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CHAPITRE IV. EFFETS DU THROMBOXANE A2 SUR LES PARAMETRES
VASCULAIRES SYSTEMIQUES
IV.1. INTRODUCTION
Dans l’introduction de ce travail, nous avons rappelé que la régulation du tonus vasculaire par
l’endothélium s’effectue via la libération de nombreux facteurs de relaxation et de contraction
des cellules musculaires lisses sous-jacente. A l’état physiologique, la production vasculaire
de TXA2 est faible et surtout d’origine plaquettaire (Moncada & Higgs, 1986 ; Smith et al.,
1986). Dans ces circonstances, le TXA2 interviendrait surtout dans la régulation de
l’hémostase (Chan et al., 1986 ; Moncada & Higgs, 1986 ; Halushka et al., 1995 ). Cependant,
de part son effet vasoconstricteur, le TXA2 pourrait intervenir dans la modulation de la
vasomotricité.
L’inhibition de la thromboxane synthase (TXS) ou le blocage du récepteur TP dans certaines
études sur des humains et animaux normotendus, n’entraînaient pas d’altération significative
de la pression artérielle, suscitant des interrogations sur le rôle exact du TXA2 dans la
régulation du tonus vasculaire et de la pression artérielle (Chan et al., 1986 ; Moncada &
Higgs, 1986 ; Smith et al., 1986 ; Nasjletti & Baer, 1988 ).
Wilcox et al. suggèrent un rôle du récepteur TP dans la régulation de la pression artérielle et
des variations hémodynamiques dans divers modèles d’hypertension, d’artériopathie et de
choc (Wilcox et al., 1991). Le TXA2 serait impliqué dans la régulation du débit sanguin rénal,
l’élimination rénale de sodium (Baylis et al., 1987 ; Remuzzi et al., 1992 ; Welch & Wilcox,
1992), et l’interaction avec le système rénine-angiotensine (Lin et al., 1991 ; Nasjletti &
Arthur, 1998). En effet, une action combinée de l’angiotensine II et du TXA2 entraînerait une
vasoconstriction rénale et systémique, une épargne sodique au niveau rénal, et une stimulation
de la prolifération des cellules musculaires lisses des parois vasculaires (Sachinidis et al.,
1995). D’autres endoperoxides dont le PGH2, seraient également impliqués dans le contrôle
de la pression sanguine puisqu’on notait dans une étude expérimentale chez des souris
dépourvues du gène de la TXS, une élévation paradoxale de la pression sanguine après
administration d’arachidonate ; effet supprimé par l’administration préventive d’un
antagoniste du récepteur TP (I-Shing et al., 2004).
Ces données suggèrent ainsi une implication potentielle du TXA2 et d’autres endoperoxides
dans la pathogénie de l’hypertension, par action au niveau du récepteur TP (Francois et al.,
2004). Toutefois, les effets vasomoteurs précis du TXA2 ainsi que les mécanismes
physiologiques qui les soutendent in vivo sont peu connus.
Objectif de l’étude
L’objectif principal de cette étude expérimentale est donc d’évaluer les effets du TXA2 sur les
paramètres hémodynamiques systémiques dans un modèle in vivo d’hypertension systémique.
Dans cette optique, nous avons étudié les effets d’un de ces plus puissants agonistes, l’U46619, sur l’hémodynamique systémique avant et après administration du BM-573 chez le
porc. La circulation systémique est représentée par un modèle windkessel à 4 éléments.
(Grant et al., 1987 ; Lambermont et al., 1999 ; Lambermont et al., 2003b).
IV.2. MATERIELS ET METHODES
IV.2.1. Préparation chirurgicale
Les expériences sont réalisées sur 12 porcs sains de race pure piétrain, des deux sexes et
pesant entre 20 et 30 kgs. Les animaux sont préparés et équipés selon les modalités décrites
dans les méthodes générales (Chapitre III).
