Chapitre 2.1.11.

CHAPITRE 2.1.11.
PESTE EQUINE
RÉSUMÉ
La peste équine (PE) est une maladie virale infectieuse mais non contagieuse, frappant toutes les
espèces d’équidés, due à un orbivirus de la famille des Reoviridae et caractérisée par une atteinte
des fonctions respiratoire et circulatoire. La PE est transmise par au moins 2 espèces de
Culicoides. Neuf sérotypes différents ont été décrits.
Tous les sérotypes de virus de la PE se rencontrent en Afrique de l’Est et du Sud. Seuls les
sérotypes 9 et 4 ont été trouvés en Afrique de l’Ouest d’où ils gagnent parfois les pays
circumméditerranéens. Les exemples d’épizooties survenues hors d’Afrique sont : Le Moyen
Orient (1959-1963), l’Espagne (sérotype 9, 1966, sérotype 4, 1987-1990), et le Portugal
(sérotype 4, 1989).
Le diagnostic de laboratoire de la PE est fondamental. Bien que les signes cliniques et les lésions
soient très évocateurs, ils peuvent être confondus avec ceux d’autres maladies.
En tant que maladie virale, le diagnostic de laboratoire peut reposer sur l’identification du virus
infectieux, de son acide nucléique, des antigènes viraux ou des anticorps spécifiques. Durant ces
dernières années, une grande variété d’épreuves de laboratoire a été adaptée à la détection à la
fois du virus (AHSV, African Horse Sickness Virus) et de ses anticorps spécifiques.
Identification de l’agent pathogène : il est important d’effectuer l’isolement et le sérotypage du
virus chaque fois que des foyers apparaissent hors des régions d’enzootie.
Le virus équipestique peut être isolé du sang prélevé durant la phase fébrile initiale. Pour isoler le
virus, les autres tissus de choix sont représentés par la rate, le poumon et les nœuds lymphatiques,
prélevés lors de l’autopsie. Les préparations peuvent être inoculées en cultures de cellules, telles
que celles de rein de jeune hamster (BHK-21), de singe (MS) ou de rein de singe vert africain
(Vero), et par voie intra-cérébrale au souriceau nouveau-né. Différentes méthodes
immuno-enzymatique (ELISA) ont été mises au point pour la détection rapide d’antigènes viraux
dans la rate et le surnageant de cultures de cellules infectées. L’identification de l’ARN viral a aussi
été réalisée à l’aide de la technique de transcription inverse couplée à une réaction d’amplification
en chaîne par polymérase (RT-PCR). Les virus isolés peuvent être sérotypés par une réaction
sérologique spécifique telle qu’une séroneutralisation virale (SN) et par RT-PCR.
Épreuves sérologiques : les chevaux qui survivent à une infection naturelle développent des
anticorps vis-à-vis du sérotype viral infectant, en 8 à 12 jours après l’infection. Ceci peut être
démontré par plusieurs méthodes sérologiques telles que la réaction de fixation du complément,
l’ELISA, l’immuno-empreinte et la SN. Cette dernière est utilisée pour le sérotypage. D’autres
épreuves ont été décrites et proposées comme l’immunodiffusion en gélose et l’inhibition de
l’hémagglutination.
Spécifications applicables aux vaccins et aux produits biologiques à usage diagnostique :
des vaccins vivants atténués (monovalents et polyvalents) destinés au cheval, mulet et âne, sont à
l’heure actuelle disponibles. Un vaccin inactivé monovalent a été commercialisé mais n’est plus
disponible. De nouveaux vaccins, y compris un vaccin sous-unités, ont été évalués
expérimentalement.
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Chapitre 2.1.11. — Peste équine
A. INTRODUCTION
La peste équine (PE) (Peste equina africana, African horse sickness [AHS]) est une maladie des équidés non
contagieuse, transmise par des arthropodes, due à un orbivirus (ARN double brin) de la famille des Reoviridae.
