Chapitre 2.8.3.

Manuel terrestre de l’OIE 2005 1045
CHAPITRE 2.8.3.
MALADIE HÉMORRAGIQUE DU LAPIN
RÉSUMÉ
La maladie hémorragique du lapin (RHD) est une maladie mortelle fortement contagieuse et aiguë
qui atteint le lapin européen (Oryctolagus cuniculus) et est provoquée par un calicivirus. Une
maladie semblable, dénommée syndrome du lièvre brun européen (EBHS), a été décrite chez les
lièvres (Lepus europaeus). L’agent étiologique est un calicivirus différent, mais antigéniquement
proche du virus de la RHD (RHDV). La RHD est caractérisée par une morbidité et une mortalité
élevées (40 à 90 %), et se propage très rapidement par transmission directe ou indirecte.
L’infection peut se produire par voie nasale, conjonctivale ou orale. La transmission de la RHD est
facilitée par la stabilité élevée du virus dans l’environnement. La période d’incubation varie de 1 à
3 jours, et la mort se produit habituellement en 12 à 36 h après le début de l’hyperthermie. Les
manifestations cliniques ont principalement été décrites pour l’infection aiguë (signes nerveux et
respiratoires, apathie et anorexie). Les lésions pathologiques sont spécifiques et évidentes, autant
macroscopiquement que microscopiquement. On constate une nécrose hépatique et une
coagulopathie intravasculaire disséminée (CIVD) massive dans tous les organes et les tissus. Les
lésions les plus importantes se retrouvent dans le foie, la trachée et les poumons. Des pétéchies
sont visibles dans presque tous les organes et sont accompagnées d’une diminution de la
coagulation sanguine.
Identification de l’agent pathogène : le foie contient les titres viraux les plus élevés et est
l’organe le plus approprié pour la mise en évidence du virus. Comme aucune condition de
croissance satisfaisante ou milieu de culture de cellules sensibles n’a pu être établie, l’isolement in
vitro ne peut être employé. Le test d’hémagglutination (HA) sur globules rouges humains du groupe
sanguin O a été le premier test utilisé pour le diagnostic de routine en laboratoire de la RHD.
Cependant d’autres tests (immunomicroscopie électronique indirecte, méthode
immuno-enzymatique (ELISA), marquage immunohistologique, amplification en chaîne par
polymérase (PCR) et Western Blot) ont montré des niveaux de sensibilité et de spécificité plus
élevés.
Épreuves sérologiques : la caractérisation et le titrage des anticorps spécifiques résultant de
l’infection normale ou de l’immunisation sont réalisés par inhibition de l’hémagglutination ou par
ELISA, indirect ou de compétition. Les réactifs suivants sont préparés : antigène à partir de foie de
lapin infecté, sérum anti-RHDV de lapins convalescents ou hyperimmunisés et sérum négatif de
lapins sensibles à l’infection par le RHDV. Plusieurs laboratoires ont produit des anticorps
monoclonaux (AcM). Quelques-uns ont produit un antigène recombinant, la protéine structurale
VP6O exprimée en système baculovirus, antigène qui peut être employé à des fins diagnostiques.
Spécifications applicables aux vaccins et aux produits biologiques à usage diagnostique : le
contrôle indirect de la maladie est réalisé par la vaccination, en utilisant un vaccin inactivé préparé
à partir de suspensions clarifiées de foie de lapins expérimentalement infectés, ensuite inactivées
ainsi qu’adjuvées. Les animaux vaccinés produisent rapidement une immunité complète contre
l’infection par le RHDV (et ceci dans les 5 à 10 jours). Les données expérimentales indiquent que la
protection vaccinale peut s’étendre sur une longue période (plus de 1 an).
A. INTRODUCTION
La maladie hémorragique du lapin (RHD) est une maladie mortelle fortement contagieuse et aiguë des lapins
européens sauvages et domestiques (Oryctolagus cuniculus).

