processus d`evaluation des projets de these

Ecole Doctorale « Santé – Sciences
Biologiques – Chimie du Vivant »
Philippe Roingeard & Luigi Agrofoglio
Directeurs
CONTRAT DOCTORAUX (rentrée 2014)
1. Informations administratives :
Nom du directeur de thèse : Malinge Jean-Marc
Nom du co-directeur / :Midoux Patrick
Unité : Centre de Biophysique Moléculaire, UPR4301 CNRS
Email du directeur de thèse :[email protected]
2. Titre de la thèse : Co-ciblage de facteurs de transcription impliqués dans le cancer : preuve
de concept de l’activité leurre moléculaire d’un minicercle d’ADN in cellulo et in vivo.
3. Résumé :
La stratégie de thérapie moléculaire dite du leurre moléculaire à ADN a fait l’objet de plusieurs
brevets portant sur des applications thérapeutiques et un ADN leurre moléculaire est en essai clinique
dans le traitement de tumeurs de la tête et du cou pour cibler le facteur de transcription STAT3. Cette
stratégie consiste à utiliser un oligodésoxyribonucléotide en double brin linéaire court contenant le site
de reconnaissance d’un facteur de transcription cible suractivé dans le cancer. Après délivrance
intracellulaire, l’acide nucléique leurre piège le facteur de transcription qui n’est alors plus capable
d’interagir avec la séquence physiologique présente dans la région promotrice de plusieurs gènes dont
la transcription puis l’expression sont impliquées dans le cancer.
Nous avons mis au point une nouvelle méthode de
production quantitative d’une forme d’ADN circulaire
(minicercle ci-contre) permettant de fixer plusieurs
facteurs de transcription in vitro, d’être résistant aux
exonucléases
et
de
pouvoir
posséder
des
fonctionnalisations chimiques (fluorophores par
exemple) (Malinge, J.-M. et coll., dépôt d’un brevet
européen par le CNRS en 2012; T. Thibault, Thèse
2012). Cette forme offre plusieurs avantages par rapport
aux leurres moléculaires ADN utilisés à l’heure actuelle
qui sont linéaires et courts, avec une efficacité
thérapeutique limitée par une instabilité et surtout par
l’impossibilité de cibler plusieurs facteurs de transcription simultanément. Les minicercles ADN
permettent le développement d’agents thérapeutiques multicibles ce qui est une nécessité dans le
traitement contre le cancer car les mécanismes moléculaires de l’oncogénèse reposent sur une
suractivation de plusieurs facteurs de transcription.
Après avoir mis au point la préparation des minicercles d’ADN, le projet de thèse proposé a pour
objectif de faire la preuve de concept de l’efficacité d’un minicercle d’ADN comme leurre moléculaire
des facteurs de transcription NF-kB, STAT3 et Ets-1 impliqués respectivement dans l’inflammation,
la prolifération cellulaire et l’angiogénèse tumorale. Cette preuve de concept sera faite en deux
parties :
1) au niveau cellulaire, l’effet du multiciblage des facteurs de transcription par un minicercle
sera déterminé en étudiant l’activité cytotoxique sur différentes lignées cellulaires tumorales; ce travail
sera accompagné par une étude sur i) la délivrance, le trafic intracellulaire du minicercle et la colocalisation leurre-cible par microscopie confocale et cytométrie en flux ii) le mécanisme d’action du
Ecole Doctorale « SSBCV »
Site Orléans  Bât. Physique-Chimie  Rue de Chartres  B.P. 6759  45067 ORLÉANS
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minicercle en déterminant l’inhibition de la transcription des gènes sous la dépendance des facteurs de
transcription ciblés (système rapporteur de la transcription, amplification quantitative de l’ARN de
gènes cibles) iii) l’interaction physique des protéines ciblées avec un minicercle biotinylé par
expérience de « pull down » et immunoblotting
2) in vivo, l’activité antitumorale d’un minicercle ciblant les facteurs de transcription NF-kB,
STAT3 et Ets-1 sera déterminée chez la souris par injection locale de l’acide nucléique dans une
tumeur ectopique luminescente (génétiquement modifiée par le gène de la luciférase) (tumeur
mammaire murine et tumeur humaine de carcinome broncho-alvéolaire); la quantité de minicercles
dans la tumeur sera déterminée en fonction du temps par une méthode d’amplification spécifique du
minicercle (effet dose/réponse). Une étude sur l’activité toxique du minicercle sera réalisée en
parallèle.
Au cours de ce projet, la délivrance intracellulaire du minicercle sera optimisée grâce à
l’expertise de notre équipe dans le domaine du transfert d’acides nucléiques par des méthodes non
virales; les expérimentations animales seront réalisées au CIPA dans le service du Dr. A. Lepape
(TAAM, CNRS, Orléans).
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