101-NYA-05 Évolution et diversité du vivant Automne 2016 Lab 6 ANALYSE GÉNÉTIQUE DE LA CAPACITÉ DE GOÛTER L’AMER. 1. OBJECTIFS 1.1 Effectuer une analyse d’ADN dans le but d’établir une relation entre les génotypes et les phénotypes d’un caractère héréditaire : la capacité de goûter une substance amère, le PTC. 1.2 Analyser cette relation pour déterminer le type de dominance, complète ou incomplète, existant entre les allèles goûteur et non goûteur de PTC. 1.3 Se familiariser avec des techniques modernes de biologie moléculaire : amplification en chaîne par polymérase ou ACP (couramment appelée PCR, de l’anglais) et électrophorèse sur gel d’agarose. 1.4 Analyser des résultats en tenant compte des variables non contrôlées et inévitables dans une expérimentation sur du vivant. PRÉPARATION AU LABO Semaine 1: Lire le protocole et compléter l’Annexe 2 à l’aide de la section «Détermination du génotype» (p.6-7). Semaine 2: Formuler une hypothèse répondant à la question expérimentale (p.2). Référence : «Génome gourmand» [1] . Identifier les génotypes attendus à la Fig.7 intitulée «Électrophorèse : résultats attendus», p.5. 2. INTRODUCTION 2.1 LE GOÛT, C’EST D’ABORD UNE AFFAIRE DE GÈNE. Aimez-vous le brocoli? Le PTC? Un peu d’histoire. Au début des années 1930, Arthur Fox, un chimiste à l’emploi de la Cie DuPont synthétise une poudre de phénylthiocarbamide (PTC). Alors qu’il en transfère dans une bouteille, des poussières s’échappent dans l’air et des collègues se plaignent de leur goût amer. Pourtant Fox n’en goûte rien. Quelques années plus tard, des généticiens démontrent que la capacité de goûter le PTC est un caractère héréditaire et qu’en Amérique environ 75% des gens sont goûteurs et 25% non goûteurs [2]. PTC et brocoli. Chez les mammifères, on connaît environ 30 gènes codant pour des récepteurs protéiniques du goût amer sur la langue. Ont-ils joué un rôle évolutif en permettant de reconnaître des molécules dangereuses souvent associées au goût amer (ex : strychnine)? Pourtant, certains aliments sains et anti-cancer contiennent beaucoup d’isothiocyanates dont la saveur amère se rapproche de celle du PTC (ex : les crucifères : chou, brocoli, chou de Bruxelles, navet). On a même pu établir un lien chez des enfants entre leur dédain pour le brocoli et leur capacité à goûter le PTC. Évidemment, rendus au cégep, tous adorent le brocoli! Mais qu’en est-il du PTC? Sarrau Lampe UV Rappel Produit toxique Sécurité au laboratoire Le port du sarrau est obligatoire. L’exposition aux UV est dommageable pour la peau et les yeux. Utiliser avec verre protecteur. Comme toujours, il est interdit de manger ou de boire au laboratoire. L’ADN est coloré avec un produit potentiellement cancérigène. Tout objet entrant en contact avec ce produit sera manipulé avec des gants et suivant un protocole très précis. Page 1 sur 10 Département de biologie Collège Lionel-Groulx 101-NYA-05 Évolution et diversité du vivant Automne 2016 Un gène pour le PTC. Un gène pour le récepteur de PTC a été identifié en 2003 et nommé TAS2R38. Il mesure 1002 pb (paires de bases). Il existerait 7 allèles dans le monde (allèles = formes différentes d’un gène), mais seuls 2 d’entre eux sont répandus en Amérique : un allèle goûteur et un allèle non goûteur qui diffèrent par 3 mutations aux positions 145, 785 et 886. Dans ce labo, seule la mutation 145 sera utilisée pour distinguer les allèles goûteur avec un C et non-goûteur avec un G (Fig.1). 