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La RHD a été rapportée pour la première fois en 1984 en République Populaire de Chine (19) ; actuellement elle
est enzootique en Asie de l’Est, en Europe et en Océanie. Des épizooties ont également été enregistrées en
Amérique Centrale (au Mexique et à Cuba), en Arabie Saoudite ainsi qu’en Afrique du Nord et de l’Ouest. En
2000 et 2001, 3 épizooties indépendantes ont été enregistrées aux États-Unis d’Amérique.
L’agent causal de la RHD est un calicivirus de 32 à 35 nm de diamètre et sa capside est constituée d’un
polypeptide unique (60 kDa), son génome est constitué d’un ARN de 7437 kb et un ARN sous-génomique de
2,2 kb (9, 20-22). La protéine de capside (VP60) du virus de la RHD (RHDV) se compose de 2 domaines distincts
liés par une région charnière : les résidus en positions 200-250 de la partie N-terminale constituent le domaine
intérieur et les résidus au-delà des positions 200-250, c’est-à-dire de la partie C-terminale, constituent le domaine
saillant. Dans l’image globale de la capside, ces domaines forment une couche interne et une couche externe,
cette dernière étant caractérisée par des structures en forme d’arche. Cette structure est également en
corrélation avec les caractéristiques antigéniques du RHDV ; en fait les déterminants antigéniques principaux
sont situés dans la partie C-terminale (4, 5, 23, 27).
Depuis 1991, un second type de particule virale a été identifié comme composant principal dans
approximativement 5 % des échantillons RHDV-positifs, c’est-à-dire pris sur des lapins présentant une évolution
longue de la maladie (8). Les caractéristiques de cette particule sont : i) une surface lisse et un diamètre plus petit
que le RHDV ; ii) sa protéine est de 28 à 30 kDa ; iii) elle réagit avec les sérums de lapins convalescents de la
RHD et avec des anticorps monoclonaux (AcM) anti-RHDV réagissant avec la partie N-terminale de la VP60 du
RHDV, et iv) elles est négative à l’hémagglutination (HA). Cette particule virale plus petite correspond à la coque
interne du RHDV, et 2 hypothèses ont été proposées pour expliquer son origine. Granzow et al (15) ont supposé
qu’elle résultait du génome tronqué du RHDV ou d’une expression défectueuse de son génome. Cependant,
Barbieri et al. (2) ont observé ce qui suit : i) une forte corrélation entre une présence plus grande de
particules lisses de RHDV (s-RHDV) dans les organes et l’apparition d’IgM spécifiques anti-RHDV au jour 3 ou
4 post-infection ; ii) la présence de grandes quantités de s-RHDV dans le foie et la rate seuls et pas dans la
circulation sanguine, comme cela se produit dans la phase de virémie de RHD aiguë ; iii) la découverte
de fragments de la VP60 ayant différentes masses moléculaires (41 à 30 kDa) durant la transition entre RHDV et
s-RHDV. De cela, ils concluent que la genèse de la particule est due au processus de dégradation qui est
probablement la conséquence du nettoyage physiologique des complexes immuns IgM-RHDV formés en grandes
quantités lors du début de la réponse humorale. Indépendamment de son origine, l’identification de cette
deuxième particule dans le foie peut être considérée comme un marqueur de la forme subaiguë/chronique de la
RHD, qui évolue habituellement entre les jours 4 et 8 post-infection et est suivie de la mort du lapin ou, moins
souvent, par son rétablissement (2).
