REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE UNIVERSITE D’ORAN ES-SENIA FACULTE DES SCIENCES DEPARTEMENT DE BIOLOGIE LABORATOIRE DE PHYSIOLOGIE VEGETALE MEMOIRE Présenté par : Mr. BOUKHELLOUT Salah Pour l’obtention du DIPLOME DE MAGISTER Spécialité: Physiologie végétale Option: Ecophysiologie végétale Intitulé Influence de la salinité sur le métabolisme azoté de l’haricot (Phaseolus vulgaris L.) Soutenu le 12 Mars 2009 devant le jury composé de : Mr. BENSOLTANE Ahmed Président Professeur Université d'Oran Mr. BENABADJI Noury Examinateur Professeur Université de Tlemcen Mr. MAROUF Abderrezak Examinateur Professeur Université d'Oran Maître de Conférences Université de Mostaganem Professeur Université d'Oran Mr. MEKHALDI Abdelkader Examinateur Mr. BELKHODJA Moulay Rapporteur Résumé Dans cette expérimentation, nous avons étudié le comportement des plantes d’haricot (Phaseolus vulgaris L.) âgées de six semaines, stressées à la salinité au NaCl à des concentrations de 100 meq.l-1 et 200 meq.l-1 et au NaCl+CaCl2 à des concentrations de 100 meq.l-1 et 150 meq.l-1. Les paramètres mesurés dans cette expérimentation sont le dosage des protéines solubles au niveau des feuilles, des tiges et des racines, par la méthode de BRADFORD (1976), l’activité de la nitrate réductase au niveau de la partie aérienne et souterraine (ROBIN et al.,1981), le comptage du nombre de nodules par plante et leurs poids frais. Les résultats obtenus montrent que les teneurs en protéines solubles varient selon l’organe, la concentration saline ainsi que le type de stress salin. D’une manière générale les feuilles sont les plus affectées par la salinité surtout au NaCl, avec une chute progressive de leur teneurs en protéines solubles lorsque la concentration du milieu en sel augmente. Par contre au niveau des racines une accumulation importante s’est produite lors de l’application de la salinité, tandis qu’au niveau des tiges la variation n’est pas significative. L’activité de la nitrate réductase est plus intense au niveau des feuilles que dans les racines chez les plantes témoins. L’effet des concentrations croissantes du NaCl sur les plantes se traduit par une chute importante de l’activité enzymatique au niveau des feuilles ; cette activité s’annule complètement lors de l’application d’une concentration de 200 meq.l-1. Tandis que cette activité est stimulée au niveau des racines avec des taux d’augmentation de 300% et 500% respectivement chez les plantes nourries au 100 meq.l-1 et 200 meq.l-1 de NaCl. Par contre l’application de la salinité au NaCl +CaCl2 provoque de nouveau une activité enzymatique au niveau des feuilles alors qu’elle baisse dans les racines. La salinité au NaCl inhibe le développement des nodules en nombre et en poids frais ; cet effet apparaît clairement lorsque la concentration saline s’élève à 200 meq.l-1 où la nodulation est bloquée. L’addition du CaCl2 au milieu a des incidences sur la nodulation ; en effet le nombre de nodules par plante augmente simultanément avec l’accroissement de la concentration saline. D’autre part le poids frais des nodules a bénéficié de l’addition du CaCl2, où une légère augmentation est signalée. Mots clés : salinité, activité de la nitrate réductase, protéines solubles, nodules, racine, partie aérienne, haricot (Phaseolus vulgaris L.), ﻣﻠﺨﺺ ﻗﻤﻨﺎ ﰲ هﺬﻩ اﻟﺘﺠﺮﺑﺔ ﺑﺪراﺳﺔ ﺳﻠﻮك ﻧﺒﺎﺗﺎت اﻟﻔﺎﺻﻮﻟﻴﺎ Phaseolus vulgarisاﻟﺒﺎﻟﻐﺔ ﺳﺘﺔ أﺳﺎﺑﻴﻊ ﻣﻦ اﻟﻌﻤﺮ ﲢﺖ ﺗﺄﺛﲑ اﻹﺟﻬﺎد اﳌﻠﺤﻲ ﺑﺈﺿﺎﻓﺔ آﻠﻮرﻳﺪ اﻟﺼﻮدﻳﻮم ﺑﱰاآﻴﺰ و آﻠﻮرﻳﺪ اﻟﺼﻮدﻳﻮم 100ﻣﻠﻲ ﻣﻜﺎﻓﺊ/ﻟﱰ ﳑﺰوج ﺑﻜﻠﻮرﻳﺪ و 200ﻣﻠﻲ ﻣﻜﺎﻓﺊ/ﻟﱰ ﺑﱰآﻴﺰ اﻟﻜﺎﻟﺴﻴﻮم 100 ﻣﻠﻲ ﻣﻜﺎﻓﺊ/ﻟﱰ و 150ﻣﻠﻲ ﻣﻜﺎﻓﺊ/ﻟﱰ. اﳌﻌﺎﻳﲑ اﳌﻘﺎﺳﺔ ﺧﻼل اﻟﺘﺠﺮﺑﺔ هﺬﻩ ﰲ ﺗﺘﻤﺜﻞ آﻤﻴﺔ ﲢﺪﻳﺪ اﻟﱪوﺗﻴﻨﺎت اﻟﱪوﺗﻴﻨﺎت اﻟﺬاﺋﺒﺔ ﰲ أوراق ،ﺟﺬور وﺳﻴﻘﺎن اﻟﻨﺒﺘﺎت وذﻟﻚ ﺣﺴﺐ ﻃﺮﻳﻘﺔ ﺑﺮادﻓﻮرد ) ، (1976و ﻧﺸﺎط إﻧﺰﱘ ﳐﺘﺰل اﻟﻨﱰات ﰲ ﺟﺬور و أوراق اﻟﻨﺒﺘﺎت ﺣﺴﺐ ﻃﺮﻳﻘﺔ روﺑﻦ ) ،(1981آﻤﺎ ﻗﻤﻨﺎ ﺑﺈﺣﺼﺎء ﻋﺪد اﻟﻌﻘﺪ اﻟﺒﻜﺘﲑﻳﺔ ﰲ ﺟﺬور آﻞ ﻧﺒﺘﺔ و ﺣﺴﺎب وزﺎ اﻟﻄﺮي. أﻇﻬﺮت اﻟﻨﺘﺎﺋﺞ اﶈﺼﻞ ﻋﻠﻴﻬﺎ أن ﻣﺴﺘﻮﻳﺎت اﻟﱪوﺗﻴﻨﺎت اﻟﺬاﺋﺒﺔ ﲣﺘﻠﻒ ﲝﺴﺐ اﻟﻌﻀﻮ اﻟﻨﺒﺎﺗﻲ ،ﺗﺮآﻴﺰ اﳌﻠﺢ و آﺬا ﻧﻮع اﻹﺟﻬﺎد اﳌﻠﺤﻲ. وﺑﺸﻜﻞ ﻋﺎم ﻓﺈن اﻷوراق هﻲ اﻷآﺜﺮ ﺗﻀﺮرا ﻣﻦ اﻹﺟﻬﺎد اﳌﻠﺤﻲ وﺧﺎﺻﺔ ﺑﻜﻠﻮرﻳﺪ اﻟﺼﻮدﻳﻮم ﺗﺴﺠﻞ ﺣﻴﺚ ﺗﺪرﳚﻲ اﳔﻔﺎض ﻣﺴﺘﻮى ﰲ اﻟﱪوﺗﻴﻨﺎت اﻟﺬاﺋﺒﺔ ﻋﻨﺪ زﻳﺎدة ﺗﺮآﻴﺰ اﳌﻠﺢ ﰲ اﻟﻮﺳﻂ ﻋﻠﻰ ﻋﻜﺲ اﳉﺬور اﻟﱵ ﻳﺮﺗﻔﻊ ﻣﺴﺘﻮاهﺎ ﲢﺖ ﺗﺄﺛﲑ اﳌﻠﻮﺣﺔ ﰲ ﺣﲔ ﻳﺒﻘﻰ اﻟﺘﻐﲑ ﰲ ﻣﺴﺘﻮى اﻟﱪوﺗﻴﻨﺎت اﻟﺬاﺋﺒﺔ ﰲ ﺳﻴﻘﺎن اﻟﻨﺒﺎت ﻏﲑ ﻣﻌﱪ. ﻧﺸﺎط إﻧﺰﱘ ﳐﺘﺰل آﺎن اﻟﻨﱰات أآﺜﺮ آﺜﺎﻓﺔ ﰲ أوراق ﻧﺒﺘﺎت اﻟﺸﺎهﺪ ﳑﺎ آﺎن ﻋﻠﻴﻪ ﰲ اﳉﺬور .أدت اﻟﺰﻳﺎدة ﰲ ﺗﺮاآﻴﺰ آﻠﻮرﻳﺪ اﻟﺼﻮدﻳﻮم إﱃ اﳔﻔﺎض ﻣﻠﺤﻮظ ﰲ ﻧﺸﺎط اﻹﻧﺰﱘ ﰲ اﻷوراق و إﱃ ﺗﻮﻗﻒ ﺗﺎم ﳍﺬا اﻟﻨﺸﺎط ﻋﻨﺪ ﺗﻄﺒﻴﻖ ﺗﺮآﻴﺰ 200ﻣﻠﻲ ﻣﻜﺎﻓﺊ/ﻟﱰ .