GENETIQUE “FORWARD”/“REVERSE”

GENETIQUE “FORWARD”/“REVERSE”
INTRODUCTION
La génétique "forward" : du phénotype vers le gène (classique) s’oppose à la génétique "reverse" : du gène vers la
fonction (plus moderne).
Elle utilise un large éventail d’outils expérimentaux. Le gène mutant est le plus puissant de ces outils.
GENETIQUE FORWARD
La génétique classique (forward) part de mutants pour découvrir la fonction normale de gènes a priori inconnus.
Base = Disposer d’un phénotype observable.
Elle est adaptée pour l’identification des gènes contrôlant une fonction.
Elle s’organise selon la séquence :
1 - production de mutants : mutation spontanée très rares
2 - isolement de mutants
3 - définition de voies génétiques
4 - création de mutants suppresseurs ou enhancers
5 - localisation et clonage du gène
Principales caractéristiques : long (des mois voire des années), fastidieux, mais efficace car capable de toucher tous
les gènes d’un organisme.
GENETIQUE INVERSE
Part de protéines purifiées ou de gènes définis et va vers la mutagenèse ciblée et l’analyse phénotypique. On
regarde une perte ou un gain de fonction. Cela permet l’identification de gènes responsables de maladies humaines.
- recouvre un large éventail de méthodes d’analyse du gène utilisant la connaissance de génomes séquencés.
- adaptée pour l’identification de gènes responsables de maladies humaines : génétique classique impossible
(mutagenèse, croisements imposés…)
Au départ, l’analyse était ciblée sur un seul gène. Depuis quelques années on est capable de faire une analyse à
grande échelle. On se dirige vers une analyse systématique en regardant les ORFs.
Possibilité de prendre un gène « neuf » dans les banques de données pour étudier sa fonction.
Analyse ciblée : étude extensive d’un seul gène.
Analyses à grande échelle : profils d’expression de tous les gènes d’un organisme dans des conditions données (ex:
wt ou mutant d’un gène).
Analyse systématique. Ex : délétion de tous les ORFs de levure ou de Drosophile, un par un, et étude du phénotype.
 Génomique fonctionnelle = approches spécifiques d’un gène et à l’échelle de tout le génome
GENETIQUE CLASSIQUE OU “FORWARD”
Il faut disposer d’un phénotype observable à différentes échelles :
- Moléculaire
observation au microscope
- Cellulaire
- Macroscopique  observation à l’œil nu
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PRODUCTION DE MUTANT S
GENETIQUE CLASSIQUE - PRODUCTION DE MUTANT S
Introduction de mutagénèses pour modifier le génome de façon plus rapide. Mais il faut induire une mutation par
génération donc il faut faire un dosage.
1. Définir la question expérimentale (ex : quels gènes contrôlent la formation de l’œil ?)
2. Anticiper le phénotype de mutants de ces gènes (absence, déformation, transformation de l’œil …)
3. Collecter des mutants possédant ces caractéristiques
Mutants spontanés : naturels mais rares (1 mutation pour 100 000 gènes par génération chez la souris) Nécessité
de cribler des millions d’individus (ex : white, T)
Mutants induits : création d’une mutation au hasard dans le génome de chaque organisme de la population afin
qu’un seul gène ne soit touché par organisme, laissant tous les autres sous forme sauvage augmentation de
fréquence par l’emploi de mutagènes Idéalement : 1 et une seule mutation par individu.
Mutagénèse saturante : mutagénèse suffisamment à grande échelle pour que chaque gène soit muté au moins une
fois.
AGENTS MUTAGENES
On peut faire des mutations à l’aide d’agents physiques, chimiques et biologiques. Toute substance qui modifie une
séquence ADN est mutagène.
EFFET DES RADIATIONS IONISANTES (UTILISEES DEPUIS 1927)
Crée des mutations violentes : Cassures chromosomiques, délétions, inversions, translocation et autres
réarrangements majeurs. Ces mutations induisent souvent des pertes de fonction qui peuvent avoir des
répercussions phénotypiques très importantes.
MUTATIONS A L’EMS (ETHYL METHYL SULFONATE) ET AUX UVS
UV, EMS (éthyl-méthyl-sulfonate), nitrosoguanine : mutations ponctuelles (souvent d’une seule paire de bases),
petites insertions ou délétions.
