peste bovine

Manuel terrestre de l’OIE 2008 365
CHAPITRE 2.1.15.
PESTE BOVINE
RÉSUMÉ
La peste bovine classique est une maladie virale des bovins, des buffles et des yaks caractérisée
par des taux de morbidité et de mortalité élevés. Les moutons, les chèvres, les porcs et les ongulés
sauvages peuvent être atteints. Du point de vue clinique, cette forme de la maladie se caractérise
par de l’hyperthermie, un développement progressif d’érosions superficielles sur les gencives, la
langue, les joues et le palais qui s’accompagnent de larmoiement et de jetage séreux ou
mucopurulents. Quand le tractus digestif est atteint, une diarrhée ou une dysenterie apparaît à
l’origine d’une déshydratation sévère et l’animal est abattu. La peste bovine qui répond à cette
description n’a pas été observée depuis 2001 (Pibor, sud du Soudan). Ces derniers temps, une
forme atténuée de la maladie avec possibilité de retour aux caractéristiques classiques survenait
fréquemment en Afrique de l’Est associée à des situations d’enzootie : elle n’a toutefois pas été
précisément diagnostiquée depuis 1997 (en Tanzanie) et pourrait avoir disparu ; dans ce cas, le
virus sauvage de la peste bovine pourrait ne plus exister. Grâce aux collections de virus
« historiques », 3 lignées génétiques distinctes ont été définies comme agents responsables de la
peste bovine en Afrique et en Asie. L’Organisation des Nations Unies pour l’alimentation et
l’agriculture (FAO) a lancé un Programme d’éradication global de la peste bovine (GREP pour Global
Rinderpest Eradication Programme) en 1992, visant à l’éradication du virus en 2010. Le succès de ce
programme devrait être évalué sur la confirmation de l’éradication définitive de deux des trois lignées
et qu’il pourrait bien en être de même avec la troisième.
Identification de l’agent pathogène : la confirmation clinique de la peste bovine classique est
basée sur la découverte d’animaux ou de petits groupes d’animaux présentant de la fièvre, sans
appétit, abattus, ayant des érosions superficielles des lèvres supérieure et inférieure et des
gencives, une érosion ou une abrasion des papilles des joues, des écoulements séreux ou
mucopurulents oculaires et/ou nasaux, de la diarrhée, étant couchés en décubitus, ou trouvés
morts. La confirmation du laboratoire est basée sur la mise en évidence du virus, de son ARN ou
d’antigène précipitant dans des échantillons provenant de la rate, des nœuds lymphatiques ou des
secrétions oculaires ou nasales d’animaux ayant une forme aiguë. Il est particulièrement important
d’isoler le virus si une extension géographique ou si une détérioration significative de l’état de la
santé animale apparaissaient. Si l’éradication au niveau mondial réussit, les pays indemnes de
peste bovine pourront alors confirmer la présence de la Peste des petits ruminants (PPR) chez les
moutons et les chèvres sur l’apparence clinique des animaux et sur la mise en évidence
d’antigènes précipitants, tant bien même ces deux manifestations s’expriment à l’identique pour ces
deux virus.
Lors de suspicion de peste bovine, il convient lors des examens post-mortem de faire
particulièrement attention à la caillette, qui peut être très distendue ou montrer des décolorations
grises ; aux plaques de Peyer, qui peuvent présenter une nécrose lymphoïde et au cæcum ; au
colon et au rectum qui développent des stries d’inflammation et dont les crêtes et les replis ont viré
au noir. Le diagnostic différentiel porte sur la PPR chez le mouton et la chèvre, la diarrhée virale
bovine, la maladie des muqueuses ou le coryza gangreneux chez les bovins ; la distinction entre
ces maladies requiert la mise en œuvre de méthodes de laboratoires appropriées.