ﺑﻴﻨﻤﺎ ﲢﻔﺰ ﻧﺸﺎط اﻹﻧﺰﱘ ﰲ اﳉﺬور ﻓﻜﺎﻧﺖ ﻧﺴﺒﺔ اﻟﺰﻳﺎدة ٪300و ٪500ﻋﻠﻰ اﻟﺘﻮاﱄ ﲢﺖ و 200ﻣﻠﻲ ﻣﻜﺎﻓﺊ/ﻟﱰ ﻣﻦ آﻠﻮرﻳﺪ اﻟﺼﻮدﻳﻮم. ﺗﺄﺛﲑ 100ﻣﻠﻲ ﻣﻜﺎﻓﺊ/ﻟﱰ ﺗﻄﺒﻴﻖ اﳌﻠﻮﺣﺔ ﺑﻜﻠﻮرﻳﺪ اﻟﺼﻮدﻳﻮم ﳑﺰوج ﺑﻜﻠﻮرﻳﺪ اﻟﻜﺎﻟﺴﻴﻮم أدى ﻣﻦ ﺟﺪﻳﺪ إﱃ ﺗﻨﺸﻴﻂ اﻹﻧﺰﱘ ﰲ اﻷوراق ﺑﻴﻨﻤﺎ ﺗﻨﺎﻗﺺ ﻧﺸﺎﻃﻪ ﰲ اﳉﺬور. اﳌﻠﻮﺣﺔ ﺑﻜﻠﻮرﻳﺪ اﻟﺼﻮدﻳﻮم أﻋﺎﻗﺖ ﳕﻮ اﻟﻌﻘﺪ اﻟﺒﻜﺘﲑﻳﺔ ﻋﺪدا ووزﻧﺎ. ﻳﺘﻀﺢ هﺬا اﻟﺸﺄن ارﺗﻔﺎع ﻋﻨﺪ ﺗﺮآﻴﺰ اﳌﻠﺢ إﱃ 200 ﻣﻠﻲ ﻣﻜﺎﻓﺊ/ﻟﱰ ﻟﻴﺘﻮﻗﻒ ﳕﻮهﺎ ﲤﺎﻣﺎ .إﺿﺎﻓﺔ اﳌﻠﺤﲔ ﳑﺰوﺟﲔ ﻣﻌﺎ آﺎن ﳍﺎ ﺗﺄﺛﲑ ﳐﺎﻟﻒ ﺣﻴﺚ ﻳﺮﺗﻔﻊ ﻋﺪد اﻟﻌﻘﺪ ﺑﺎﳌﻮازاة ﻣﻊ زﻳﺎدة ﺗﺮآﻴﺰ اﳌﻠﺢ و ﺑﺎﻟﺘﺎﱄ ﺳﺠﻠﻨﺎ زﻳﺎدة ﻃﻔﻴﻔﺔ ﰲ اﻟﻮزن اﻟﻄﺮي ﻟﻠﻌﻘﺪ اﻟﺒﻜﺘﲑﻳﺔ. اﻟﻜﻠﻤﺎت اﻟﺮﺋﻴﺴﻴﺔ :اﳌﻠﻮﺣﺔ ،ﻧﺸﺎط إﻧﺰﱘ ﳐﺘﺰل اﻟﻨﱰات ،اﻟﱪوﺗﻴﻨﺎت اﻟﺬاﺋﺒﺔ ،اﻟﻌﻘﺪ اﻟﺒﻜﺘﲑﻳﺔ ،ﺟﺬور ،أوراق ،اﻟﻔﺎﺻﻮﻟﻴﺎPhaseolus vulgaris Abstract In this experimentation, we intend to place in a prominent and show up the attitude of String bean, plants (Phaseolus vulgaris L) aged six weeks stressed under increasing concentrations salinity NaCl at 100 meq.l-1 , 200 meq.l-1 and with NaCl+CaCl2 at 100 meq.l-1 et 150 meq.l-1. These parameters are evaluated in this experimentation are, the determination of the soluble proteins at the level of leafs, stems and roots, by the method of BRADFORD (1976), the activity of the nitrate reductase at the level of the aerial, and the underground parts (ROBEN et al.,1981) and the counting of the nodules number by each plant, and also their fresh weight. The obtained results show that; the soluble proteins content varies according to the organ, the saline concentration and the salt type. Generally, leafs are much more affected by salinity, especially by NaCl, with a progressive fall of their soluble proteins content in proportion of the increase the saline concentration. By against at the level of roots, we noted that an important accumulation has been produced during the salinity application, while the variation at the level of stems is poor discovered. The nitrate reductase activity has more on leafs than it has on roots among the non stressed plants. The impact of increasing concentrations of NaCl on String bean is reflected by an important fall of the enzyme activity at the level of leafs, this activity is completely cancelled during the application of a concentration of 200 meq.l-1.While this activity is stimulated at the level of roots with augmentations that could reach 300% and 500% respectively. Among plants which are nourished at 100 meq.l-1 and 200 meq.l-1 of NaCl. On the other side, the application of salinity using NaCl +CaCl2 Restorers the ANR of leafs and roots. The salinity with NaCl restrains the expansion of nodules in number and in fresh weight, this impact appears clearly when the saline concentration raised at 200 meq.l-1 where nodulation is blocked. The addition of CaCl2 has incidences on nodulation; in fact, the nodules number by plant increase simultaneously with the augmentation of the saline concentration. Somewhere else, the nodules fresh weight has benefited of the addition of CaCl2, where a light augmentation has been signalized. Key words: salinity, nitrate reductase activity, soluble proteins, nodules, root, aerial parts, bean (Phaseolus vulgaris L). Remerciements ﺍﻟﺤﻤﺩ ﷲ ﺍﻟﺫﻱ ﻭﻓﻘﻨﻲ ﻹﺘﻤﺎﻡ ﻫﺩﺍ ﺍﻟﻌﻤل,ﺍﻟﺤﻤﺩ ﷲ ﻋﻠﻰ ﻨﻌﻤﻪ ﺍﻟﺘﻲ ﻻ ﺘﺤﺼﻰ ﻭ ﻻ ﺘﻌﺩ J'exprime ma reconnaissance au Professeur BELKHOUDJA Moulay pour la confiance qu'il m'a témoignée en m'accueillant au sein de son laboratoire pendant ces trois années de recherche et pour avoir diriger ce travail. Je remercie Mr. BENSOLTANE Ahmed, Professeur à l’Université d’Oran d’avoir accepter de présider le jury de thèse, aussi pour ses remarques objectives qu’il nous a apporté au cours de l’année théorique. Je remercie profondément Mr. MEKHALDI Abdelkader, Maître de conférences à l’Université de Mostaganem pour son soutien moral. Je souhaiterai ici lui témoigner ma sincère reconnaissance pour son aide précieuse pendant la réalisation de ce travail. Je tiens également à remercier Mr. MAROUF Abderazak, Professeur à l’Université d’Oran pour sa disponibilité, ses orientations et ses remarques fructueuses. Je suis très sensible à l’honneur que m’ont fait Messieurs ; BENABADJI. N professeur à l’université de Tlemcen, Mr. MAROUF. A Professeur à l’Université d’Oran et MEKHALDI. A maître de conférences à l’Université de Mostaganem d’avoir accepter d’examiner ce travail. Mes remerciements s’adressent également à Mesdames, BENABDALLAH, BENACEUR et IGHIL pour leurs aides et leurs conseils. Qu’elles trouvent ici ma profonde gratitude. J’exprime