L`analyse métagénomique ciblée au service de la microbiologie des

L’analyse métagénomique ciblée au service de la microbiologie des aliments : applications concrètes Bernard Taminiau, Carine Nezer, Laurent Delhalle,
Ysabelle Adolphe, Pedro Imazaki, Amélie Darcis,
Antoine Clinquart et Georges Daube
????
Quels sont les liens entre les bactéries et les mots ?
•  Les mots sont organisés en phrases ce qui forme un
texte cohérent.
•  Les bactéries s’organisent populations formant des
communautés
•  Chaque mot véhicule un sens, une fonction voire
plusieurs…
•  Chaque bactérie peut être associée à une ou
plusieurs fonctions ou à une activité donnée.
•  La modification de la structure du texte a une
signification
•  La modification de la structure de la communauté
microbienne a aussi un sens.
•  …
L’analyse métagénomique ciblée,
C’est l’identification des membres de la communauté microbienne d’un biotope afin:
•  d’en étudier la composition
•  en étudier les évolutions
•  déduire les parentés entre communautés.
Analyse ciblée
Analyse fonctionnelle
WHO is in
there ???
Réalise une analyse taxonomique
Taxonomie bactérienne est basée sur la séquence de l’ARN 16S
Tri et neJoyage des séquences
Alignement des séquences sur des séquences de référence
Regroupement et définition des OTUs
L’OTU : unité taxonomique opérationnelle
0.01
Blabla Blabla
BlablBlablBlabla
BlBlablBlablBlablabla
BlaBlablbl
Regroupe des éléments qui partagent un consensus au niveau :
•  De la séquence
•  Du chemin taxonomique
BlablBlablBlablBlablBlabl
BlablBlablBlabl
0.1
Blabl
BlablBlablBlabl
Blabla Blabla
BlablBlablBlabla
BlBlablBlablBlablabla
BlaBlablbl
BlablBlablBablBlabl
BlablBlablBlabl
0.03
Blabl
Blabla Blabla
BlablBlablBlabla
BlBlablBlablBlablabla
BlaBlablbl
BlablBlablBablBlabl
BlablBlablBlabl
Quel avantage ?
•  Analyse à large spectre !!!
  1000 individus vs 300 colonies
•  Analyse culture-­‐‑indépendante
•  Reproductible
•  Portable et stockable
•  Analyse quantitative
Métagénomique et industrie agro-­‐‑
alimentaire
DLC
…
Matrice alimentaire est un biotope de choix !!
Denrée alimentaire
Aspect sensoriel
Santé publique
Aspect qualitatif
Chimie alimentaire
Biologie moléculaire
•  séquenceur
•  Rt-­‐‑PCR
Unité pilote
•  Production produits crus/cuits
Etude du vieillissement de deux matrices à base de viande
•  Viande de porc
•  Produit cuit
White pudding
•  > 1 ingredient
Microflore :
•  Contamination post cuisson
•  Population Thermodurique
•  Viande de porc
•  Produit cru
Minced Meat
•  1 ingrédient
Microflore :
•  Contamination originale
•  Contamination par manipulation
WP_D0
Plan de travail
AIR -­‐‑ 4°C
MM_D0
WP_FW_D6
30% CO2 70% N2 – 4°C
WP_MAP30_D21
50% CO2 50% N2 -­‐‑ 4°C
WP_MAP50_D21
AIR -­‐‑ 4°C
MM_FW_S4_D3
AIR – 4-­‐‑8°C
MM_FW_S4-­‐‑8_D3
AIR – 12°C
MM_FW_S12_D3
30% CO2 70% O2 – 4°C
30% CO2 70% O2 – 4-­‐‑8°C
30% CO2 70% O2 – 12°C
MM_MAP_S4_D6
MM_MAP_S4-­‐‑8_D6
MM_MAP_S12_D6
Microbiological Analysis Label
WP_D0
WP_FW_D6
WP_MAP30_D21
WP_MAP50_D21
MM_D0
MM_FW_S4_D3
MM_FW_S4-­‐‑8_D3
MM_FW_S12_D3
MM_MAP_S4_D6
MM_MAP_S4-­‐‑8_D
TOTAL LACTIC ACID ENTEROBACTERIACEA
AEROBIC BACTERIA
E
3,13
6,83
8,54
8,64
3,92
6,48
7,94
8
7,56
7,39
<3
<3
<3
<3
<3
<3
<3
<3
<3
<3
<3
<3
<3
<3
<3
<3
<3
5,30
4,34
4,67
4,63
4,70
5,37
5,33
<3
<3
<3
<3
7,02
