influence des conditions de production du virus de la fièvre

INFLUENCE DES CONDITIONS DE PRODUCTION
DU VIRUS DE LA FI` EVRE APHTEUSE SUR SA
COMPOSITION EN PROT´ EINES
Serge Bernard, Jeanne Grosclaude
To cite this version:
Serge Bernard, Jeanne Grosclaude. INFLUENCE DES CONDITIONS DE PRODUCTION DU
VIRUS DE LA FI` EVRE APHTEUSE SUR SA COMPOSITION EN PROT´ EINES. Annales
de Recherches V´et´erinaires, INRA Editions, 1975, 6 (1), pp.83-91. <hal-00900831>
HAL Id: hal-00900831
https://hal.archives-ouvertes.fr/hal-00900831
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INFLUENCE
DES
CONDITIONS
DE PRODUCTION
DU VIRUS DE
LA FIÈVRE APHTEUSE
SUR
SA COMPOSITION EN PROTÉINES
S.
BERNARD
Jeanne
GROSCLAUDE
Station de Recherches de
Virologie
et
d’Immunologie,
I. N. R.
A., .,
78850
Thiverval-Grignon
SUMMARY
EFFECT
OF FOOT-AND-MOUTH
DISEASE
VIRUS
INCUBATION
WITH
CELLULAR LYSATE
ON
ITS
PROTEIN
COMPOSITION
Earlier
studies
of the
biochemical
stability
of
FMDV
with
hydrolytic enzymes
suggested
that
the
capsidal
composition
may
be
changed
when incubated
with
cellular
lysate.
Our studies
were
done
with
a cloned dextran
sulphate positive
0
type
mutant
exhibiting
a fast
replication cycle.
Virus was
harvested
at
4. 30
hours
(« early » virus)
and 20 hours
(o
late »
virus) ;
then concentrated and
purified by isopycnic
centrifugation
in cesium chloride. The
virus
peaks
(density 1. 47
for
ec
early
o and
1. 51
for
«
late
»j
were
analysed by
polyacrylamide
SDS
gel electrophoresis.
A
significant
modification
of
the
three viral
proteins
was
observed with
prolonged
incubation
in cell
lysate :
there was a
greater
concentration of the VP I
protein
(MW 34 ooo) present
in the
«
early
» virus than
in
the « late
».
This
protein
has been
strongly implicated
as
an
immunogenic
agent
in the
neutralizing antibody
synthesis ;
the
consequences
of
these
observations
for
the
immunogenic activity
of
the
virus
in
vaccinal
preparations
are
discussed.
Key-words :
Foot-and-mouth
disease
virus,
Purification,
Inactivated
vaccine,
Viral
proteins,
Separation,
VPI
protein, Immunogenicity.
INTRODUCTION
Le
succès
inégal,
dans
l’espèce porcine,
des
vaccins
anti-aphteux
inactivés a
été
imputé
à
plusieurs
causes : mauvaise
réponse
immunitaire
de
l’animal,
inadap-
tation
de
l’agent
d’inactivation des
particules
virales
ou
de
l’adjuvant,
système
hétérologue
de
production
du virus en culture
cellulaire.
L’inefficacité
relative
de
ces
vaccins,
même à doses
élevées,
contraste
avec le bon
degré
de
protection
observé
chez
des
animaux
ayant
été
en contact
avec
du virus
pathogène
ou
un vaccin vivant
expérimental.
Le
Porc,
mieux
que
les
ovins
ou les
bovins,
révèle ainsi
une insuffi-

sance en sites
immunogènes
des
préparations
vaccinantes
classiques.
Il
nous
a donc
paru important
d’étudier l’évolution
qualitative
du virus entre
un
stade
relativement
précoce
(choisi
par
nous)
et le stade où il est habituellement
récolté en culture
cellu-
laire à
des
fins de
préparation
de vaccin.
Des
études
préliminaires
(L APO R TE
et
al.,
1973 )
nous ont montré
que,
à
la surface
du virus de
type
0,
une classe de
protéines,
VP I,
de
masse moléculaire
34 000,
est suffisante
pour
susciter
la
synthèse
d’anticorps
neutralisant
le
virus.