Épreuves sérologiques : l’OIE a énoncé un ensemble de Principes généraux pour la surveillance
épidémiologique de la peste bovine (Procédure OIE) qui gouvernent l’action des Pays Membres
souhaitant démontrer qu’ils ont rempli les conditions pour être déclarés indemne d’infection. Pour cela
il existe une méthode immuno-enzymatique (ELISA) de compétition qui permet de mettre en évidence

Chapitre 2.1.15. — Peste bovine
366 Manuel terrestre de l’OIE 2008
la présence d’anticorps anti-peste bovine chez des animaux qui ont été infectés avec des souches
sauvages ou qui ont été vaccinés avec la souche vaccinale. Un ELISA indirect a aussi été décrit.
Quelque soit le test retenu, il devra être sensible vis-à-vis de la lignée de virus ayant de fortes
probabilités de circuler dans le pays mais aussi très spécifique. La mise en évidence des anticorps
neutralisants peut également avoir le même but. Les Pays Membres peuvent souhaiter recevoir
conseil d’un expert d’un Laboratoire de référence de l’OIE ou du secrétariat du GREP pour le choix de
l’épreuve la plus appropriée.
Spécifications applicables aux vaccins et aux produits biologiques à usage diagnostique : il
existe une souche vaccinale du virus de la peste bovine obtenue par atténuation sur culture
cellulaire. Ces dernières années, son utilisation a été considérablement réduite car l’immunité de
longue durée qu’elle peut interférer avec le suivi vaccinal des campagnes nécessaire pour
l’obtention par un pays du statut de pays indemne. Compte tenu du fait que l’utilisation accidentelle
du vaccin a donné lieu à des résultats sérologiques confus lors de la surveillance de la maladie et
qu’il existe toujours des quantités considérables de vaccin, les Pays Membres devraient répertorier
et consigner tous les stocks restants pour garantir la capacité de mener à bien la sérosurveillance.
A. INTRODUCTION
Ces dernières années, le Programme d’éradication global de la Peste bovine (GREP pour Global Rinderpest
Eradication Programme) de l’Organisation des Nations Unies pour l’alimentation et l’agriculture (FAO) a contribué à
d’énormes avancées en organisant et en documentant le déclin de la peste bovine (13). Historiquement, le virus
était largement réparti en Europe, en Afrique et en Asie. Récemment, cependant, il n’a sévi qu’en Afrique et en Asie.
L’analyse de séquences génomiques a montré que toutes les souches de peste bovine appartiennent à l’une des
trois lignées phylogénétiques individualisées et que, ces dernières années, la répartition géographique des lignées
de virus a pu être dressée. Ainsi, la lignée appelée lignée asiatique (lignée 3) n’ai été signalée qu’en Afghanistan, en
Inde, en Irak, au Koweït, à Oman, au Pakistan, en Russie, en Arabie Saoudite, en Turquie, au Sri Lanka et au
Yémen. Le résultat des campagnes de vaccination concertées et coordonnées et de sérosurveillance a empêché
cette lignée de virus de refaire surface depuis septembre 2000 (Pakistan). Bien que les évaluations ne soient pas
tout à fait complètes, il est presque certain que ce virus a été éradiqué avec succès.
Les lignées 1 et 2 de peste bovine n’ont été signalées qu’en Afrique. La lignée 1 paraît être répartie de l’Egypte
au sud Soudan ainsi que vers l’est jusqu’en Ethiopie et dans l’extrême nord et ouest du Kenya. D’autre part, la
lignée 2 a été signalée en Afrique de l’Est et de l’Ouest et, à un certain moment, elle a envahi toute la ceinture
sub-saharienne de part et d’autre du continent (12). Cependant, de nos jours, après la poursuite des vaccinations
coordonnées et des programmes de surveillance (Pan African Rinderpest Campaign en particulier), les parties
ouest et centrale de l’Afrique n’ont pas déclaré la maladie depuis 1988 (Ghana/Burkina Faso). Jusqu’à une date
récente, les deux lignées étaient signalées en Afrique de l’est mais il est certain maintenant que la lignée 1 a été
éliminée du sud Soudan en 2001, grâce à une intense campagne de vaccinations.
