GENETIQUE “FORWARD”/“REVERSE”

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GENETIQUE “FORWARD”/“REVERSE”
INTRODUCTION
La génétique "forward" : du phénotype vers le gène (classique) s’oppose à la génétique "reverse" : du gène vers la
fonction (plus moderne).
Elle utilise un large éventail d’outils expérimentaux. Le gène mutant est le plus puissant de ces outils.
GENETIQUE FORWARD
La génétique classique (forward) part de mutants pour découvrir la fonction normale de gènes a priori inconnus.
Base = Disposer d’un phénotype observable.
Elle est adaptée pour l’identification des gènes contrôlant une fonction.
Elle s’organise selon la séquence :
1 - production de mutants : mutation spontanée très rares
2 - isolement de mutants
3 - définition de voies génétiques
4 - création de mutants suppresseurs ou enhancers
5 - localisation et clonage du gène
Principales caractéristiques : long (des mois voire des années), fastidieux, mais efficace car capable de toucher tous
les gènes d’un organisme.
GENETIQUE INVERSE
Part de protéines purifiées ou de gènes définis et va vers la mutagenèse ciblée et l’analyse phénotypique. On
regarde une perte ou un gain de fonction. Cela permet l’identification de gènes responsables de maladies humaines.
- recouvre un large éventail de méthodes d’analyse du gène utilisant la connaissance de génomes séquencés.
- adaptée pour l’identification de gènes responsables de maladies humaines : génétique classique impossible
(mutagenèse, croisements imposés…)
Au départ, l’analyse était ciblée sur un seul gène. Depuis quelques années on est capable de faire une analyse à
grande échelle. On se dirige vers une analyse systématique en regardant les ORFs.
Possibilité de prendre un gène « neuf » dans les banques de données pour étudier sa fonction.
Analyse ciblée : étude extensive d’un seul gène.
Analyses à grande échelle : profils d’expression de tous les gènes d’un organisme dans des conditions données (ex:
wt ou mutant d’un gène).
Analyse systématique. Ex : délétion de tous les ORFs de levure ou de Drosophile, un par un, et étude du phénotype.
 Génomique fonctionnelle = approches spécifiques d’un gène et à l’échelle de tout le génome
GENETIQUE CLASSIQUE OU “F OR WARD”
Il faut disposer d’un phénotype observable à différentes échelles :
- Moléculaire observation au microscope
- Cellulaire
- Macroscopique  observation à l’œil nu

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PRODUCTION DE MUTANTS
GENETIQUE CLASSIQUE - PRODUCTION DE MUTANTS
Introduction de mutagénèses pour modifier le génome de façon plus rapide. Mais il faut induire une mutation par
génération donc il faut faire un dosage.
1. Définir la question expérimentale (ex : quels gènes contrôlent la formation de l’œil ?)
2. Anticiper le phénotype de mutants de ces gènes (absence, déformation, transformation de l’œil …)
3. Collecter des mutants possédant ces caractéristiques
Mutants spontanés : naturels mais rares (1 mutation pour 100 000 gènes par génération chez la souris) Nécessité
de cribler des millions d’individus (ex : white, T)
Mutants induits : création d’une mutation au hasard dans le génome de chaque organisme de la population afin
qu’un seul gène ne soit touché par organisme, laissant tous les autres sous forme sauvage augmentation de
fréquence par l’emploi de mutagènes Idéalement : 1 et une seule mutation par individu.
Mutagénèse saturante : mutagénèse suffisamment à grande échelle pour que chaque gène soit muté au moins une
fois.
AGENTS MUTAGENES
On peut faire des mutations à l’aide d’agents physiques, chimiques et biologiques. Toute substance qui modifie une
séquence ADN est mutagène.
EFFET DES RADIATIONS IONISANTES (UTILISEES DEPUIS 1927)
Crée des mutations violentes : Cassures chromosomiques, délétions, inversions, translocation et autres
réarrangements majeurs. Ces mutations induisent souvent des pertes de fonction qui peuvent avoir des
répercussions phénotypiques très importantes.
MUTATIONS A L’EMS (ETHYL METHYL SULFONATE) ET AUX UVS
UV, EMS (éthyl-méthyl-sulfonate), nitrosoguanine : mutations ponctuelles (souvent d’une seule paire de bases),
petites insertions ou délétions.
Obtention d’un panel de phénotypes mutants de modérés à sévères selon l’endroit où se trouve la mutation.
MUTANTS THERMO-SENSIBLES
Mutations conditionnelles : très utiles pour l’étude des gènes essentiels.
Obligatoires pour conserver des mutations chez les organismes haploïdes ou pour conserver des mutations
dominantes chez les diploïdes.
En général, ce sont des mutations faux-sens qui rendent une protéine moins stable, thermo-labile.
Fonction maintenue à température permissive
Fonction bloquée à température non permissive
MUTAGENESE PAR MOBILISATION DE TRANSPOSONS
Insertion aléatoire d’un élément mobile du génome : transposon.
Ils sont silencieux dans un génome mais sont capables d’insérer une mutation dans certaines régions à étudier. Ils
peuvent cependant avoir des effets d’invalidation de gène de modération ou de suppression d’un gène :
1. Perte de fonction si le transposon rompt l’ORF du gène hôte.
2. Modification de l’expression si le transposon s’intègre dans les régions régulatrices ou dans des introns du
gène hôte.
L’enzyme codée par un transposon est une intégrase. Et pour induire un transposon on se sert d’un plasmide.

