4- tol locale

Principalesétudesnoncliniques
entoxicologie
Etudes de Toxicologie générale
•
toxicité par administration unique
•
toxicité par administration réitérée
Etudes de Toxicologie spécifique
Cancérogenèse
Mutagenèse
Fonctions de reproduction
Tolérance locale
Autres Etudes
TOLERANCE CUTANEE
Tests d’irritation/corrosion
Test de sensibilisation
Irritationcutanée=lésionscutanéesréversiblesconsécutivesàl’applicationd’un
produitchimiquetestédurantunepériodedequatreheuresaumaxim
=>érythème,œdème
Corrosioncutanée=lésionscutanéesirréversibles,etplusprécisémentnécrose
visibleàtraversl’épidermeetjusquedanslederme,àlasuitedel’applicationd’un
produitchimiquetestédurantunepériodedequatreheuresaumaximum.
=>ulcères,saignements,croûtessaignanteset,autermedelapériodede14jours,
décolorationdueaupâlissement delapeau,zonesd’alopécietotaleetescarres
Testd’irritationetcorrosionaiguëcutanée
TestdeDraize
OCDE404(1981misesàjour1992,2002,2015)
• 3lapinalbinos:régiondorsalerasée
• produit :0,5mlou500mg
• Contact4hsouscompressedeprotection
1er A:essai3min
sirienessai1h
sirien4h
Confirmationsur2autreslapins
• Observations:1h,24,48,72h
Réversibilité14j
Cotation
Erythème:max4
Œdème:max4
Examenhistologique
MÉTHODESALTERNATIVESVALIDÉES
invitro
CorrosioncutanéeinvitroOCDE430(2015)
Membraned’étanchéitéOCDE435(2015)
modèle3D
Épidermehumainreconstituée
=>corrosionOCDE431(2015)
=>irritationOCDE439(2015)
Testdecorrosion:Essaiderésistanceélectriquecutanée
ouTranscutaneousElectricalResistance
OCDE4302015
Principegénéral:
Explantdepeaudorsalederat
Disqued’épidermerasé
Montagesuruntube
Applicationdupdt24h
Mesuredelarésistance
Triplicate
Résultat:
>5W
Non corrosif
£5W
Corrosif
Membraned ’étanchéitépourlacorrosioncutanée
Corrositex®
OCDE4352015
Membranesynthétiquemacromoléculaireprotéique
Systèmededétectionchimique
Résultat:tempsentrel’applicationduproduitetlapénétrationdelamembrane
Épidermehumainreconstitué:testdecorrosion
OCDE4312015
Puit de culture cellulaire
Insert
Tissu
Milieu de culture
4modèlesvalidés:Episkin®,Epiderm®,SkinEthic®,epiCS®
Episkin®
Support collagénique
Epiderm®
Support polycarbonate
Contact : 3 mn, 1h et 4h (Episkin)
2 réplicats
Viabilité : MTT (colorant vital)
Témoin +
Témoin -
Résultat :
exemple Episkin
Test MTT, 3heures de contact +
extraction, lecture DO 540 nm
Viabilité > 35% à 4 h
Non corrosif
Viabilité < 35% à 1 h et ≥ 35% à 3 min
Corrosif
Viabilité < 35% à 3 mn
Corrosif
Épidermehumainreconstitué:testd’irritation
OCDE4392015
4modèlesvalidés:Episkin®,Epiderm®,SkinEthic®,Epimodel24SIT®
Temps de contact : variable en fonction des modèles : 15 à 60 min
Cytotoxicité : MTT
Résultat :
Viabilité ≤ 50%
Irritant
Viabilité > 50%
Non Irritant
Approcheintégrée
IntegratedApproach toTesting andAssessment (IATA)
forskincorrosionandirritationOCDETG203
TOLERANCE CUTANEE
Tests d’irritations/nécrose
Test de sensibilisation
=réactioncutanéedecaractèreimmunologique
aucontactd'unesubstance
Allergiedecontact
allergène
en2temps
Épiderme
Derme
1- Phasedesensibilisation
Vaisseaux
lymphatiques
Silencieuse
Ganglion lymphatique
cellule T naïve
dosedépendante
notiond’haptène
cellule T mémoire
(PM<1000Da)
Prolifération
Dissémination
dans la circulation
2- Phasederévélation
allergène
Nouveauxcontacts
Pasdosedépendante:
chezunpetit%patients
=Phasesymptomatique
Inflammation
Clinique:
œdème,
érythème,
prurit,
vésicules…
TestdeMagnusson etKligman :testdemaximisationchezlecobaye
ouguinea pig maximization test(GPMT)
Testavecadjuvant
