L`herpesvirus aviaire de la maladie de Marek

cas-image
L’herpesvirus aviaire de la maladie de Marek :
discordance entre infectiosité et particules virales
physiques observées en microscopie électronique
C. Denesvre
C. Blondeau
Laboratoire de virologie moléculaire,
INRA, UR1282,
Infectiologie animale et Santé publique,
IASP, 37380 Nouzilly
<[email protected]>
Le virus de la maladie de Marek aussi appelé Gallid herpesvirus de type 2,
est un alpha-herpesvirus, qui présente des propriétés biologiques parti-
culières par rapport aux autres virus de cette sous-famille : oncogénicité,
tropisme pour les lymphocytes et infectiosité strictement associée aux cellules
vivantes en culture cellulaire. Ce virus pour lequel on n’a jamais détecté
d’infectiosité dans les surnageants de culture se propage cependant efficace-
ment en culture cellulaire. Les infections ne peuvent donc être réalisées que par
coculture à partir de cellules infectées vivantes. De ce point de vue, le MDV est
très proche d’un autre alphaherpesvirus, le virus humain de la varicelle et du
zona (VZV). Cependant, à la différence du VZV, il n’est même pas possible
actuellement d’obtenir des particules de MDV infectieuses à partir de lysats de
cellules infectées. Cela a une conséquence directe dans le procédé de fabrication
des vaccins MDV homologues utilisés en élevage aviaire. En effet, ceux-ci sont
constitués de cellules infectées et doivent donc être conservés en azote liquide.
Afin de mieux comprendre à quoi attribuer cette infectiosité restreinte du MDV,
nous avons entrepris d’étudier la morphogenèse de ce virus, jamais décrite
jusqu’alors.
Les herpesvirus présentent un processus de morphogenèse
complexe et unique au sein des virus enveloppés, débattu
depuis plusieurs années. Le processus le plus couramment
admis est celui du double enveloppement : les nucléocap-
sides assemblées dans le noyau bourgeonnent au niveau de
la membrane nucléaire interne dans l’espace périnucléaire
des cellules infectées. Les virions issus de ce premier
enveloppement, aussi appelés virions primo-enveloppés,
fusionnent avec la membrane nucléaire externe libérant
ainsi des capsides « nues » dans le cytoplasme. Ces capsi-
des s’enveloppent enfin une seconde fois au niveau du
complexe de Golgi, du réseau trans-golgien ou des endo-
somes. Les particules enveloppées matures sont alors
exportées vers la surface cellulaire et libérées dans le milieu
extérieur. L’ensemble de ce processus est très bien décrit et
discuté dans plusieurs revues [1, 2].
Afin d’étudier la morphogenèse du MDV, nous avons pro-
duit un MDV recombinant fluorescent dont la protéine de
tégument VP22 était fusionnée à la protéine fluorescente
EGFP. La VP22 est spécifique des alpha-herpesvirus et
aucune mutation dans cette protéine n’a jamais été associée
à une inhibition de la formation des particules virales. Ce
virus recombinant, qui se réplique efficacement en culture
Tirés à part : C. Denesvre
Figure 1.Vue par microscopie à épifluorescence de cellules
primaires de poulet infectées par un virus recombinant de la
maladie de Marek, le Bac20 EGFPVP22. Ce virus exprime une
protéine de tégument VP22, codée par le gène UL49, fusionnée en
N-terminal à la protéine fluorescente, GFP. Les cellules ont été
triées par cytométrie de flux sur la base de la fluorescence verte et
ré-ensemencées sur des lamelles de verre pendant 1 h 30 avant
fixation. Les images ont été prises avec un microscope Zeiss
équipé d’un système apotome. Les cellules triées sont positives
pour la protéine majeure de capside. Le niveau d’expression de la
protéine VP5 et sa localisation montrent que les cellules triées sont
à un stade tardif du cycle viral. VP22, vert ; VP5, rouge ; ADN,
bleu. barre, 20 lm.
Virologie 2007, 11 (6) : 471-3
doi: 10.1684/vir.2007.0133
Virologie, Vol. 11, n° 6, novembre-décembre 2007 471
Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 26/05/2017.