IV.2.2. Préparation chimique
U-46619 (Cayman chemical, Ann Arbor, MI) est mis en solution alcoolique et dilué dans du
NaCl 0.9% , afin d’obtenir une solution finale de 10 µg/ml. Le BM-573 est fourni par le
Laboratoire de Chimie pharmaceutique de l’Université de Liège. Il est dilué dans du
propylène glycol afin d’aboutir à une concentration de 20 mg/ml. Nous avons démontré que
la solution de propylène glycol n’avait aucun effet sur les paramètres hémodynamiques et
agrégométriques (Rolin et al., 2003 ; Ghuysen et al., 2004].
IV.2.3. Protocole expérimental
Après une période de stabilisation de 30 minutes, les animaux sont repartis de façon aléatoire
en deux groupes. Dans le premier groupe (n=6) (groupe agoniste), les animaux reçoivent six
injections consécutives d’une même dose de U-46619 (1,25 µg/kg) à 30 minutes d’intervalle.
Les injections de U-46619 sont répétées toutes les 30 minutes en raison de caractéristiques
spécifiques de cet agoniste décrits notamment par Fiedler et al. (Fiedler et al., 1990).
Brièvement, une administration unique de U-46619 (1,25 µg/kg) chez le porc entraîne une
élévation transitoire de la pression artérielle. Cet agoniste étant rapidement métabolisé, la
pression artérielle et les autres paramètres hémodynamiques retournent aux valeurs basales
après une vingtaine de minutes. De ce fait, nous avons opté pour des injections répétées de U46619 toutes les 30 minutes, parce qu’elles n’entraînent pas d’effets cumulés. Un protocole
similaire est d’ailleurs utilisé dans l’évaluation des effets dose-dépendant d’un antagoniste du
thromboxane A2 (Bay-U-3405). Les données hémodynamiques sont enregistrées avant chaque
injection de U-46619 (T0), 2 (T2) et 15 minutes (T15) plus tard. Les paramètres enregistrés
inclus la pression artérielle pulmonaire (PAP), le débit cardiaque systémique (CO), la pression
auriculaire gauche, la pression artérielle systémique (BP) et la fréquence cardiaque (FC).
Dans le deuxième groupe (n=6) (groupe antagoniste), des doses croissantes de BM-573 sont
administrées par voie intraveineuse 10 minutes avant chaque administration de U-46619, à
l’exception de la première. Les animaux reçoivent donc 0,125 mg/kg de BM-573 avant la
deuxième, 0,250 mg/kg avant la troisième, 0,500 mg/kg avant la quatrième, 1/mg/kg avant la
cinquième et 2 /mg/kg avant la sixième injection de l’agoniste (U-46619). Dans ce groupe, les
paramètres hémodynamiques sont enregistrés avant chaque administration de l’antagoniste
(Anta 0, Anta 0,125, Anta 0,25, Anta 0,5, Anta 1, Anta 2), 10 minutes plus tard (ce qui
correspond à la période qui précède l’administration de l’agoniste) (T0), et 2 (T2) et 15
minutes (T15) après l’administration de U-46619.
Dans les deux groupes, les séquences d’administration de l’agoniste et d’enregistrement des
données (T0, T2, T 15) sont appelées respectivement Run 0,125, Run 0,250, Run 0,500, Run
1, Run 2 en fonction de la dose d’antagoniste administrée.
L’acquisition et l’analyse des données sont réalisées selon la méthodologie décrite au
Chapitre III.
IV.2.4. Etude de l’agrégation plaquettaire ex-vivo et mesure des taux de BM-573
Le potentiel anti-plaquettaire du BM-573 est déterminé selon une méthode précédemment
décrite (Dogne et al., 2000). Les porcs ne sont pas traités ni par aspirine, ni par AINS.
