Chapitre 2.5.14.

CHAPITRE 2.5.14.
ENCÉPHALITE JAPONAISE
RÉSUMÉ
Le virus de l’encéphalite japonaise (EJ) est un arbovirus de la famille des Flaviviridae responsable
d’encéphalite, principalement chez les chevaux. Il infecte aussi l’homme et cause des avortements
chez le porc. Les porcs jouent un rôle d’amplificateur du virus et les oiseaux peuvent être aussi
impliqués dans sa diffusion.
Un diagnostic de certitude de l’EJ chez les chevaux repose sur l’isolement du virus à partir des
individus affectés ou retrouvés morts. Comme le taux d’isolement du virus est habituellement très
faible, les constatations cliniques, sérologiques et anatomo-pathologiques sont utiles pour le
diagnostic.
Identification de l’agent pathogène : un prélèvement de cerveau est effectué à partir des
chevaux morts ayant présenté des signes cliniques d’encéphalite pour isoler le virus. Les méthodes
d’isolement du virus incluent l’inoculation à des souriceaux non sevrés et l’inoculation à des
cultures cellulaires. Une suspension de matériel nerveux en solution saline tamponnée contenant
du sérum de veau (ou de la sérumalbumine bovine) et des antibiotiques est inoculée par voie
intracérébrale à des souris âgées de 2 à 4 jours. Si une souris présente des signes nerveux suivis
de la mort dans les 14 jours, l’identification du virus peut être ensuite réalisée en culture cellulaire.
Le virus est aussi isolé en culture de cellules d’embryon de poulet, de reins de hamster ou de porc,
de rein de singe vert africain (cellules Vero), en culture de cellules MD-BK et en lignées cellulaires
de moustique.
Un effet cytopathogène (ECP) apparaît dans quelques cultures de cellules, mais il est
habituellement difficile à mettre en évidence. L’identification du virus sur souriceau ou en culture
cellulaire est confirmée par des méthodes sérologiques.
Épreuves sérologiques : la sérologie est la méthode habituellement utilisée pour déterminer la
prévalence de l’infection dans les populations de chevaux, et aussi pour le diagnostic individuel
chez les sujets malades. Les techniques utilisées sont la séroneutralisation virale (SN), l’inhibition
de l’hémagglutination, et la fixation du complément. La SN est la méthode la plus spécifique. Elle
permet de différencier une infection par le virus de l’EJ des infections par d’autres Flavivirus. La
meilleure méthode est l’épreuve de SN par réduction des plages.
Spécifications applicables aux vaccins et aux produits biologiques à usage diagnostique :
c’est un vaccin à virus inactivé préparé à partir d’une suspension virale dérivée de cerveaux de
souris infectées ou de cultures cellulaires infectées.
A. INTRODUCTION
L’encéphalite japonaise est une maladie des chevaux causée par un Flavivirus transmis par les moustiques qui
provoque des signes cliniques d’encéphalite chez les animaux infectés et qui peut être mortelle (3, 4). Le virus
infecte aussi l’homme et cause des avortements chez les porcs. Ces derniers jouent un rôle d’amplificateur du
virus, et les oiseaux peuvent être aussi impliqués dans sa diffusion. Un seul sérotype du virus de l’EJ a été
identifié parmi les isolats de virus de l’EJ, bien qu’une variation des souches ait été mise en évidence par des
études sérologiques et moléculaires. Les épreuves d’inhibition de l’hémagglutination et la séroneutralisation
associées à des procédures d’absorption des antigènes ont permis de distinguer dernièrement au moins
2 sous-types, Nakayama et JaGAr-01, parmi les virus de l’EJ (5).
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Chapitre 2.5.14. — Encéphalite japonaise
B. TECHNIQUES DE DIAGNOSTIC
Le diagnostic de confirmation de l’EJ chez les chevaux repose sur l’isolement du virus responsable. Le taux
d’isolement du virus à partir des animaux malades ou morts est habituellement très faible, en raison de l’instabilité
du virus dans certaines conditions d’environnement, et aussi de la présence d’anticorps chez les animaux
infectés. Les constations cliniques, sérologiques et anatomopathologiques sont une aide au diagnostic. Le
diagnostic est aussi possible par détection des anticorps IgM et IgG spécifiques dans le liquide cérébrospinal par
des méthodes immuno-enzymatiques (1). L’acide nucléique viral a été détecté par la technique de la transcription
inverse couplée à une réaction d'amplification en chaîne par polymérase (RT-PCR) dans l’encéphale de chevaux
infectés (7).