Réapparue en 1994, en 1996 et en 2001 chez la faune sauvage, la lignée 2 a été transmise à l’intérieur de
l’écosystème pastoral somalien (9) où sa présence a constitué une préoccupation considérable (10). En 1994, ce
virus a réapparu dans le sud-est du Kenya avec des effets des plus sévères sur les buffles du Parc National de
Tsavo (7) illustrant ainsi la possibilité qu’il a eue de persister de façon inexplicable pendant au moins 30 ans,
temps pendant lequel il semble s’être transmis à bas niveau de virulence chez les bovins. Bien que ce virus
semble avoir évolué au point d’échapper à la vigilance des vétérinaires dans les endroits reculés, sa présence n’a
pas échappé aux pasteurs nomades dont il a infecté le bétail. Cependant, il semble évident que ce virus n’a pas
été observé dans ces régions depuis 2001 et, bien que le succès ne soit pas confirmé, il est probable que les
vaccinations sporadiques ont cassé la chaîne de transmission de la lignée 2.
L’agent causal de la peste bovine est un virus à ARN négatif appartenant au genre Morbillivirus dans la famille
Paramyxoviridae. Dans la description classique de la peste bovine, il est fait référence à une maladie
extrêmement mortelle pour le bétail, les buffles et les yaks. Le virus atteint également certaines races de porcs et
une très grande variété d’espèces de la faune sauvage dans l’ordre des Artiodactyles, sans toujours présenter
une forme clinique apparente : une récente synthèse bibliographique considère que les moutons et les chèvres
sont sensibles, mais qu’ils ne jouent pas un rôle épidémiologique important dans la peste bovine (14).
Bien que l’éradication de la peste bovine ait été dans sa phase finale, quelques souches du virus ont évolué pour
ne plus provoquer qu’une maladie infectieuse atténuée et non mortelle des bovins ; toutefois, ces souches
conservaient deux caractères de dangerosité. Le premier était la possibilité quasi certaine de modulations de sa
virulence. Le second était sa capacité à infecter le gibier et à générer chez le buffle, la girafe, le petit kudu et le
phacochère, une infection aiguë associée à de forts taux de mortalité.

Chapitre 2.1.15. — Peste bovine
Manuel terrestre de l’OIE 2008 367
Dans la forme classique de la peste bovine, la période d’incubation est de 1 à 2 semaines et la maladie clinique
qui suit est caractérisée par une attaque fébrile au cours de laquelle on distingue une phase prodromale et une
phase érosive. La phase prodromale dure environ 3 jours pendant lesquels on observe de la fièvre (entre 40 °C et
41,5 °C), de l’anorexie, de la constipation, de la congestion des muqueuses, du larmoiement et du jetage séreux,
de l’abattement et un dessèchement de la muqueuse du mufle. Cependant ce n’est que lors de la phase érosive
avec le développement des lésions nécrotiques de la bouche qu’un diagnostic clinique de peste bovine peut être
envisagé. Au pic de température, de petites plaques épithéliales nécrosées apparaissent sur la gencive et la lèvre
inférieures, qui s’étendent rapidement à la gencive supérieure, aux côtés de la langue, à la face interne des joues
et aux papilles, ainsi qu’au palais. Du fait de l’accroissement des lésions existantes et de l’apparition de nouveaux
foyers, la nécrose de la cavité buccale s’étend de façon dramatique au cours des 2 à 3 jours suivants. La plus
grande partie des tissus nécrosés tombe pour laisser place à des érosions peu profondes et non-hémorragiques
de la muqueuse.
La diarrhée est un autre trait caractéristique de la peste bovine et se développe en 1 à 2 jours après l’apparition
des lésions buccales. La diarrhée est généralement importante, liquide mais peut contenir ultérieurement du
mucus, du sang et des lambeaux d’épithélium et peut s’accompagner, dans les cas sévères, de ténesme.
Pendant la phase érosive, une nécrose peut s’observer dans le nasopharynx, sur la vulve et le vagin et sur le
fourreau. L’anorexie s’accroît, le mufle se dessèche complètement, l’animal est déprimé, la respiration est fétide
et le larmoiement et le jetage mucopurulents se développent.
