ml) for 24 hours prior to FACs analysis. Figure 7. Cellular localization. Fluorescence microscopy of FANCL-EGFP and FANCLΔ4-EGFP transiently transfected in HEK293T cells treated or not with 50 ng/ml of MMC for 16 hours. Counterstaining with DAPI is performed to visualize the nucleus. 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 Supplemental Figure 1 94 DISCUSSION ET PERSPECTIVES À la lecture de la section 1.5.4, les quatre objectifs cités dans la problématique de mon projet ont été dûment remplis. Tout d'abord, le premier objectif était d'évaluer l'effet de différentes variations de séquence (SNP) sur l'épissage de l'exon 4 de FANCL. À l'aide de la technique minigène, j'ai pu vérifier l'effet de 7 mutations connues de FANCL, toutes situées autour de l'exon 4. Alors que les 6 autre SNPs avaient un effet négligeable sur l'épissage de l'exon 4, le SNP rs79588315 avait un effet marqué qui semblait provoquer directement l'isoforme FANCL∆4. Le deuxième objectif étant de quantifier le variant d'épissage FANCL∆4 dans différentes lignées cellulaires et dans une cohorte de 96 patientes atteintes de cancer du sein, nous avons pu constater la présence de l'isoforme FANCL∆4 chez plusieurs patientes. Qui plus est, nous sommes parvenus à associer le génotype de ce variant avec la quantité de transcrit alternatif: les patientes porteuses hétérozygotes pour le SNPs rs79588315 voyaient leur taux de FANCL∆4 monter à 25,0% du taux total de FANCL (FANCwt et FANCL∆4) et à 40,1% dans le cas des porteurs homozygotes. Ces résultats témoignent donc de l'importance de FANCL∆4 chez les porteurs du SNP rs79588315. La fréquence du SNP dans la cohorte de 96 cas de cancer du sein déjà séquencée pour FANCL était de 15%. Nous avons donc entrepris de séquencer une cohorte de 94 contrôles pour obtenir une comparaison, et nous avons obtenu une fréquence de 12%, soit le même pourcentage que dans une cohorte européenne Hapmap de 60 individus et légèrement inférieur aux 15% obtenus précédemment. La taille de l'échantillon n'a cependant pas permis d'affirmer que ces résultats étaient significatifs. Le troisième objectif de mon projet était de vérifier la traduction de l'ARN messager de FANCL∆4 en protéine. L'analyse des polyribosomes a permis de démontrer que le transcrit d'ARN messager se trouvait attaché aux polyribosomes, indiquant ainsi que le transcrit était traduit activement en protéine. Cependant, les analyses par western montraient toujours une bande plus faible pour FANCL∆4 que pour FANCLwt. Cette particularité sera abordée un peu plus loin dans cette section. Finalement, le dernier objectif et le plus complexe était d'évaluer l'effet fonctionnel du saut de l'exon 4 dans la protéine FANCL. Pour cette partie, le test de monoubiquitination a été réalisé en premier lieu. Suite à des résultats encourageants, les 95 tests de localisation cellulaire, de survie et de cycle cellulaire ont été réalisés, et les résultats obtenus démontraient l'inefficacité de FANCL∆4 dans la réparation de l'ADN, ce qui m'a permis de compléter avec succès les objectifs de mon projet de maîtrise. Tel que prédit par les nouveaux modèles d'interaction intergénique de plusieurs facteurs de faible risque qui expliqueraient une bonne proportion des cancers familiaux et héréditaires, le SNP rs79588315 s'inscrit dans une lignée de variants de séquence dont l'effet à lui seul n'est pas très clair. Tel que mentionné précédemment, sa présence chez des individus peut mener à des taux de FANCL∆4 d'environ 25% chez des porteurs hétérozygotes et 40% chez des porteurs homozygotes en rapport avec la version sauvage de FANCL. En regardant les choses de façon réaliste, cela laisse tout de même une majorité de FANCL sauvage à la disposition de la cellule pour accomplir ses fonctions normales. Il faudrait donc des études beaucoup plus approfondies afin de pouvoir mesurer toute l'étendue de l'effet de FANCL∆4 lorsqu'il est présent dans les proportions citées ci-dessus. Ce que nous savons cependant, c'est que la version FANCL∆4 ne semble pas efficace concernant la réparation de l'ADN. En conséquence, sa présence en proportion significative chez des porteurs du SNP rs79588315 en combinaison avec d'autres polymorphismes de séquence du même genre pourrait avoir un effet sérieux sur le risque de développer certains types de cancers, dont le cancer du sein. Comme mentionné plus tôt, la combinaison de plusieurs SNPs de faible risque peut avoir un effet synergique et provoquer un risque fort de développer le cancer du sein (Harlid et al., 2012). Ainsi, il faudrait pouvoir analyser le SNP rs79588315 à grande échelle, c'est-àdire sur de très grandes cohortes, par des études GWAS pour pouvoir détecter son effet individuel et en association. Il demeure malgré tout que cette variation de séquence est présente chez entre 20 et 25% de la population québécoise et européenne, et qu'il serait intéressant voire important de connaître son effet réel. Du côté de la protéine FANCL, il en reste beaucoup à découvrir. La portion N-terminale de la protéine est clairement la moins étudiée à ce jour, et les données recueillies dans ce projet ont contribué à améliorer nos connaissances sur FANCL. Tout d'abord, Medhurst et collaborateurs ont été les premiers à accorder une certaine importance à la section Nterminale de FANCL en démontrant que toute la protéine était nécessaire pour interagir 96 avec FANCB (Medhurst, 2006). L'interaction entre FANCB et FANCL permettrait alors d'interagir avec FANCA et le reste du complexe cœur. Il n'est pas encore connu précisément comment chacune des protéines se rend au noyau pour y accomplir ses fonctions, mais il a été proposé que FANCA et FANCM aient un rôle important à jouer dans la localisation nucléaire du sous-complexe FANCB/FANCL/FAAP100 (Ling et al., 2007). Ainsi, l'incapacité de FANCL∆4 à se rendre au noyau pourrait être expliquée par une mauvaise interaction avec FANCB et par conséquent une mauvaise interaction avec le reste du complexe cœur. L'incapacité de FANCL∆4 à se rendre au noyau expliquerait également le mauvais déroulement du cycle cellulaire et les hauts taux de mortalité en présence de MMC. Il serait intéressant de tester la validité de cette hypothèse, soit que l'absence de l'exon 4 de FANCL supprime l'interaction avec FANCB, par essais double hybride avec FANCB ou par essais de coimmunoprécipitations. Il y a de bonnes raisons de croire que l'interaction avec FANCB est inhibée par l'absence de l'exon 4, et par conséquent la formation du complexe cœur en sera également affectée. 97 98 BIBLIOGRAPHIE Adachi, Daiki, Tsukasa Oda, Hiroshi Yagasaki, Keiko Nakasato, Toshiyasu Taniguchi, Alan D D'Andrea, Shigetaka Asano, et Takayuki Yamashita. 2002. « Heterogeneous activation of the Fanconi anemia pathway by patient-derived FANCA mutants. ». Hum. Mol. Genet. Vol. 11, n°25, p. 3125–3134. Adams, M D. 2000. « The Genome Sequence of Drosophila melanogaster ». Science. Vol. 287, n°5461, p. 2185–2195. 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