Les prélèvements à réaliser pour l’isolement du virus sont une partie du corps strié, du cortex ou du thalamus
d’encéphale de chevaux affectés. Des prélèvements de sang et de moelle épinière peuvent aussi être utilisés
pour l’isolement. Tous les prélèvements doivent être placés au froid immédiatement après récolte, et congelés à
–80°C si l’isolement doit être différé dans le temps. Tous les matériels potentiellement infectés doivent être
manipulés suivant les procédures de niveau 3 (voir le Chapitre I.1.6., « La biosécurité au laboratoire de
microbiologie vétérinaire ») pour prévenir tout risque de contamination humaine. L’homme peut se contaminer par
contact direct du matériel infectieux avec une peau lésée ou les muqueuses, par inoculation parentérale
accidentelle ou par aérosol. Les personnes réalisant les prélèvements devraient aussi prendre les précautions
appropriées pour éviter toute contamination. Un vaccin humain est disponible et toutes les personnes à risque,
vétérinaires ou personnels de laboratoire, devraient être vaccinées.
1.
Identification de l’agent pathogène
Les prélèvements d’encéphale et de moelle épinière sont homogénéisés (à 10%) dans une solution saline
tamponnée à pH 7,4, contenant du sérum de veau (2%) ou de la sérumalbumine bovine (0,75%), de la
streptomycine (100 µg) et de la pénicilline (100 unités/ml). Le sérum de veau doit être exempt d’anticorps dirigés
contre le virus de l’EJ. La suspension est centrifugée à 1 500 g pendant 15 min, et le surnageant est prélevé pour
l’inoculation. Un volume de 0,02 ml est inoculé par voie intracérébrale à des souris âgées de 2 à 4 jours. Ces
souris sont gardées en observation pendant 14 jours. Il est possible qu’aucun signe clinique net ne se développe,
mais l’anorexie est révélée par la disparition des taches de lait blanches sur l’abdomen. La peau change ensuite
de couleur, passant de rosée à rouge foncé, et des convulsions apparaissent juste avant la mort. Les cerveaux
des souris mortes ou moribondes sont collectés et stockés à –80°C pour un passage ultérieur.
Pour identifier le virus, un antigène extrait sur saccharose/acétone est préparé à partir des cerveaux des souris
après un second passage effectué suivant la procédure décrite précédemment (section B.2.b.1). Cet antigène est
testé pour sa capacité à agglutiner les globules rouges de poulet de 1 jour ou d’oie à des pH compris entre 6,0 et
7,0, avec des intervalles de pH de 0,2 conformément à la procédure décrite (2). Des suspensions de globules
rouges à 1/24 sont préparées dans les solutions correspondant aux différents pH. L’extrait antigénique est dilué
de façon sériée de 2 en 2 sous un volume de 25 µl dans une plaque de microtitrage à 96 puits (puits à fond rond).
Puis 25 µl de chaque suspension de globules rouges sont ajoutés dans chaque puits. La plaque est incubée à
37°C pendant 1 h, et le résultat de l’hémagglutination est lu. Si l’antigène a la capacité d’agglutiner les globules
rouges, il est utilisé lors d’une épreuve d’inhibition de l’hémagglutination avec un sérum contre l’EJ.
Des cultures primaires de cellules d’embryon de poulet ou de rein de hamster, ou des lignées cellulaires de
moustique C6/C36 (lignée cellulaire clonée à partir d’Aedes albopictus) peuvent être utilisées pour l’isolement
viral. Les prélèvements (encéphale, sang prélevé sur les animaux infectés en début de maladie), ou la
suspension cérébrale de souriceau après inoculation, sont inoculés dans la culture cellulaire. Des anticorps
monoclonaux spécifiques des Flavivirus et du virus de l’EJ peuvent être utilisés pour identifier le virus par
immunofluorescence indirecte (6).
2.