Il y a de la mortalité mais le taux est variable et peut augmenter si le virus atteint un grand nombre d’animaux
sensibles. Les taux initiaux de mortalité sont aux alentours de 10 à 20 % et aux stades terminaux de la maladie,
les animaux peuvent tomber en décubitus pendant 24 à 48 h avant de mourir. Certains d’entre eux meurent avec
des lésions sévères de nécrose, une forte fièvre et de la diarrhée, d’autres après une chute rapide de la
température, souvent en dessous de la normale. À l’opposé, au milieu de la phase érosive, la température peut
se calmer puis, 2 à 3 jours plus tard retourner complètement à la normale avec une cicatrisation rapide des
lésions buccales, un arrêt de la diarrhée et une convalescence sans complications.
De façon typique, la carcasse de l’animal mort est déshydratée, émaciée et souillée. Le mufle et les joues portent
les traces du larmoiement et du jetage mucopurulents, les yeux sont enfoncés dans les orbites et la conjonctive
est congestionnée. Dans la cavité buccale, l’épithélium nécrosé est souvent complètement desquamé et forme
une démarcation nette avec les parties saines de la muqueuse adjacente. Les lésions s’étendent fréquemment au
voile du palais et peuvent inclure le pharynx et la partie haute de l’œsophage. Le rumen, le bonnet et le feuillet
sont le plus souvent indemnes, bien que des plaques de nécroses soient trouvées de façon occasionnelle sur les
piliers du rumen. La caillette, et spécialement la région du pylore sont sévèrement atteintes et montrent une
congestion, une pétéchisation et un œdème de la sous-muqueuse. La nécrose épithéliale donne à la muqueuse
une couleur grise. L’intestin grêle n’est généralement pas impliqué excepté par l’altération notable des plaques de
Peyer dont la nécrose lymphoïde et la desquamation laisse l’architecture de base congestionnée et noirâtre.
Dans le gros intestin, les changements concernent la valvule iléo-caecale, les cils caecaux et les crêtes des plis
longitudinaux du coecum, la muqueuse du colon et le rectum. Les plis apparaissent très congestionnés dans le
cas de mort brutale ou avec une décoloration noirâtre dans les cas prolongés ; dans les deux situations, ces
lésions forment les « zébrures » typiques.
La forme clinique associée à la lignée 2 est un bon exemple de forme atténuée de peste bovine telle qu’elle est
rencontrée dans les zones d’enzootie : la période d’incubation est de 1 à 2 semaines et la maladie clinique qui
suit se résume en un pic de température ou à peine plus. La fièvre est fluctuante, transitoire (3 à 4 jours) et est
peu élevée (38 à 40 °C). Les animaux qui développent des formes frustes ne présentent pas la dépression
caractéristique des formes plus aiguës et comme ils ne perdent pas leur appétit, ils continueront de brouter, de
boire et de marcher comme les animaux sains. Ils n’ont généralement pas de diarrhée. En pratiquant un examen
plus poussé, on peut déceler une congestion des muqueuses et sur les gencives inférieures, de petites zones
d’érosion épithéliales surélevées et blanchâtres, parfois pas plus grandes qu’une tête d’épingle, et quelques
papilles érodées. Certains animaux peuvent ne pas développer de telles érosions, dont la manifestation est
brève. D’autres peuvent montrer de discrètes sécrétions séreuses oculaires ou nasales, mais, n’évoluant pas
vers la purulence contrairement à ce qui se passe dans formes plus sévères de la maladie.
Même si l’infection par le virus de lignée 2 peut passer inaperçue chez le bovin, il est hautement pathogène pour
les espèces de la faune sauvage et pour celles généralement considérées comme sensibles (buffle, girafe, éland
et petit koudou) il génère de la fièvre, du jetage, une stomatite nécrosante, une gastroentérite et la mort. En outre,
Kock (7) a observé que les buffles infectés par la lignée 2 présentaient des nœuds lymphatiques périphériques
hypertrophiés, des lésions de kératinisation en plaque de la peau et une kératoconjonctivite. Les petits koudous
étaient atteints à l’identique, mais alors que chez eux la cécité causée par une kératoconjonctivite sévère était
ordinaire, la diarrhée elle, n’était pas usuelle. Les élands montraient aussi une nécrose et une érosion de la
muqueuse buccale accompagnée d’une déshydratation et d’une émaciation. Aussi, dans de telles conditions, un
diagnostic de peste bovine chez une de ces espèces privilégie l’hypothèse d’une transmission concurrente du
virus aux bovins avoisinants, même à un niveau sub-clinique.