ma gratitude à m’elle SAADA Keltoum et a Mr TAIBI Kheled qui m’ont beaucoup aidé dans la correction de ce document. Je n’oublie pas l’aide précieuse du Pr. KEROUA O. ainsi que les membres de son équipe qui m’ont permis de réaliser une partie de mon travail. Je ne pourrai terminer ces remerciements sans y associer ma famille et mes amis (es) qui m'ont toujours apporté tout leur soutien et leur appui afin d’arriver au terme de cette aventure. Et tous ceux rencontrés durant ces trois années pour leurs conseils. A toutes et à tous je leur dis un grand merci. Dédicaces Je dédie ce modeste travail : A mes très chers parents qui ont largement contribué à mon éducation et mon enseignement. A toute ma grande famille. Mes frères : Samir, Mohamed, Aissam, Houssem et Ahmed. Mes sœurs : Fatiha, Teldja, Nadia, Wahiba et Chafia. A mes amis (es) : Hamiani S, Zeghoudi S, Brahimi .AB, Taibi KH, Arous A, Saada. K., Nerimene Z, Fatiha, Toumi A-R, Arbi. A tous le membre du laboratoire. A mes enseignants de lycée Hirech et en particulier Mr. BENFARHAT pour son aide précieuse. Enfin à tous ceux qui m’ont aidé de près ou de loin. « SALAH » LISTE DES FIGURES LISTE DES FIGURES Fig.1– Graines misent en germination ...................................................................................... 34 Fig.2– Dispositif expérimental ................................................................................................. 35 Fig.3– Préparation du broyat végétal. ....................................................................................... 36 Fig.4– Gamme étalon de SBA. ................................................................................................. 37 Fig.5– denombrement des nodules .......................................................................................... 38 Fig.6 – Teneurs en protéines solubles des feuilles, des tiges et des racines des plantes d’haricot âgées de 6 semaines, stressées au NaCl. ..................................................... 40 Fig.7 – Teneurs en protéines solubles des feuilles, des tiges et des racines des plantes d’haricot âgées de 6 semaines, stressées au NaCl+CaCl2 .......................................... 41 Fig.8 – Ratios des protéines solubles parties aériennes (feuilles+tiges)/ racines desplantesd’haricot âgées de 6 semaines, stressées au NaCl...................................... 42 Fig.9 – Ratio des protéines solubles parties aériennes (feuilles+tiges)/ racines des plantes d’haricot âgées de 6 semaines, stressées au NaCl+CaCl2. ......................................... 43 Fig.10 – Activité de la nitrate réductase des feuilles et des racines des plantes d’haricot âgées de 6 semaines, stressées au NaCl. ..................................................................... 44 Fig.11– Activité de la nitrate réductase des feuilles et des racines des plantes d’haricot âgées de 6 semaines, stressées au NaCl+CaCl2 ........................................................................................45 Fig.12 – Ratio de l’activité de la nitrate réductase (ANRparties aériennes /ANR racinaire) des plantes d’haricot âgées de 6 semaines, stressées au NaCl.................................... 46 Fig.13 – Ratio de l’activité de la nitrate réductase (parties aériennes / racines) des plantes d’haricot âgées de 6 semaines, stressées au NaCl + CaCl2 ................................................................47 Fig.14 – Nombre de nodules/plante des plantes d’haricot âgées de 6 semaines, stressées au NaCl ............................................................................................................................ 48 Fig.15 – Nombre de nodules/plante des plantes d’haricot âgées de 6 semaines, stressées au NaCl + CaCl2. ............................................................................................................. 48 Fig.16 – poids frais des nodules/plante en (g) des plantes d’haricot âgées de 6 semaines, stressées au NaCl ........................................................................................................ 49 Fig.17 – poids frais des nodules/plante en (g) des plantes d’haricot âgées de 6 semaines, stressées au NaCl+CaCl2. .............................................................................................................................................50 Fig.18 – Nombre de nodules par unité de masse seche racinaire (mg) des plantes d’haricot âgées de 6 semaines, stressées au NaCl. ..................................................................... 