Brièvement, le sang est prélevé dans des tubes contenant 1 :9 de citrate (concentration finale
0,38%). Le plasma riche en plaquettes (PRP) est obtenu de la fraction soluble après
centrifugation de la solution pendant 20 minutes à 90 g (25°C). La fraction restante est
centrifugée à 1200 g pendant 10 minutes (25°C) et sa portion soluble fournit le plasma pauvre
en plaquettes (PPP). La concentration plaquettaire du PRP est ajustée à 3.108 cells/ml par
dilution avec du PPP. Les tests d’agrégation sont effectués selon la méthode turbidimétrique
de Born à l’aide d’un agrégomètre à 4 canaux (bioData Corporation, PAP4) (Born et al ;
1963). Le PPP est utilisé pour ajuster les mesures photométriques à la densité optique
minimale. Le PRP (225 µl) est introduit dans une cuvette et agité (1100 rev/min).
L’agrégation plaquettaire est initiée par l’addition de 5/µl d’acide arachidonique (600 µM de
concentration finale) ou 1 /µl d’ADP (5 µM de concentration final) ou 1/µl de collagène (1
µg/ml de concentration finale). Afin d’évaluer l’agrégation plaquettaire, l’augmentation
maximale dans la transmission de la lumière (amplitude de l’agrégation plaquettaire) est
déterminée à partir de la courbe d’agrégation six minutes après l’addition de l’inducteur. Les
mesures de BM-573 sont effectuées sur les échantillons sanguins en utilisant une technique
ultra-performante de chromatographie en phase liquide (HPLC).
IV.2.5. Analyse statistique
Les données sont exprimées en termes de moyenne ± erreur type de la moyenne (SEM). La
comparaison inter-groupe à des moments spécifiques, de même que les tests intra-groupe pour
les différences statistiques aux différents moments sont effectués en utilisant un test de
Wilcoxon (Mann-Whitney) non-paramétrique et bivarié.
Les résultats des tests statistiques sont considérés comme significatifs au niveau d’incertitude
de 5 %. Ainsi, des valeurs de p<0.05 indiquent une différence inter ou intra-groupe (en
fonction de la situation analysée).
IV.3. RESULTATS
IV.3.1. Variables hémodynamiques conventionnelles
L’évolution au cours du temps des données hémodynamiques conventionnelles dans les deux
groupes est représentée dans la Figure IV-1.
Groupe Agoniste
Du Run 0 au Run 0,250, on ne note pas de variation significative de la fréquence cardiaque
(FC) après l’injection de U-46619 ; au Run 0,5, on note une évolution particulière c’est à dire
une tachycardisation continue de T0 à T15 (p=0,14) . La FC augmente de façon significative
(p<0.05) de 129±10 bat/min (T0) à 145±9 bat/min (T2) au Run 1, et de 119±3(T0) à 162±15
bat/min (T2) au Run 2.
Le débit cardiaque moyen (Qmoy ) décroît de 78 ± 1.8 ml/s (T0) à 62.6±2.2 ml/s (T2) (p<0.05)
après l’administration de U-46619 au Run 0. Cette diminution s’aggrave au cours du temps, et
Qmoy décroît dans le dernier Run de 61.6±1.8 ml/s (T0) à 55.6±2.2 ml/s (T2) (p<0.05).
On ne note pas de variation significative de la pression moyenne (Pmoy) après l’administration
de U-46619 du Run 0 au Run 2.
Groupe Antagoniste
On ne note aucune différence significative entre les groupes ago et anta au Run 0 pour toutes
les variables hémodynamiques conventionnelles.
Dans chaque Run, FC et Qmoy ne varient pas après les injections de U-46619 qui suivent celles
de BM-573.
On ne note pas de variation significative de Pmoy après l’administration de U-46619 du Run 0
au Run 2.