Chapitre 2.1.15. — Peste bovine
368 Manuel terrestre de l’OIE 2008
B. TECHNIQUES DE DIAGNOSTIC
1. Identification de l’agent pathogène
Au vu des grands espoirs soulevés par la Campagne globale d’éradication de la peste bovine (GREP), tout
nouveau foyer de peste bovine revêtira, au plan épidémiologique, une signification considérable, non seulement
en tant que menace pour une nouvelle panzootie, mais aussi en tant qu’indicateur des lacunes dans la
séro-surveillance mondiale. En conséquence, tant qu’un pays n’a pas atteint le statut de pays officiellement
indemne d’infection par le virus de la peste bovine (statut reconnu sur la base de la séro-surveillance), tous les
échantillons d’un foyer diagnostiqué comme de la peste bovine sur des bases cliniques ou pathologiques devront
être envoyés en routine pour confirmation par le laboratoire. Une variété d’épreuves de laboratoire adaptées est
disponible, mais dans le contexte décrit ci-dessus, il est d’une importance cruciale d’isoler le virus, d’identifier la
lignée et d’attester de sa virulence par une infection expérimentale de bovins (1). Le sang prélevé sur
anticoagulant est le prélèvement de choix dans la mesure du possible. En moyenne, la virémie précède de peu la
poussée de température et peut s’étendre sur 1 à 2 jours au-delà de la fièvre. Aussi, les animaux faisant de la
température sont probablement virémiques et donnent alors les meilleurs prélèvements sanguins pour l’isolement
viral. Cependant, comme des animaux fébriles peuvent parfois ne plus être virémiques, des échantillons de
plusieurs animaux fébriles doivent être prélevés. Il est important de s’assurer lors de la première soumission, que
le tissu provenant du foyer suspect est en quantité suffisante pour au moins deux tentatives d’isolement. Les
autres procédures décrites doivent seulement être entreprises s’il y a du tissu en trop.
a) Isolement du virus
Le virus de la peste bovine peut être cultivé à partir de la fraction des leucocytes du sang total qui a été
collecté sur héparine à la concentration finale de 10 unités internationales (UI)/ml ou sur EDTA (acide
éthylène-diamine-tétra-acétique) à 0,5 mg/ml. Les échantillons doivent être parfaitement mélangés et
transférés au laboratoire sur glace, mais non congelés. Le virus peut être isolé à partir des échantillons de
rate, des ganglions mésentériques et préscapulaires des animaux morts ; ces échantillons doivent être
congelés pendant le transport.
Pour isoler le virus du sang, le sang non coagulé est centrifugé à 2 500 g pendant 15 min pour produire la
couche leucocyto-plaquettaire à la lisière du plasma et des érythrocytes. Il est prélevé aussi proprement que
possible, mélangé avec 20 ml de solution physiologique salée et centrifugé à nouveau dans un protocole
incluant des lavages pour éliminer les anticorps neutralisants présents dans le plasma. Le culot cellulaire
obtenu est resuspendu dans un milieu de culture d’entretien et des aliquots de 2 ml sont répartis sur des
cellules de rein de veau, des cellules B95a d’ouistiti ou des cellules de rein de singe (Vero) en culture dans
des tubes rond de Leighton. Le milieu de culture doit être remplacé tous les 2 à 3 jours et la culture
observée au microscope pour l’apparition éventuelle de l’effet cytopathogène (ECP). Celui-ci est caractérisé
par la réfringence, la rétraction et l’arrondissement des cellules et la formation de ponts inter-cytoplasmiques
et/ou de syncytiums. La vitesse avec laquelle l’ECP se développe varie en fonction de la cellule hôte et
certainement aussi selon le virus. Douze jours suffisent en culture cellulaire de première explantation, une
semaine en cellules Vero et 2 à 4 jours en cellules B95a. Des passages en aveugle doivent être entrepris si
l’échantillon est négatif, mais il faudrait de préférence inoculer la suspension cellulaire ou le restant de
l’échantillon original en intraveineuse à un bovin sensible à la peste bovine et essayer de ré-isoler le virus à
partir de son sang. Les virus isolés peuvent être partiellement identifiés par mise en évidence dans les
débris cellulaires infectés de précipitogènes spécifiques des morbillivirus ou totalement identifiés par
immunofluorescence à l’aide d’anticorps monoclonaux (AcMs).