51 LISTE DES FIGURES Fig.19 – Nombre de nodules par unité de masse seche racinaire (mg) des plantes d’haricot âgées de 6 semaines, stressées au NaCl+CaCl2. ......................................................... 52 Fig.20 – Teneurs en protéines solubles des feuilles des plantes d’haricot âgées de 6 semaines, stressées au NaCl et au NaCl+CaCl2. ........................................................ 53 Fig.21 – Teneurs en protéines solubles des racines des plantes d’haricot âgées de 6 semaines, stressées au NaCl et au NaCl+CaCl2 ......................................................................................54 Fig.22 – Activité de la nitrate réductase des feuilles des plantes d’haricot âgées de 6 semaines, stressées au NaCl et au NaCl+CaCl2 ......................................................... 55 Fig.23 – Activité de la nitrate réductase des racines des plantes d’haricot âgées de 6 semaines, stressées au NaCl et au NaCl+CaCl2 ......................................................... 56 Fig.24 – Nombre de nodules des plantes d’haricot agées de 6 semaines, stressées au NaCl et au NaCl+CaCl2. ...................................................................................................... 57 Fig.25 – Poids frais des nodules/plante des plantes d’haricot âgées de 6 semaines, stressées au NaCl et au NaCl+CaCl2. ........................................................................................ 58 LISTE DES TABLEAUX LISTE DES TABLEAUX Tableau 1- Composition de la solution nutritive de HOAGLAND (1938) ............................. 34 Tableau 2 – Test de signification de Student à P= 5% des teneurs en protéines solubles (µg.ml-1) des feuilles, des tiges et des racines des plantes d’haricot âgées de 6 semaines, stressées au NaCl ............................. .................. ........ ........................ 40 Tableau 3– Test de signification de Student à P= 5% des teneurs en protéines solubles (µg.ml-1) des feuilles, des tiges et des racines des plantes d’haricot âgées de 6 semaines, stressées au NaCl+CaCl2 ................. .................. ....... ......................... 42 Tableau 4 –Ratios des protéines solubles parties aériennes (feuilles+tiges)/ racines des plantes d’haricot âgées de 6 semaines, stressées au NaCl. ................................... 43 Tableau 5 –Ratio des protéines solubles parties aériennes (feuilles+tiges)/ racines des plantes d’haricot âgées de 6 semaines, stressées au NaCl+ CaCl2. ...................... 43 Tableau 6 – Test de signification de Student à P= 5% de l’activité de la nitrate réductase des feuilles et des racines des plantes d’haricot âgées de 6 semaines, stressées au NaCl. ............................................................................................................... 44 Tableau 7 – Test de signification de Student à P= 5% de l’Activité de la nitrate réductase des feuilles et des racines des plantes d’haricot âgées de 6 semaines, stressées au NaCl+ CaCl2..................................................................................................... 45 Tableau 8 – résultats moyens des ratios de l’activité de la nitrate réductase (parties aériennes / racines) des plantes d’haricot âgées de 6 semaines, stressées au NaCl. ..................................................................................................................... 46 Tableau 9 – résultats moyens des ratios de l’activité de la nitrate réductase (parties aériennes / racines) des plantes d’haricot âgées de 6 semaines, stressées au NaCl + CaCl2. ....................................................................................................... 47 Tableau 10 – Test de signification de Student à P= 5% de nombre de nodules/plante des plantes d’haricot âgées de 6 semaines, stressées au NaCl. ................................... 48 Tableau 11 – Test de signification de Student à P= 5% de nombre de nodules/plante des plantes d’haricot âgées de 6 semaines, stressées au NaCl + CaCl2..................... 49 Tableau 12 – Test de signification de Student à P= 5% du poids frais des nodules/plante en (g) des plantes d’haricot âgées de 6 semaines, stressées au NaCl. .............. 50 Tableau 13 – Test de signification de Student à P= 5% du poids frais des nodules/plante en (g) des plantes d’haricot âgées de 6 semaines, stressées au NaCl+ CaCl2. .... 