Tous les isolats viraux connus de RHD semblent appartenir à un seul sérotype. La séquence complète de
souches de RHD d’origines géographiquement différentes a été publiée. Les comparaisons révèlent une
homologie assez proche en termes de séquence génomique avec peu ou pas de changements dans la
composition en acides aminés (différences variant de 2 à 5 %). Néanmoins des isolats qui montrent des
variations dépendant de la température de l’hémagglutination (3) ont été décrits, et plus récemment un variant
génétique et antigénique du RHDV a été décrit simultanément en Italie (4) et en Allemagne (23). Ce variant
RHDV, appelé RHDVa présente des changements en acides aminés 3 fois plus importants que dans les isolats
précédemment séquencés, ceci en surface de la région exposée E (aa 344-434) qui contient les épitopes
principaux des calicivirus. Un set d’anticorps donné qui protègent contre l’infection par le RHDV a été testé
négativement par réaction immuno-enzymatique (ELISA) contre un antigène du RHDVa. Cependant, des lapins
expérimentalement vaccinés avec le vaccin actuellement disponible contre le RHDV ont été protégés lors d’un
challenge avec le RHDVa, même si c’était avec une efficacité inférieure (4, 23).
Un autre virus, provisoirement appelé calicivirus du lapin (RCV) et lié au RHDV, a été identifié chez des lapins
sains (6, 7). Il est significativement différent des isolats précédemment caractérisés de RHDV en terme de
pouvoir pathogène, titrage viral, tropisme tissulaire et séquence primaire de la protéine structurale. Il est avirulent,
se réplique dans l’intestin à un bas titre et a une homologie génomique d’environ 92 % avec le RHDV. Les
résultats d’expériences de protection croisée indiqueraient que ce virus ne pourrait pas infecter les lièvres. En
outre les données antigéniques et les comparaisons de séquence ont démontré qu’il est plus proche du RHDV
que du virus du syndrome du lièvre brun européen (EBHSV).
Le RHDV est très stable et résistant dans l’environnement. L’infectiosité du virus n’est réduite ni par traitement au
chloroforme, ni par l’éther, ni par la trypsine, ni par exposition à pH3, ni par chauffage à 50°C pendant 1 h. Le
virus survit durant au moins 225 jours dans une suspension d’organe maintenue à 4°C, au moins 105 jours à
l’état déshydraté sur tissu à température ambiante, et au moins 2 jours à 60°C, autant en suspension d’organe
qu’à l’état déshydraté (24). Il garde également son infectiosité à des températures basses, et reste tout à fait
stable lors des processus de congélation/décongélation. Le RHDV est inactivé par l’hydroxyde de sodium à
10 %, par le formol à 1-1,4 % et par la béta-propiolactone à 4°C. De tels traitements n’altèrent pas
l’immunogénicité du virus.

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Le lapin européen (Oryctolagus cuniculus) est la seule espèce connue à être infectée par la RHD. Aucun autre
lagomorphe, tel le lapin du volcan du Mexique (Romerolagus diazzi), le lapin à queue noire (Lepus californicus) et
le lapin de garenne d’Amérique du Nord (Sylvilagus floridanus), ne s’est avéré sensible (16). Une maladie
semblable, nommée le syndrome du lièvre brun européen (EBHS), a été décrite chez les lièvres (Lepus
europaeus), mais son agent étiologique, qui est également un calicivirus, est différent du RHDV, bien qu’il lui soit
antigéniquement apparenté. L’alignement des séquences d’ARN des génomes du EBHS et du RHDV montre une
identité nucléotidique de 71 %, et l’alignement des acides aminés montre une identité de 78 % et une similitude
de 87 % (27). L’infection croisée expérimentale de lapins avec l’EBHS et de lièvres avec le RHDV ne se produit
pas (18). Des études récentes ayant tenté de démontrer la sensibilité du lapin à l’EBHSV ont indiqué une
prévalence diffuse du virus dans une population sauvage de lapins de garenne et la possibilité d’induire une
maladie clinique et une mortalité chez un petit nombre de ces lapins de garenne expérimentalement infectés
(Lavazza données non publiées).
La RHD est caractérisée par une morbidité élevée et un taux de mortalité qui se situe entre 40 et 90 %. L’infection
se produit chez les lapins de tout âge, mais la maladie clinique n’est seulement observée que chez les adultes et
les jeunes animaux de plus de 40 ou 50 jours. Le mécanisme pathogénique de résistance des jeunes animaux
est encore inconnu (8).