Épreuves sérologiques
Les épreuves sérologiques sont utiles pour déterminer la prévalence de l’infection dans une population animale,
la distribution géographique du virus, et le niveau de production des anticorps chez les chevaux vaccinés. Pour
appliquer les épreuves sérologiques au diagnostic individuel, il faut tenir compte du fait que les chevaux vivant en
zone d’enzootie peuvent avoir déjà été infectés de façon inapparente ou avoir été vaccinés. La validité des
résultats repose sur une augmentation significative du titre sérologique sur des prélèvements réalisés pendant la
phase aiguë et la phase de convalescence. La spécificité de chaque épreuve sérologique devrait être aussi
considérée. Un test d’agglutination au latex mis au point pour détecter les anticorps dirigés contre le virus de L’EJ
chez le porc a été récemment décrit (8).
Dans certaines régions du monde, il est nécessaire, avant de poser un diagnostic de certitude d’encéphalite
japonaise, de réaliser des tests complémentaires destinés à éliminer une infection par des virus antigéniquement
proches. C’est le cas en Australie, par exemple, où les animaux peuvent être infectés par le virus de l’encéphalite
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Chapitre 2.5.14. — Encéphalite japonaise
de la vallée de Murray et le virus Kunjin, 2 virus étroitement rattachés sur le plan antigénique au virus de l’EJ. La
récente expansion du virus West Nile en Amérique du nord, où l’infection par le virus Saint Louis était enzootique,
démontre l’aptitude des Flavivirus à s’adapter à des environnements nouveaux.
a)
Séroneutralisation virale
L’épreuve de séroneutralisation par réduction des plages utilisant des cultures primaires de cellules
d’embryon de poulet, des cultures de cellules de reins de singe vert d’Afrique (Vero), ou des cultures de
cellules de reins de jeune hamster (BHK) est à la fois sensible et fiable.
Le virus de l’encéphalite japonaise (souche Nakayama ou soucheJaGAr-01) est inoculé par voie
intracérébrale à des souriceaux âgés de 1 jour. L’encéphale des souriceaux morts ou moribonds est
prélevé et mis en suspension dans une solution physiologique tamponnée au phosphate (PBS) de
pH 7,2, contenant 10% de sérum de veau fœtal. La suspension est centrifugée à 5 000 g pendant 20 min à
4°C. Le surnageant est stocké sous forme d’aliquotes à –80°C.
•
Protocole
i)
Inactiver les sérums par chauffage à 56°C au bain marie pendant 30 min.
ii)
Réaliser des dilutions sériées des sérums allant du 1/10 au 1/160 en milieu de culture cellulaire dans
des plaques de 24 puits à fond plat (diamètre des puits : 17 mm) ou des tubes.
iii)
Diluer le stock de virus dans le milieu de culture de façon à obtenir 100 UFP (unité formant plage) dans
0,2 ml.
iv)
Mélanger un volume de chaque dilution de sérum avec un volume égal de dilution de virus. Inclure
dans chaque plaque un témoin virus avec le milieu de culture, un témoin sérum négatif et un témoin
sérum positif.
v)
Incuber l’ensemble pendant 90 min à 37°C.
vi)
Ajouter 200 µl de chaque mélange sérum-virus dans chaque puits (plaque 24 puits) de culture
cellulaire où se trouvent les cellules BHK-21.
vii)
Incuber les plaques pendant 90 min à 37°C sous atmosphère de CO2.
viii) Retirer l’inoculum et ajouter 1 ml de milieu de recouvrement (1,5% de carboxyméthyl cellulose, 1% de
sérum de veau fœtal dans du milieu de Eagle).
ix)
Incuber les plaques pendant 4 jours à 37°C sous une atmosphère de CO2.
x)
Après avoir retirer le milieu de culture, fixer avec une solution contenant 2,5% de bichromate de
potassium, 5% d’acide acétique glacial et 5% de formol pendant 30 min à température ambiante
(utiliser des gants de caoutchouc pour manipuler la solution de fixation).
xi)
Colorer avec une solution de cristal violet à 0,1% pendant 30 min à température ambiante.
xii)
Retirer le colorant et rincer les cellules avec de l’eau du robinet.
xiii) Laisser sécher à l’air libre et compter les plages.