50 Tableau 14 – Test de signification de Student à P= 5% Nombre de nodules par unité de masse sèche racinaire (mg) des plantes d’haricot âgées de 6 semaines, stressées au NaCl. .............................................................................................. 51 LISTE DES TABLEAUX Tableau 15 – Test de signification de Student à P= 5% Nombre de nodules par unité de masse sèche racinaire (mg) des plantes d’haricot âgées de 6 semaines, stressées au NaCl+ CaCl2. ................................................................................... 52 Tableau 16 – Test de signification de Student à P= 5% des teneurs en protéines solubles des feuilles des plantes d’haricot âgées de 6 semaines, stressées au NaCl et au NaCl+ CaCl2 ....................................................................................................... 53 Tableau 17 – Test de signification de Student à P= 5% des teneurs en protéines solubles des racines des plantes d’haricot âgées de 6 semaines, stressées au NaCl et au NaCl+ CaCl2 ....................................................................................................... 54 Tableau 18 – Test de signification de Student à P= 5% de l’activité de la nitrate réductase des feuilles des plantes d’haricot âgées de 6 semaines, stressées au NaCl et au NaCl+ CaCl2. ...................................................................................................... 55 Tableau 19 – Test de signification de Student à P= 5% de l’activité de la nitrate réductase des racines des plantes d’haricot âgées de 6 semaines, stressées au NaCl et au NaCl+ CaCl2. ...................................................................................................... 56 Tableau 20 – Test de signification de Student à P= 5% du nombre de nodules des plantes d’haricot agées de 6 semaines, stressées au NaCl et au NaCl+ CaCl2 ............... 57 Tableau 21 – Test de signification de Student à P= 5% du poids frais des nodules des plantes d’haricot agées de 6 semaines, stressées au NaCl et au NaCl+ CaCl2 ... 58 Liste des abréviations Liste des abréviations ABA ANR °C Ca++ CaCl2 CE CEC CH4 Clcm CO2 CO3-Fig g GR Ha K+ L m mho/cm meq.l-1 MF Mg++ ml mm MS Na NaCl NiR NO2NO3O3 PS II PS SO4-Tab µg µl µmol NR SAB Acide Abscisic Activité de la nitrate réductase Degré Celsius Calcium Di chlorure de calcium. Conductivité Electrique Complexe d’Echange Cationique Ammonium Chlore Centimètre Dioxyde de carbone Carbonate Figure Gramme Glutathione réductase Héctard Potassium Litre Millimhos par centimètre Milli équivalant/litre Matière fraîche Magnésium millilitre millimètre matière sèche Sodium Chlorure de sodium Activité de la Nitrite Réductase Nitrite (dioxyde d’Azote) Nitrate Ozone Photosystème II Poids Sec Sulfate Tableau micro gramme micro litre micro mole Nitrate Réductase Sérum Albumine Bovine INTRODUCTION GENERALE CAPITRE I- RECHERCHE BIBLIOGRAPHIQUE .................................................................... 3 I- L’AZOTE ET LA PLANTE ..................................................................................................... 3 1- Cycle de l’azote ............................................................................................................... 3 2- Assimilation de l'azote par les plantes ............................................................................ 4 • • • • Absorption des nitrates par la racine ................................................................. 4 Cheminement du nitrate .................................................................................... 5 Sécrétion dans le xylème ................................................................................... 5 Réduction du NO3- ............................................................................................................................................. 5 3- Voie d'assimilation du nitrate chez les plantes supérieures………………………. ...... 6 4- Structure et fonction de la nitrate réductase et de la nitrite réductase............................. 6 • • La nitrate réductase ........................................................................................... 6 La nitrite réductase ............................................................................................ 7 5 - Régulation de la NR et de la NiR ................................................................................... 