L’évolution clinique de la maladie peut être suraiguë, aiguë, subaiguë ou chronique. Les manifestations cliniques
ont été décrites principalement pour l’infection aiguë, puisque habituellement il n’existe aucun signe clinique dans
la forme suraiguë, et que la forme subaiguë est caractérisée par des signes similaires, mais plus légers. La
période d’incubation varie de 1 à 3 jours ; la mort peut survenir 12 à 36 h après le début de la fièvre (>40°C).
Pendant une épizootie, un nombre limité de lapins (5 à 10 %) pourra développer une forme chronique ou
subaiguë de la maladie. Ces animaux meurent souvent 1 à 2 semaines plus tard, probablement suite à une
dysfonction hépatique.
Les lésions pathologiques sont variables et peuvent être légères. Les lésions primaires sont de la nécrose
hépatique et de la splénomégalie. Cependant, une coagulopathie massive est généralement la cause
d’hémorragies dans toute une série d’organes et d’une mort soudaine. Dans la maladie subaiguë et la maladie
chronique, un ictère des oreilles, de la conjonctive et des muqueuses est clairement évident.
Les signes cliniques et les lésions macroscopiques et microscopiques observés chez les lièvres atteints de EBHS
sont très similaires à ceux décrits pour la RHD chez le lapin. À l’autopsie, les principales découvertes sont de
l’œdème et de la congestion de la trachée avec un contenu hémorragique spumeux, de la dégénérescence
hépatique, de la splénomégalie et un ictère généralisé (8). La maladie chez les lièvres dure légèrement plus
longtemps et cause un taux de mortalité un peu plus bas (autour des 50 %) que la RHD chez le lapin ; le pic de
mortalité chez des lièvres expérimentalement infectés est généralement observé entre 60 et 90 h post-infection.
B. TECHNIQUES DE DIAGNOSTIC
1. Identification de l’agent pathogène
Le foie contient le titre viral le plus élevé (de 103 DL50 [dose létale 50 %] à 106,5 DL50) et est l’organe de choix pour
l’identification virale du RHDV comme du EBHSV. La quantité de virus présente dans d’autres parties du corps
est directement proportionnelle à la vascularisation ; ainsi la rate et le sérum sont assez riches en virus et
peuvent servir de matériel alternatif de diagnostic. En particulier, de plus hauts niveaux en particules sous-virales
peuvent être détectés dans la rate plutôt que dans le foie de certains animaux morts de la forme
subaiguë/chronique de la maladie (2). Le traitement initial de l’échantillon de diagnostic est presque identique
quelque soit la méthode de diagnostic à appliquer, à l’exception des techniques d’immunomarquage. Un fragment
d’organe est homogénéisé mécaniquement dans une solution physiologique tamponnée au phosphate à 5-20 %
(w/v) (PBS), pH 7,2, filtré à l’aide de gaze et clarifié par centrifugation à 5 000 g pendant 5 min. À cette étape, le
surnageant peut être directement examiné par un test d’hémagglutination (HA) ou par un ELISA. Si l’échantillon
doit être examiné au microscope électronique (EM), il est envisageable de réaliser une seconde centrifugation à
12 000 g pendant 15 min, avant l’ultracentrifugation finale.
Comme aucune condition de croissance satisfaisante ni de culture de cellules sensibles n’a pu être établie,
l’isolement in vitro du RHDV ou du EBHSV ne peut pas être inclus dans les méthodes virologiques. L’inoculation
de suspensions de tissus de lapins infectés ne permet pas de reproduire la maladie et aucune réplication du virus
n’a été détectée par la technique de la transcription inverse couplée à une réaction d'amplification en chaîne par
polymérase (RT-PCR) chez 28 espèces de vertébrés autres que le lapin (24). L’inoculation au lapin reste donc la
seule manière d’isoler, de propager et de titrer l’infectiosité du virus.