Le genre Orbivirus comprend aussi le virus de la fièvre catarrhale ovine et celui de la maladie hémorragique
épizootique qui ont des aspects morphologiques et des propriétés biochimiques voisines alors qu’ils diffèrent par
leurs caractéristiques pathogènes et antigéniques ainsi que par les espèces affectées. Le génome du virus de la
peste équine (AHSV, African Horse Sickness Virus) est formé de 10 segments double brin d’ARN, qui codent
7 protéines structurales (VP 1-7), la plupart de celles-ci ayant été séquencées pour les sérotypes viraux 4, 6 et
9 (25, 31, 34), et 4 protéines non structurales (NS1, NS2, NS3, NS3A) (9, 17). Les protéines VP2 et VP5 forme la
partie externe de la capside du virion, et les protéines VP3 et VP7 constituent les constituants majeurs de la
couche interne de la capside. Les protéines VP1, VP4 et VP6 sont les constituants mineurs de cette couche
interne. Récemment, il a été indiqué que les protéines NS3 sont les secondes protéines virales les plus
variables (32) ; les premières plus variables étant la protéine majeure VP2 de la surface de la capside. Cette
protéine VP2 est aussi responsable des sérotypes viraux et, avec VP5, de l’activité de neutralisation du virus (23).
Neuf sérotypes distincts de virus de la PE ont été identifiés par neutralisation virale, mais aucune réaction croisée
avec d’autres orbivirus connus n’a été observée.
La PE demeure enzootique en Afrique sub-saharienne, bien que des poussées occasionnelles aient été
enregistrées en Afrique du Nord (1965, 1989-1990), au Moyen Orient (1959-1961), et en Europe (Espagne, 1966,
1987-1990 et Portugal, 1989).
La maladie présente, à la fois une incidence saisonnière (fin de l’été, automne) et cyclique avec des pics
épizootiques en Afrique du Sud durant les accès de chaleur (1). La mortalité apparaît en rapport avec les
espèces d’équidés affectés et la souche ou le sérotype de virus en cause. Au moins 2 vecteurs sont impliqués sur
le terrain : Culicoides imicola et C. bolitinos. Parmi la famille des équidés, le cheval est le plus sensible au virus
de la PE, avec un taux de mortalité de 50 à 90 %, suivi par le mulet, avec un taux de mortalité voisin de
50 %. Dans les régions d’enzootie africaines ; l’âne est très résistant et ne fait que des infections sub-cliniques.
Cependant, en Europe et dans les pays asiatiques, l’âne se révèle moyennement sensible et la mortalité peut
atteindre 10 %. Les zèbres sont aussi très résistants, n’extériorisent aucun signe clinique, mais ils peuvent
présenter une virémie prolongée (jusqu’à 40 jours).
B. TECHNIQUES DE DIAGNOSTIC
Le diagnostic de laboratoire est essentiel. Bien que certains signes cliniques et certaines lésions soient très
évocateurs, la PE peut être confondue avec d’autres maladies. Par exemple, l’œdème de la fosse temporale, qui
est souvent présent chez les chevaux atteints de forme subaiguë, est, associé à des commémoratifs historiques,
suffisant pour tenter le diagnostic. Les autres signes et lésions sont moins spécifiques de la PE, et d’autres
maladies telles que l’encéphalose équine, l’anémie infectieuse, la pneumonie à morbilivirus, l’artérite à virus, la
babésiose et le purpura hémorragique, doivent être écartés. Il existe 4 formes classiques de PE : pulmonaire,
cardiaque, cardio-pulmonaire ou mixte, et fébrile pure (6).
La forme suraiguë ou pulmonaire, qui a une incubation courte (3 à 5 jours), est caractérisée par une dyspnée
sévère et une atteinte respiratoire progressive. Une poussée aiguë fébrile, durant 1 à 2 jours et pouvant atteindre
40 à 41°C, peut être le seul signe. Le plus souvent elle est suivie par divers degrés de détresse respiratoire – La
fréquence respiratoire peut augmenter à 60 ou même 75 respirations/min. Le sujet se tient immobile, les
antérieurs écartés, la tête tendue sur l’encolure, les naseaux dilatés. Un jetage abondant est fréquent et une toux
spasmodique peut être notée en phase terminale avec un jetage mousseux obstruant les naseaux. La mort
survient en général quelques heures après le début des manifestations cliniques, l’animal se noyant littéralement
dans son propre fluide séreux. La forme pulmonaire est habituellement observée chez les animaux très sensibles,
infectés par une souche hautement virulente, ou sur des animaux qui ont été soumis à un effort physique durant
la phase fébrile. La guérison de cette forme est exceptionnelle, survenant dans moins de 5 % des cas.