FC
200
180
160
140
bat/min
120
100
80
60
40
20
5
T2
T1
2
An
ta
T0
5
T2
T1
1
T0
An
ta
5
T1
T0
T2
0,
5
5
An
ta
T2
T1
0
0,
25
T0
5
An
ta
T2
T1
5
0,
12
T0
5
An
ta
T1
T0
T2
0
Qmoy
90
80
70
60
ml/s
50
40
30
20
10
0
T0
T15
Anta
0,125
T2
T0
T15
Anta
0,5
T2
T0
T15
Anta
2
T2
Pmoy
140
120
100
mmHg
80
60
40
20
0
T0
T15
Anta
0,125
T2
T0
T15
Anta
0,5
T2
T0
T15
Anta
2
T2
Figure IV-1. Evolution au cours du temps des variables hémodynamiques conventionnelles
dans le groupe Ago (cercle noir) et dans le groupe Anta (carré blanc) avant (T0), 2 min (T2),
et 15 min (T15) après l’injection de U-46619 dans les groupes Ago et Anta et, dans le groupe
Anta, avant l’administration de BM-573 (Anta 0,125, Anta 0,250, Anta 0,500, Anta 1, Anta 2,
en fonction des doses de BM-573 injectées (mg/kg)). FC, fréquence cardiaque; Qmoy, debit
cardiaque moyen; Pmoy., Pression aortique moyenne.
IV.3.2. Paramètres hémodynamiques systémiques
L’évolution au cours du temps des paramètres vasculaires systémiques fournis par le modèle
windkessel (WK4) est représentée dans la Figure IV-2.
Groupe agoniste
Au Run 0, on note une élévation des résistances vasculaires périphériques (R2 ) de 0,91±0.09
(T0) à 1,32±0,04mmHg.sec/ml après l’administration de U-46619 (T2) (p<0,05), sans retour
complet à la valeur basale à T15 (p<0,05). Au cours des Run suivants, R2 augmente de T0 à
T2 avec retour aux valeurs basales à T15.
L’élastance artérielle effective (Ea ) suit la même évolution que R2. Il augmente à T2 après
l’injection de U-46619 et retourne aux valeurs basales à T15, sauf au cours du dernier Run.
On observe une diminution de la compliance vasculaire (C) et de l’impédance caractéristique
(R1 ) au cours des premiers Runs après l’administration de U-46619 (T2) (p<0,05). Mais
aucune variation significative de ces deux paramètres n’est observée au cours des Run
suivants.
Groupe Antagoniste
Du Run 0.250 au Run 2, on ne note pas de variation de R2 et Ea après l’injection de U-46619.
C et R1 montrent une diminution durant les premiers Runs après l’administration de U-46619
(T2), mais ne varient pas de façon significative dans les autres Runs.
C
1,4
1,2
ml/mmHg
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
T0
T15
Anta
0,125
T2
T0
T15
Anta
0,5
T2
T0
T15
Anta
2
T2
T15
T2
T0
Anta 2
T15
T2
T0
Anta 1
T15
T2
T0
Anta 0,5
T15
T2
T0
Anta 0,250
T15
T2
T0
Anta 0,125
T15
T2
T0
mmHg.s/ml
R1
0,12
0,1
0,08
0,06
0,04
0,02
0
R2
3,00
2,50
2,00
1,50
1,00
0,50
0,00
Ea
9,00
8,00
7,00
mmHg/ml
6,00
5,00
4,00
3,00
2,00
1,00
T15
T2
T0
Anta 2
T15
T2
T0
Anta 1
T2
T15
T0
Anta 0,5
T15
T2
T0
Anta 0,250
T15
T2
T0
Anta 0,125
T2
T15
T0
0,00
Figure IV-2. Evolution au cours du temps des paramètres hémodynamiques dérivés du modèle
de windkessel à 4 éléments dans le groupe Ago (cercle noire) et le groupe Anta (carré blanc)
avant (T0), 2 min (T2), et 15 min (T15) après l’injection de U-46619 dans les groupes Ago et
Anta et, dans le groupe Anta , avant l’injection de BM-573 (Anta 0,125, Anta 0,250, Anta
0,500, Anta 1, Anta 2, en fonction de la dose de BM-573 injectée (mg/kg)). R1, impédance
caractéristique ; C, compliance vasculaire ; R2, résistance vasculaire périphérique ; Ea,
élastance artérielle effective.