De grandes quantités d’antigènes viraux sont préparées pour les réactifs diagnostiques et pour produire des
vaccins inactivés dérivés de tissus. L’infection expérimentale n’est pas pratique comme méthode de diagnostic de

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routine, bien que cela puisse être utile dans le cas où des échantillons donneraient des résultats de tests
équivoques (exemple : HA négatif/ELISA positif) ou pour le diagnostic initial dans des pays où la RHD n’est pas
censée exister.
Pour faire des essais expérimentaux réussis, les lapins concernés doivent être entièrement sensibles au virus,
c’est-à-dire qu’ils devraient être âgés de 40 ou 50 jours et ne pas posséder d’anticorps spécifiques, même à bas
titre. La RHD peut être reproduite par utilisation de suspensions de foie filtrées et traitées aux antibiotiques,
inoculées soit par voie intramusculaire, soit par voie intraveineuse, soit per os. Quand la maladie est cliniquement
évidente, les signes et les lésions post mortem sont identiques à ceux décrits pour une infection naturelle. Une
augmentation de la température corporelle est enregistrée entre 18 et 24 h post-infection, suivie, aux alentours de
70 à 90 % des cas, de mort entre 24 et 72 h post-infection. Quelques individus peuvent survivre jusqu’à 6 jours
après l’infection. Les animaux qui surmontent la maladie montrent seulement une hyperthermie transitoire, de
l’abattement et de l’anorexie, mais présentent une forte séroconversion saisissante qui peut être facilement
détectée 4 à 6 jours après l’infection.
a) Test d’hémagglutination
L’HA a été le premier test utilisé pour le diagnostic de laboratoire en routine de la RHD (19). Il devrait être
réalisé avec des globules rouges (GR) humains de groupe O, fraîchement collectés, stockés toute une nuit
dans de la solution d’Alsever, et lavés avec du PBS à 0,85 % et à pH 6,5 (gamme de 6-7,2). L’HA est moins
évidente voire inexistante lorsque des GRs d’autres espèces sont utilisés. Les GRs lavés sont suspendus
dans du PBS à 0,75 %. Une dilution 2x du surnageant clarifié d’un homogénat à 10 % de tissus de foie ou
de rate est incubé avec un volume égal de GRs lavés dans une plaque de microtitrage scellée à 4°C, de
préférence. Après 1 h (entre 20 min et 2 h) d’incubation, l’hémagglutination à une dilution > à 1/160 est
considérée comme positive. Des titres moins élevés pourraient être considérés comme douteux, et
devraient être vérifiés par d’autres méthodes. Aux alentours de 10 % des échantillons sont positifs par
ELISA ou microscopie électronique, mais donnent des résultats négatifs au test d’hémagglutination (HA faux
négatifs). Certains isolats de RHD peuvent montrer des différences dépendant de la température dans leurs
caractéristiques d’hémagglutination (3) et pourraient montrer une activité HA seulement lorsque le test est
réalisé à 4°C. Néanmoins les faux négatifs au HA sont principalement détectés dans les organes de lapins
montrant une forme subaiguë/chronique de la maladie et cela dépend des caractéristiques des particules
lisses, tronquées de RHDV.
Les organes de lièvres donnent rarement un titre significatif quand le protocole HA RHDV est utilisé. Pour
metttre en évidence une activité HA dans des organes provenant de lapins infectés par le EBHSV, une
procédure modifiée doit être adoptée : toutes les étapes sont effectuées à 4°C, la suspension d’organe est
traitée avec un volume égal de chloroforme, et les GRs ne sont pas utilisés à un pH plus élevé que 6,5 (8).
Même avec cette méthode, environ 50 % seulement des échantillons donnent un résultat positif, car cette
maladie est le plus souvent subaiguë ou chronique chez les lièvres et que le virus doit donc avoir les
caractéristiques antigéniques et structurales typiques des particules s-RHDV (8).