xiv) La concentration du sérum en anticorps est exprimée par la dilution du sérum entraînant une réduction
de 50% des plages de lyse comptabilisées dans le témoin virus (témoin sans sérum).
b)
Inhibition de l’hémagglutination
L’inhibition de l’hémagglutination (IHA) est une épreuve couramment utilisée pour le diagnostic de l’EJ, mais
des réactions croisées avec d’autres Flavivirus sont observées. Pour cette épreuve, le sérum doit être
préalablement traité avec de l’acétone ou du kaolin, et ensuite adsorbé avec des globules rouges
homotypiques pour retirer les hémagglutinines non spécifiques. Des globules rouges d’oie ou de poussins
d’un jour sont utilisés à un pH optimal compris entre 6,6 et 7. L’épreuve devrait être réalisée avec des
sérums traités et 8 unités d’antigène standard ; cet antigène est commercialement disponible dans quelques
pays.
•
Hémagglutination (HA)
•
1.
Préparation de l’antigène viral
Extraction sur saccharose et acétone de l’antigène produit sur encéphales de souriceaux infectés
i)
Homogénéiser l’encéphale des souriceaux dans 4 volumes d’une solution de saccharose à 8,5%.
ii)
Ajouter goutte-à-goutte l’homogénat dans 20 fois son volume d’acétone.
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Chapitre 2.5.14. — Encéphalite japonaise
iii)
Centrifuger (500 g pendant 5 min), puis retirer le surnageant.
iv)
Resuspendre le culot avec le même volume que précédemment d’acétone glacée, et laisser dans de la
glace pendant 1 h.
v)
Centrifuger (500 g pendant 5 min), puis retirer le surnageant.
vi)
Mélanger les culots dans un même tube avec l’acétone glacée.
vii)
Centrifuger (500 g pendant 5 min), puis retirer le surnageant.
viii) Disperser le culot au fond du tube et sécher sous vide pendant 1 à 2 h.
2.
1.
ix)
Dissoudre le culot séché avec une solution physiologique salée (0,4 du volume initial de l’homogénat).
x)
Centrifuger à 8 000 g pendant 1 h à 4°C. Le surnageant (l’antigène) est prêt à l’emploi.
Antigène produit à partir de cellules d’insecte (Aedes albpictus), clone C6/C36, infectées
i)
Récolter le surnageant de culture des cellules infectées après une semaine d’incubation à 28°C.
ii)
Centrifuger à 1 000 g pendant 15 min. Le surnageant (antigène) est prêt à l’emploi.
•
Préparation des globules rouges d’oie
Solutions
Acide-citrate-dextrose (ACD) : 11,26 g de citrate de sodium (Na3C6H5O7.2H2O) ; 4,0 g d’acide citrique
(H3C6H5O7.H2O) ; 11,0 g de dextrose (C6H12O6) ; eau distillée pour un volume final de 500 ml. Stérilisation
à l'autoclave à 10 lb (1,7 unités de pression) pendant 10 min.
Dextrose-gélatine-véronal (DGV) : 0,58 g de véronal (Barbital) ; 0,60 g de gélatine ; 0,38 g de véronal
sodique (barbital sodique) ; 0,02 g (0,026 g) de CaCl2 (pour CaCl2.2H2O) ; 0,12 g de MgSO4.7H2O ; 8,50 g
de NaCl ; 10,0 g de dextrose ; eau distillée pour un volume final de 1 000 ml. Stérilisation à l'autoclave à
10 lb (1,7 unités de pression) pendant 10 min (il est plus facile préparer d’emblée un volume 5 fois plus
grand).
2.
Saignée
Prélever 8,5 ml de sang sur 1,5 ml de ACD (ou 2,8 ml de sang sur 0,5 ml d’ACD).
3.
4.
1.
830
Lavage (stérile)
i)
Un volume de sang total pour 2,5 volumes de DGV. Centrifuger (500 g pendant 15 min), puis éliminer
le surnageant.
ii)
Resuspendre le culot globulaire dans 3 volumes (analogue au volume initial de sang total) de DGV.
iii)
Centrifuger (500 g pendant 15 min), puis éliminer le surnageant. Répéter les étapes 2 et 3 encore à
2 reprises (soit au total 4 séries de lavage).
iv)
Transférer la suspension finale de globules rouges dans un flacon fermé avec du papier d'aluminium.