3 MUTATIONS: 2 Allèles du gène TAS2R38 (1002 pb) 1 Une des 23 paires de CHROMOSOMES 145 785 886 CCA ALLÈLE Goûteur GCA ALLÈLE Non Goûteur 1002pb Fig.1. Différences entre les deux principaux allèles du gène TAS2R38. On soupçonne que notre sensibilité au PTC soit sous contrôle polygénique, c’est-à-dire que plusieurs paires de gènes seraient impliquées. Cependant, le gène TAS2R38 serait le principal responsable des variations observées dans la population [2]. Le goût, pas juste une affaire de gène… La perception des saveurs est très complexe et plusieurs facteurs interviennent, tels que l’influence de l’odorat, les mécanismes cérébraux, les différences culturelles, ou simplement le nombre de papilles gustatives qui peut varier d’un individu à l’autre! Le sexe pourrait aussi intervenir puisque c’est souvent chez les femmes qu’on trouve des «super goûteuses» [3]. 2.2 GÉNOTYPE VS PHÉNOTYPE. Nous venons au monde avec un bagage de gènes donnés, c’est notre génotype [4;p.303]. Les gènes sont reçus en deux versions, l’une maternelle, l’autre paternelle. Lorsqu’un individu reçoit 2 allèles identiques du gène TAS2R38, on dit qu’il est «homozygote». Le caractère héréditaire observé, le «phénotype», est bien sûr celui porté par les allèles : l’individu est goûteur ou non-goûteur. Mais quel sera le phénotype d’un individu «hétérozygote», c'est-à-dire un individu qui hérite de deux allèles différents? Dans un cas de dominance complète, l’hétérozygote présente un phénotype correspondant à celui de l’allèle dit «dominant». L’allèle qui ne se manifeste pas est dit «récessif». S’il s’agit d’un cas de dominance incomplète, l’hétérozygote présente un phénotype intermédiaire entre ceux des homozygotes [4;p.309]; il sera alors semi-goûteur ou «goûteur faible». 2.3 QUESTION EXPÉRIMENTALE. Puisque nous possédons maintenant les moyens techniques d’analyser notre ADN et nos gènes, nous pouvons énoncer la question expérimentale suivante : l’interaction entre les deux allèles se rapproche-t-elle d’une dominance complète ou incomplète? En termes de résultats attendus, la question peut s’énoncer ainsi : Les élèves hétérozygotes possédant un allèle goûteur et un allèle non-goûteur du gène TAS2R38 auront-ils un phénotype «goûteur fort» de PTC, «non-goûteur», ou un phénotype intermédiaire «goûteur faible»? 2.4 HYPOTHÈSE … à rédiger après lecture de l’article «Génome gourmand» [1] disponible à l’Annexe 3. Rédigez une hypothèse et justifiez-la à l’aide de l’article «Génome gourmand» [1]. Indiquer le type de dominance attendu, le phénotype attendu pour un hétérozygote et citer un passage de l’article à l’appui. Page 2 sur 10 Département de biologie Collège Lionel-Groulx 101-NYA-05 Évolution et diversité du vivant Automne 2016 2.5 DÉMARCHE GÉNÉRALE PROPOSÉE Au cours de ce labo, nous tenterons de répondre à la question posée en suivant la démarche suivante (Fig.2): 1) D’abord une dégustation de PTC, pour déterminer le phénotype de chacun. Qui est goûteur? Non-goûteur? Y-a-t-il des «goûteurs faibles»? 2) Ensuite une analyse d’ADN, pour déterminer le génotype de chacun : homozygote ou hétérozygote? (un seul élève expérimentateur par équipe) 3) Enfin, une analyse croisée des résultats pour déterminer le type de dominance, complète ou incomplète, selon le phénotype observé chez les hétérozygotes. Les homozygotes, goûteurs et non-goûteurs, constituent un groupe témoin servant à valider la méthode d’analyse, puisque leur phénotype devra nécessairement correspondre à leur génotype, en toute logique. 1) DÉTERMINATION DES PHÉNOTYPES 2) DÉTERMINATION DES GÉNOTYPES G 1o EXTRACTION D’ADN de cellules buccales Allèle Non-goûteur ? 