De façon alternative, le même résultat peut être obtenu à partir de 20 % de la suspension (p/v) de nœud
lymphatique ou de la rate. Les tissus doivent macérer dans du milieu d’entretien sans sérum après broyage
et lacération par des techniques classiques et inoculés à des cellules comme précédemment. La libération
du virus à partir de tissu peut être obtenue de différentes manières. La plus facile est peut-être avec un pilon
et un mortier, mais cette technique requiert du sable stérile comme abrasif. Autrement, le tissu peut être
broyé sans abrasif avec des broyeurs en verre, par exemple le broyeur Ten Broeck. Des techniques de
broyage sont aussi possibles en utilisant des mixeurs tels que les appareils Silverson ou Waring. Les
suspensions contenant du virus sont centrifugées à basse vitesse. Le volume de l’inoculum n’est pas
important ; un volume de travail doit être de l’ordre de 1 à 2 ml. Les antibiotiques utilisés communément sont
la pénicilline et la streptomycine en mélange, chacun à une concentration de 100 UI/ml. Une couverture à un
aussi large spectre peut être obtenue avec de la néomycine à 50 μI/ml. La fungizone doit être ajoutée à
2,5 µg/ml.

Chapitre 2.1.15. — Peste bovine
Manuel terrestre de l’OIE 2008 369
b) Détection de l’antigène par immunodiffusion en gélose
L’épreuve d’immunodiffusion en gélose (IDG) doit être exécutée en boîte de Petri ou sur une lame de
microscope (5). Dans les deux cas, la surface doit être couverte avec de l’agarose sur une épaisseur
d’environ 4 mm avec une solution aqueuse à 1 % d’agarose de qualité supérieure. Les puits sont découpés
avec un emporte-pièce hexagonal à 6 puits périphériques autour d’un puits central. Sur lames, les puits
doivent avoir 3 mm de diamètre et être distantes de 2 mm. Pour la boîte de Petri, les puits peuvent atteindre
4 mm de diamètre et être distants de 3 mm. Plus les puits sont rapprochés, plus courte sera la réaction.
En utilisant une pipette de petit volume le sérum hyperimmun de lapin anti-peste bovine doit être placé dans
le puits central. De même, l’antigène témoin positif, préparé à partir de nœuds lymphatiques d’un lapin
infecté par la souche lapinisée Nakamura III de peste bovine, doit être placé tous les deux puits en
périphérie (première, troisième et cinquième). Le témoin antigène négatif est placé dans le puits quatre. Les
antigènes à tester sont les exsudats récupérés à la surface de la rate ou de nœud lymphatique après
section ; si aucun exsudat ne peut être obtenu, une petite partie de l’échantillon peut être broyé avec un peu
de solution physiologique salée. Les larmes oculaires peuvent être directement déposés en pressant les
écouvillons ou à l’aide d’un cône de pipette (le coton doit être découpé de l’écouvillon et placé par le grand
côté du cône de 50 à 250 µl ; la tige de l’écouvillon sert alors à comprimer le coton et à pousser l’exsudat
par la petite extrémité du cône). Les échantillons à tester sont placés dans les puits deux et six. L’épreuve
est réalisée de préférence à 4 °C ou à basse température ambiante. La zone de réaction doit être examinée
à partir de la deuxième heure pour voir apparaître les lignes de précipitation nettes et fines entre les puits et
former une ligne d’identité avec les témoins. L’épreuve doit être arrêtée et recommencée si aucun résultat
n’a été obtenu après 24 h. Le résultat n’est pas satisfaisant tant que les réactions de précipitation n’ont pas
donné de lignes d’identité avec la préparation des témoins positifs.