Obtention d’un panel de phénotypes mutants de modérés à sévères selon l’endroit où se trouve la mutation.
MUTANTS THERMO-SENSIBLES
Mutations conditionnelles : très utiles pour l’étude des gènes essentiels.
Obligatoires pour conserver des mutations chez les organismes haploïdes ou pour conserver des mutations
dominantes chez les diploïdes.
En général, ce sont des mutations faux-sens qui rendent une protéine moins stable, thermo-labile.
Fonction maintenue à température permissive
Fonction bloquée à température non permissive
MUTAGENESE PAR MOBILISATION DE TRANSPOSONS
Insertion aléatoire d’un élément mobile du génome : transposon.
Ils sont silencieux dans un génome mais sont capables d’insérer une mutation dans certaines régions à étudier. Ils
peuvent cependant avoir des effets d’invalidation de gène de modération ou de suppression d’un gène :
1. Perte de fonction si le transposon rompt l’ORF du gène hôte.
2. Modification de l’expression si le transposon s’intègre dans les régions régulatrices ou dans des introns du
gène hôte.
L’enzyme codée par un transposon est une intégrase. Et pour induire un transposon on se sert d’un plasmide.
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Mode d’action du transposon Sleeping Beauty
2 sites de reconnaissance inversés
1 enzyme codée : transposase
Le transposon est flanqué entre deux séquences terminales
= IR/DR (en noir) qui contiennent des sites de fixation de la
transposase (en violet). Celle-ci peut séparer le transposon
du reste de la séquence et le mettre à un autre endroit du
génome.
Le transposon sleeping Beauty est
utilisé pour insérer des gènes
d’intérêt (souvent thérapeutiques)
dans des cellules hôte. Pour cela,
on insère au préalable le gène
d’intérêt au sein du transposon. On
intègre ensuite le transposon dans
un vecteur (en bleu) que l’on
transfecte dans une cellule hôte. Le
transposon et le gène d’intérêt
vont s’intégrer
au
génome
chromosomique.
Drosophila melanogaster : mutagenèse aléatoire
Elément P = 1 gène d’intérêt + 1 gène codant pour un caractère
visible flanqués entre deux extrémités (répétitions inversées de
plusieurs paires de bases)
1 : Le gène d’intérêt est cloné dans le plasmide de transformation
qui contient également un gène dominant conférant les yeux
rouges. Ces gènes sont flanqués par les extrémités de l’élément P.
Le plasmide « helper » contient le gène codant pour la transposase.
2 : Les deux plasmides sont co-injectés dans des œufs fécondés
homozygotes pour le gène muté codant pour la couleur des yeux
(n’exprime aucune couleur).
L’élément P s’insère dans les cellules germinales, donc les deux
transgènes et le gène de la transposase ne seront transcrits et
traduits que dans ces cellules. L’embryon va alors se développer en
adulte aux yeux blancs.
3 : Croisement entre les descendants aux yeux blancs : obtention de
mouches qui expriment le marqueur « couleur rouge » si le
plasmide transformant s’est bien inséré dans les cellules parentales.
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1 : Interruption du gène X par l’insertion de l’élément P.
En jaune = extrémités de l’élément P
En vert = gène résistance à l’Ampicilline
En rouge = allèle « yeux rouges »
2 : purification de l’ADN à partir des mouches aux yeux rouges
3 : Digestion par EcoRI
4 : Ligature (avec de la ligase) des fragments de restriction afin
d’obtenir des ADN circulaires. Obtention de milliers de
molécules circulaires différents (car EcoRI coupe tout le
génome pas seulement aux deux endroits présentés sur la
figure) dont celle qui nous intéresse.
5 : Transformation de bactéries sensibles à l’Ampicilline
6 : Sélection positive : seules les bactéries ayant ingéré le
plasmide survivent sur un milieu contenant l’antibiotique.
Purification du plasmide et séquençage du gène X.
RECHERCHE DES MUTANTS
• Détection
• Maintien
Majorité des mutations : perte de fonction, récessives (le produit de l’allèle sauvage des hétérozygotes suffit à un
phénotype normal)
Fréquent : mutations récessives létales chez l’homozygote
Rare : mutations dominantes. Phénotype immédiat des hétérozygotes, facile à maintenir si non létal. Les mutations
dominantes létales sont perdues en cours de criblage.