2o AMPLIFICATION : Ciblage et multiplication de fragment du gène C Allèle Goûteur 3o DIGESTION : Coupure des allèles goûteurs pour les différencier des nongoûteurs C DÉGUSTATION de PTC + 4o ÉLECTROPHORÈSE : séparation par bandes selon leur grosseur Homozygote Goûteur 2X C + Homozygote Hétérozygote Non-goûteur G 2X G C + G C Goûteurs forts? Goûteursfaibles? NonGoûteurs? 3) ANALYSE GÉNOTYPES VS PHÉNOTYPES Y-a-t-il une forte corrélation entre les génotypes et les phénotypes observés? La relation entre les allèles du gène TAS2R38 est-elle un exemple de dominance complète ou de dominance incomplète? Fig.2. Résumé de la démarche générale proposée. Page 3 sur 10 Département de biologie Collège Lionel-Groulx 101-NYA-05 Évolution et diversité du vivant Automne 2016 2.6 DÉMARCHE DÉTAILLÉE DE L’ANALYSE D’ADN (Consulter la «Vue d’ensemble», Annexe 1) I. EXTRACTION D’ADN. Des cellules buccales sont d’abord recueillies par rinçage vigoureux avec une solution saline. L’ADN est ensuite extrait des cellules par ébullition en présence d’une résine; celle-ci sert à éliminer les cations bivalents (ex : Ca++) nuisibles à l’enzyme «ADN polymérase» utilisée à la prochaine étape. II. AMPLIFICATION DE L’ADN PAR ACP. (Consulter Campbell Biologie, fig. 20.8). Objectifs. L’amplification en chaîne par polymérase (ACP) nous permet d’atteindre 2 objectifs : 1o Cibler une région précise de l’ADN : ici la région de la mutation 145 du gène PTC. 2o Faire de multiples copies (ou «réplicons») de cette région pour pouvoir l’analyser. Chez un homozygote, toutes les copies obtenues seront identiques; Chez un hétérozygote, on aura 2 types de copies qui diffèrent par une seule lettre, C ou G Étapes. L’ACP s’effectue dans un thermocycleur (petit four à température programmable) en 3 étapes (Fig.3): 1o Dénaturation à 94oC : à cette température, l’agitation moléculaire l’emporte sur les liaisons H de l’ADN et les brins d’ADN se séparent. 2o Hybridation à 68oC; l’agitation diminue et les brins d’ADN tendent à se lier, mais les amorces, plus concentrées, prennent de vitesse l’ADN chromosomique. Elles se fixent au début et à la fin de la région ciblée grâce à la complémentarité des bases azotées. Pour cibler la région de la mutation 145, nous utilisons une «amorce-début» de 44pb, complémentaire à la région 101-144 du gène, et une «amorce-fin» de 24pb, complémentaire à la région 297-320 (Fig.4) 3o Élongation à 72oC; à partir des amorces, l’enzyme ADN polymérase Taq ajoute les nucléotides complémentaires. Cet enzyme est extrait de la bactérie Thermophilus aquaticus vivant dans des eaux thermales et il est activé à la température de 72oC. 1o Dénaturation 94oC 2o Hybridation 68oC Amorce début Amorce fin 72oC 3o Élongation Chacune de ces 3 opérations ne dure que 30 secondes mais elles sont répétées plusieurs fois, de telle sorte qu’au bout de 30 cycles on Polymérase obtient 1 073 741 824 réplicons de la région ciblée : la région 101 à 320 Fig.3. Étapes de l’ACP [5] du gène PTC, mesurant 220 pb (Fig.4). Attention, un hétérozygote présentera deux types de réplicons qui diffèrent uniquement à la position 145! ALLÈLE GOÛTEUR 101 145 Amorce début 144 297 Amorce fin 320 5’ ....CCTTCGTTTTCTTGGTGAATTTTTGGGATGTAGTGAAGAGGCAGC................................................................................................................ 3’ I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I 3’ CTACTAACGTTTGGTTCGGTTGGA 5’ 5’ CCTTCGTTTTCTTGGTGAATTTTTGGGATGTAGTGAAGAGGCGG 3’ I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I ...............................................CTACTAACGTTTGGTTCGGTTGGA... 