L’incubation de la forme subaiguë, oedémateuse ou cardiaque, varie de 7 à 14 jours, et l’apparition des signes
cliniques est marquée par une réaction fébrile (39 à 41°C) qui dure 3 à 6 jours. Peu après le déclin de la fièvre,
des tuméfactions oedémateuses peuvent apparaître. Elles débutent dans la fosse temporale ou supra-orbitaire et
sur les paupières, puis, plus tard atteignent les lèvres, les joues, la langue, l’espace inter-mandibulaire et la
région laryngée. Les oedèmes sous-cutanés peuvent s’étendre à distance du cou vers la poitrine et, dans les cas
sévères, peuvent envahir la cage thoracique et les épaules, mais en général pas les membres postérieurs. En
phase terminale, des pétéchies peuvent être constatées dans la conjonctive et sous la face ventrale de la langue.
Finalement, l’animal devient agité et peut montrer des signes de coliques avant de mourir d’un arrêt cardiaque.
Une difficulté de déglutition en rapport avec une paralysie de l’œsophage est aussi rencontrée. Le taux de
mortalité est d’environ 50 % et la mort survient généralement en 4 à 8 jours après l’apparition de la réaction
fébrile. Lors de guérison, les oedèmes se résorbent progressivement en 3 à 8 jours. Cette forme clinique est
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habituellement associée à une infection par une souche virale de basse virulence ou se rencontre sur des sujets
immunisés par des souches virales hétérologues, ou apparaît en rapport avec des variations biologiques chez
l’animal infecté.
La forme aiguë ou mixte associe à la fois la forme pulmonaire et la forme cardiaque. Bien que rarement reconnue
cliniquement, elle est la forme la plus fréquente, découverte à la faveur d’autopsie dans la plupart des cas fatals
de PE chez le cheval et le mulet. La période d’incubation varie de 5 à 7 jours, et la maladie peut se manifester de
la façon suivante :
• Des signes pulmonaires initiaux relativement modérés sont suivis par l’apparition de tuméfactions
oedémateuses importantes de la tête et de l’encolure, la mort résultant d’un arrêt cardiaque.
• Des tuméfactions oedémateuses, typiques de la forme subaiguë, sont suivies par l’apparition soudaine
d’une dyspnée et des autres signes cliniques caractéristiques de la forme suraiguë pulmonaire.
Le taux de mortalité dans la forme mixte est de 80 % et l’issue fatale survient dans les 3 à 6 jours suivant
l’apparition de la réaction fébrile.
La forme fébrile pure est la forme la plus discrète et passe souvent inaperçue dans les foyers. L’incubation varie
de 5 à 14 jours débouchant sur une réaction fébrile (39 à 40°C) de type rémittent, avec une rémission le matin et
une exacerbation le soir, durant 5 à 8 jours. Mis à part la réaction fébrile, les autres manifestations sont rares. Les
conjonctives peuvent être légèrement congestionnées, le pouls accéléré, et un certain degré d’anorexie et
d’abattement peut être noté. Cette forme de maladie est habituellement observée chez les animaux bénéficiant
déjà d’une immunité partielle et sur les espèces résistantes, telles que les ânes et les zèbres.
Il n’existe aucune donnée plaidant pour la possibilité d’infection de l’homme par une souche de terrain de virus de
la PE, soit à la suite d’un contact avec des animaux infectés naturellement ou expérimentalement, soit au cours
de manipulation du virus au laboratoire. Cependant certaines souches vaccinales neurotropes peuvent entraîner
des encéphalites et des rétinites chez l’homme, suite à une contamination trans-nasale (24). La transmission
expérimentale et naturelle du virus au chien a été rapportée, suite à l’ingestion de viande de cheval infecté (3).
Néanmoins, on ne dispose que de peu d’éléments quant à la possibilité d’infection du chien par piqûre
d’insecte (30).