Cette
protéine,
de
par
sa
localisation
à la
surface
de la
capside,
est extrêmement
sen-
sible
à l’action
des
enzymes
protéolytiques (Wn,D et
al.,
ig6g
B URROU GH S et
al.,
1971 ;
IMPORTE
et
I,!rrorR,
zg!3 ;
S’r ROri M Ar>;R
et
ADAM,
1974 )
ainsi
qu’à
certains
traitements
physiques
comme
les
centrifugations isopycniques
successives
en
chlo-
rure de césium
(BE RNARD et
al.,
rg73).
Or,
au
cours même
de
sa
production,
le
virus
est
exposé
aux
enzymes
cellulaires ;
en
particulier,
à
partir
du
moment
où les cellules
productrices
sont
lysées,
les
enzymes
des
lysosomes
sont
libérées dans le milieu
(Wor,>·x
et
BusEr&dquo;
rg6q. ;
F!,nrrAGArr,
19 66).
Aussi nous
sommes-nous demandés
si
dès leur
synthèse
les virions ne subissaient
pas
des altérations
et
si,
plus que
toute
autre,
la
protéine
VPi,
dont nous avons reconnu
l’importance
pour l’immunogénicité
virale,
n’était
pas dégradée
ou
décapée
de la surface virale.
Nous
présentons
ici une
comparaison, quant
à la teneur en différentes classes
de
protéines,
de virus récolté
très
précocement
dans
le
cycle
viral au sein d’une
population
de
cellules
non
encore
lysées
(conditions
de
cycle
unique
de
réplication)
et
de
virus
ayant
subi
une
incubation
avec le
lysat
cellulaire,
tel
qu’il
est libéré
après
quelques cycles
de
réplication.
Nous
mettons
en
évidence une évolution
significative
de
la
composition
moyenne
en
protéines
des virions
au contact
des
produits
de la
lyse
cellulaire,
se
traduisant notamment
par
une
nette
diminution de
la
classe
VPi.
MATÉRIEL
ET
TECHNIQUES
Le
virus
Le
virus
utilisé
dans cette
étude
est un
mutant de
type
0
récemment
isolé
au
laboratoire
en culture cellulaire
(S TOESSEL , 1974 )
et cloné
par
la
technique
d’étalement des
plages
en
milieiu
gélifié (LA
B ONNARDI È RE ,
1971 ).
Ce
mutant,
résistant
à
la dose de sulfate
de dextrane
qui
réduit
le titre
du
virus 0
de
référence
par
un facteur
10 4
à
io 5,
présente
un
cycle
de
réplication
court :
le
plateau
de
production
d’UFP
est atteint
dès
5
heures
après
le début de
l’infection.
C’est un
virus
à
capside
solide,
selon
la classification d’Asso
(i96!),
avec trois classes
de
protéines
de masses
moléculaires
respectivement 34 00 o pour
VP I,
29 00 o
pour
VP 2 et
VP 3, r4 00 o
pour
VP 4.
S TOESSEL
a montré
que
le
caractère
de
résistance
au
sulfate
de dextrane est
associé
à une
confi-
guration
externe de la
capside
distincte
de celle du
virus de référence. Par des
passages
successifs
en
culture
cellulaire
associés
à une récolte
précoce
nous avons
pu
éliminer
toute
contamination
par
un virus
à
cycle
long.
Le virus est
multiplié
sur
tapis
de cellules BHK
21 ,
titré selon
la méthode
de
LA
BorrNna-
DI È RE
( 1971 )
sur cellules
du
clone S
13 ,
ce
qui permet
de vérifier
l’homogénéité
de
chaque prépa-
ration
pour
la vitesse de
réplication
(taille
des
plages)
et la résistance au sulfate de dextrane
(titrage
en
présence
et
en
absence
de
la
drogue
à
la dose
critique
dans
le milieu
gélifié).
Conditions
de
pvoduction
du virus «
précoce
»
et du
virus
o
tardif
»
marqués
radioactivement
Des cellules
BHK
21
ont
été
multipliées jusqu’à
confluence
dans des bouteilles
roulantes
de
2 litres
(environ 400
X
io 6 cellules
par
bouteille)
en
milieu
MEM
d’Eagle
modifié selon STOKER
et McPx E xsorr
( 19 61)
en
présence
de
tryptose
et de
sérum de
Veau
(io p. 100 ).