IV.3.3. Etude de l’agrégation plaquettaire ex-vivo et mesures du BM-573
Les effets du BM-573 sont étudiés sur l’agrégation plaquettaire induite par l’acide
arachidonique, le collagène et l’adénosine diphosphate (ADP). La figure IV-3 illustre bien
que l’administration de U-46619 dans les conditions basales (basal + U-46619) n’a aucun
effet sur l’agrégation plaquettaire provoquée par les trois inducteurs mentionnés plus haut.
L’agrégation plaquettaire est maximale et irréversible. Dix minutes après l’administration de
0,125 mg/kg de BM-573 (Run 0,125), on observe une légère diminution dans l’amplitude de
l’agrégation plaquettaire quand l’acide arachidonique est utilisé comme inducteur, alors que
l’agrégation induite par l’ADP et le collagène reste maximale. Après l’administration de doses
de BM-573 supérieures ou égales à 0,250 mg/kg (Run 0,250, Run 0,500, Run 1 et 2),
L’agrégation plaquettaire induite par l’acide arachidonique est complètement inhibée. Au
cours des mêmes Run, l’agrégation provoquée par les autres inducteurs (ADP et collagène)
diminue légèrement mais demeure maximale et irréversible.
Les concentrations plasmatiques de BM-573 sont déterminées après chaque injection de BM573. Les résultats sont représentés à la Figure IV-4. Les taux plasmatiques de BM-573
augmentent pour atteindre un maximum de 13,3 µg/ml après le Run 2. Trente minutes après
le Run 2, la concentration plasmatique de BM-573 décroît à 1,6 µg/ml.
amplitude de l'agrégation plaquettaire
60
AA
ADP
Collagène
50
40
30
20
10
2 mg/kg
1 mg/kg
0,5 mg/kg
0,25 mg/kg
0,125 mg/kg
basal+46619
basal
0
Figure IV-3. Effets du BM-573 sur l’agrégation plaquettaire induite par l’acide arachidonique
(AA), le collagène et l’adénosine diphosphate (ADP).
concentration plasmatique (µg/ml)
16
14
12
10
8
6
4
2
0
0,125
0,25
0,5
1
2
2 + 30min
Dose de BM-573 injectée (mg/kg)
Figure IV-4. Evolution des concentrations plasmatiques de BM-573 après chaque injection.
IV.4. DISCUSSION
Cette partie de notre travail vise à mieux comprendre les effets vasomoteurs du TXA2 in vivo
en étudiant les effets d’un de ses agonistes (U-46619), sur les paramètres vasculaires
systémiques avant et après administration de BM-573 chez le porc.
On constate que les injections de U-46619 induisent une nette élévation des résistances
vasculaires systémiques (R2), associée à une diminution de la compliance vasculaire
systémique (C). L’impédance caractéristique (R1), qui reflète les propriétés élastiques de
l’aorte, est moins affectée par l’injection de U-46619. Le résultat global de l’effet sur ces
paramètres élémentaires est une élévation significative de la postcharge ventriculaire gauche
exprimée par l’élastance artérielle (Ea). L’administration de BM-573 bloque complètement
cette élévation de Ea et stabilise Pmoy et Q moy aux doses supérieures ou égales à 0,500 mg/kg.
Dans une précédente étude portant sur des rats chez lesquels le gène codant pour les
récepteurs TP avait été supprimé, l’administration intraveineuse de U-46619 entraînait une
élévation transitoire de la pression artérielle systémique, suivie d’un collapsus
cardiovasculaire chez les rats sauvages. Toutefois, U-46619 n’entraînait pas de modification
des paramètres hémodynamiques chez les rats dénués du gène codant pour les récepteurs TP,
suggérant ainsi que les effets observés impliquaient exclusivement les récepteurs TP (Thomas
et al., 1998). Une autre étude sur des lapins, avait démontré que des injections de U-46619
par l’oreillette gauche entraînaient une chute de la pression artérielle systémique et une
bradycardie par stimulation des branches cardiaques afférentes du nerf vague (Wacker et al.,
2002). Dans notre étude, Pmoy augmente pendant les premiers Run après les injections de U46619, et décroît ensuite aux Run 1 et 2, chute qui entraîne une tachycardie compensatrice.