Ajustement de la concentration globulaire
i)
0,2 ml de la suspension de globules rouges +7,8 ml de de NaCl à 0,9% (dilution à 1/40).
ii)
Relever la densité optique pour une longueur d’onde de 490 nm (DO490) dans un spectrophotomètre
avec un tube de 10 mm.
iii)
Ajuster le stock de globules rouges de telle sorte que la dilution à 1/40 donne une DO490 de
0,450. (volume final = volume initial x absorbance à la DO490/0,450).
iv)
Stocker les globules rouges dans un réfrigérateur 3 semaines au plus.
v)
Avant emploi, resuspendre doucement les globules rouges et les diluer à 1/24 dans le VAD.
•
Dilution de l’antigène
Solutions courantes (qui devraient être maintenues à 4°C) : NaCl 1,5 M : 87,7 g de NaCl et eau distillée pour
un volume final de 1 000 ml ; acide borique 0,5 M : 30,92 g de H3BO3 et eau distillée chaude pour un volume
final de 700 ml (dissoudre l’acide borique et refroidir) ; NaOH 1 N : 40,0 g de NaOH et eau distillée pour un
volume final de 1 000 ml ; borate salin (BS), pH 9,0 : 80 ml de NaCl 1,5 M, 100 ml de H3BO3 0,5 M, 24 ml de
NaOH 1,0 N, et eau distillée pour 1 volume final de 1 000 ml ; albumine bovine à 4% : 4 g d’albumine bovine
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Chapitre 2.5.14. — Encéphalite japonaise
fraction V (Laboratoires Armour), 90 ml de BS, pH 9,0, pH ajusté à 9,0 avec du NaOH 1 N, et BS,
pH 9,0, pour obtenir un volume final de 1 000 ml.
2.
Diluant pour l’antigène : albumine bovine à 0,4% dans du borate salin (BABS) : 10 ml d’albumine bovine à
4%, pH 9,0, et 90 ml de BS, pH 9,0.
3.
Dilution sériée de 2 en 2 de l'antigène dans le BABS dans une plaque de microtitrage (avec puits en U).
•
1.
Addition des hématies d’oie
Solutions à préparer
NaCl 1,5 M
Na2HPO4 0,5 M : 70,99 g de Na2HPO4 (pour Na2HPO4, 12 H2O : 179,08 g), et eau distillée pour un volume
final de 1 000 ml.
Na2HPO4 1,0 M : 138,01 g de NaH2PO4.H2O (pour Na2PO4, 2H2O : 156,01 g), et eau distillée pour un
volume final de 1 000 ml.
2.
Solution de travail : diluant d'ajustement du virus (VAD)
VAD
NaCl 1,5 M
Na2HPO4 0,5 M
NaH2PO4 1,0 M
6,0
100
32
184
6,2
100
62
160
et eau
6,4
100
112
144
distillée pour
6,6
100
160
120
un volume final
6,8
100
192
104
de 1 000 ml
7,0
100
240
80
Les valeurs du diluant (VAD) ne correspondent pas au pH de chaque VAD, mais au pH obtenu après que
chaque VAD ait été mélangé à un volume égal de BABS, pH 9,0.
3.
Réalisation
i)
1 volume de globules rouges d’oie pour 23 volumes de VAD (dilution à 1/24).
ii)
Ajouter 25 µl de globules rouges dilués dans chaque puit de la plaque de microtitrage contenant les
dilutions d’antigène (25 µl/puits).
iii)
Incuber 1 h à 37°C, puis lire les résultats.
++
Agglutination complète (les globules rouges agglutinés forment une mince pellicule
uniformément répartie sur le fond concave du puits).
+
Agglutination partielle (les globules rouges forment un anneau associé à une pellicule rugueuse
ou plus mince).
±
Agglutination minimale (les globules rouges forment un bouton entouré d’une pellicule mince ou
hétérogène).
–
Agglutination négative (bouton clairement défini sans film de globules rouges).
Le point final correspond à la dernière dilution (dilution la plus forte) dans laquelle + + ou + est observé.
Le titre est la réciproque de la dilution correspondant au point final.
•
Inhibition de l’hémagglutination
•
Préparation du sérum à tester
1.