En raison de la difficulté pratique d’obtenir et de conserver des cellules sanguines humaines du groupe O,
ainsi que du risque de travailler avec ces cellules, et de la difficulté d’obtenir des résultats répétables, ce test
a été remplacé par la détection du virus par ELISA.
b) Microscopie électronique
La microscopie électronique en coloration négative peut être réalisée par la méthode dite « méthode de la
goutte ». Une grille recouverte de formvar/carbone est placée sur une goutte de suspension d’organe
(préparée de la façon décrite dans la section B.1.a), et laissée pendant 5 min. Après avoir enlevé l’excès de
fluide avec le bord d’un morceau de papier filtre déchiré, la grille est laissée, flottant sur une goutte à 2 % de
phosphotungstate de sodium (NaPT), pH 6,8, pendant 1,5 min. L’excès de coloration est enlevé et la grille
peut être observée à un grossissement de 25 000.
Du fait de la faible sensibilité de la méthode de la goutte, il est envisageable de centrifuger l’échantillon dans
le but de concentrer les particules virales. Le culot obtenu après ultracentrifugation d’au moins 100 000 g
pendant 30 min ou, alternativement en utilisant une Beckman Airfuge à 21 psi durant 5 min est resuspendu
dans du PBS ou de l’eau distillée, déposé sur une grille pendant quelques minutes, et ensuite coloré tel que
décrit par avant. Les virions de RHD sont visibles sous forme de particules sans membrane, de 32 à 35 nm
de diamètre, présentant une structure interne (25 à 27 nm de diamètre), délimitée par un anneau duquel
radient 10 petites projections périphériques à distribution régulière. Les particules lisses (s-RHDV) sont
identifiées par la perte complète des portions externes, devenant parfaitement hexagonales et plus petites,
avec seulement l’anneau de la capside visible (2, 8, 14).
Dans le but de réaliser un diagnostic, notamment lorsque les autres méthodes donnent des résultats
douteux, la meilleure méthode microscopique est une technique immuno-électromicroscopique (IEM). Cette
méthode utilise soit un sérum hyperimmun anti-RHDV, obtenu de lapin ou d’autres espèces, soit des AcMs

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spécifiques, qui sont incubés avec un volume équivalent de l’échantillon pendant 1 h à 37°C avant
ultracentrifugation. La réaction immunologique induit l’agglutination des particules virales dans un agrégat
qui est rapidement et aisément identifié à l’EM. Les méthodes immunologiques utilisant l’or sont également
appliquées pour mieux visualiser les virions et les protéines virales.
L’EBHSV peut aussi être identifié dans des échantillons diagnostiques par examen en EM. En outre, la
méthode IEM utilisant du sérum convalescent anti-EBHSV ou des AcMs spécifiques anti-EBHS peut être
appliquée pour identifier l’EBHSV. En utilisant des antisérums spécifiques pour l’EBHSV et le RHDV, il est
possible de différencier les 2 virus.
c) Méthodes immuno-enzymatiques
La détection de virus par un ELISA se fonde sur une technique de type « sandwich » et beaucoup de
techniques dérivées ont été décrites. Une procédure utilise les réactifs, solutions, temps et température qui
sont employées dans l’ELISA de compétition (c-ELISA) pour la sérologie (voir section B.2.b.), excepté que
la concentration en Tween 20 est 2 fois plus importante (0,1 % [v/v]). La microplaque utilisée doit avoir de
bonnes capacités d’absorption (par exemple Nunc Maxisorp immunoplate). L’homogénat de foie est
resuspendu à 10 % (w/v) dans du PBS standard ; 50 µl est le volume standard à utiliser à chaque étape. Le
tampon d’ELISA utilisé pour toutes les étapes est du PBS avec 1 % d’extrait de levure (ou l’albumine
sérique bovine [BSA]), et du Tween 20 0,1 %, pH 7,4. Toutes les étapes d’incubation durent de 50 à 60 min
à 37°C en agitation douce. Après toutes ces étapes, 3 lavages de 3 à 5 min doivent être réalisés en
employant du PBS avec du Tween 20 0,1 %. Des homogénats de foie de lapin positif et négatif pour la RHD
doivent être utilisés comme témoins. La peroxydase de raifort (HRPO) peut être couplée à des IgG purifiées
d’un sérum polyclonal ou à des AcMs (voir section B.2.b.). Les AcMs anti-RHDV ont été produits dans
plusieurs laboratoires et peuvent être utilisés à la place de sérums polyclonaux. Plus récemment, des AcMs
reconnaissant des épitopes spécifiques exprimés seulement par le variant RHDVa ont été également
produits (Capucci, données personnelles).