1. Identification de l’agent pathogène
Plusieurs techniques sont déjà disponibles pour l’identification du virus de la PE, allant du dosage
immuno-enzymatique (ELISA) qui est une technique rapide et utilisant des anticorps soit polyclonaux (AcP) soit
monoclonaux (AcM), à la réaction d’amplification en chaîne par polymérase (PCR) qui inclue une nouvelle
technique de transcription inverse couplée à une PCR (RT-PCR) pour discriminer les 9 sérotypes du virus (27) et
en passant par la culture sur cellule et l’inoculation à un souriceau nouveau-né. Si possible, plus d’une épreuve
doit être réalisée pour diagnostiquer un foyer de PE, spécialement pour préciser le taux d’atteinte. L’épreuve
initiale peut être une épreuve rapide telle que l’ELISA ou la PCR, complétée par l’isolement du virus en culture de
cellules. La séroneutralisation virale (SN) permettant l’identification du sérotype, doit être effectuée aussitôt que
possible lors d’épizootie afin de pouvoir choisir le vaccin adapté. Par la suite, l’ELISA sera très utile pour le
diagnostic de laboratoire.
Aujourd’hui, il n’existe aucun standard international de virus ou de réactifs de diagnostic, et aucune méthodologie
standard pour l’identification du virus de la PE. Néanmoins un panel de virus a été évalué et des études
comparatives entre différentes tests ELISA pour l’identification antigénique ont été conduites dans différents
laboratoires. Les résultats ont démontré un haut niveau de corrélation, pour la détection antigénique (26) lorsque
l’on utilise la méthode ELISA sandwich indirecte (11, 16).
Un élément très important du diagnostic est le choix des prélèvements et les conditions de leur transport au
laboratoire.
a) Prélèvements pour isolement du virus
Du sang récolté sur anti-coagulant durant le début de la phase fébrile de la maladie, ainsi que des fragments
(2 à 4 g) de rate, poumon et nœuds lymphatiques prélevés sur un animal venant de mourir, constituent les
prélèvements de choix du diagnostic. Ils doivent être placés à 4°C durant le transport et au laboratoire.
b) Culture de cellules
L’isolement direct du virus sur lignées BHK-21, MS et Vero a été réalisé avec succès. Les prélèvements de
sang recueillis sur héparine peuvent être utilisés non dilués. Après 60 min d’adsorption, les cellules en
culture sont lavées et le milieu d’entretien est ajouté. Il est aussi possible et plus courant de laver le sang, de
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le lyser et le diluer au 1/10. Cette modalité élimine les anticorps indésirables qui peuvent neutraliser le virus
et favorise la libération des virus associés aux membranes cellulaires des globules rouges. Quand des
prélèvement tissulaires (rate, poumon, etc.) sont utilisés, une suspension tissulaire à 10 % est préparée
dans une solution physiologique tamponnée au phosphate (PBS) ou dans du milieu de culture de cellules,
contenant des antibiotiques.
Un effet cytopathogène (ECP) peut apparaître entre 2 et 8 jours en post-infection. Trois passages aveugles
doivent être réalisés avant de considérer les prélèvements comme négatifs.
c) Souriceau nouveau-né
Cette méthode d’isolement de l’AHSV nécessite une inoculation intra-cérébrale de 2 familles de souriceaux
âgés de 1 à 3 jours. Lors de résultats positifs, les animaux présentent des signes nerveux entre 3 et 15 jours
en post-inoculation. Les cerveaux des animaux malades sont récoltés, homogénéisés et ré-inoculés par voie
intra-cérébrale à au moins 6 souriceaux de 1 à 3 jours. Le second passage doit induire une réduction de la
période d’incubation (2 à 5 jours) et 100 % d’infectiosité.
d) Méthode immuno-enzymatique sandwich
Au moins 2 techniques ELISA sandwich ont été mises au point et appliquées à la détection de l’antigène de
l’AHSV à la fois sur des prélèvements de terrain et sur des cultures de cellules infectées au
laboratoire (11, 16).
L’une (11), utilise des AcPs et l’autre (16), des AcMs vis-à-vis de l’une des protéines majeures la mieux
conservée parmi les sérotypes – la protéine VP7. Les 2 méthodes se sont révélées convenables pour le
diagnostic de la PE, en raison de leur grande sensibilité et spécificité ainsi que de l’obtention des résultats
en seulement 2 à 4 h (26). L’utilisation de l’immunoglobuline IgY dans un ELISA en double sandwich
d’anticorps pour la détection de tous les sérotypes de l’AHSV, a été décrite (5).