Saignée et séparation des sérums
i)
Incuber l’échantillon sanguin à 37°C pendant 1 h et ensuite à 4°C pendant la nuit. Si l’épreuve doit être
réalisée immédiatement, l’incubation pendant la nuit peut être remplacée par une incubation pendant
2 à 3 h à 37°C.
ii)
Centrifuger (2 000 g pendant 15 min) pour séparer le sérum du caillot.
Manuel terrestre de l’OIE 2005
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Chapitre 2.5.14. — Encéphalite japonaise
2.
3.
4.
5.
iii)
Inactiver par chauffage à 56°C pendant 30 min.
iv)
Conserver à –20°C si l’épreuve n’est pas réalisée immédiatement.
Traitement au 2-mercaptoéthanol
i)
Placer 50 µl de sérum dans 2 petits tubes.
ii)
Ajouter 150 µl de 2-mercaptoéthanol 0,13 M en PBS dans le premier tube, et 15 µl de PBS dans le
second tube.
iii)
Incuber à 37°C pendant 1 h, puis refroidir dans un bain de glace.
Extraction à l’acétone
i)
Placer 2,5 ml d’acétone glacée dans chaque tube. Mettre des bouchons en caoutchouc et extraire
pendant 5 min dans un bain de glace.
ii)
Centrifuger à froid (1 500 g pendant 5 min), puis enlever le surnageant.
iii)
Répéter les étapes i et ii une fois encore.
iv)
Étaler le culot à l'intérieur des tubes et sécher par le vide durant 1 h à température de la pièce.
v)
Ajouter 0,5 ml de PBS à pH 9,0, dans chaque tube. Mettre des bouchons en caoutchouc. Laisser le
sédiment se dissoudre durant la nuit à 4°C pour obtenir une dilution des sérums à 1/10.
Extraction au kaolin comme alternative à l’extraction à l’acétone
i)
Kaolin lavé à l’acide (Fischer) à 25% en BS, pH 9,0.
ii)
1 volume de sérum pour 4 volumes de BS et 5 volumes de kaolin à 25%.
iii)
Extraire pendant 20 min à température de la pièce en agitant de temps en temps.
iv)
Centrifuger (30 min à 1 000 g). Les surnageants représentent la dilution 1/10 des sérums.
Absorption avec les globules rouges d’oie
i)
Ajouter à 1/50 les globules rouges (culot) d’oie à chaque sérum à traiter.
ii)
Absorber pendant 20 min dans un bain de glace.
iii)
Centrifuger (10 min à 800 g). Le surnageant est prêt pour l’épreuve d’IHA (dilution à 1/10).
•
Épreuve d’inhibition de l’hémagglutination (IHA)
1.
Premier titrage de l’antigène
Diluer l’antigène pour obtenir 4 à 8 unités hémagglutinantes dans 0,05 ml.
2.
Dilution sériée de 2 en 2 des sérums à tester en microplaque
Réaction sérum-antigène
Ajouter 25 µl d’antigène dilué dans chaque puits contenant les sérums à tester dilués. Placer le reste de
l’antigène dans les cupules vide et incuber une nuit à 4°C.
3.
4.
Titrage secondaire de l’antigène
i)
Collecter l’antigène distribué dans les puits vides et contrôler l’activité hémagglutinante par dilution
sériée de 2 en 2 en conservant un volume de 25 µl.
ii)
Ajouter 25 µl de BABS dans chaque puits pour avoir 50 µl par puits.
Addition des globules rouges d’oie
i)
Diluer le stock de globules rouges (1/24) dans le VAD.
ii)
Distribuer 50 µl dans chaque puits contenant 50 µl de mélange sérum + antigène ou 50 µl d’antigène
destiné au titrage secondaire.
iii)
Incuber à 37°C pendant 1 h, puis lire le résultat.
Le titre IH du sérum est la réciproque de la dilution la plus élevée du sérum à tester montrant une
inhibition complète de l’HA.
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Manuel terrestre de l’OIE 2005
Chapitre 2.5.14. — Encéphalite japonaise
5.
