Chapitre 2.5.14.

CHAPITRE 2.5.14.
ENCÉPHALITE JAPONAISE
RÉSUMÉ
Le virus de l’encéphalite japonaise (EJ) est un arbovirus de la famille des Flaviviridae responsable
d’encéphalite, principalement chez les chevaux. Il infecte aussi l’homme et cause des avortements
chez le porc. Les porcs jouent un rôle d’amplificateur du virus et les oiseaux peuvent être aussi
impliqués dans sa diffusion.
Un diagnostic de certitude de l’EJ chez les chevaux repose sur l’isolement du virus à partir des
individus affectés ou retrouvés morts. Comme le taux d’isolement du virus est habituellement très
faible, les constatations cliniques, sérologiques et anatomo-pathologiques sont utiles pour le
diagnostic.
Identification de l’agent pathogène : un prélèvement de cerveau est effectué à partir des
chevaux morts ayant présenté des signes cliniques d’encéphalite pour isoler le virus. Les méthodes
d’isolement du virus incluent l’inoculation à des souriceaux non sevrés et l’inoculation à des
cultures cellulaires. Une suspension de matériel nerveux en solution saline tamponnée contenant
du sérum de veau (ou de la sérumalbumine bovine) et des antibiotiques est inoculée par voie
intracérébrale à des souris âgées de 2 à 4 jours. Si une souris présente des signes nerveux suivis
de la mort dans les 14 jours, l’identification du virus peut être ensuite réalisée en culture cellulaire.
Le virus est aussi isolé en culture de cellules d’embryon de poulet, de reins de hamster ou de porc,
de rein de singe vert africain (cellules Vero), en culture de cellules MD-BK et en lignées cellulaires
de moustique.
Un effet cytopathogène (ECP) apparaît dans quelques cultures de cellules, mais il est
habituellement difficile à mettre en évidence. L’identification du virus sur souriceau ou en culture
cellulaire est confirmée par des méthodes sérologiques.
Épreuves sérologiques : la sérologie est la méthode habituellement utilisée pour déterminer la
prévalence de l’infection dans les populations de chevaux, et aussi pour le diagnostic individuel
chez les sujets malades. Les techniques utilisées sont la séroneutralisation virale (SN), l’inhibition
de l’hémagglutination, et la fixation du complément. La SN est la méthode la plus spécifique. Elle
permet de différencier une infection par le virus de l’EJ des infections par d’autres Flavivirus. La
meilleure méthode est l’épreuve de SN par réduction des plages.
Spécifications applicables aux vaccins et aux produits biologiques à usage diagnostique :
c’est un vaccin à virus inactivé préparé à partir d’une suspension virale dérivée de cerveaux de
souris infectées ou de cultures cellulaires infectées.
A. INTRODUCTION
L’encéphalite japonaise est une maladie des chevaux causée par un Flavivirus transmis par les moustiques qui
provoque des signes cliniques d’encéphalite chez les animaux infectés et qui peut être mortelle (3, 4). Le virus
infecte aussi l’homme et cause des avortements chez les porcs. Ces derniers jouent un rôle d’amplificateur du
virus, et les oiseaux peuvent être aussi impliqués dans sa diffusion. Un seul sérotype du virus de l’EJ a été
identifié parmi les isolats de virus de l’EJ, bien qu’une variation des souches ait été mise en évidence par des
études sérologiques et moléculaires. Les épreuves d’inhibition de l’hémagglutination et la séroneutralisation
associées à des procédures d’absorption des antigènes ont permis de distinguer dernièrement au moins
2 sous-types, Nakayama et JaGAr-01, parmi les virus de l’EJ (5).
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B. TECHNIQUES DE DIAGNOSTIC
Le diagnostic de confirmation de l’EJ chez les chevaux repose sur l’isolement du virus responsable. Le taux
d’isolement du virus à partir des animaux malades ou morts est habituellement très faible, en raison de l’instabilité
du virus dans certaines conditions d’environnement, et aussi de la présence d’anticorps chez les animaux
infectés. Les constations cliniques, sérologiques et anatomopathologiques sont une aide au diagnostic. Le
diagnostic est aussi possible par détection des anticorps IgM et IgG spécifiques dans le liquide cérébrospinal par
des méthodes immuno-enzymatiques (1). L’acide nucléique viral a été détecté par la technique de la transcription
inverse couplée à une réaction d'amplification en chaîne par polymérase (RT-PCR) dans l’encéphale de chevaux
infectés (7).