5’ 3’ ...................................................................................................................... ALLÈLE NON-GOÛTEUR 145 5’ ....CCTTCGTTTTCTTGGTGAATTTTTGGGATGTAGTGAAGAGGCAGG.............................................................................................................. 3’ I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I 3’ CTACTAACGTTTGGTTCGGTTGGA 5’ 5’ CCTTCGTTTTCTTGGTGAATTTTTGGGATGTAGTGAAGAGGCGG 3’ I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I ..............................................CTACTAACGTTTGGTTCGGTTGGA.... 5’ 3’ ...................................................................................................................... Fig.4. Régions ciblées sur le gène PTC par l’amorce début et l’amorce fin. Page 4 sur 10 Département de biologie Collège Lionel-Groulx 101-NYA-05 Évolution et diversité du vivant Automne 2016 Astuce de l’amorce-début. 145 ALLÈLE Goûteur Normalement, les nucléotides d’une Gène 143 101 amorce sont identiques à ceux du gène. Ici, 5’ ....CCTTCGTTTTCTTGGTGAATTTTTGGGATGTAGTGAAGAGGCAGCC................ 3’ l’amorce-début diffère à la position #43 : Amorce début 5’ CCTTCGTTTTCTTGGTGAATTTTTGGGATGTAGTGAAGAGGCGGCC 3’ elle contient un G au lieu d’un A! Cette «erreur» vise à introduire le doublet GG 3’ ......................................................................................................................................... 5’ devant la mutation 145. Ainsi, les réplicons 145 obtenus par ACP contiendront en ALLÈLE Non-Goûteur 143 Gène positions 143-146 les séquences GGCC 5’ ....CCTTCGTTTTCTTGGTGAATTTTTGGGATGTAGTGAAGAGGCAGGC............... 3’ pour l’allèle goûteur ou GGGC pour le nonAmorce début 5’ CCTTCGTTTTCTTGGTGAATTTTTGGGATGTAGTGAAGAGGCGGGC 3’ goûteur (Fig.5). Ces deux séquences sont essentielles au bon déroulement de la 3’ ......................................................................................................................................... 5’ Fig.5. Différence entre l’amorce-début et le gène en position 143. prochaine étape. III. DIGESTION DE L’ADN. Objectif : couper l’allèle goûteur de manière à pouvoir le distinguer de l’allèle non-goûteur. Les réplicons sont incubés en présence de l’enzyme de restriction HaeIII (extrait de la bactérie Haemophilus aegypticus). Cet enzyme coupe l’ADN par hydrolyse au milieu d’une séquence GGCC. Cette séquence se trouve aux positions 143-146 de l’allèle goûteur! Ce dernier est alors coupé en 2 fragments de 44pb et 176pb (Fig. 6). Par contre, l’allèle non101 320 goûteur présente la séquence 5’ ..................................GG145 CC…….................................................... 3’ GGGC et ne peut être coupé 3’ ……………………………………………………………………… ……..5’ par l’enzyme. réplicon de 220 PB de l’allèle goûteur Fig.6. Hydrolyse enzymatique de l’allèle goûteur. NB. En guise de groupe 5’ CC……..................................................... 3’ 5’ …………………….…GG 3’ témoin, des réplicons ne 3’ ……………………….….. 5’ + 3’ ………………………………………………. 