CRIBLE GENETIQUE
Examen visuel d’un grand nombre d’organismes
mutagénisés afin de détecter les mutations dominantes. Le
mutant identifié peut ensuite être croisé afin de maintenir
des stocks d’hétéro/homozygotes.
CRIBLE GENETIQUE DE TOLERANCE A L’ETHANOL
Pour étudier les mécanismes de la tolérance, les auteurs
ont sélectionné des mouches mutantes (hangAE10)
caractérisées par une tolérance réduite à l’éthanol, attestée
par une majoration du temps d’élution.
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DETECTION DES MUTATIONS RECESSIVES CHEZ LES HAPLOÏDES
Exemple des mutants ts de levure : technique des répliques
- La protéine mutante est bien conformée à température permissive
- Repliement anormal ou instabilité structurale à température restrictive  perte de fonction
DETECTION DES MUTATIONS RECESSIVES CHEZ LES DIPLOÏDES
Chromosome Balanceur : chromosome remanié qui possède 3 gènes
 Inversion C qui empêche les recombinaisons avec le chromosome homologue.
 Gène létal l’état homozygote (L) : contre-sélection des homozygotes.
 Marqueur dominant B : permet d’identifier les porteurs même hétérozygotes
Exemple de la technique ClB chez la drosophile (Muller, 1920) : Détecte des
mutations létales récessives sur le chromosome X
Les mères portent deux chromosomes X dont un est le balanceur qui possède un
marqueur dominant B qui confère des yeux barrés.
Les pères sont mutagénisés. Leur X peut contenir une mutation récessive létale
induite.
En F1
Recherche de femelles à œil barré (portent un X maternel ClB et un X paternel
mutagénisé)
Backcross de ces femelles F1 avec un mâle sauvage
En F2
50% des mâles meurent car hémizygotes pour l’allèle l.
Si le X mutagénisé porte une mutation nouvelle létale, les 50% restants meurent aussi
L’absence de mâles en F2 signale la présence d’une mutation récessive sur le chromosome X
50% des femelles ont un phénotype « œil barré » et 50% sont normales.
SELECTION DES MUTANT S
But de la sélection : créer les conditions supprimant ce que l’on ne cherche pas (individus sauvages et mutants sans
rapport à la question)
Cas le plus simple : ce qu’on cherche favorise la survie dans certaines conditions (résistance, avantage sélectif,
correction d’un défaut métabolique). Souvent inapplicable (mutations perte de fonction récessives), mais utiles
ensuite pour rechercher des suppresseurs.
Suppresseur : mutation qui affecte un autre gène que le gène mutant considéré, et qui restaure une fonction
normale. Il favorise l’identification des gènes d’une voie multi-étapes.
Recherche manuelle des mutants : long et fastidieux. Si une sélection est possible, on réduit temps et effort
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IDENTIFICATION DES VOIES GENETIQUES
DECOUVRIR LES GENES QUI AFFECTENT LE PHENOTYPE
But de la dissection génétique : trouver TOUS les gènes qui contrôlent un phénotype et comprendre comment ils
fonctionnent.
Un même gène peut présenter plusieurs allèles mutants (forts, faibles, nul). Dans ce cas, des mutations du même
gène conduisent à des phénotypes différents
Un gène peut agir au sein d’une voie multigénique : des mutations dans différents gènes de la voie peuvent conduire
au même phénotype
Comment le généticien détermine à quel cas il a affaire ?
Analyse de complémentation (mutations récessives)
Analyse de recombinaison (mutations dominantes)
ANALYSE DE COMPLEMEN TATION
Dans le premier cas, les deux mouches ont le même phénotype (pas d’ailes), pourtant elles ont chacune une
mutation sur un gène différent. Leur croisement permet d’obtenir une mouche avec des ailes : il y a eu
complémentation.
Dans le second cas, les deux mouches n’ont pas d’ailes et sont mutées sur le même gène (même si ce n’est pas au
même endroit). Leur croisement ne permet pas de complémentation, la mouche qui en résulte ne possède donc pas
d’aile.