8 Régulation par des facteurs de l'environnement ............................................................ 8 • • • • Nitrate ................................................................................................................ 8 Lumière ............................................................................................................. 8 Phytohormones .................................................................................................. 8 Spécificité tissulaire .......................................................................................... 9 6- Assimilation symbiotique d’azote ................................................................................... 9 6-1 La formation et développement du nodule ................................................................... 10 • • • Pré infection ...................................................................................................... 10 Infection............................................................................................................. 11 Développement du nodule ................................................................................. 11 II- LES LEGUMINEUSES ........................................................................................................... 12 1- Haricot commun (Phaseolus vulgaris L.) ....................................................................... 12 1-1 Historique ...................................................................................................................... 12 1-2- Ecologie de l’espèce .................................................................................................... 13 1-3- Classification ............................................................................................................... 13 1-4- Description ................................................................................................................... 13 1-5- Description du cycle de développement de l’haricot ................................................... 14 1-6- Utilisation .................................................................................................................... 15 III- LES STRESS ABIOTIQUES ................................................................................................. 15 1- Définition du stress ......................................................................................................... 16 2 - STRESS THERMIQUE ................................................................................................. 17 2-1- Les basses températures ......................................................................................... 17 2-2 Les hautes températures .......................................................................................... 17 2-3- Réponse des plantes face au stress thermique ....................................................... 18 3 - STRESS HYDRIQUE.................................................................................................... 19 3-1- Effets du déficit hydrique sur les plantes ............................................................... 19 3-2- Les paramètres d’adaptation et de résistance à la sécheresse ................................ 20 4 - LE STRESS SALIN ....................................................................................................... 20 4-1- Généralités sur la salinité ....................................................................................... 20 4-2- Effets des sels sur les plantes ................................................................................. 21 • • • • • • • Effets de salinité sur la feuille ........................................................................... 22 Effets de salinité sur la photosynthèse .............................................................. 23 Effet de la salinité sur le métabolisme azoté ..................................................... 23 Effets de salinité sur l’activité de la nitrate réductase et l’assimilation de l’azote ................................................................................................................ 23 La symbiose sous stress salin ............................................................................ 24 La survie des bactéries symbiotiques sous contrainte saline ............................. 