Les réactifs nécessaires à l’ELISA peuvent être obtenus auprès des Laboratoires de référence de l’OIE pour
la peste équine (se reporter à la liste de la partie 3 de ce Manuel terrestre).
• Ce qui suit est un exemple d’ELISA utilisant des anticorps monoclonaux
i) Phase solide : Fixer sur les plaques ELISA (par exemple Nunc Maxisorb à haute capacité d’adsorption)
un mélange de AcM 5G5 et 3D2 dilué en PBS, pH 7,2 (10 µg/ml). Incuber une nuit à 4°C ;
ii) Laver les plaques 5 fois avec de l’eau distillée contenant 0,05 % (v/v) de Tween 20 (solution de
lavage). Tapoter délicatement les plaques sur une substance absorbante pour éliminer le liquide
résiduel ;
iii) Saturer les plaques avec du PBS + 1 % de sérum-albumine bovine (SAB), pH 7,2, 200 µl par puits,
pendant 1 h à 37°C ;
iv) Eliminer la solution de blocage et tapoter délicatement les plaques sur une substance absorbante ;
v) Prélèvements à tester : Ajouter les prélèvements à tester (dilutions de 2 en 2 en commençant par les
homogénats ou les surnageant de cultures de cellules non dilués) dilués en PBS + 1 % SAB,
pH 7,2, 100 µl par puits. Incuber pendant 1 h à 37°C. (homogénat de rate : homogénéiser environ
2 cm3 [1 g] de rate dans 3 ml de milieu de culture MEM [milieu essentiel minimum]. Centrifuger à
600 g pendant 10 min et récupérer le surnageant) ;
vi) Laver les plaques comme décrit à l’étape ii) ;
vii) Conjugué : Répartir 100 µl par puits de 5G5 AcM marqué à la biotine, dilué au 1/500 en PBS + 1 % de
SAB, pH 7,2. Incuber 1 h à 37°C. Laver les plaques comme décrit à l’étape ii). Ajouter 100 µl par puits
d’avidine/peroxidase à la dilution optimale en PBS + 1 % de SAB. Incuber 45 min à la température
ambiante ;
viii) Laver les plaques comme décrit à l’étape ii) ;
ix) Substrat : Ajouter 200 µl par puits de solution de substrat (10 ml de DMAB 80,6 mM [diméthyl
aminobenzaldéhyde] + 10 ml de MBTH 1,56 mM [3-méthyl-2-benzo-thiazolinone hydrazone
hydrochlorure] + 5 µl de H2O2). Le développement de la couleur est stoppé par addition de 50 µl de
H2SO4 3 N, après environ 5 à 10 min (avant que les témoins négatifs commencent à se colorer) ;
x) Lire les plaques à 600 nm (ou 620 nm) ;
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xi) Interprétation des résultats : Calculer le seuil critique de la façon suivante : C + ou – 0,06 = Seuil (où C
est la valeur de densité optique (DO) obtenue avec le témoin négatif). Les prélèvements donnant des
DO inférieures au seuil sont considérés négatifs. Les prélèvements donnant des DO supérieures
de + 0,20 sont considérés positifs. Les échantillons donnant des DO intermédiaires sont douteux et
doivent faire l’objet d’une autre technique afin de confirmer les résultats.
e) Réaction d’amplification en chaîne par polymérase
Une technique PCR a été mise au point pour la mise en évidence spécifique de l’ARN viral. Les amorces
correspondent aux extrémités 5’ (nucléotides 1-21) et 3’ (nucléotides 1160-1179) du segment 8 de l’ARN
(20, 29, 35).
