François Gallet 2 - Institut des Molécules et Matériaux du Mans
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III – Mécanique des membranes biologiques Membranes biologiques bicouche de lipides dans laquelle sont insérées diverses protéines : récepteurs, canaux ioniques… Caractéristiques mécaniques d'une membrane Propriétés mécaniques caractérisées par trois coefficients : - module d’extension c (changement de surface à forme constante) L0+DL Contrainte (= tension de surface) L0 s = F/L0 = c DS/S0 - module de cisaillement µ (changement de forme à surface constante) L0 s = F/L0 = 2µ DL/ L0 ou L0+DL - Rigidité de courbure k L0 L0+DL La plupart des membranes biologiques sont fluides µ=0 Mesurer la tension de surface et le module d’extension d’une membrane modèle (vésicule) P0 Pi < P0 Micropipette de verre étiré. Diamètre à l’extrémité ~ qqs µm Force appliquée contrôlée par la différence de pression DP = P0-Pi Aspiration de la vésicule DL La membrane du globule rouge : cas particulier d'une membrane non fluide - Cellule sans noyau - Forme discoïde diamètre 7 à 8 µm ; épaisseur 1.5 µm - Très grande résistance au cisaillement (flux sanguin) - Intérieur : fluide visqueux (hémoglobine) pas d'élasticité - Propriétés élastiques liées à la membrane Structure de la membrane du globule rouge Cytosquelette bidimensionnel : - réseau triangulaire de spectrine (pas du réseau ~ 200 nm) - lié à la bicouche par des complexes de jonction - confère à la membrane sa résistance au cisaillement La membrane n'est pas fluide comme les autres membranes lipidiques : le module de cisaillement µ n’est pas nul Module de cisaillement : mesure par pinces optiques suspension globules rouges + billes de silice adhésion non spécifique et irréversible F= 7 pN Faible force Pas d’extension de la membrane F= 25 pN Cisaillement pur DS/S = 0 F= 56 pN D Diamètre D (µm) 9 8.5 8 7.5 7 6.5 6 0 10 20 30 40 50 Force appliquée (pN) 60 Comportement d'élasticité linéaire aux faibles forces D = D0 – F/2pm µ : module élastique de cisaillement de la membrane µ = 2.5 ± 0.4 µN/m S. Hénon et al. (1999) Biophys. J. 76:1145-51 Comparaison avec mesures par micropipettes : 4 < µ < 10 µN.m-1 (Evans et al., 1973 ; Hochmuth et al., 1987, Lelièvre et al., 1995) Régimes élastiques différents : petites déformations grandes déformations (pinces optiques) (micropipettes) Glissement du squelette par rapport à la membrane IV - Adhésion cellulaire Dynamique des contacts adhésifs Chen JCS 2009 Architecture d'une adhésion focale Le problème vu par les biologistes… … et par les physiciens A. Nicolas, B. Geiger and S. Safran PNAS 2004 Forces exercées sur le substrat Cellules sur substrat déformable (feuille de silicone) Cellule adhérente (SV 80) Cellule migrante (keratocyte) Geiger et al. Nature Rev. Mol. Cell Biol 2 p. 793 (2001) Burton et al. Mol. Biol. Cell 10 p. 3745 (1999) Déplacements et contraintes ? Substrat = feuille de polymère (polyacryalamide) déformable, élastique + microbilles fluorescentes incorporées dans le gel servent à repérer les déplacements locaux Carte des déplacements Carte des contraintes (le passage de l'une à l'autre nécessite un traitement numérique complexe) Fibroblaste en migration Dembo and Wang, Biophys. J. 76 p. 2307 (1999) Cartographie directe des forces exercées 20µm 1 µm (images MEB) Réseau de capteurs de forces : piliers en PDMS élastiques, déformables de raideur ajustable (diamètre, rapport d'aspect, réticulation du PDMS) Taille caractéristique : micromètre Mesures de forces - calibration Les cellules ne pénètrent pas entre les piliers Relation force-déplacement d'un pilier : R rayon ; L longueur E module d'Young du PDMS k ajustable de 1.5 à 200 nN/µm 5µm Cartographie des forces substrat libre cellules epitheliales 10 µm O. du Roure, A. Saez, B. Ladoux et al. PNAS 15, 2390 (2005) Forces exercées par un îlot de cellules adhérentes 10 nN 20 µm Les forces exercées sur le substrat sont en moyenne centripètes Leur intensité est maximale à la périphérie de l'amas La cellule adapte sa traction à la rigidité du substrat log-log scale loi linéaire (pente ~1) F=k·x =Cte·k mean x=Cte max Saez et al., BiophysJ, 2005 Les piliers subissent toujours la même déformation… Longueur caractéristique dans la cellule? Régulation active par feedback? La rigidité induit la polarisation des cellules Trichet, LeDigabel et al., PNAS 2012 Adhésion en géométrie contrainte Cellule cultivée sur substrat