Les prélèvements à réaliser pour l’isolement du virus sont une partie du corps strié, du cortex ou du thalamus
d’encéphale de chevaux affectés. Des prélèvements de sang et de moelle épinière peuvent aussi être utilisés
pour l’isolement. Tous les prélèvements doivent être placés au froid immédiatement après récolte, et congelés à
–80°C si l’isolement doit être différé dans le temps. Tous les matériels potentiellement infectés doivent être
manipulés suivant les procédures de niveau 3 (voir le Chapitre I.1.6., « La biosécurité au laboratoire de
microbiologie vétérinaire ») pour prévenir tout risque de contamination humaine. L’homme peut se contaminer par
contact direct du matériel infectieux avec une peau lésée ou les muqueuses, par inoculation parentérale
accidentelle ou par aérosol. Les personnes réalisant les prélèvements devraient aussi prendre les précautions
appropriées pour éviter toute contamination. Un vaccin humain est disponible et toutes les personnes à risque,
vétérinaires ou personnels de laboratoire, devraient être vaccinées.
1. Identification de l’agent pathogène
Les prélèvements d’encéphale et de moelle épinière sont homogénéisés (à 10%) dans une solution saline
tamponnée à pH 7,4, contenant du sérum de veau (2%) ou de la sérumalbumine bovine (0,75%), de la
streptomycine (100 µg) et de la pénicilline (100 unités/ml). Le sérum de veau doit être exempt d’anticorps dirigés
contre le virus de l’EJ. La suspension est centrifugée à 1 500 g pendant 15 min, et le surnageant est prélevé pour
l’inoculation. Un volume de 0,02 ml est inoculé par voie intracérébrale à des souris âgées de 2 à 4 jours. Ces
souris sont gardées en observation pendant 14 jours. Il est possible qu’aucun signe clinique net ne se développe,
mais l’anorexie est révélée par la disparition des taches de lait blanches sur l’abdomen. La peau change ensuite
de couleur, passant de rosée à rouge foncé, et des convulsions apparaissent juste avant la mort. Les cerveaux
des souris mortes ou moribondes sont collectés et stockés à –80°C pour un passage ultérieur.
Pour identifier le virus, un antigène extrait sur saccharose/acétone est préparé à partir des cerveaux des souris
après un second passage effectué suivant la procédure décrite précédemment (section B.2.b.1). Cet antigène est
testé pour sa capacité à agglutiner les globules rouges de poulet de 1 jour ou d’oie à des pH compris entre 6,0 et
7,0, avec des intervalles de pH de 0,2 conformément à la procédure décrite (2). Des suspensions de globules
rouges à 1/24 sont préparées dans les solutions correspondant aux différents pH. L’extrait antigénique est dilué
de façon sériée de 2 en 2 sous un volume de 25 µl dans une plaque de microtitrage à 96 puits (puits à fond rond).
Puis 25 µl de chaque suspension de globules rouges sont ajoutés dans chaque puits. La plaque est incubée à
37°C pendant 1 h, et le résultat de l’hémagglutination est lu. Si l’antigène a la capacité d’agglutiner les globules
rouges, il est utilisé lors d’une épreuve d’inhibition de l’hémagglutination avec un sérum contre l’EJ.
Des cultures primaires de cellules d’embryon de poulet ou de rein de hamster, ou des lignées cellulaires de
moustique C6/C36 (lignée cellulaire clonée à partir d’Aedes albopictus) peuvent être utilisées pour l’isolement
viral. Les prélèvements (encéphale, sang prélevé sur les animaux infectés en début de maladie), ou la
suspension cérébrale de souriceau après inoculation, sont inoculés dans la culture cellulaire. Des anticorps
monoclonaux spécifiques des Flavivirus et du virus de l’EJ peuvent être utilisés pour identifier le virus par
immunofluorescence indirecte (6).