ETABLISSEMENT DE GROUPES DE COMPLEMENTATION
Au sein d’un groupe, les mutations ne complémentent pas. Dans notre exemple, les mutations du cas 2 seront dans
le même groupe de complémentation.
Entre groupes, les mutations se complémentent. Les mutations du cas 1 sont dans des groupes différents.
En général, un groupe de complémentation = 1 gène
/!\ Cette analyse est différente des expériences de complémentation fonctionnelle (ex : cdc2 de levure, P. Nurse)
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/!\ Aux questions posées : « combien de gènes contrôlant le phénotype étudié SONT REPRESENTES par ces
mutations ? » Ici la réponse est 2 car 2 groupes de complémentation.
Si la question avait été « combien de gènes contrôlent le phénotype étudié » la réponse serait : AU MOINS 2 gènes.
CAS DES MUTATIONS DOMINANTES
Non testables par complémentation  Utilisation de l’analyse de recombinaison
Calcul du taux de recombinaison (crossing-over) entre loci mutants lorsqu’ils sont présents chez le même individu.
Estimation du degré de liaison génétique : d(a,b) =
x 100
Si les mutations touchent le même gène, la liaison est très forte (donc il y a très peu ou pas de recombinants)
DISSECTION DES RESEAUX GENETIQUES : EPISTASIE ET VOIES DE BIOSYNTHESE
Les analyses de complémentation et recombinaison peuvent conclure que deux gènes ou plus contribuent au même
phénotype. Comment déterminer à quel niveau de la voie génétique ils agissent ?
 Analyse d’épistasie = examen de l’interaction de différents gènes
Epistasie : l’effet d’un gène masque ou modifie celui d’un autre gène
Celui qui masque est dit “épistatique”
Celui qui est masqué est dit “hypostatique”
METHODE D’ANALYSE D’EPISTASIE
Il faut disposer de phénotypes légèrement différents
pour chaque mutant
Croisement de deux mutants homozygotes aux
phénotypes discernables puis croisement de la F1.
Examen de la F2.
Si on a épistasie, le ratio dévie de la distribution 9:3:3:1
du dihybridisme, et révèle quels gènes contrôlent les
étapes amont ou aval de la voie.
Création d’un double mutant homozygote et examen
de son phénotype. Si celui-ci est identique à l’un des
mutants simples, ce dernier est en amont.
Dans l’exemple, l’allèle b est épistasique sur m+ et m. A
l’inverse, m+ et m ne peuvent être exprimés qu’en
présence b+. L’allèle épistasique étant récessif, il s’agit
là d’un cas d’épistasie récessive.
En réalité, la notion d’épistasie est très complexe : un gène contrôlant l’assimilation d’une vitamine peut influencer
la croissance, l’immunité, la pigmentation…
EXTENSION DE L’ANALY SE : SUPPRESSEURS ET ENHANCERS
But : compléter la connaissance d’une voie génétique car souvent, le crible génétique original ne révèle qu’une
partie des gènes intervenant dans la voie métabolique.
 Second criblage de mutagenèse à partir de mutants du premier crible. Permet de trouver de nouveaux
mutants (dans d’autres gènes) qui aggravent ou atténuent de façon dominante le phénotype connu.
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MECANISMES DE SUPPRESSION
Suppresseur = seconde mutation (parfois dans le même gène)
qui restaure le phénotype original
Il peut :
- Restaurer une interaction protéique : mutation dans gène
codant pour une protéine qui ne peut plus interagir avec la
protéine codée par le premier gène (car la mutation l’a
rendue anormalement repliée). Suite à la mutation
suppresseur, les deux protéines anormales peuvent interagir
ce qui restaure la fonction.
- Activer une voie secondaire : mutation d’une seconde voie
qui peut alors contourner ou se substituer à la voie
anormale chez le premier mutant.
- Suppresseur à haut nombre de copies (multicopies) :
sauvent le premier mutant en fournissant des niveaux élevés
du produit d’un autre gène qui peut compenser ou stabiliser
le produit anormal du premier gène muté.
MUTATIONS « ENHANCER » (OU AGGRAVATRICES)
Les enhancers sont l’opposé des mutations suppresseurs. Elles augmentent l’intensité du premier phénotype
mutant. Elles permettent toutefois (comme les mutations suppresseurs) d’identifier d’autres gènes dans un réseau
génétique.
