L’analyse métagénomique ciblée au service de la microbiologie des aliments : applications concrètes Bernard Taminiau, Carine Nezer, Laurent Delhalle, Ysabelle Adolphe, Pedro Imazaki, Amélie Darcis, Antoine Clinquart et Georges Daube ???? Quels sont les liens entre les bactéries et les mots ? • Les mots sont organisés en phrases ce qui forme un texte cohérent. • Les bactéries s’organisent populations formant des communautés • Chaque mot véhicule un sens, une fonction voire plusieurs… • Chaque bactérie peut être associée à une ou plusieurs fonctions ou à une activité donnée. • La modification de la structure du texte a une signification • La modification de la structure de la communauté microbienne a aussi un sens. • … L’analyse métagénomique ciblée, C’est l’identification des membres de la communauté microbienne d’un biotope afin: • d’en étudier la composition • en étudier les évolutions • déduire les parentés entre communautés. Analyse ciblée Analyse fonctionnelle WHO is in there ??? Réalise une analyse taxonomique Taxonomie bactérienne est basée sur la séquence de l’ARN 16S Tri et neJoyage des séquences Alignement des séquences sur des séquences de référence Regroupement et définition des OTUs L’OTU : unité taxonomique opérationnelle 0.01 Blabla Blabla BlablBlablBlabla BlBlablBlablBlablabla BlaBlablbl Regroupe des éléments qui partagent un consensus au niveau : • De la séquence • Du chemin taxonomique BlablBlablBlablBlablBlabl BlablBlablBlabl 0.1 Blabl BlablBlablBlabl Blabla Blabla BlablBlablBlabla BlBlablBlablBlablabla BlaBlablbl BlablBlablBablBlabl BlablBlablBlabl 0.03 Blabl Blabla Blabla BlablBlablBlabla BlBlablBlablBlablabla BlaBlablbl BlablBlablBablBlabl BlablBlablBlabl Quel avantage ? • Analyse à large spectre !!! 1000 individus vs 300 colonies • Analyse culture-­‐‑indépendante • Reproductible • Portable et stockable • Analyse quantitative Métagénomique et industrie agro-­‐‑ alimentaire DLC … Matrice alimentaire est un biotope de choix !! Denrée alimentaire Aspect sensoriel Santé publique Aspect qualitatif Chimie alimentaire Biologie moléculaire • séquenceur • Rt-­‐‑PCR Unité pilote • Production produits crus/cuits Etude du vieillissement de deux matrices à base de viande • Viande de porc • Produit cuit White pudding • > 1 ingredient Microflore : • Contamination post cuisson • Population Thermodurique • Viande de porc • Produit cru Minced Meat • 1 ingrédient Microflore : • Contamination originale • Contamination par manipulation WP_D0 Plan de travail AIR -­‐‑ 4°C MM_D0 WP_FW_D6 30% CO2 70% N2 – 4°C WP_MAP30_D21 50% CO2 50% N2 -­‐‑ 4°C WP_MAP50_D21 AIR -­‐‑ 4°C MM_FW_S4_D3 AIR – 4-­‐‑8°C MM_FW_S4-­‐‑8_D3 AIR – 12°C MM_FW_S12_D3 30% CO2 70% O2 – 4°C 30% CO2 70% O2 – 4-­‐‑8°C 30% CO2 70% O2 – 12°C MM_MAP_S4_D6 MM_MAP_S4-­‐‑8_D6 MM_MAP_S12_D6 Microbiological Analysis Label WP_D0 WP_FW_D6 WP_MAP30_D21 WP_MAP50_D21 MM_D0 MM_FW_S4_D3 MM_FW_S4-­‐‑8_D3 MM_FW_S12_D3 MM_MAP_S4_D6 MM_MAP_S4-­‐‑8_D TOTAL LACTIC ACID ENTEROBACTERIACEA AEROBIC BACTERIA E 3,13 6,83 8,54 8,64 3,92 6,48 7,94 8 7,56 7,39 <3 <3 <3 <3 <3 <3 <3 <3 <3 <3 <3 <3 <3 <3 <3 <3 <3 5,30 4,34 4,67 4,63 4,70 5,37 5,33 <3 <3 <3 <3 7,02 <3 <3 7,07 6,61 PSEUDOMONADACEAE 6 MM_MAP_S12_D6 9,38 Data in Log UFCg-­‐‑1 Moraxellaceae_Psychrobacter 0% Ruminococcaceae_Faecalibacterium Populations bactériennes – boudin blanc 0% Pseudoalteromonadaceae_Pseudoalterom 100% 0% 