2. Épreuves sérologiques
Les épreuves sérologiques sont utiles pour déterminer la prévalence de l’infection dans une population animale,
la distribution géographique du virus, et le niveau de production des anticorps chez les chevaux vaccinés. Pour
appliquer les épreuves sérologiques au diagnostic individuel, il faut tenir compte du fait que les chevaux vivant en
zone d’enzootie peuvent avoir déjà été infectés de façon inapparente ou avoir été vaccinés. La validité des
résultats repose sur une augmentation significative du titre sérologique sur des prélèvements réalisés pendant la
phase aiguë et la phase de convalescence. La spécificité de chaque épreuve sérologique devrait être aussi
considérée. Un test d’agglutination au latex mis au point pour détecter les anticorps dirigés contre le virus de L’EJ
chez le porc a été récemment décrit (8).
Dans certaines régions du monde, il est nécessaire, avant de poser un diagnostic de certitude d’encéphalite
japonaise, de réaliser des tests complémentaires destinés à éliminer une infection par des virus antigéniquement
proches. C’est le cas en Australie, par exemple, où les animaux peuvent être infectés par le virus de l’encéphalite
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de la vallée de Murray et le virus Kunjin, 2 virus étroitement rattachés sur le plan antigénique au virus de l’EJ. La
récente expansion du virus West Nile en Amérique du nord, où l’infection par le virus Saint Louis était enzootique,
démontre l’aptitude des Flavivirus à s’adapter à des environnements nouveaux.
a) Séroneutralisation virale
L’épreuve de séroneutralisation par réduction des plages utilisant des cultures primaires de cellules
d’embryon de poulet, des cultures de cellules de reins de singe vert d’Afrique (Vero), ou des cultures de
cellules de reins de jeune hamster (BHK) est à la fois sensible et fiable.
Le virus de l’encéphalite japonaise (souche Nakayama ou soucheJaGAr-01) est inoculé par voie
intracérébrale à des souriceaux âgés de 1 jour. L’encéphale des souriceaux morts ou moribonds est
prélevé et mis en suspension dans une solution physiologique tamponnée au phosphate (PBS) de
pH 7,2, contenant 10% de sérum de veau fœtal. La suspension est centrifugée à 5 000 g pendant 20 min à
4°C. Le surnageant est stocké sous forme d’aliquotes à –80°C.
• Protocole
i) Inactiver les sérums par chauffage à 56°C au bain marie pendant 30 min.
ii) Réaliser des dilutions sériées des sérums allant du 1/10 au 1/160 en milieu de culture cellulaire dans
des plaques de 24 puits à fond plat (diamètre des puits : 17 mm) ou des tubes.
iii) Diluer le stock de virus dans le milieu de culture de façon à obtenir 100 UFP (unité formant plage) dans
0,2 ml.
iv) Mélanger un volume de chaque dilution de sérum avec un volume égal de dilution de virus. Inclure
dans chaque plaque un témoin virus avec le milieu de culture, un témoin sérum négatif et un témoin
sérum positif.
v) Incuber l’ensemble pendant 90 min à 37°C.
vi) Ajouter 200 µl de chaque mélange sérum-virus dans chaque puits (plaque 24 puits) de culture
cellulaire où se trouvent les cellules BHK-21.
vii) Incuber les plaques pendant 90 min à 37°C sous atmosphère de CO2.
viii) Retirer l’inoculum et ajouter 1 ml de milieu de recouvrement (1,5% de carboxyméthyl cellulose, 1% de
sérum de veau fœtal dans du milieu de Eagle).
ix) Incuber les plaques pendant 4 jours à 37°C sous une atmosphère de CO2.
x) Après avoir retirer le milieu de culture, fixer avec une solution contenant 2,5% de bichromate de
potassium, 5% d’acide acétique glacial et 5% de formol pendant 30 min à température ambiante
(utiliser des gants de caoutchouc pour manipuler la solution de fixation).
xi) Colorer avec une solution de cristal violet à 0,1% pendant 30 min à température ambiante.
xii) Retirer le colorant et rincer les cellules avec de l’eau du robinet.
xiii) Laisser sécher à l’air libre et compter les plages.
xiv) La concentration du sérum en anticorps est exprimée par la dilution du sérum entraînant une réduction
de 50% des plages de lyse comptabilisées dans le témoin virus (témoin sans sérum).