<3
<3
7,07
6,61
PSEUDOMONADACEAE
6
MM_MAP_S12_D6
9,38
Data in Log UFCg-­‐‑1
Moraxellaceae_Psychrobacter
0%
Ruminococcaceae_Faecalibacterium
Populations bactériennes – boudin blanc
0%
Pseudoalteromonadaceae_Pseudoalterom
100%
0%
90%
Enterobacteriaceae_Enterobacter
80%
Neisseriaceae_unclassified
Frelative
W bacterial count of the OTU/total relative bacterial count (%)
_D
6
0%
70%
Vibrionaceae_Vibrio
60%
0%
Enterococcaceae_Enterococcus
50%
0%
Lactobacillaceae_Lactobacillus
20%
Listeriaceae_Brochothrix
_D
50
Leuconostocaceae_Leuconostoc
107 89
M
AP
50
_D
21
W
P_
W
P_
M
AP
30
_D
21
M
W
P_
6
W
P_
FW
_D
0
D
0%
W
P_
M
AP
10%
AP
30
_D
21
Streptococcaceae_Streptococcus
21
30%
W
P_
W
P_
D0
0%
W
P_
40%
63
69
Xanthomonadaceae_unclassified
Viande hachée
– MAP
BD2-2_unclassified
Bacteroidaceae_Bacteroides
100%
Streptococcaceae_Lactococcus
90%
relative bacterial count of the OTU/total relative bacterial count (%)
Corynebacteriaceae_Corynebacterium
80%
Lactobacillaceae_Lactobacillus_2
Carnobacteriaceae_Carnobacterium
70%
Enterobacteriaceae_Serratia
60%
Pseudoalteromonadaceae_Pseudoalteromonas
50%
Vibrionaceae_Vibrio
40%
Microbacteriaceae_Microbacterium
Neisseriaceae_unclassified
30%
Pseudomonadaceae_Pseudomonas
20%
Streptococcaceae_Streptococcus
10%
MM_MAP_S4_D6
Listeriaceae_Brochothrix
T°
MM_MAP_S4-8_D6
MM_MAP_S12_D6
Lactobacillaceae_Lactobacillus_1
6
6
D
D
4_
8_
_M
AP
_S
_S
4M
226 210
M
M
M
_M
223
AP
_S
AP
_M
M
M
244 12
M
_F
W
_D
_D
0
6
0%
M
_FW_D0
PeH08_unclassified
Leuconostocaceae_Leuconostoc
Ruminococcaceae_unclassified
Viande hachéePeH08_unclassified
– AIR
Xanthomonadaceae_unclassified
BD2-2_unclassified
Bacteroidaceae_Bacteroides
$!!"#
Streptococcaceae_Lactococcus
Corynebacteriaceae_Corynebacterium
Lactobacillaceae_Lactobacillus_2
+!"#
Carnobacteriaceae_Carnobacterium
*!"#
Enterobacteriaceae_Serratia
)!"#
Pseudoalteromonadaceae_Pseudoalteromonas
Vibrionaceae_Vibrio
(!"#
Microbacteriaceae_Microbacterium
'!"#
Neisseriaceae_unclassified
Pseudomonadaceae_Pseudomonas
&!"#
Streptococcaceae_Streptococcus
%!"#
MM_MAP_S4_D6
MM_MAP_S4-8_D6
Listeriaceae_Brochothrix
MM_MAP_S12_D6
$!"#
Lactobacillaceae_Lactobacillus_1
T°
Leuconostocaceae_Leuconostoc
'.
1&
#
&#
0
.2
'3
+.
1
-
./
0
.2
175 -
./
186 -
-
-
244 -
./
-
0
.2
./
0
.1
$%
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-
MM_FW_D0
4567895#:7;<54=76#;>?@<#>A#<B5#CDEF<><76#4567895#:7;<54=76#;>?@<#G"H!
,!"#
221
Analyse est reproductible
!
!
Qualité de la viande de bœuf emballée sous vide
•  « Prêt à trancher » reconditionné en unités de vente
•  Facilité logistique pour les distributeurs
Deux catégories de viandes :
•  viande produite en Belgique – Blanc bleu belge
•  viande importée arrivant sous-­‐‑vide par bateau : viande irlandaise ou australienne ou sud-­‐‑américaine
Contre-­‐‑filet de Blanc Bleu Belge
•  Conservé sous vide
•  À 4°C
100%
Lactobacillales
4%
90%
•  Echantillon j0
PAT issu de l’abaJoir
Xanthomonada
Flavobacteriale
Bacillales
Proportions
des populations
>1% - blanc
les
s
3%
bleu belge 4%
2%
Vibrionales
80%
2%
Lactobacillus concavus
Pantoea ananatis
Pseudomonad
ales
10%
Brochothrix thermosphacta
Pseudomonas uncultured
Dyella sp.
70%
BBB j0
Enterobacterialuncultured
Carnobacterium
es
60%
•  Echantillon j60
Cedecea 75%
neteri
Pseudomonas sp.