90% Enterobacteriaceae_Enterobacter 80% Neisseriaceae_unclassified Frelative W bacterial count of the OTU/total relative bacterial count (%) _D 6 0% 70% Vibrionaceae_Vibrio 60% 0% Enterococcaceae_Enterococcus 50% 0% Lactobacillaceae_Lactobacillus 20% Listeriaceae_Brochothrix _D 50 Leuconostocaceae_Leuconostoc 107 89 M AP 50 _D 21 W P_ W P_ M AP 30 _D 21 M W P_ 6 W P_ FW _D 0 D 0% W P_ M AP 10% AP 30 _D 21 Streptococcaceae_Streptococcus 21 30% W P_ W P_ D0 0% W P_ 40% 63 69 Xanthomonadaceae_unclassified Viande hachée – MAP BD2-2_unclassified Bacteroidaceae_Bacteroides 100% Streptococcaceae_Lactococcus 90% relative bacterial count of the OTU/total relative bacterial count (%) Corynebacteriaceae_Corynebacterium 80% Lactobacillaceae_Lactobacillus_2 Carnobacteriaceae_Carnobacterium 70% Enterobacteriaceae_Serratia 60% Pseudoalteromonadaceae_Pseudoalteromonas 50% Vibrionaceae_Vibrio 40% Microbacteriaceae_Microbacterium Neisseriaceae_unclassified 30% Pseudomonadaceae_Pseudomonas 20% Streptococcaceae_Streptococcus 10% MM_MAP_S4_D6 Listeriaceae_Brochothrix T° MM_MAP_S4-8_D6 MM_MAP_S12_D6 Lactobacillaceae_Lactobacillus_1 6 6 D D 4_ 8_ _M AP _S _S 4M 226 210 M M M _M 223 AP _S AP _M M M 244 12 M _F W _D _D 0 6 0% M _FW_D0 PeH08_unclassified Leuconostocaceae_Leuconostoc Ruminococcaceae_unclassified Viande hachéePeH08_unclassified – AIR Xanthomonadaceae_unclassified BD2-2_unclassified Bacteroidaceae_Bacteroides $!!"# Streptococcaceae_Lactococcus Corynebacteriaceae_Corynebacterium Lactobacillaceae_Lactobacillus_2 +!"# Carnobacteriaceae_Carnobacterium *!"# Enterobacteriaceae_Serratia )!"# Pseudoalteromonadaceae_Pseudoalteromonas Vibrionaceae_Vibrio (!"# Microbacteriaceae_Microbacterium '!"# Neisseriaceae_unclassified Pseudomonadaceae_Pseudomonas &!"# Streptococcaceae_Streptococcus %!"# MM_MAP_S4_D6 MM_MAP_S4-8_D6 Listeriaceae_Brochothrix MM_MAP_S12_D6 $!"# Lactobacillaceae_Lactobacillus_1 T° Leuconostocaceae_Leuconostoc '. 1& # &# 0 .2 '3 +. 1 - ./ 0 .2 175 - ./ 186 - - - 244 - ./ - 0 .2 ./ 0 .1 $% .1 !# &# !"# - MM_FW_D0 4567895#:7;<54=76#;>?@<#>A#<B5#CDEF<><76#4567895#:7;<54=76#;>?@<#G"H! ,!"# 221 Analyse est reproductible ! ! Qualité de la viande de bœuf emballée sous vide • « Prêt à trancher » reconditionné en unités de vente • Facilité logistique pour les distributeurs Deux catégories de viandes : • viande produite en Belgique – Blanc bleu belge • viande importée arrivant sous-­‐‑vide par bateau : viande irlandaise ou australienne ou sud-­‐‑américaine Contre-­‐‑filet de Blanc Bleu Belge • Conservé sous vide • À 4°C 100% Lactobacillales 4% 90% • Echantillon j0 PAT issu de l’abaJoir Xanthomonada Flavobacteriale Bacillales Proportions des populations >1% - blanc les s 3% bleu belge 4% 2% Vibrionales 80% 2% Lactobacillus concavus Pantoea ananatis Pseudomonad ales 10% Brochothrix thermosphacta Pseudomonas uncultured Dyella sp. 70% BBB j0 Enterobacterialuncultured Carnobacterium es 60% • Echantillon j60 Cedecea 75% neteri Pseudomonas sp. 50% Vibrionales Lactobacillus sakei 0% Bacillales 0% Carnobacterium divergens 40% Yokenella regensburgei 30% Lactococcus piscium Lactobacillales 57% 20% Enterobacterial Serratia sp. es 43% Lactobacillus algidus Leuconostoc uncultured 10% Enterobacter cloacae Pseudomonad BBB -SV j60 0% BBB j0 BBB j60 Obesumbacterium proteus ales 0% Du contre-­‐‑filet d’importation Viande britannique Populations >1% - Contre-filet britannique