Le milieu de

culture est
remplacé
pendant
deux
heures
par
du milieu salin d’Earle
tamponné
en
Tvis ;
les
bouteilles sont
vidées
et un
inoculum
de 10
ml
de virus
par
bouteille
(titrant
5
X
io a
UFP/ml)
est
étalé en un film
juste
mouillant sur le
tapis
cellulaire ;
dans ces
conditions,
la
multiplicité
d’infection
est
voisine
de
10
UFP/cellule
et toutes les cellules sont
infectées.
Après
un
contact
de
15
minutes
à
37°C
le
surnageant
d’inoculation est éliminé
et
remplacé par
25
ml de solution
saline
d’Earle,
tamponnée
en
Tris,
enrichie
en acides aminés
marqués
radioactivement
au
carbone
l ’C
(hydrolysat
de
chlorelle,
CEA
Saclay),
l’activité étant de
i microcurie
par
millilitre
de milieu.
Le
pH
est
maintenu
à
7,4
par
addition
de
Tris
molaire.
Le
virus dit o
précoce
»
est
récolté 4
h 30 après
le début de
l’infection.
Le virus
dit
t!
tardif
,>
est laissé en incubation
zq
heures
après
le
début de
l’infection ;
on
peut
considérer
qu’il
a
été
produit
en
totalité dès le
premier cycle
de
réplication,
les cellules étant
pratiquement
toutes infec-
tées dans
nos conditions
d’adsorption ;
le
contact du
virus
avec
le
lysat
cellulaire
à
37°C
est
donc
d’environ
15
à
20
heures.
Concentration
et
purification
du
virus
Toutes
les
opérations
s’effectuent dans la
glace
fondante ou dans
des
appareils
réfrigérés
à
4 0C
pour bloquer
le
plus possible
l’activité des
enzymes
cellulaires. Les
bouteilles
sont
alterna-
tivement
congelées
et
décongelées pour
récolter les cellules
infectées,
leur
surnageant
et leurs
débris et libérer le virus
inclus
dans
le
matériel
cellulaire. Les
débris
cellulaires
sont
séparés par
centrifugation à 4 ooo
tr/mn
sur une
centrifugeuse
Sorvall
RC 3
rotor
HG- 4 L,
pendant
io
minutes,
à
40 C.
Les
culots sont
repris
dans
un
petit
volume de
milieu
salin
glacé
et
homogénéisés
au
Dounce
dans la
glace
fondante
pour
extraire
le
plus
de virus
possible. Après
centrifugation,
dans
les mêmes
conditions,
des
suspensions
homogénéisées,
ces
surnageants
sont
ajoutés aux premiers
pour
être
soumis à
concentration
par
le PEG
(polyéthylène glycol,
PM 6
000) ;
le PEG est
ajouté
à l’état
solide dans la
solution clarifiée à une concentration finale de io
p.
100
(p/v)
et
la dissolution
s’effec-
tue
en
quelques
minutes à
la
glace
fondante
sous
agitation
douce ;
le
mélange
est
laissé
i
heure
en
agitation
à
ooC. Le
précipité
est recueilli
par
centrifugation
à
5
ooo
tr/mn pendant
15
minutes,
puis homogénéisé
au Dounce
dans la
glace
fondante
dans
un volume de
tampon
Tvis-HCl
0,08 M,
NaCl
o, 2 M,
pH 7 ,6
correspondant
au
i/io
du
volume de la
solution
initiale.
Après
une
nuit
d’agitation
douce à
oo C,
les
débris
non solubilisés
sont éliminés
par
une nouvelle
centrifugation
dans
les
mêmes conditions.
Après
concentration des
produits
du
lysat
cellulaire,
on
procède
à
la
purification
du virus
et à sa
séparation
des
protéines
cellulaires
par centrifugation isopycnique
en
chlorure
de
césium.
La densité de la solution virale
concentrée
est
ajustée
à
1,46
ou
1,47 par adjonction
de
chlorure
de
césium
cristallisé,
ce
qui
est
contrôlé
par
mesure
de
l’indice
de
réfraction
à
25°C
au
réfracto-
mètre d’Abbe. Ces
préparations
sont
centrifugées
dans
des tubes
de
5
ml sur le
rotor
SW
65
d’une
ultracentrifugeuse Spinco
L2
65B
à 55
ooo
tr/mn pendant
18 à 20 heures à
40 C.
La collecte
de ces
gradients
de
densité
se
fait
à
l’aide d’un
collecteur
de
gradients
Isco,
par
fractions
de
0,3
ml.