uniforme Cellules cultivées sur motifs adhérents Motifs pour imposer une géométrie d'adhésion reproductible et bien définie -> réduit la dispersion des observations -> moyennes d’ensemble M Théry, A Pépin, E Dressaire, Y Chen, M Bornens, Cell motility and the Cytoskeleton, 63, 341 (2006) Le plan de division cellulaire dépend de l'orientation des fibres d'actine M Théry, V. Racine, M. Piel, Y. Chan, J-B Sibarita, M Bornens, Nature Cell Biology 7, 947 (2005) La géométrie n'explique pas tout Localisation des adhésions focales V - Moteurs moléculaires et trafic intracellulaire Importance du trafic intracellulaire Moteurs moléculaires Mouvement directionnel Energie apportée par hydrolyse de l’ATP = carburant de la cellule Génération de force et transport de charge le long du filament Nb de protéines chez l’homme Myosines Kinésines Dynéines 50 75 10 D’après cours de Tim Mitchison, Harvard Univ. Principales fonctions Contraction musculaire Transport de vésicules Récepteur de cellules sensorielles Transport axonal Transport de vésicules Division cellulaire Mouvement de cils et Flagelles Transport de vésicules Division cellulaire Un système modèle Extraction de tubes à l'aide de moteurs A. Roux et al. PNAS 99, p. 5394 (2002) Mouvement coopératif des moteurs C. Leduc et al. Institut Curie 2004 Rupture des tubes et formation de vésicules Vésicule constituée d'un mélange de lipides près d'une séparation de phase : Possibilité de fission du tube Création de petites vésicules individuelles Distribution des forces générées par les moteurs Mouvements actifs et trafic cellulaire : - Réorganisation du cytosquelette - Activité des moteurs moléculaires Mouvement fluctuant/ transport actif des organelles Motion of peroxysomes along microtubules P. Selvin group, PNAS 105, 10011 (2008) La diffusion d’un petit objet n’est pas due aux fluctuations thermiques, mais aux forces internes générées par l’activité biologique Thermodynamique hors-équilibre Généralisation du théorème fluctuation-dissipation ? Diffusion thermique ou diffusion activée ? Mouvement brownien d’une particule micrométrique dans un fluide newtonien à l’équilibre thermodynamique : Dx²(t) = 2Dt Théorème « fluctuation-dissipation » (FDT) : fluctuation D kBT 6pa Le déplacement quadratique moyen Dx²(t) = < [x(t+t)-x(t)]²>t est relié à la viscosité dissipation Système vivant : - Comportement viscoélatique non-newtonien - Système hors équilibre : FDT ne s’applique pas Sonder les forces actives dans le cortex cellulaire Silica bead (1.56 µm) Billes micrométriques liées à l’actine via des récepteurs intégrines C2 myoblast Deux expériences sur la même bille RGD Integrin Cell membrane Paxillin, Talin… Myosin II Actin network 1) Diffusion libre de la bille à la membrane (rhéologie passive) Déplacement quadratique moyen (MSD) Dx²(t) 2) Réponse à une force externe (rhéologie active) Appliquée via une pince optique (OT) Fonction de fluage J(t) 3) Combinaison des deux expériences Spectre de puissance des forces actives F. Gallet, P. Bohec Soft Matter 2009 Diffusion libre Déplacement quadratique moyen (MSD) Confined motion Directed motion y (nm) trajectoire Dt = 120 s MSD (µm²) 1.51 0.28 t0 300 noise level 200 100 0 0 100 200 x (nm) 300 time (s) t < t0 (t0 ~ 1s) Régime sous-diffusif bille confinée par le réseau d ’actine t > t0 Régime superdiffusif mouvement dirigé, tracté par les moteurs moléculaires sur la membrane Spectre des forces actives et écart à l’équilibre Measured force spectrum Sf(s) calculated at equilibirum Frequency s (Hz) Departure from equilibirum (s) Force spectrum Sf(s) (pN².s) En combinant mesures de diffusion libre Dx²(t) et fonction de réponse du système (fonction de fluage) on peut calculer la distribution des forces exercées par les éléments actifs (moteurs) <F(t)F(t+t)> SˆF ( s ) Teff ( s) ˆ S Feq ( s ) T Frequency s (Hz) Mécanique d’une cellule d’une molécule unique d’une membrane Rôle et impact sur les principales fonctions biologiques ? - Dynamique de l’adhésion cellulaire - Dynamique du trafic intracellulaire Remerciements: Alia ALKILANI Atef ASNACIOS Kelly AUBERTIN Martial BALLAND Pierre BOHEC Julien BROWAEYS Nicolas DESPRAT Jonathan FOUCHARD Florence GAZEAU Sylvie HÉNON Delphine ICARD-ARCIZET Benoit LADOUX Nathalie LUCIANI Démosthene MITROSSILIS Alain RICHERT Damien ROBERT Claire WILHELM Groupe Physique du vivant MSC – UMR 7057 Matière et Systèmes Complexes Campus Paris - Rive Gauche