Bien que la réaction ne soit ni très sensible ni très spécifique, elle est fiable et s’adapte aux conditions de
terrain. Une réaction positive à partir d’un grand ruminant devrait être considérée comme de la peste bovine.
S’il s’agit d’un petit ruminant, un résultat positif devrait être considéré comme dérivant d’un cas de peste
bovine ou de peste des petits ruminants (PPR) ce qui demande alors un supplément de différentiation.
c) Histopathologie et immunohistochimie
À l’examen post-mortem, pour l’histopathologie et l’immunochimie, les tissus doivent être prélevés et placés
dans du formol tamponné à 10 % ; les tissus à prélever sont : la base de la langue, les ganglions du
rétropharynx et la membrane nictitante. Des formations syncytiales et des cellules à inclusions virales
intranucléaires doivent être recherchées dans les sections colorées à l’hématoxyline et à l’éosine. L’antigène
peste bovine peut être mis en évidence dans des tissus fixés au formol par réaction à l’immunoperoxydase
après extinction de l’activité peroxydase endogène. Si un anti-sérum polyclonal est utilisé, cette épreuve ne
pourra différencier les virus de la peste bovine et de la PPR. Mais le problème sera contourné si on utilise
des anticorps monoclonaux spécifiques de la peste bovine et de la PPR dans des tests réalisés en double
(3).
d) Identification de la lignée par transcription inverse couplée à une amplification en chaîne par
polymérase
La transcription inverse couplée à l’amplification en chaîne par polymérase (RT-PCR) (6) produit de l’ADN
utilisable pour l’analyse par séquençage. L’ARN viral peut être purifié à partir de la rate (pas idéale à cause
de sa haute teneur en sang), les nœuds lymphatiques et les amygdales (idéal), les lymphocytes du sang
périphérique (LSP), ou des écouvillonnages des yeux ou des lésions buccales (sous réserve). Les tissus
(0,5 à 1,0 g) sont broyés et homogénéisés avec 4,0 ml de solution de lyse, les écouvillons oculaires et
buccaux sont traités avec 1,0 ml et les LSP purifiés (à partir de 5 à 10 ml de sang total) sont traités avec
0,4 ml selon la procédure publiée. La solution D (solution de lyse) : on recommande la procédure suivante
pour minimiser les risques liés à la manipulation du thiocyanate de guanidium qui est toxique. Il doit être
manipulé dans une sorbonne. Les quantités suivantes valent pour un flacon de 250 g de thiocyanate, mais
d’autres volumes peuvent être ajustés à des quantités différentes. Ne pas essayer de peser le thiocyanate
de guanidium, mais le diluer dans le flacon d’origine avec 293 ml d’eau stérile, 17,6 ml de citrate de sodium
à 0,75 M, pH 7,0 et 26,4 ml de sarcosyl à 10 %, puis chauffer à 65 °C dans un bain-marie pour la
dissolution. La solution peut être gardée plusieurs mois dans le noir à température ambiante dans une
armoire chimique de sûreté. La solution finale D est obtenue par l’addition de 0,36 ml de 2-mercaptoéthanol
pour 50 ml de solution stock. Cette solution ne doit pas être conservée plus de 1 mois. Au cours des
dernières années, les colonnes « spin » se sont généralisées pour la purification d’ARN de haute qualité
(RNeasy kit, Qiagen). L’ARN obtenu est précipité avec 2,5 volumes d’éthanol, lavé dans de l’éthanol à 70 %,
dissout dans de l’eau stérile ou du tampon TE (Tris/EDTA, 10 mM, pH 7,5, 1 mM EDTA) et conservé à –
70 °C ou –20 °C jusqu’à utilisation. La synthèse de l’ADNc est obtenue avec des amorces aléatoires
hexanucléotidiques pour permettre l’usage des différents couples d’amorces spécifiques dans l’étape
d’amplification PCR. Des aliquots de l’ADNc obtenus sont amplifiés avec au moins 3 couples d’amorces
pouvant détecter et différentier les 2 morbillivirus. Les couples d’amorce incluent deux couples d’amorces