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Mode d’action du transposon Sleeping Beauty
2 sites de reconnaissance inversés
1 enzyme codée : transposase
Le transposon est flanqué entre deux séquences terminales
= IR/DR (en noir) qui contiennent des sites de fixation de la
transposase (en violet). Celle-ci peut séparer le transposon
du reste de la séquence et le mettre à un autre endroit du
génome.
Le transposon sleeping Beauty est
utilisé pour insérer des gènes
d’intérêt (souvent thérapeutiques)
dans des cellules hôte. Pour cela,
on insère au préalable le gène
d’intérêt au sein du transposon. On
intègre ensuite le transposon dans
un vecteur (en bleu) que l’on
transfecte dans une cellule hôte. Le
transposon et le gène d’intérêt
vont s’intégrer au génome
chromosomique.
Drosophila melanogaster : mutagenèse aléatoire
Elément P = 1 gène d’intérêt + 1 gène codant pour un caractère
visible flanqués entre deux extrémités (répétitions inversées de
plusieurs paires de bases)
1 : Le gène d’intérêt est cloné dans le plasmide de transformation
qui contient également un gène dominant conférant les yeux
rouges. Ces gènes sont flanqués par les extrémités de l’élément P.
Le plasmide « helper » contient le gène codant pour la transposase.
2 : Les deux plasmides sont co-injectés dans des œufs fécondés
homozygotes pour le gène muté codant pour la couleur des yeux
(n’exprime aucune couleur).
L’élément P s’insère dans les cellules germinales, donc les deux
transgènes et le gène de la transposase ne seront transcrits et
traduits que dans ces cellules. L’embryon va alors se développer en
adulte aux yeux blancs.
3 : Croisement entre les descendants aux yeux blancs : obtention de
mouches qui expriment le marqueur « couleur rouge » si le
plasmide transformant s’est bien inséré dans les cellules parentales.

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1 : Interruption du gène X par l’insertion de l’élément P.
En jaune = extrémités de l’élément P
En vert = gène résistance à l’Ampicilline
En rouge = allèle « yeux rouges »
2 : purification de l’ADN à partir des mouches aux yeux rouges
3 : Digestion par EcoRI
4 : Ligature (avec de la ligase) des fragments de restriction afin
d’obtenir des ADN circulaires. Obtention de milliers de
molécules circulaires différents (car EcoRI coupe tout le
génome pas seulement aux deux endroits présentés sur la
figure) dont celle qui nous intéresse.
5 : Transformation de bactéries sensibles à l’Ampicilline
6 : Sélection positive : seules les bactéries ayant ingéré le
plasmide survivent sur un milieu contenant l’antibiotique.
Purification du plasmide et séquençage du gène X.
RECHERCHE DES MUTANTS
• Détection
• Maintien
Majorité des mutations : perte de fonction, récessives (le produit de l’allèle sauvage des hétérozygotes suffit à un
phénotype normal)
Fréquent : mutations récessives létales chez l’homozygote
Rare : mutations dominantes. Phénotype immédiat des hétérozygotes, facile à maintenir si non létal. Les mutations
dominantes létales sont perdues en cours de criblage.
CRIBLE GENETIQUE
Examen visuel d’un grand nombre d’organismes
mutagénisés afin de détecter les mutations dominantes. Le
mutant identifié peut ensuite être croisé afin de maintenir
des stocks d’hétéro/homozygotes.
CRIBLE GENETIQUE DE TOLERANCE A L’ETHANOL
Pour étudier les mécanismes de la tolérance, les auteurs
ont sélectionné des mouches mutantes (hangAE10)
caractérisées par une tolérance réduite à l’éthanol, attestée
par une majoration du temps d’élution.

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DETECTION DES MUTATIONS RECESSIVES CHEZ LES HAPLOÏDES
Exemple des mutants ts de levure : technique des répliques
- La protéine mutante est bien conformée à température permissive
- Repliement anormal ou instabilité structurale à température restrictive  perte de fonction
DETECTION DES MUTATIONS RECESSIVES CHEZ LES DIPLOÏDES
Chromosome Balanceur : chromosome remanié qui possède 3 gènes
 Inversion C qui empêche les recombinaisons avec le chromosome homologue.
 Gène létal l’état homozygote (L) : contre-sélection des homozygotes.
 Marqueur dominant B : permet d’identifier les porteurs même hétérozygotes
Exemple de la technique ClB chez la drosophile (Muller, 1920) : Détecte des
mutations létales récessives sur le chromosome X
Les mères portent deux chromosomes X dont un est le balanceur qui possède un
marqueur dominant B qui confère des yeux barrés.
Les pères sont mutagénisés. Leur X peut contenir une mutation récessive létale
induite.
En F1
Recherche de femelles à œil barré (portent un X maternel ClB et un X paternel
mutagénisé)
Backcross de ces femelles F1 avec un mâle sauvage
En F2
50% des mâles meurent car hémizygotes pour l’allèle l.
Si le X mutagénisé porte une mutation nouvelle létale, les 50% restants meurent aussi
L’absence de mâles en F2 signale la présence d’une mutation récessive sur le chromosome X
50% des femelles ont un phénotype « œil barré » et 50% sont normales.
SELECTION DES MUTANTS
But de la sélection : créer les conditions supprimant ce que l’on ne cherche pas (individus sauvages et mutants sans
rapport à la question)
Cas le plus simple : ce qu’on cherche favorise la survie dans certaines conditions (résistance, avantage sélectif,
correction d’un défaut métabolique). Souvent inapplicable (mutations perte de fonction récessives), mais utiles
ensuite pour rechercher des suppresseurs.
Suppresseur : mutation qui affecte un autre gène que le gène mutant considéré, et qui restaure une fonction
normale. Il favorise l’identification des gènes d’une voie multi-étapes.
Recherche manuelle des mutants : long et fastidieux. Si une sélection est possible, on réduit temps et effort