Interprétation des résultats
Une multiplication ou une division par 4 du titre sérique (différence entre le sérum précoce prélevé en phase
aiguë et le sérum tardif prélevé en phase de convalescence) est considérée comme une augmentation ou
une diminution significative. Elle permet le diagnostic d'infection par un virus antigéniquement rattaché à
celui utilisé dans l’épreuve.
c)
Fixation du complément
La fixation du complément (FC) est parfois employée pour le diagnostic sérologique. L'antigène pour ce test
est extrait par l’acétone/éther (mélange à volume égal) à partir des cerveaux de souris inoculées.
•
Préparation de l’antigène
i)
Extraire et peser les cerveaux des souris inoculées mortes.
ii)
Ajouter à ces cerveaux 20 volumes d’acétone glacée, placer à –20°C, et homogénéiser.
iii)
Centrifuger la suspension pendant 5 min à 5 000 g à 4°C, et retirer le surnageant.
iv)
Ajouter au culot le même volume d’acétone glacée comme déjà réalisé dans l’étape ii au-dessus, et
bien mélanger.
v)
Extraire avec l’acétone en conservant le culot à –20°C pendant 20 min, et refaire la centrifugation
décrite dans l’étape iii au-dessus.
vi)
Répéter les étapes iv et v.
vii)
Répéter les étapes iv et v, en utilisant cette fois de l’acétone/éther (mélange à volume égal).
viii) Répéter les étapes iv et v 2 fois en utilisant de l’éther glacé.
ix)
Retirer le surnageant par aspiration et étaler le culot au fond du tube à centrifuger.
x)
Sécher sous vide pendant 1 à 2 h.
xi)
Dissoudre le culot dans de l’eau physiologique froide (2 ml/g de cerveau) et placer à 4°C durant la nuit.
xii)
Centrifuger 1 h à 5 000 g. Le surnageant constitue l’antigène.
•
Protocole
i)
inactiver par la chaleur les sérums à tester dilués au 1/4 dans du tampon gélatine-véronal.
ii)
Réaliser une dilution sériée de 2 en 2 des sérums dans une plaque de microtitrage à 96 puits (25 µl).
iii)
Ajouter 4 unités d’antigène sous un volume de 25 µl et mélanger par vibration.
iv)
Ajouter 2 unités de complément sous un volume de 50 µl (pool de sérums frais de cobaye).
v)
Mélanger par vibration et incuber 18 h à 4°C.
vi)
Laisser la plaque de microtitrage à température de la pièce pendant 15 min.
vii)
Ajouter dans chaque puits 25 µl d’hématies de mouton sensibilisées.
viii) Mélanger par vibration et incuber 30 min à 37°C, puis lire le résultat.
ix)
La dilution la plus élevée des sérums à tester ne montrant aucune hémolyse représente le titre de ces
sérums en FC. Une multiplication ou une division du titre par 4 ou plus est considérée comme
significative.
C. SPÉCIFICATIONS APPLICABLES AUX VACCINS ET AUX PRODUITS
BIOLOGIQUES À USAGE DIAGNOSTIQUE
Le vaccin contre l’encéphalite japonaise chez les chevaux est préparé par inactivation d’une suspension virale
dérivée de cerveaux de souris ou de cultures cellulaires infectées.
Les instructions pour la production des vaccins vétérinaires sont données dans le Chapitre I.1.7., « Principes de
fabrication des vaccins à usage vétérinaire ». Les instructions données ici et dans le Chapitre I.1.7. sont d’ordre
général et peuvent être complétées par les exigences nationales et régionales.
Manuel terrestre de l’OIE 2005
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Chapitre 2.5.14. — Encéphalite japonaise
1.
Gestion des semences virales
a)
Caractéristiques de la semence virale
La souche Beijing-1 du virus de l’encéphalite japonaise est utilisée pour la production du vaccin au Japon.
La souche doit être létale pour les souris quant elle est inoculée par voie intracérébrale, et doit pouvoir se
répliquer dans une culture primaire de cellules de rein de porc. Cette souche a la capacité d’agglutiner les
hématies d’oie, de poussin de 1 jour ou de pigeon. Le virus doit pouvoir être neutralisé par un antisérum
standard dirigé contre le virus de l’encéphalite japonaise.
b)
Méthodes de culture
Le virus initial et le virus de semence devraient être produits sur cerveaux de souris ou en cultures de
cellules. Le nombre de passages ne devrait pas excéder 3 passages pour le pour virus initial et 2 passages
pour le virus de semence.
c)
Validation de la semence candidate comme semence vaccinale
Le vaccin produit à partir de cette souche induit une protection des équins contre l’encéphalite et prévient la
naissance de porcelets mort-nés chez les truies gestantes.