24 La fixation du N2 sous stress salin .................................................................... 25 4-3- Réponses des plantes face au stress salin............................................................... 26 4-3-1- Glycophytes et Halophytes ................................................................................. 26 4-3-2- Réponse de croissance ........................................................................................ 27 4-3-3- Adaptation et résistance...................................................................................... 28 4-3-3-1- Ajustement osmotique..................................................................................... 28 • La synthèse et l’accumulation des osmolytes.................................................... 28 ¾ Accumulation de proline ........................................................................ 29 ¾ Accumulation de sucres ......................................................................... 29 4-3-3-2- Transports ioniques ......................................................................................... 29 ¾ • Compartimentation du sodium dans les vacuoles………………… ...... 30 Synthèse et accumulation des osmoprotecteurs ................................................ 30 4-3-4- Rôle des phytohormones dans la tolérance a la salinité ..................................... 31 4-3-5- Rôle du Calcium dans la tolérance à la salinité .................................................. 32 CAPITRE II- MATERIELS ET METHODES ................................................................. 33 I - Matériel végétal ............................................................................................................ 33 II – Méthodes ..................................................................................................................... 33 1- Préparation des pots .................................................................................................. 33 2- Préparation du substrat .............................................................................................. 33 3- Déroulement de l’expérimentation............................................................................ 33 - Test préliminaire de la germination ..................................................................... 33 - Repiquage des graines germées ........................................................................... 34 - Dispositif expérimental ........................................................................................ 35 4- Les traitements salins ................................................................................................ 35 5 - Paramètres mesurés .................................................................................................. 36 51- Dosages des protéines Solubles .............................................................................. 36 • • • • • • Principe .............................................................................................................. 36 Préparation du broya végétal ............................................................................. 36 Préparation des extraits protéiques .................................................................... 36 Préparation du réactif ........................................................................................ 36 Etablissement de la gamme étalon .................................................................... 36 Dosage des protéines solubles ........................................................................... 37 5-2 - Détermination de l’activité du nitrate réductase (ANR) ....................................... 37 5-3- Les paramètres de la nodulation ............................................................................ 38 • • Nombre de nodules par plante ........................................................................... 38 Détermination du poids frais ............................................................................. 39 6 - Analyse statistique ....................................................................................................... 39 CHAPITRE III- RESULTATS.......................................................................................... 40 I - Teneurs en protéines solubles dans les différents organes des plantes stressées .......... 