5’ seront pas traités avec fragment de 176 PB fragment de 44 PB l’enzyme. Fig.6. Digestion enzymatique de l’allèle goûteur. IV. ÉLECTROPHORÈSE. (Campbell Biologie, fig. 20.9) Objectif : séparer et visualiser les deux types d’allèles. Les fragments d’ADN sont placés dans un gel d’agarose et soumis à un courant électrique. Puisque l’ADN porte des charges négatives (-), les fragments sont entraînés vers l’électrode positive (+) et ce, à différentes vitesses, les plus petits se déplaçant plus rapidement à travers le gel. Une fois la migration terminée, un colorant fluorescent sous UV permet de visualiser les bandes d’ADN (Fig. 7). La position des fragments est évaluée à l’aide d’un marqueur comportant des brins de dimension connue; la bande de 500pb est plus brillante et sert de repère. L’allèle nongoûteur n’est pas coupé et ne présente qu’une seule bande de 220pb, alors que l’allèle goûteur est coupé et présente 2 bandes distinctes de 176pb et 44pb. Sur la fig.7, quels sont les génotypes des individus 1-2-3 : hétérozygote, homozygote goûteur ou homozygote non-goûteur? 1D : ____________________ (-) 3 GÉNOTYPES POSSIBLES 1N 220 pb 176 pb 1D 2N 2D 3N MARQUEUR 3D 220 pb 500 pb 400 pb 300 pb 200 pb 176 pb 100 pb 44 pb 44 pb N : contrôle (réplicons Non Digérés) D : réplicons digérés (+) Fig 7. Électrophorèse : résultats attendus 2D : ____________________ 3D : ____________________ Page 5 sur 10 Département de biologie Collège Lionel-Groulx 101-NYA-05 Évolution et diversité du vivant Automne 2016 3. PROTOCOLE EXPÉRIMENTAL. 3.1 DÉTERMINATION DU PHÉNOTYPE Goûteur fort? Non-goûteur? Goûteur faible? Il est parfois difficile d’évaluer objectivement le goût de chacun. Cette partie du protocole comporte une bonne part de subjectivité et on devra en tenir compte dans l’analyse des résultats. Par exemple, si on distingue des goûteurs forts et des goûteurs faibles, est-ce vraiment relié à une dominance incomplète ou simplement dû à divers facteurs influençant la perception des saveurs? Chaque équipe se voit attribuer un numéro. Dans chaque équipe il y a un élève «A» et un élève «B». Seul l’élève «A» déterminera aussi son génotype à partir de sa salive. On inscrira donc au tableau des résultats les numéros 1A, 1B, 2A, 2B, etc. 1) Goûter une languette contrôle (sans PTC) en l’humectant bien au milieu de la langue pendant 10 secondes. 2) Goûter de la même manière une languette imbibée de PTC. Y-a-t-il une différence? Si un goût amer est perçu, est-il «fort» ou «faible»? 3) Inscrire au Tableau 1 (voir «résultats») les numéros de chacun des élèves dans un des 3 groupes : goûteur fort, goûteur faible ou non-goûteur. 3.2 DÉTERMINATION DU GÉNOTYPE JOUR 1 : EXTRACTION et AMPLIFICATION DE L’ADN I. EXTRACTION D’ADN DE CELLULES BUCCALES 1) Se rincer vigoureusement la bouche avec 10 ml de saline pendant 1 minute. Rejeter dans le même petit contenant («shooter»). 2) Transférer 1000 μl dans un microtube de 1,5 ml. Refermer et écrire le # d’équipe sur le couvercle. 3) Centrifuger à vitesse maximale pendant 2 minutes. 4) Après la centrifugation, observer un culot au fond du microtube et rejeter délicatement le surnageant par une simple inversion au-dessus d’un évier. NB : un peu de liquide (0,1 ml) doit rester dans le microtube avec le culot. De manière à doubler l’extraction d’ADN, répéter les étapes 2 à 4 en réutilisant le même microtube. Pendant la 2e centrifugation, pipeter 100 μl de résine Chelex dans un microtube de 0,5 ml Important : juste avant de prélever la résine, bien la suspendre en aspirant-rejetant plusieurs fois. Réserver pour l’étape #6. 5) Resuspendre le culot en aspirant et rejetant délicatement (4-5 fois) avec une micropipette de 30 μl. 6) Transférer 30 μl de suspension dans le microtube contenant la résine. Fermer et identifier. Mélanger au Vortex. 7) Porter à ébullition pendant 10 min. (thermocycleur à 99oC) 8) Agiter vigoureusement pendant 5 secondes. 9) Centrifuger à vitesse maximale pendant 90 secondes pour faire précipiter la résine au fond du microtube. 