De plus, l’administration de U-46619 induit dans tous les Run une diminution transitoire du
débit sanguin moyen systémique (Qmoy), qui peut s’expliquer par l’élévation significative de
la postcharge du ventricule gauche (Ea). Dans une étude portant sur les effets de la coarctation
aortique sur les performances ventriculaire gauche, on observait une chute similaire du Qmoy
quand le ventricule gauche était confronté à une élévation des résistances vasculaires
proximales et distales (R1 et R2) (Kolh et al., 2003).
Rappelons que Lambermont et al. ont mis en évidence une élévation des résistances
vasculaires pulmonaires et donc de la pression artérielle pulmonaire après l’administration de
U-46619 (Lambermont et al., 2003a). Cette élévation de la postcharge du ventricule droit peut
également contribuer à la chute de Qmoy par réduction de la précharge du ventricule gauche.
Dans notre étude, l’administration de U-46619 entraîne une élévation de la postcharge du
ventricule gauche qui peut s’expliquer par les effets notés au niveau des résistances
périphériques (R2), mais de façon surprenante, on n’observe pas de variations significatives de
Pmoy. Cette élévation aiguë de la postcharge du ventricule gauche entraîne une altération de
ses performances mécaniques qui se traduit par une diminution de Qmoy, effet précédemment
décrit (Kolh et al., 2003).
Notre étude démontre, en outre que, les effets hémodynamiques systémiques induits par
l’agoniste stable du TXA2, U-46619, sont réduits de façon significative par l’administration
préventive de BM-573. De plus, l’administration de doses de BM-573 supérieures ou égales à
0,500 mg/ml entraîne une inhibition complète de l’agrégation plaquettaire provoquée par
l’acide arachidonique. Dans les mêmes conditions, l’agrégation plaquettaire induite par l’ADP
et le collagène n’est pas affectée. Ces résultats montrent que le BM-573 exerce, par ses
propriétés de modulateur du thromboxane A2, une action effective sur les plaquettes.
L’amplitude de l’agrégation plaquettaire observée chez le porc est inférieure à celle observée
chez l’homme. En effet, nous avions évalué précédemment les effets du BM-573 comme antiagrégant sur du plasma humain riche en plaquettes (3.10 8 cells.mL-1) (Rolin et al.,
2001 ;Dogne et al., 2004b).Toutefois, les données restent interprétables et sont en accord avec
les effets anti-plaquettaire du BM-573 observés in vitro et in vivo chez d’autres espèces (Rolin
et al., 2003 ; Dogne et al., 2004b). Dans notre étude, nous confirmons par ailleurs la
métabolisation rapide du BM-573 après son administration intraveineuse puisque les taux
plasmatiques apparaissent non cumulatifs. Nous observons ainsi que 30 minutes après la
dernière injection (Run 2) de 2 mg/Kg de BM-573, son taux plasmatique décroît de façon
significative (88%). Nous démontrons de plus que le BM-573 est un ligand à haute affinité
des récepteurs TP, agissant comme un antagoniste sélectif et compétitif de ces derniers (Rolin
et al., 2001 ; Dogne et al., 2004b). Ainsi, les effets du BM-573 peuvent être expliqués par son
action antagoniste sur le U-46619 au niveau des récepteurs TP.
CONCLUSIONS
L’administration de l’agoniste stable du TXA2, U-46619, entraîne une élévation des
résistances vasculaires systémiques (R2), et une altération de la compliance vasculaire
systémique (C). Elle a peu d’effets sur l’impédance caractéristique (R1), reflet des propriétés
élastiques de l’aorte. L’intégration de ces données se traduit par une élévation aiguë et
transitoire de la postcharge du ventricule gauche, à l’origine d’une altération des
performances mécaniques de ce dernier reflétée par l’effondrement du débit cardiaque. Ces
effets sont prévenus par l’administration de BM-573 qui se révèle capable de bloquer l’action
du TXA2 au niveau de ses récepteurs présents dans la circulation systémique.