Sur chacune des fractions une
partie aliquote
de
10
!tl
est
prélevée
et
comptée
en
liquide
de
scin-
tillation de
Bray
sur un
compteur Intertechnique
SL
30 ;
une autre
partie
de 10
!1
sert
à
établir
la forme du
gradient
de densité
par
lecture des indices de réfraction.
Analyse
des
protéines
virales
en
gel
de
palyacvylamide-SDS
Les
fractions
de
virus
purifié
sont dénaturées
sans
dessalage par adjonction
de
10
p.
ioo
(v/v)
d’une
solution d’urée
6
M,
SDS
10
p.
ioo en
tampon phosphate
de
sodium
0,1 M,
pH
7,2
et
portées
à
ébullition
pendant
5
minutes.
i
p.
ioo
de
2 -mercaptoéthanol
est
ajouté
dans la solu-
tion
chaude,
le
tout est laissé
à
refroidir doucement. Une
dialyse
de
15
heures à
la
température
ambiante
permet d’équilibrer
les
échantillons en
tampon phosphate
0, 01 M,
urée
o, 5
M,
SDS
0,1
p.
roo,
2-mercaptoéthanol
0,1
p.
100 ,
pH
7,1.
Les
gels,
à
la concentration de
10
p.
100
en
acrylamide,
sont
préparés
suivant la
technique
de
S HAPIRO
et
al.,
19 67.
Les
gels
de 8 cm
de
long
sont
coulés
dans des
tubes
cylindriques
de
0, 55
cm
de
diamètre. Les échantillons dénaturés sont
déposés
au
sommet
du
gel
en
présence
d’un indi-
cateur
de
migration,
le
bleu de
bromophénol.
La
migration
s’effectue
pendant 7
à
8 heures sous
une
intensité
de mA
par
gel (4 Volt/cm).
Les
gels
sont
découpés automatiquement
en tranches
de
i
millimètre
par
un
fractionnateur de
gels
Gilson ;
les fractions
broyées
sont
comptées
en
liquide
de
Bray.
Estimation
des
quantités
relatives
des
pvotéines capsidiaives
Les
quantités
relatives
des
diverses classes de
protéines
sont déduites
des courbes de distri-
bution
de la
radioactivité
en
gel
SDS
par
estimation
des aires
correspondant
à
chaque pic
de
masse
moléculaire,
par
des méthodes
graphiques
ou
arithmétiques. Auparavant
a été établie
une courbe

moyenne
des résultats
obtenus avec différentes
préparations
et
par répétition
de
plusieurs
électrophorèses :
les
profils
obtenus
par
la
répétition
de
migrations
indépendantes
sont
norma-
lisés
en
distances
de
migration
et en échelles de radioactivité
et
pour
chaque
fraction une
estimation
moyenne
de radioactivité
est
calculée,
permettant
de construire
la
courbe
moyenne.
RÉSULTATS
Les
résultats
des
expériences
effectuées sur
les deux
types
de
virus,
précoce
ou
tardif,
sont
des
données
moyennes
correspondant
à
des
répétitions
du
protocole
décrit :
trois
préparations
indépendantes
de virus
précoce
et de virus
tardif ont été
réalisées
avec des cellules BHK 21
de
lots
différents ;
les virus ainsi
produits
ont été
soumis
à des
protocoles
de
dénaturation
répétés
et
chaque produit
de ces dénatura-
tions a été
analysé par plusieurs
électrophorèses.
I.
-
Modification
de la densité
du virus
Les
profils
de sédimentation
des virus
précoce
et tardif
sont
donnés
sur
la
figure
1.
Le
virus sédimente
dans les deux cas
sous
forme
d’un
pic
très
aigu.
La
densité
du virus
précoce
est
comprise
entre
1,460
et
1, 475 ;
celle
du virus
tardif
entre
1,5 00
et
1 ,520 .
Les
sommets
de ces
pics
ont été
analysés
en
gel
de
polyacrylamide
SDS.