EXTENSION DE L’ANALY SE : LE CLONAGE DES GEN ES
Une fois que les mutants ont été générés et que les réseaux génétiques ont été identifiés : les gènes impliqués sont
identifiés par clonage.
Clonage par complémentation fonctionnelle à partir d’une banque de plasmides d’ADNc sauvage: possible chez la
levure et chez C.elegans (nématode).
- Transfert de vecteurs d’expression dans la souche mutante et recherche du clone qui restaure le phénotype
sauvage.
- Purification du clone à partir de la souche transformée
- Séquençage de l’ADNc en question : positionnement précis de la mutation (recombinaison, linkage, SNPs)
- Recherche de la séquence génomique complémentaire chez la levure
- Clonage de l’allèle sauvage qui peut être utilisé pour isoler l’allèle mutant à partir de l’organisme mutant.
Exemple chez la Drosophile : voie de signalisation RAS / sevenless :
Le gène sevenless (sev), codant un récepteur tyrosine kinase (RTK) est important pour la détermination de l’un des
photorécepteurs de l’œil de la Drosophile. Une mutation de ce gène empêche le développement du neurone
photosensible.
MUTANTS PAR TRANSPOSONS (DROSOPHILE)
Récupération de l’information de séquence directement voisine du
transposon par PCR inverse
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UTILISATION DES SNPS / RFLP
Détection de SNPs par PCR (Voir TD1)
Rappel : probabilité de trouver un site de restriction de 6 pb
6
(par exemple) dans le génome p(6 pb)= (¼)
Ensuite, on peut calculer précisément :
GENETIQUE INVERSE
But : définir la ou les fonctions d’un gène identifié a priori
CAS HISTORIQUES
APPROCHES DE GENETIQUE INVERSE
BIOINFORMATIQUE
Analyse de la séquence du gène pour recherches des motifs particuliers (de la séquence d’acides aminés)connus
dans les banques
Ex: domaine de liaison de l’ATP, domaine transmembranaire
BIOCHIMIE ET DE GENETIQUE MOLECULAIRE
Analyse de l’expression spatio-temporelle
Etude des interactions moléculaires avec des acides nucléiques et des protéines
Mutagenèse dirigée
Remplacement de gène (knock-in)
Invalidation (knockout)
Phénotype d’animaux transgéniques
ANALYSE A PARTIR D’UNE PROTEINE PURIFIEE
Situation classique pour des protéines abondantes (Hb, myosine, …) ou
supposées être impliquées dans un phénotype d’intérêt.
- Identification de la séquence en acides aminés
- Déduction de la séquence d’ADN correspondant à la séquence :
 A partir du code génétique
 Séquençage de l’extrémité N-terminale (méthode d’Edman)
- Synthèse d’oligonucléotides antisens (marqués) de combinaisons
différentes correspondant à toutes les combinaisons possibles de
codons.
- Utilisation de ces oligonucléotides pour sonder une banque d’ADNg
ou d’ADNc : si un ou plusieurs de ces oligo s’hybride à un clone de la
banque, ce clone est sélectionné pour d’autres analyses (comme le clonage).
AUJOURD’HUI
ANALYSE A PARTIR D’UN GENE CLONE
La spectrométrie de masse est une méthode destructive, qui permet à la fois
d'accéder à la mesure de la masse moléculaire d'une substance ainsi que
d'obtenir des données structurales.
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-
Extraction de la protéine non identifiée du gel
Fragmentation en fragments de quelques acides aminés
Détermination de la masse
comparaison à une base de données = logiciels qui vont aligner la structure, rechercher des motifs et prédire des
structures (GenBank, Ensembl, Swissprot…)
Détermination de la séquence en acides aminés
Identification de la protéine
ANALYSE A PARTIR D’UN ORGANISME MODELE MUTANT
Le gène CDC2 code pour une protéine kinase qui régule plusieurs étapes du cycle
cellulaire.
Clonage du gène humain par transformation de levures thermosensibles mutante
pour cdc2 avec des clones d’une banque d’ADNc humain : complémentation
fonctionnelle entre un clone et la levure (restauration du phénotype sauvage chez la
levure).