10) Transférer 30 μl de surnageant (sans culot ni résine) dans un nouveau microtube de 1,5 ml. Identifier et conserver sur glace. C’est l’extrait d’ADN. Page 6 sur 10 Département de biologie Collège Lionel-Groulx 101-NYA-05 Évolution et diversité du vivant Automne 2016 II. AMPLIFICATION DE L’ADN PAR ACP (Amplification en Chaîne par Polymérase) 1) Dans un tube ACP de 0,2ml contenant une pastille «Ready-to-go» incluant des nucléotides (A, T, C et G) et la polymérase Taq, ajouter : 1o 22,5 μl de la solution d’amorces et attendre quelques secondes pour dissoudre la pastille. 2o 2,5 μl de votre extrait d’ADN. Garder sur glace en attendant que tous les élèves soient prêts pour la prochaine étape. 2) Centrifuger à vitesse maximale pendant 10 secondes, pour bien faire descendre le mélange. 3) Placer dans le thermocycleur et amplifier l’ADN pendant 30 cycles. Conserver à 4oC jusqu’au Jour 2. JOUR 2 : DIGESTION et ÉLECTROPHORÈSE III. DIGESTION AVEC L’ENZYME DE RESTRICTION HaeIII 1) Centrifuger 10 secondes le tube ACP puis, - Transférer 10 μl dans un 1er microtube de 0,5 ml. Identifier «N» (témoin non-digéré) et # d’équipe. - Transférer à nouveau 10 μl dans un 2e microtube de 0,5 ml; identifier « D » (digéré) et # d’équipe. 2) Ajouter 1 μl d’enzyme HaeIII au microtube «D» seulement; observer une microgoutte sur la paroi du tube. 3) Centrifuger les 2 tubes pour faire descendre les gouttes au fond des tubes (vitesse maximale, 10 secondes). 4) Incuber les 2 tubes à 37oC pendant 30 minutes, dans le thermocycleur. (30 minutes est une durée minimale) IV. ANALYSE DES FRAGMENTS D’ADN PAR ÉLECTROPHORÈSE. 1) Ajouter 5 μl de colorant de chargement à chacun des tubes «N» et «D». Centrifuger pour mélanger (10 sec.). 2) Technicienne : charger un marqueur d’ADN « 100pb DNA Ladder » dans le puits #1 du gel d’agarose 2%. 3) Charger 15 μl des tubes «N» et «D» dans les puits d’un gel d’agarose 2% (Fig.8). Noter les # des puits (Fig.9). Le gel contient un colorant potentiellement cancérigène. On portera des gants à la station d’électrophorèse. 4) Faire migrer à 130 V pendant 30-40 minutes ou jusqu’à une migration de 5 cm du colorant de chargement. 5) Observer les résultats aux UV et prendre une photo. Puits 1 : Marqueur Puits 2 : échantillon N, équipe 1 Puits 3 : échantillon D, équipe 1 Puits 4 : échantillon N, équipe 2… Puits Pipette Solution tampon Gel d’agarose Puits Gel d’agarose Échantillon d’ADN Figure 8 – Coupe transversale d’un gel d’agarose lors du chargement d’un échantillon d’ADN Figure 9 – Gel d’agarose vu du dessus avec identification de l’utilisation des différents puits Page 7 sur 10 Département de biologie Collège Lionel-Groulx 101-NYA-05 Évolution et diversité du vivant Automne 2016 4. RÉSULTATS 4.1 Détermination des phénotypes de tous les élèves Tableau 1. Répartition de tous les étudiants du groupe selon leur phénotype «goûteur de PTC». (On y écrit le « code » de chaque étudiant dans la case appropriée; ex : 1A, 3B, etc.) PHÉNOTYPE (no des élèves) Goûteur fort Goûteur faible Non goûteur 4.2 Détermination du génotype des élèves-expérimentateurs GÉNOTYPE (No des élèves) Tableau 2. Répartition des élèves-expérimentateurs selon leurs génotypes «Goûteur de PTC». (On y écrit le « code » de chaque étudiant dans la case appropriée; ex : 1A, 3B, etc.) Homozygote goûteur Hétérozygote Homozygote non goûteur 4.3 Résultats croisés des phénotypes et des génotypes des élèves-expérimentateurs Tableau 3. Résultats croisés du phénotype et du génotype des