50%
Vibrionales
Lactobacillus
sakei
0%
Bacillales
0%
Carnobacterium divergens
40%
Yokenella regensburgei
30%
Lactococcus piscium
Lactobacillales
57%
20%
Enterobacterial
Serratia sp.
es
43%
Lactobacillus algidus
Leuconostoc uncultured
10%
Enterobacter cloacae
Pseudomonad
BBB -SV j60
0%
BBB j0
BBB j60
Obesumbacterium
proteus
ales
0%
Du contre-­‐‑filet d’importation
Viande britannique
Populations >1% - Contre-filet britannique
Moraxellaceae_Psychrobacter
100%
Oxalobacteraceae_Janthinobacterium
Bacilli_unclassified
90%
Comamonadaceae_unclassified
Caulobacteraceae_Caulobacter
•  Echantillon blanc = DLC 1/3 !
Sphingomonadaceae_Sphingomonas
80%
Comamonadaceae_Pelomonas
Family_XII_Incertae_Sedis_Exiguobacterium
70%
Enterobacteriaceae_Citrobacter
Brucellaceae_Ochrobactrum
Chromatiaceae_Rheinheimera
60%
Carnobacteriaceae_unclassified
•  Echantillon DLC
Clostridiaceae_Clostridium
50%
Flavobacteriaceae_Flavobacterium
Moraxellaceae_Acinetobacter
40%
Vibrionaceae_unclassified
Carnobacteriaceae_Carnobacterium
Xanthomonadaceae_Rhodanobacter
30%
Pseudomonadaceae_Pseudomonas
Leuconostocaceae_Leuconostoc
20%
Burkholderiaceae_Ralstonia
Enterobacteriaceae_Serratia
Enterobacteriaceae_unclassified
10%
Burkholderiaceae_Burkholderia sp.
Lactobacillales_unclassified
0%
GB1 DLC
1/3
GB1 DLC
GB2 DLC
1/3
GB2 DLC
Streptococcaceae_Lactococcus sp.
Lactobacillaceae_Lactobacillus_algidus
Enterococcaceae_Enterococcus uncultured
Du contre-­‐‑filet d’importation
Viande australienne
•  Echantillon blanc = DLC 2/3 !!
Population >1% - contre-filet australien
100%
Beijerinckiaceae_uncultured
90%
80%
Enterobacteriaceae_Halfnia sp.
70%
Leuconostocaceae_Leuconostoc uncultured
60%
Carnobacteriaceae_carnobacterium
uncultured
50%
•  Echantillon DLC
Enterobacteriaceae_Serratia sp.
40%
Lactobacillaceae_Lactobacillus algidus
30%
20%
Carnobacteriaceae_Carnobacterium
maltaromaticum
10%
0%
AU1
AU1
AU2
AU2
Est-­‐‑ce un ajout d’une flore spécifique ?
DLC 2/3 DLC DLC 2/3 DLC
Pose la question du status de viande fraîche
Un produit de viande crue de bœuf, souvent accompagné d’épices et autres végétaux
2 échantillons de boucherie
2 échantillons de restaurant
2 échantillons de sandwich
Soumis à l’analyse métagénomique
Soumis à l ’analyse microbio
%!!"!!!#$
!"#$#"%#&'()*'(+,-#&'(
(),&'(.*('+*,/(+,"+,"*(
-!"!!!#$
,!"!!!#$
Lactobacillus algidus
Pseudomonas sp.
Photobacterium phosphoreum
Leuconostoc uncultured
Brochothrix thermosphacta
Lactococcus piscium
Lactobacillus sakei
Weissella sp.
Acinetobacter sp.
Xanthomonas campestris
Psychrobacter sp.
Acinetobacter uncultured
Photobacterium uncultured
Pseudomonas uncultured
Lactobacillus paraplantarum
Uncultured unclassified
Acinetobacter baumannii
Carnobacterium divergens
Enterobacter cloacae
Carnobacterium uncultured
bacterium uncultured
Aeromonas uncultured
Psychrobacter uncultured
+!"!!!#$
*!"!!!#$
)!"!!!#$
(!"!!!#$
'!"!!!#$
&!"!!!#$
%!"!!!#$
!"!!!#$
./012$3%$
./0123&$ 456789:;3%$456789:;3&$<2=:;/>9/3%$<2=:;/>9/3&$
On a testé d’autres matrices…
Il est pas frais mon poisson ??!!
Poster 35
Poster 36
Se poser les bonnes questions…
•  Est-­‐‑ce reproductible ?
Oui c’est reproductible, avec des échantillons standardisés
•  Combien faut-­‐‑il de séquences par échantillon ?
Ca dépend, entre autres, de la charge bactérienne du produit
•  Est-­‐‑ce valorisable ?
Oui car les séquences obtenues sont des données durables
Dans des domaines variés : biopréservation, biologie prédictive, contrôle des procédés,…
Les chantiers actuels
•  Analyse simultanée pour les bactéries et les levures/moisissures
• 
Et surtout….
Réalisation de modèle de croissance à l’échelle de la flore
RETOURNER AU LABO !!!
•  Améliorer l’obtention de données quantifiables pour les populations
L’équipe Méta :
Carine Nezer
Laurent Delhalle
Ysabelle Adolphe
Pedro Imazaki
Amélie Darcis
Pr Antoine Clinquart
Pr Georges Daube