Il est recommandé que le virus initial et le virus de semence soient conservés en dessous de –70°C, ou en
dessous de 5°C après lyophilisation.
2.
Méthode de fabrication
Le virus est multiplié sur cerveaux de souris âgées de 3 à 4 semaines ou sur culture cellulaire en monocouche.
Des cultures témoins non inoculées ne devraient montrer aucun ECP causé par d’autres virus. Le virus de
semence est inoculé aux souris par voie intracérébrale. Les cerveaux des souris qui présentent des symptômes
sévères d’encéphalite sont collectés. Ils sont broyés et homogénéisés en PBS, centrifugés à 1 500 g pendant
30 min ; le liquide surnageant représente la suspension de virus.
Le virus de semence est inoculé à des cultures de cellules et les liquides sont ensuite récoltés séparément pour
chaque lot lorsque la réplication virale atteint son maximum. Ce liquide est filtré, ou centrifugé à 1 500 g pendant
30 min ; le liquide surnageant représente la suspension de virus.
Du formol (0,5%) est ajouté à la suspension afin d’inactiver le virus vivant ; on considère qu’il s’agit de « la
suspension non diluée de virus ». Un adjuvant peut être ajouté pour augmenter son pouvoir immunogène.
3.
Contrôles en cours de fabrication
Des contrôles devraient être effectués sur la suspension virale, d’une part par les techniques classiques de
culture pour rechercher la présence de contaminants bactériens, d’autre part par inoculation intracérébrale à la
souris ou inoculation de cultures de cellules pour la présence de virus infectieux. La suspension virale inactivée
non diluée devrait être de nouveau contrôlée par culture et examen microscopique après coloration pour
rechercher une contamination bactérienne. Elle devrait être en outre contrôlée par inoculation intracérébrale à la
souris pour s’assurer de la complète inactivation du virus par le formol.
4.
Contrôle des lots
a)
Stérilité
Les tests destinés à contrôler la stérilité et l’absence de contamination des matériaux biologiques peuvent
être trouvés dans le Chapitre I.1.5., « Contrôle de la stérilité ou de l’absence de contamination des matériels
biologiques ».
b)
Innocuité
Dix souris âgées de 3 jours son inoculées par voie intracérébrale avec 0,02 ml du produit final, et sont mises
en observation durant 14 jours afin de s’assurer (par l’absence de mortalité) de la complète inactivation du
virus vivant.
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Manuel terrestre de l’OIE 2005
Chapitre 2.5.14. — Encéphalite japonaise
5.
Contrôles du produit fini
a)
Stérilité
Les tests destinés à contrôler la stérilité et l’absence de contamination des matériaux biologiques peuvent
être trouvés dans le Chapitre I.1.5.
b)
Innocuité
Voir le paragraphe C.4.b.
c)
Détermination de la concentration en formol
La concentration en formol devrait être trouvée inférieure à 0,2% (v/v) par les méthodes habituelles de
quantification.
d)
Activité
Le produit final doit être contrôlé, afin de s’assurer de son pouvoir immunogène, par des tests de protection
chez la souris. Le produit est dilué au dixième dans du PBS ; 30 souris âgées de 2 à 3 semaines sont
inoculées par voie intrapéritonéale, 2 fois à 3 jours d’intervalle, avec 0,1 ml du produit dilué. Il devrait y avoir
un groupe témoin équivalent non inoculé. 8 jours après la première inoculation, toutes les souris subissent
une épreuve virulente par injection intrapéritonéale d’une dose définie de virus vivant. Le pourcentage de
survivants dans le groupe vacciné devrait être supérieur à 40% et le taux de mortalité dans le groupe témoin
devrait être supérieur à 90%. Le titre du virus d’épreuve ne devrait pas être inférieur à 103 DL50 (dose létale
50%) par 0,2 ml.
e)
Stabilité
Conservé à 4°C, le produit final doit rester pleinement efficace pendant 12 mois.
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