Récupération du plasmide correspondant, séquençage : séquences identiques à 63%
entre l’humain et la levure
ETUDE DU PATTERN D’EXPRESSION
Distribution différente des ARNm en fonction des tissus chez l’adulte (RT-PCR).
Le Northen blot permet une identification des régulations au cours de la différenciation chez l’embryon.
L’hybridation in situ (l’ARN est détectable par un marquage de couleur) peut permettre de révéler la présence d’un
ARNm dans un ou plusieurs tissus au sein d’un organisme pluricellulaire ou dans une structure d’une cellule.
/!\ Qui dit ARNm ne dit pas forcément protéine…
DETECTION DE LA PROTEINE D’INTERET
Activité intrinsèque (kinase)
Anticorps spécifique
o sur membrane : western-blot
o sur coupes : immunocytochimie, immunofluorescence
o in toto : immunocytochimie
Fusion GFP : visualisation directe
CONNAITRE LES INTERACTEURS POUR INFERER LA FONCTION
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ANALYSE A L’AIDE DES TECHNOLOGIES CIBLANT LES GENES
Test ultime de la fonction d’un gène : étude du phénotype de mutants in vivo
Création de mutants perte et gain de fonction.
Deux principales méthodes puissantes :
• knockout ciblé possible chez levure, drosophile, souris
• remplacement de gène après mutagenèse dirigée = gene targeting
techniques
REMPLACEMENT DE GENE : METHODE DE CHOIX CHEZ LA LEVURE
Le taux de recombinaison élevé permet un remplacement efficace.
Longueur d’homologie nécessaire très limitée (100 pb peuvent suffire)
Gènes assez courts
Facile avec des plasmides (0-10 kb d’insert)
Exemple : invalidation du gène X à l’aide d’une cassette de sélection
conférant la résistance à l’antibiotique Kanamycine chez la levure
1 : élimination d’une portion du gène X et insertion du gène KanMX. Ce
remplacement préserve de chaque côté du gène KanMX, les séquences
d’ADN qui correspondent au gène d’intérêt.
2 : transformation d’une souche diploïde avec le gène invalidé.
Recombinaisons homologues entre le chromosome de la levure et le gène
inséré : remplacement du gène sauvage par la cassette KanMX.
Les cellules sporulent et les spores sont mises en présence de l’antibiotique
G418.
Les cellules haploïdes qui survivent sont résistantes donc elles portent
l’allèle « perte de fonction » du gène d’intérêt.
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CREATION D’UNE SOURIS KNOCKOUT
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Prélèvement de cellules souches embryonnaires (ES) d’une souris marron, puis mise en culture
Invalidation du gène X un gène de résistance à la neomycine dans un vecteur de criblage contenant le gène Tk
codant pour une enzyme qui, en présence de ganciclovir, inhibe la réplication de l’ADN.
Transformation des cellules ES par ce vecteur. Intégration au génome de la souris soit par recombinaison
homologue (à gauche) soit par intégration aléatoire. Cette dernière n’est pas souhaitée, on élimine donc cette
option grâce au gène Tk
Croissance des cellules ES transformées sur un milieu contenant néomycine + ganciclovir
Sélection des colonies ayant survécu
Test de la présence du gène invalidé puis culture des cellules KO
Injection de ces cellules dans un blastocyte de souris noire
MUTAGENESE DIRIGEE
Création de mutation ponctuelle
Etude fine de la protéine
Reproduction de pathologies
Blocage d’un site de régulation
Exemple : mutagenèse par PCR. Cette méthode utilise quatre oligonucléotides. On fait
deux amplifications séparées chacune avec un oligonucléotide externe et un
oligonucléotide portant la mutation. Les deux fragments obtenus séparément sont
ensuite amplifiés ensemble avec les deux amorces les plus externes. On digère ensuite
les deux extrémités par des enzymes de restriction et on ligue dans le plasmide
original.
DISSECTION DE FONCTI ONS DE GENES PAR LES METHODES DE GENOMIQUE FONCTIONNELLE ET RNA I
Amélioration accidentelle de la stratégie “ARN antisens” qui consiste à
introduire expérimentalement des ARN dans des cellules pour
interférer avec la fonction d’un gène endogène.