cellulaire, nous a permis de trier par cytométrie en flux les
cellules infectées à un stade tardif d’infection (figure 1)
pour les étudier en microscopie électronique à transmis-
sion. Grâce à cette méthode d’enrichissement cellulaire,
plus de 90 % des cellules observées en TEM présentaient
au moins une capside virale intracellulaire (figure 2).
Aucune particule virale extracellulaire n’a pu être détectée
à partir de ces cellules bien que toutes les autres formes
virales l’aient été. Nous avons dénombré dix fois moins de
capsides nues dans le cytoplasme que dans le noyau. De
plus, les particules virales cytoplasmiques enveloppées,
comme celle présentée dans la figure 3, se sont révélées très
rares. Cela est très différent des autres alphaherpesvirus,
pour lesquelles de nombreuses particules virales envelop-
pées sont visibles dans le cytoplasme de chaque cellule
mais aussi dans le milieu extracellulaire. Ainsi nous avons
montré que le MDV semble déficient pour trois étapes
cruciales de la morphogenèse virale : la sortie du noyau, le
second enveloppement et le processus d’exocytose [3].
Afin d’augmenter nos chances de visualiser des particules
virales extracellulaires, nous avons récemment analysé la
surface de ces cellules infectées triées par microscopie
électronique à balayage. Nous n’avons observé aucune
image évoquant des particules d’herpesvirus à la surface
des cellules comme c’est le cas avec le VZV dans certaines
cellules [4].
Bien que nous n’ayons observé aucune particule virale de
MDV par ces deux techniques de microscopie électronique,
nous ne pouvons affirmer l’absence totale de telles particu-
les en culture de cellules. Néanmoins, si elles existent, ces
particules doivent être très peu nombreuses. Ces résultats
sont en accord avec les propriétés biologiques du MDV en
culture cellulaire, comme l’absence d’infectiosité à partir
*
*
*
*
*
**
go
2 µm
2 µm
2 µm
go
N
C
0.5 µm
0.5 µm
0.5 µm
Figure 2. Vue en microscopie électronique à transmission (MET) d’une cellule primaire de poulet infectée par le virus Bac20 EGFPVP22.
Les cellules infectées fluorescentes ont été triées par cytométrie avant leur préparation pour la MET. Des capsides nues sont visibles dans
le noyau et le cytoplasme et indiquées par des astérisques rouges. Aucune particule enveloppée (périnucléaire, cytoplasmique ou
extracellulaire) n’est visible sur cette section. N, noyau ; C, cytoplasme ; go, complexe de Golgi. L’encadré montre des capsides
cytoplasmiques nues à plus fort grossissement, dont deux de type C (têtes de flèche rouges).
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Virologie, Vol. 11, n° 6, novembre-décembre 2007 472
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des surnageants et des lysats de cellules infectées. En
revanche, ces résultats semblent en contradiction avec une
réplication virale efficace et laissent penser que, en culture
cellulaire, l’infection par le MDV se fait exclusivement par
passage de cellule à cellule.
Remerciements. C. Blondeau a été financée par une bourse
doctorale de la région Centre. Les auteurs remercient tous les
membres de la plateforme RIO de microscopie de la faculté de
médecine de Tours pour leur contribution dans ce travail. Nous
remercions également la région Centre pour son soutien. Les
auteurs sont membres de l’IFR136.
Références
1. Mettenleiter TC. Herpesvirus assembly and egress. J Virol 2002 ; 76 :
1537-47.
2. Campadelli-Fiume G, Gianni T. HSV glycoproteins and their roles in
virus entry and egress. In : Sandri-Goldin RM, ed. Alpha herpesviruses.
Norfolk, UK : Caister Academic Press, 2006.
3. Denesvre C, Blondeau C, Lemesle M, et al. Morphogenesis of a highly
replicative EGFPVP22 recombinant Marek’s disease virus (MDV) in cell
culture. J Virol 2007 ; (in press).
4. Harson R, Grose C. Egress of varicella-zoster virus from the melanoma
cell : a tropism for the melanocyte. J Virol 1995 ; 69 : 4994-5010.
Figure 3. Vue en MET d’une particule virale cytoplasmique enve-
loppée mature située dans une vésicule. Ce type de particules a
été rarement trouvée sur l’ensemble des sections observées. La
taille de cette particule enveloppée est de 230 nm x 195 nm. barre,
0,2 lm.
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