b) Inhibition de l’hémagglutination
L’inhibition de l’hémagglutination (IHA) est une épreuve couramment utilisée pour le diagnostic de l’EJ, mais
des réactions croisées avec d’autres Flavivirus sont observées. Pour cette épreuve, le sérum doit être
préalablement traité avec de l’acétone ou du kaolin, et ensuite adsorbé avec des globules rouges
homotypiques pour retirer les hémagglutinines non spécifiques. Des globules rouges d’oie ou de poussins
d’un jour sont utilisés à un pH optimal compris entre 6,6 et 7. L’épreuve devrait être réalisée avec des
sérums traités et 8 unités d’antigène standard ; cet antigène est commercialement disponible dans quelques
pays.
• Hémagglutination (HA)
• Préparation de l’antigène viral
1. Extraction sur saccharose et acétone de l’antigène produit sur encéphales de souriceaux infectés
i) Homogénéiser l’encéphale des souriceaux dans 4 volumes d’une solution de saccharose à 8,5%.
ii) Ajouter goutte-à-goutte l’homogénat dans 20 fois son volume d’acétone.
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iii) Centrifuger (500 g pendant 5 min), puis retirer le surnageant.
iv) Resuspendre le culot avec le même volume que précédemment d’acétone glacée, et laisser dans de la
glace pendant 1 h.
v) Centrifuger (500 g pendant 5 min), puis retirer le surnageant.
vi) Mélanger les culots dans un même tube avec l’acétone glacée.
vii) Centrifuger (500 g pendant 5 min), puis retirer le surnageant.
viii) Disperser le culot au fond du tube et sécher sous vide pendant 1 à 2 h.
ix) Dissoudre le culot séché avec une solution physiologique salée (0,4 du volume initial de l’homogénat).
x) Centrifuger à 8 000 g pendant 1 h à 4°C. Le surnageant (l’antigène) est prêt à l’emploi.
2. Antigène produit à partir de cellules d’insecte (Aedes albpictus), clone C6/C36, infectées
i) Récolter le surnageant de culture des cellules infectées après une semaine d’incubation à 28°C.
ii) Centrifuger à 1 000 g pendant 15 min. Le surnageant (antigène) est prêt à l’emploi.
• Préparation des globules rouges d’oie
1. Solutions
Acide-citrate-dextrose (ACD) : 11,26 g de citrate de sodium (Na3C6H5O7.2H2O) ; 4,0 g d’acide citrique
(H3C6H5O7.H2O) ; 11,0 g de dextrose (C6H12O6) ; eau distillée pour un volume final de 500 ml. Stérilisation
à l'autoclave à 10 lb (1,7 unités de pression) pendant 10 min.
Dextrose-gélatine-véronal (DGV) : 0,58 g de véronal (Barbital) ; 0,60 g de gélatine ; 0,38 g de véronal
sodique (barbital sodique) ; 0,02 g (0,026 g) de CaCl2 (pour CaCl2.2H2O) ; 0,12 g de MgSO4.7H2O ; 8,50 g
de NaCl ; 10,0 g de dextrose ; eau distillée pour un volume final de 1 000 ml. Stérilisation à l'autoclave à
10 lb (1,7 unités de pression) pendant 10 min (il est plus facile préparer d’emblée un volume 5 fois plus
grand).
2. Saignée
Prélever 8,5 ml de sang sur 1,5 ml de ACD (ou 2,8 ml de sang sur 0,5 ml d’ACD).
3. Lavage (stérile)
i) Un volume de sang total pour 2,5 volumes de DGV. Centrifuger (500 g pendant 15 min), puis éliminer
le surnageant.
ii) Resuspendre le culot globulaire dans 3 volumes (analogue au volume initial de sang total) de DGV.
iii) Centrifuger (500 g pendant 15 min), puis éliminer le surnageant. Répéter les étapes 2 et 3 encore à
2 reprises (soit au total 4 séries de lavage).
iv) Transférer la suspension finale de globules rouges dans un flacon fermé avec du papier d'aluminium.