élèves-expérimentateurs. (On y écrit le « code » de chaque étudiant dans la case appropriée; ex : 1A, 3B, etc.) GÉNOTYPE PHÉNOTYPE Goûteur fort Goûteur faible Non goûteur Homozygote goûteur Hétérozygote Homozygote non goûteur 6. MÉDIAGRAPHIE [1] M. Saint-Hilaire, «Génome gourmand,» Québec Science, pp. 28-30, sept 2007. [2] S. Wooding, «Phenylthiocarbamide: A 75-Year Adventure in Genetics and Natural Selection,» Genetics, 2015. [En ligne]. URL: http://www.genetics.org/content/172/4/2015.full . [Accès le 02 10 2015]. [3] «People differ in their taste sensitivity,» Taste Science Lab, 2015. [En ligne]. URL: http://www.tastescience.com/abouttaste3.html . [Accès le 02 10 2015]. [4] J. Reece et coll, Campbell Biologie, 4e éd., Montréal: ERPI, 2012, 1458 p. [5] «La PCR?,» Réseau Lyonnais d'Ingénierie Éducative, 2015. [En ligne]. URL: http://www.ens-lyon.fr/RELIE/PCR/principe/principe.htm . [Accès le 02 10 2015]. Ce laboratoire a été mis au point à partir du protocole suivant: CAROLINA Cie, Page consultée le 02/10/2015, Using a Single-Nucleotide Polymorphism to predict Bitter-Tasting Ability, [En ligne], URL: http://bioinformatics.dnalc.org/ptc/animation/index.html Page 8 sur 10 Département de biologie Collège Lionel-Groulx 101-NYA-05 Évolution et diversité du vivant Automne 2016 ANNEXE 1. Vue d’ensemble de la méthode utilisée pour l’analyse de l’ADN. I. EXTRACTION D’ADN Gène TAS2R38 (1002pb) – 2 allèles chez Homo sapiens 145 1 785 GCA 101 ALLÈLE Non Goûteur Fragments amplifiés = 220 pb ou «réplicons» AMORCE DÉBUT 144 297 145 CCTTCGTTTTCTTGGTGAATTTTTGGGATGTAGTGAAGAGGCGGCC ................ AMORCE FIN 320 ALLÈLE Goûteur............. GATGATTGCAAACCAAGCCAACCT CCTTCGTTTTCTTGGTGAATTTTTGGGATGTAGTGAAGAGGCGGGC .............ALLÈLE III. DIGESTION Les 2 gènes allèles diffèrent par 3 mutations, seule la 145 est ciblée dans ce labo 320 101 II. AMPLIFICATION 1002 ALLÈLE Goûteur CCA Une des 23 paires de chromosomes d’un hétérozygote 886 Non Goûteur........ GATGATTGCAAACCAAGCCAACCT Digestion HaeIII : GG↔CC : allèle goûteur coupé en 2 fragments de 44pb et 176pb IV. ÉLECTROPHORÈSE ALLÈLE Goûteur (coupé) 130 V (--) départ départ ALLÈLE Non Goûteur (non coupé) FRAGMENT 220 pb FRAGMENT 176 pb FRAGMENT 44 pb (+) Une seule bande est visible Deux bandes sont visibles Combien de bandes seront visibles chez un hétérozygote? Page 9 sur 10 Département de biologie Collège Lionel-Groulx 101-NYA-05 Évolution et diversité du vivant Automne 2016 NOM : ____________________________________ Groupe : ______ ANNEXE 2. Schématisation des 3ères étapes de l’analyse d’ADN. JOUR 1 I. EXTRACTION D’ADN 1.RINCER La ______ __ ml de _____ / __ min 2.TRANSFÉRER ____ μL 4.REJETER Le __________ GARDER ___ ml 3.CENTRIFUGER Vitesse maximale __ min puis RÉPÉTER les étapes # _____ Pendant la 2e centrifugation AJOUTER ___ μl de Chelex 5.RESUSPENDRE Pipette de ___ μL 6.__________ ____ μL 7.CHAUFFER __OC x __ min VORTEX 9.___________ 8. VORTEX _ sec 10.__________ __ μL Vitesse ________ __ sec CONSERVER Sur _____ L’extrait d’___ II. AMPLIFICATION DE L’ADN 1. «Ready-to-go» AJOUTER : 1o _______________ 2o _______________ 2.__________________ 3. AMPLIFIER ____ cycles Vitesse ________ __ sec GARDER SUR _________ et attendre le groupe pour la prochaine étape JOUR 2 III. DIGESTION AVEC HaeIII 1.___________ Vitesse ________ __ sec Puis TRANSFÉRER __ μL (2 fois) 2.AJOUTER __ μL de ______ 3.___________ Vitesse ________ __ sec 4. ___________ 37oC X ___ min Tube « __ » Tube « __ » Garder jusqu’à l’étape 3 Page 10 sur 10 Département de biologie Collège Lionel-Groulx