optimisation des conditions de manipulation des ovules en vue du

PREMIERES JOURNEES RECHERCHE FILIERE PISCICOLE
3 & 4 Juillet 2007 – PARIS
JRFP 2007- Session 4 Reproduction et Amélioration Génétique
OPTIMISATION DES CONDITIONS DE MANIPULATION DES OVULES EN VUE
DU TRANSFERT NUCLEAIRE CHEZ LE CARASSIN.
Chênais Nathalie, Mahé Sophie, Vignon Xavier (1), Depincé Alexandra, Bobe Julien, Le
Bail Pierre-Yves, Labbé Catherine.
INRA, UR 1037, SCRIBE, Campus de Beaulieu, 35000 Rennes, France
INRA, UMR 1198, BDR, Domaine de Vilvert, 78350 Jouy en Josas, France
Contexte et objectifs.
Des développements embryonnaires prometteurs ont été reportés pour plusieurs
espèces de poisson après transfert nucléaire (ou clonage) à partir de noyaux issus de cellules
embryonnaires ou somatiques. Des adultes fertiles ont même été obtenus, mais à des taux très
faibles. Le succès du transfert nucléaire dépend d’une combinaison de facteurs cellulaires et
physiologiques, dont fait partie la qualité initiale des œufs, qui sont indissociables de la
nécessité de maîtriser en parallèle la technique de microinjection des oeufs. L’objectif de ce
travail développé chez le carassin (Carassius auratus) est de rationaliser les conditions de
transfert nucléaire 1) en maîtrisant la qualité initiale des ovules au cours du temps post-
ovulation, 2) en contrôlant le moment de leur activation, 3) en optimisant les conditions
d’injection des noyaux donneurs.
Protocole.
L’évolution de la qualité des œufs a été suivie au cours d’un temps équivalent à une
succession de séances de transfert nucléaire (10 min à 5 heures) : après ovulation, les ovules
ont été conservés soit in vivo, soit in vitro à différentes températures. Par ailleurs, différents
milieux d’inactivation des ovules ont été testés in vitro. L’évolution de l’aptitude des ovules à
soutenir un développement embryonnaire a été estimée par les taux de survie à 24h post-
fécondation. Dans une seconde série d’expériences, la microinjection de noyaux de cellules
embryonnaires et de cellules somatiques a été testée sur des œufs non activés (ovules), et sur
des œufs activés parthénogénétiquement (sans fécondation). Le maintien de l’intégrité des
œufs et les taux de développement à 1000 cellules ont été suivis.
Résultats.
1) Après ovulation, la qualité des ovules est mieux conservée au cours du temps dans
le tractus femelle que lors d’une incubation in vitro puisque in vivo, aucune baisse notable de
la qualité n’est observée dans les 3 heures qui suivent l’ovulation. Ensuite, après collecte des
ovules, la conservation pendant 3 heures in vitro est meilleure à 4°C qu’à 12, 16 ou 20°C.
2) L’activation des ovules collectés est initiée dès leur dilution dans une solution
saline. En revanche, la dilution des ovules dans du liquide coelomique de truite permet
d’inhiber la réaction corticale et de maintenir la fécondabilité des ovules. Une solution saline
supplémentée en inhibiteur de protéase permet également de réprimer l’activation des ovules,
alors que le MG132, un inhibiteur de la voie de dégradation du MPF chez les mammifères, ne
peut empêcher la réaction corticale des ovules de carassin.
3) L’injection de noyaux à travers le micropyle des ovules non activés est délicate du
fait de leur déformabilité. En revanche, les œufs activés peuvent être injectés très précocement
à travers le micropyle et des taux de développement à 1000 cellules de 3% ont été obtenus.
L’injection dans des œufs activés déchorionné reste difficile du fait de leur fragilité, mais des
développements à 1000 cellules ont également pu être obtenus.
Conclusion-perspectives.
Les conditions de manipulation décrites ici constituent une base encourageante pour
l’amélioration des résultats de transfert nucléaire chez les carassins.