• Protocole
L’extraction des acides nucléiques à partir de prélèvements de rate, est effectuée de la façon suivante :
1 g du prélèvement tissulaire est homogénéisé dans 1 ml de solution dénaturante (thiocyanate de guanidium
4 M, citrate de sodium 25 mM, 2-mercaptoéthanol 0,1 M, sarcosyl 0,5 %). Après centrifugation, 1 µg d’ ARN
de levure, 0,1 ml d’acétate de sodium 2 M pH 4, 1ml de phénol et 0,2 ml d’un mélange (49/1) de
chloroforme/alcool isoamylique, sont ajoutés au surnageant. La suspension est agitée vigoureusement et
placée sur glace pendant 15 min. Après centrifugation, l’ARN présent dans la phase aqueuse est extrait au
phénol, précipité à l’éthanol et repris en eau stérile. Les méthodes de synthèse de l’ADNc et d’amplification
en PCR sont appliquées, dans tous les cas, à une température de régénération de 37°C. Les séquences
d’amorces PCR utilisées sont : 5’-GTT-AAA-ATT-CGG-TTA-GGA-TG-3’, qui correspond à la polarité de
l’ARN messager et 5’-GTA-AGT-GTA-TTC-GGT-ATT-G-3’, qui est complémentaire de la polarité de l’ARN
messager. Le protocole PCR proprement dit comprend 40 cycles (94°C pendant 1 min, 55°C durant 1,5 min,
72°C pendant 2,5 min et 70°C durant 7 min) puis les tubes PCR sont conservés à 4°C. L’analyse des
produits PCR est conduite par électrophorèse dans un gel d’agarose à 1,2 % (poids/volume) contenant du
bromure d’éthidium. Les prélèvements positifs donneront des bandes de 1179 paires de base.
Une nouvelle RT-PCR permettant de discriminer les 9 sérotypes, a été décrite (27). Neuf paires d’amorces
ont été définies pour chaque sérotype spécifique. Les résultats obtenus sont parfaitement en accord avec
ceux de la séroneutralisation.
Le typage des 9 sérotypes du virus équipestique a aussi été réalisé avec des sondes obtenues d’une série
de gènes entiers clonés de VP2 et cette technique peut être une alternative à l’amplification du segment
génomique 2 (15).
2. Épreuves sérologiques
Les sérums de référence internationale OIE sont disponibles auprès du Laboratoire de référence de l’OIE de
Valdeolmos, Madrid, Espagne (se reporter à la liste de la partie 3 de ce Manuel terrestre). Ces sérums ont été
produits afin de standardiser l’ELISA, qui est l’épreuve prescrite par l’OIE. De plus, un ensemble de sérums de
référence a été évalué et des études comparatives entre différentes techniques ELISA utilisant des AcMs et des
AcPs, impliquant plusieurs laboratoires, ont été réalisées. Les résultats ont révélé un degré élevé de corrélation
en utilisant l’ELISA de compétition pour la mise en évidence des anticorps (10, 18, 26). Plus récemment, un
ensemble de sérums a été produit et est utilisé aujourd’hui pour les contrôles annuels de qualité de 3 épreuves
de détection des anticorps par ELISA adoptés par les laboratoires nationaux en Europe (8, 10, 18).
L’ELISA indirect de compétition utilisant soit l’antigène soluble de l’AHSV soit une protéine VP7 recombinante
(18), et l’ELISA de compétition utilisant l’antigène soluble (10), se sont révélés de bonnes méthodes de détection
des anticorps spécifiques de groupe, notamment pour des recherches à grande échelle (26). L’ensemble de ces
épreuves a été reconnu par la Commission Européenne (8). L’ELISA de compétition peut aussi être utilisé chez
les animaux sauvages puisque les anti-globulines spécifiques d’espèce ne sont pas nécessaires avec cette
méthode. Une épreuve d’immuno-empreinte a été appliquée à la recherche des anticorps anti-AHSV (18). Elle est
particulièrement adaptée à l’étude d’un petit nombre de sérums. Un ELISA indirect utilisant la protéine non
structurale NS3 comme antigène, est aussi disponible ; il peut être utilisé pour différencier les animaux infectés
ou vaccinés avec le vaccin à virus vivant de ceux vaccinés avec le vaccin inactivé préparé à partir de virions
purifiés (19). La réaction de fixation du complément (FC) a été largement utilisée, mais certains sérums se
révèlent anti-complémentaires.
a) Méthode immuno-enzymatique indirecte (épreuve prescrite pour les échanges internationaux)
La protéine VP7 recombinante a été utilisée comme antigène pour la recherche des anticorps anti-AHSV et
a révélé une grande sensibilité et spécificité (18, 33). Les autres avantages de cet antigène résident dans sa
stabilité et son innocuité.
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