A:20 cobayesalbinosdanslottraité,10 lottémoin
1- induction :épaulerasée
J1 :injectionIDauniveaudel’épaulerasée
adjuvantcompletdeFreund
substancetestà []légèrementirritante
J6-8:applicationtopiquepdt48hsouspansementocclusif
OCDE406
2- déclenchement :flancrasé
J21:applicationtopiquepdt24hsouspansementocclusifà[]maxnonirritante
3- Lecture : 48het72haprès
Réactioncutanée:intensitédel’érythème…examenhisto
Comparaison/lottémoin
Cotation
0 = pas de modification visible
1 = érythème discret ou en taches
2 = érythème modéré et confluent
3 = érythème intense et tuméfaction
Lottémoin:
Induction:véhicule
Déclenchement:produittest
Méthodesalternativesvalidées
invivo
Testdestimulationlocaledesganglionslymphatiques OCDE429(2010)
Variantes OCDE442Aet442B(2010)
invitro
TestARE-Nrf2luciféraseOCDE442D(2015)
inchemico
Liaisondirectesurlaréactivitépeptidique(DPRA)OCDE442C (2015)
Avancéescf conf deSaadiaKerdine
Essaidestimulationlocaledesganglionslymphatiques
ouLocalLymphNodeAssay(LLNA)
OCDE429
Principe : un agent sensibilisant induit la prolifération de lymphocytes dans le
ganglion lymphatique drainant le site d’application
- animaux,- souffrance
J1-J2-J3:ProduitX/solvant,¹concentrations
15µlsurl’oreille
Sourisfemelle:5/dose
J6:Injectiondethymidinetritiée danslaveinecaudale
J1-J2-J3:ProduitX/solvant,¹concentrations
15mlsurl’oreille
Souris femelle : 5 / dose
J6:Injectiondethymidinetritiéedanslaveinecaudale
J6+5h:Prélèvementduganglionlymphatiqueauriculairedrainantl’oreille
Dissociationduganglion
Mesuredelaradioactivité :siá = proliférationdelymphocytes
Indexdestimulation(IS)DPMtraitée/DPMtémoin
Positifsi≥3
Séquencedesévènementspouruneapprocheintégrée
TOLERANCE OCULAIRE
cornée
conjonctive
iris
Œil
humain
lésion oculaire grave = lésion des tissus oculaires ou une dégradation sévère de la vue,
provoquée par l’application d’un produit chimique testé sur la face antérieure de l’œil,
et pas totalement réversible dans les 21 jours suivant l’application
irritation oculaire = changements dans l'œil suite à l'application d'un produit chimique
testé sur la surface antérieure de l’œil et totalement réversibles dans les 21 jours suivant
l'application.
Testd’irritationoculairedeDraize
OCDE405(1981misesàjour87,2002,2012)
Cible :partieantérieureduglobeoculaire: cornée,iris,
conjonctive
• 3lapinsalbinos(9)
• analgésiquesystémiqueetanesthésiquetopique
• produit :0,1mlou100mgdanslesacconjonctival(1œiltraité
/1témoin)
• examensoculaires :1h,24,48et72h(réversibilité=>21j)
• observations
Cotations:
Cornée :opacité,ulcération…
max4
Iris :hyperhémie,hémorragie…
max2
Conjonctive :rougeur,hyperhémie,œdèmemax7
Substancesirritantes,fortementirritantes,corrosives
MÉTHODESALTERNATIVESVALIDÉES
invitro
TestdecytotoxicitéOCDE491 (2015)
DiffusiondefluorescéineOCDE460(2012)
exvivo
OpacitéetperméabilitédecornéebovineOCDE437(2013)
ŒildepouletisoléOCDE438(2013)
Modèleen3D
EpithéliumcornéenhumainreconstituéOCDE492(2015)
Testdecytotoxicitéinvitro,expositiondecourtedurée
OCDE491
Cellulesépithélialesdecornée:SIRC/Boite96puits
Produit :2[]:200µLà0,05%et5%
Témoinpositif:laurylsulfate desodium
Témoinsolvant
Contact :5min
Mesuredelaviabilitécellulaire:
colorantvitalMTT=>bleudeformazan
MesuredelaDOà570nm
Viabilitécellrelative%=(DOtraité/DOsolvant)x100
Testentriplicate
Résultat:
Viabilité
cellulaire à
5%
Viabilité cellulaire
à 0,05%
Interprétation
>70
>70
Sans catégorie
≤ 70
> 70
Aucune prédiction
possible
< 70
<70
Lésions oculaires
graves