Pour mieux caractériser l’antigénicité des isolats de RHD par un ELISA sandwich, il est envisageable de
tester chaque échantillon 4 fois, et d’utiliser 4 conjugués HRPO différents, par exemple 2 AcMs
reconnaissant le même déterminant antigénique présent à la surface du virus et exprimé soit par la souche
classique soit par le variant RHDVa, un sérum hyperimmun anti-RHDV polyclonal (qui pourrait identifier des
« nouveaux variants potentiels » ou des virus apparentés, comme le EBHSV) et un pool d’AcMs
reconnaissant des épitopes internes qui peut détecter les particules s-RHDV lisses, dégradées telles que le
EBHSV. Un ELISA de capture d’antigène alternatif utilisant des anticorps anti-RHDV de moutons comme
anticorps de capture et un AcM pour la détection du RHDV a été décrit (11).
• Protocole (exemple)
Pour les étapes qui ne sont pas indiquées spécifiquement, voir la procédure du c-ELISA pour la sérologie
(section B.2.b.).
i) Recouvrir la plaque avec un sérum hyperimmun anti-RHDV et un sérum RHDV négatif, le dernier
servant de témoin vis-à-vis de réactions non spécifiques (échantillons faux positifs). Pour chaque
échantillon, 4 puits doivent être sensibilisés avec le sérum positif et 4 puits avec le négatif.
ii) Diluer l’extrait de foie au 1/5 et au 1/30 (2 répliques pour chaque dilution) dans le tampon d’ELISA (voir
ci-dessus), directement dans les puits de la plaque (par exemple ajouter 45 µl du tampon dans tous les
puits de la plaque, ajouter 10 µl de l’échantillon dans les 2 premiers puits et ensuite, après
basculement, transférer 9 µl dans le second puits). Traiter les témoins, aussi bien le positif que le
négatif, de la même façon que les échantillons.
iii) Après incubation et lavage (voir ci-dessus), incuber avec le conjugué HRPO.
iv) Après une dernière série de lavages, ajouter le substrat chromogénique. L’orthophénylènediamine
(OPD) doit être utilisée comme substrat de la peroxydase pour le développement final de la réaction.
Employer du tampon 0,15 M de citrate phosphate, pH 5,0, avec 0,5 mg/ml d’OPD et 0,02 % de
H2O2. La réaction est arrêtée après 5 min par addition de 50 µl de H2SO4 1 M.
v) L’absorbance est lue à 492 nm. Les échantillons positifs sont ceux montrant une différence > 3 dans
l’absorbance, entre les puits recouverts avec du sérum RHDV-positif et ceux recouverts avec du sérum
négatif. Habituellement, à la dilution 1/30, les échantillons positifs récoltés de lapins présentant la
forme classique aiguë de la RHD donnent une valeur d’absorbance > 0,8, tandis que la valeur des
échantillons négatifs, à la dilution 1/5, varie de 0,1 à 0,25.
Pour le diagnostic de l’EBHSV, il est possible d’utiliser cet ELISA sandwich RHDV-spécifique, mais, du fait
de la forte différence antigénique existant entre les 2 virus, il y a un risque d’obtenir des résultats faux
négatifs. De plus, l’adoption d’une technique d’ELISA sandwich spécifique à l’EBHSV utilisant autant un