Moraxellaceae_Psychrobacter 100% Oxalobacteraceae_Janthinobacterium Bacilli_unclassified 90% Comamonadaceae_unclassified Caulobacteraceae_Caulobacter • Echantillon blanc = DLC 1/3 ! Sphingomonadaceae_Sphingomonas 80% Comamonadaceae_Pelomonas Family_XII_Incertae_Sedis_Exiguobacterium 70% Enterobacteriaceae_Citrobacter Brucellaceae_Ochrobactrum Chromatiaceae_Rheinheimera 60% Carnobacteriaceae_unclassified • Echantillon DLC Clostridiaceae_Clostridium 50% Flavobacteriaceae_Flavobacterium Moraxellaceae_Acinetobacter 40% Vibrionaceae_unclassified Carnobacteriaceae_Carnobacterium Xanthomonadaceae_Rhodanobacter 30% Pseudomonadaceae_Pseudomonas Leuconostocaceae_Leuconostoc 20% Burkholderiaceae_Ralstonia Enterobacteriaceae_Serratia Enterobacteriaceae_unclassified 10% Burkholderiaceae_Burkholderia sp. Lactobacillales_unclassified 0% GB1 DLC 1/3 GB1 DLC GB2 DLC 1/3 GB2 DLC Streptococcaceae_Lactococcus sp. Lactobacillaceae_Lactobacillus_algidus Enterococcaceae_Enterococcus uncultured Du contre-­‐‑filet d’importation Viande australienne • Echantillon blanc = DLC 2/3 !! Population >1% - contre-filet australien 100% Beijerinckiaceae_uncultured 90% 80% Enterobacteriaceae_Halfnia sp. 70% Leuconostocaceae_Leuconostoc uncultured 60% Carnobacteriaceae_carnobacterium uncultured 50% • Echantillon DLC Enterobacteriaceae_Serratia sp. 40% Lactobacillaceae_Lactobacillus algidus 30% 20% Carnobacteriaceae_Carnobacterium maltaromaticum 10% 0% AU1 AU1 AU2 AU2 Est-­‐‑ce un ajout d’une flore spécifique ? DLC 2/3 DLC DLC 2/3 DLC Pose la question du status de viande fraîche Un produit de viande crue de bœuf, souvent accompagné d’épices et autres végétaux 2 échantillons de boucherie 2 échantillons de restaurant 2 échantillons de sandwich Soumis à l’analyse métagénomique Soumis à l ’analyse microbio %!!"!!!#$ !"#$#"%#&'()*'(+,-#&'( (),&'(.*('+*,/(+,"+,"*( -!"!!!#$ ,!"!!!#$ Lactobacillus algidus Pseudomonas sp. Photobacterium phosphoreum Leuconostoc uncultured Brochothrix thermosphacta Lactococcus piscium Lactobacillus sakei Weissella sp. Acinetobacter sp. Xanthomonas campestris Psychrobacter sp. Acinetobacter uncultured Photobacterium uncultured Pseudomonas uncultured Lactobacillus paraplantarum Uncultured unclassified Acinetobacter baumannii Carnobacterium divergens Enterobacter cloacae Carnobacterium uncultured bacterium uncultured Aeromonas uncultured Psychrobacter uncultured +!"!!!#$ *!"!!!#$ )!"!!!#$ (!"!!!#$ '!"!!!#$ &!"!!!#$ %!"!!!#$ !"!!!#$ ./012$3%$ ./0123&$ 456789:;3%$456789:;3&$<2=:;/>9/3%$<2=:;/>9/3&$ On a testé d’autres matrices… Il est pas frais mon poisson ??!! Poster 35 Poster 36 Se poser les bonnes questions… • Est-­‐‑ce reproductible ? Oui c’est reproductible, avec des échantillons standardisés • Combien faut-­‐‑il de séquences par échantillon ? Ca dépend, entre autres, de la charge bactérienne du produit • Est-­‐‑ce valorisable ? Oui car les séquences obtenues sont des données durables Dans des domaines variés : biopréservation, biologie prédictive, contrôle des procédés,… Les chantiers actuels • Analyse simultanée pour les bactéries et les levures/moisissures • Et surtout…. Réalisation de modèle de croissance à l’échelle de la flore RETOURNER AU LABO !!! • Améliorer l’obtention de données quantifiables pour les populations L’équipe Méta : Carine Nezer Laurent Delhalle Ysabelle Adolphe Pedro Imazaki Amélie Darcis Pr Antoine Clinquart Pr Georges Daube