Opacitéetdeperméabilitédelacornéebovine(OPCB)
ouBovineCornealOpacityandPermeability(BCOP)
OCDE4372013
Cornéeisolée=>Porte-cornées
Exposition10minou4h
Rinçage
Mesures:
1- Opacité
2- Perméabilité transcornéenne
Passage de fluorescéine à travers la cornée
Scored’irritationinvitro:SIIV
valeurmoyenned’opacité+(15xvaleurDO490 moyennedeperméabilité)
Résultat
SIIV
Interprétation
≤3
Sans catégorie
>3 et ≤ 55
Aucune prédiction
possible
> 55
Lésions oculaires
graves
Epithéliumcornéenhumainreconstitué(ECHR)
OCDE4922015
Modèle : EpiOcular®
Puit de culture cellulaire
Insert
Tissu
Membrane synthétique
Milieu de culture
Expositionpendant30min
Rinçage
ViabilitéavecMTT
2réplicats
Respectdespropriétés
histologiques,morphologiques,
biochimiquesetphysiologiques
Résultat:
Viabilité>60%=>produitnonirritant
Viabilité≤60%=>produitauminimumirritant
pas de distinction entre irritation et lésions oculaires graves
Analyse histologique
Irritationoculaire – OCDE405
préconisationd’unestratégieparétapes
u Evaluationdesdonnées existantes hommeetanimal
8 Sicorrosionsuroeiloupeauouirritantpouroeil¢ arrêt
v Etudedesrelationsstructure-activité :QSAR
8 Sicorrosionsuroeiloupeauouirritantpouroeil¢ arrêt
w Etudedespropriétés physico-chimiques etréactivité chimique
8 SipHextrêmes,supposécorrosif¢ arrêt
x Autres infos :Evaluationdelatoxicité systèmique parvoie cutanée
8 Sitrèstoxiquepourles[C]quiseraienttestéesdansl’oeil¢ arrêt
y Evaluationdelacorrosioncutanée invivo
8 corrosif ou irritantsévère ¢ arrêt
z Evaluationdesétudes invitroou exvivo decorrosion/irritationoculaire
8 corrosif ou irritantsévère ¢ arrêt
{ essai invivo initialsurl’oeild’1seul lapin
8 corrosif ¢ arrêt
| Confirmationsur1ou2lapinssipaslésionsgraves
Apermisderéduirede90%,
letestdeproduitscorrosifssurl’œildelapin
NB :
méthodes alternatives validées en F
TestduHetCam:Hen’sEggTestChorioAllantoicMembrane
JORF26/12/96
produitfinicosmétiques
Membranechorioallantoïdiennedel’œufdepoulede10j
Produitàtester(puroudilué)
Rinçage
Observationdansles5minutes quisuivent
Observations:
Hyperhémie
Coagulation
Hémorragie
Résultats:moyennede4œufs
tempsd’apparition➛ notation
tempscourt=notationélevée
INDICE : Echelle de 0 à 21
Interprétation des résultats
INDICE
I<1
CLASSIFICATION
Pratiquement non irritant
1 <I<5
Faiblement Irritant
5 <I<9
Modérément Irritant
I<9
Irritant
Méthodepardiffusionengeld’agarose
JORF30/12/99
produitfinicosmétiques
J0:cellulesensemencéesdansdesboitesdePétri
J1:cellulesrecouvertesd’ungeld’agarose
Milieu de culture
Cellules
Agarose 1%
Cellules
Solidification du gel
J1+30min:dépôtd’undisquedepapierfiltre
imprégnéduproduittest
Incubation24h
10µl /10mg
produit à tester
J2:éliminationdugel,colorationdescellules(rougeneutre,MTT…)
Résultat
Zonedelyse=cytotoxicité
Classificationenfonctiondudiamètredelalyse
>2cm cytotoxicitéfaible
2à3
cytotoxicitémodérée
≥3
cytotoxicitéimportante
TOLERANCEdesMUQUEUSES
exempleBUCCALE
Poche jugale du hamster
Absorptioncutanéeinvitro
(passagetranscutané)
OCDE4282004
=étudedudevenirduproduittestdanslesdifférentescouches delapeau
etsonpassagedanslacirculationgénérale aprèsuneapplicationtopique
Celluleàdiffusion
CelluledeFranz(statiqueoudynamique)
Epidermehumainoud’oreilledeporc
Produit(radiomarqué)
Fluiderecepteur
Clip de
fixation
Dépôt24h
Disquedepeau
Contact(tempsàdéfinir)
Ouverture à l’air
Compartiment donneur
Préparation à étudier
Membrane : peau
Compartiment
récepteur
Circuit de
thermostatation
Barreau magnétique
Dosage:couchesdelapeau,liquiderécepteur