Injection dans la gonade, étude de l’effet à la génération suivante.
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Effet d’ARN sens, d’ARN antisens et de mélange des deux sur des gènes de c.elegans dont on connaît le phénotype
mutant.
PROPRIETES DU PHENOMENE D’INTERFERENCE
ARN interférent est un ARN simple ou double brin, qui interfère avec un ARN messager spécifique conduisant à sa
dégradation et à la diminution de sa traduction en protéine.
• Fonctionne quelque soit l’exon utilisé, si l’ARN est double-brin
• Indépendant de la taille de l’ARN
• Nécessite une séquence présente dans l’ARNm
• Efficacité variable (pas toujours 100% de phénotype)
• Peut dépasser l’effet de la mutation (unc-54)
MODE D’ACTION DES ARN INTERFERENTS, SIRNA - MIRNA
Les microARN (ARNmi) codés naturellement par notre ADN pour contrôler l'expression d'autres gènes de notre
génome et les petits ARN interférents (ARNsi: small interfering RNA) sont introduits artificiellement dans les cellules
remplissent de nombreuses fonctions, en particulier celle de l'inhibition post-transcriptionnelle des gènes.
Dans la cellule, ils sont pris en charge par un complexe de plusieurs protéines nommé RISC, acronyme de RNAi
Induced Silencing Complex. L'ensemble RISC/ARN interférent scanne les différentes molécules d'ARN messagers
présentes dans la cellule. Plusieurs situations peuvent alors se produire :
 S'il n'y a pas d'homologie entre l'ARNi et l'ARN messager scanné, celui-ci est normalement traduit en protéine.
 Si l'ARNi est un miRNA et qu'il y a une homologie partielle entre lui et l'ARNm la traduction est bloquée mais
l'ARN messager n'est pas dégradé
 Si l'ARNi est un siRNA dont la vingtaine de nucléotides est parfaitement homologue avec une région de l'ARNm,
celui-ci est coupé par RISC. L'ARN messager coupé est très rapidement dégradé et la protéine correspondante ne
peut plus être synthétisée.
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AVANTAGES - LIMITES DE L’APPROCHE ARNI
Spécificité d’action (séquence de l’ARNm ciblé)
Puissance d’action (mécanismes d’amplification)
Action à distance du site d’injection
Dure parfois deux ou trois générations (C.elegans)
Simplicité : feeding = c.elegans se nourrit d’ E.coli
Culture sur souches d’ E.coli produisant un seul ARNdb
Banque de souches => criblage de tous les gènes
Réponse transitoire liée au métabolisme /
dégradation de l’ARNi
Inhibition forte, mais rarement totale : effets partiels
Difficultés
de
transduire
certaines
cellules
mammifères
Réponse différente selon les espèces (parasites,
nématodes)
Oligos ARN chers et instables (RNAses)
PROFILAGE TRANSCRIPTOMIQUE : ANALYSE SUR PUCE ADN
Permet l’analyse simultanée de l’expression de nombreux gènes dont les séquences ont été appliquées sur un
support: membrane poreuse : high density grided array support en verre : - ac nucléiques (100 pb)
présynthétisés par PCR à partir de de banques par ex et appliqués sur lame de verre: DNA micro-array
- oligonucléotides(20-25 nt) synthétisés in situ sur support activé : DNA chip (Affymetrix)
APPLICATION A L’ETUDE D’UN FACTEUR DE TRANSCRIPTION
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Gènes cibles : ChIP on chip / ChIP-seq
RESUME
On se sert d’organismes modèles pour disséquer la fonction de gènes (nombreux descendants, mutagenèse possible,
croisements contrôlés)
Ces modèles sont pertinents parce que beaucoup de processus biologiques sont communs au travers de l’évolution
et beaucoup de gènes ont conservé une fonction semblable
La génétique forward part de mutants pour trouver les gènes responsables d’un processus
La génétique reverse part de gènes définis pour trouver leur(s) fonction(s)
Il existe un arsenal de méthodes biochimiques et génétiques pour étudier la fonction d’un gène cloné
L’ARNi permet de créer aisément un KO d’expression (knock down)
Micropuces et méthodes à haut débit analysent des milliers d’interactions à la fois : génomique fonctionnnelle
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