4. Ajustement de la concentration globulaire
i) 0,2 ml de la suspension de globules rouges +7,8 ml de de NaCl à 0,9% (dilution à 1/40).
ii) Relever la densité optique pour une longueur d’onde de 490 nm (DO490) dans un spectrophotomètre
avec un tube de 10 mm.
iii) Ajuster le stock de globules rouges de telle sorte que la dilution à 1/40 donne une DO490 de
0,450. (volume final = volume initial x absorbance à la DO490/0,450).
iv) Stocker les globules rouges dans un réfrigérateur 3 semaines au plus.
v) Avant emploi, resuspendre doucement les globules rouges et les diluer à 1/24 dans le VAD.
• Dilution de l’antigène
1. Solutions courantes (qui devraient être maintenues à 4°C) : NaCl 1,5 M : 87,7 g de NaCl et eau distillée pour
un volume final de 1 000 ml ; acide borique 0,5 M : 30,92 g de H3BO3 et eau distillée chaude pour un volume
final de 700 ml (dissoudre l’acide borique et refroidir) ; NaOH 1 N : 40,0 g de NaOH et eau distillée pour un
volume final de 1 000 ml ; borate salin (BS), pH 9,0 : 80 ml de NaCl 1,5 M, 100 ml de H3BO3 0,5 M, 24 ml de
NaOH 1,0 N, et eau distillée pour 1 volume final de 1 000 ml ; albumine bovine à 4% : 4 g d’albumine bovine
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fraction V (Laboratoires Armour), 90 ml de BS, pH 9,0, pH ajusté à 9,0 avec du NaOH 1 N, et BS,
pH 9,0, pour obtenir un volume final de 1 000 ml.
2. Diluant pour l’antigène : albumine bovine à 0,4% dans du borate salin (BABS) : 10 ml d’albumine bovine à
4%, pH 9,0, et 90 ml de BS, pH 9,0.
3. Dilution sériée de 2 en 2 de l'antigène dans le BABS dans une plaque de microtitrage (avec puits en U).
• Addition des hématies d’oie
1. Solutions à préparer
NaCl 1,5 M
Na2HPO4 0,5 M : 70,99 g de Na2HPO4 (pour Na2HPO4, 12 H2O : 179,08 g), et eau distillée pour un volume
final de 1 000 ml.
Na2HPO4 1,0 M : 138,01 g de NaH2PO4.H2O (pour Na2PO4, 2H2O : 156,01 g), et eau distillée pour un
volume final de 1 000 ml.
2. Solution de travail : diluant d'ajustement du virus (VAD)
VAD NaCl 1,5 M Na2HPO4 0,5 M NaH2PO4 1,0 M
6,0 100 32 184
6,2 100 62 160 et eau
6,4 100 112 144 distillée pour
6,6 100 160 120 un volume final
6,8 100 192 104 de 1 000 ml
7,0 100 240 80
Les valeurs du diluant (VAD) ne correspondent pas au pH de chaque VAD, mais au pH obtenu après que
chaque VAD ait été mélangé à un volume égal de BABS, pH 9,0.
3. Réalisation
i) 1 volume de globules rouges d’oie pour 23 volumes de VAD (dilution à 1/24).
ii) Ajouter 25 µl de globules rouges dilués dans chaque puit de la plaque de microtitrage contenant les
dilutions d’antigène (25 µl/puits).
iii) Incuber 1 h à 37°C, puis lire les résultats.
+ + Agglutination complète (les globules rouges agglutinés forment une mince pellicule
uniformément répartie sur le fond concave du puits).
+ Agglutination partielle (les globules rouges forment un anneau associé à une pellicule rugueuse
ou plus mince).
± Agglutination minimale (les globules rouges forment un bouton entouré d’une pellicule mince ou
hétérogène).
– Agglutination négative (bouton clairement défini sans film de globules rouges).
Le point final correspond à la dernière dilution (dilution la plus forte) dans laquelle + + ou + est observé.
Le titre est la réciproque de la dilution correspondant au point final.
• Inhibition de l’hémagglutination
• Préparation du sérum à tester
1. Saignée et séparation des sérums
i) Incuber l’échantillon sanguin à 37°C pendant 1 h et ensuite à 4°C pendant la nuit. Si l’épreuve doit être
réalisée immédiatement, l’incubation pendant la nuit peut être remplacée par une incubation pendant
2 à 3 h à 37°C.
ii) Centrifuger (2 000 g pendant 15 min) pour séparer le sérum du caillot.
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