40 II – Etude du ratio des protéines solubles .......................................................................... 42 1- Ratio partie aérienne/partie souterraine sous stress au NaCl ........................................ 42 1- Ratio partie aérienne/partie souterraine sous stress au NaCl + CaCl2 .......................... 43 III - Activité de la nitrate reductase des plantes stressées ................................................. 44 IV - Etude des ratios de l’activite de la nitrate réductase .................................................. 46 1 - Ratio partie aerienne/partie souterraine sous stress au NaCl ................................... 46 2 - Ratio partie aérienne/partie souterraine sous stress au NaCl+CaCl2 .................................. 47 V – Caracterisation des nodules ........................................................................................ 47 1- Nombre de nodules/plante des plantes stressées ....................................................... 47 2 - Le poids frais des nodules des plantes stressées ...................................................... 49 3 - Nombre de nodules par unité de masse sèche racinaire ........................................... 51 VI - Comparaison entre les traitements salins ................................................................... 52 1- La teneur en protéines solubles ................................................................................. 52 • • Dans les feuilles................................................................................................. 52 Dans les racines ................................................................................................. 53 2 - L’activité de la nitrate réductase .............................................................................. 54 • • Au niveau foliaire .............................................................................................. 54 Dans les racines ................................................................................................. 55 3 - Caractéristiques des nodules .................................................................................... 56 • • Le nombre de nodule ......................................................................................... 56 Poids frais des nodules par plante ..................................................................... 57 CHAPITRE IV- DISCUSSION ET CONCLUSION GENERALE .................................. 59 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES .......................................................................... 65 ANNEXE Introduction générale INTRODUCTION INTRODUCTION Les contraintes abiotiques, telles que la sécheresse, la salinité et les températures extrêmes causent d’importantes pertes de récolte mondiale réduisant les rendements moyens pour la plupart des plantes cultivées de plus de 50% (BRAY et al.,2000). En particulier, la salinité, de plus en plus une menace sérieuse pour l’agriculture, affecte approximativement 20% des régions agricoles irriguées. Ces régions assurent le tiers des besoins alimentaires mondiaux (MUNNS, 2002). Les végétaux tolèrent l’excès des sels en impliquant des mécanismes physiologiques, morphologiques et biochimiques variés. La salinité et la sécheresse ont des effets néfastes sur la croissance et la survie des populations rhizobiennes dans le sol (SINGLOTON et al.,1982), sur le développement et le fonctionnement des nodosités et, donc, sur la capacité de fixation d’azote par l'association symbiotique. Les légumineuses, sous contrainte saline, développent des stratégies adaptatives principalement la biosynthèse et l'accumulation d'osmolytes organiques qui participent à l'ajustement osmotique et à des remaniements protéiques nécessaires au maintien de l'intégrité cellulaire (MOHAMMAD KIANI,2007), ainsi le transport et à la compartimentation des ions pour éviter leurs effets toxiques (MEZNI,1999). Le métabolisme azoté et la synthèse protéique sont sévèrement affectés par le stress salin (HUNGRIA et VARGAS,2000). Il en résulte un développement anormal des plantes et une diminution du rendement (PESSARAKLI et al.,1989), également la nodulation est très affectée par le stress salin qui affecte à la fois la survie et la multiplication des populations rhizobiennes (POOLMAN et GLAASKER,1998), menant à une rupture de l’association symbiotique entre les légumineuses et les bactéries fixatrices d’azote (ZAHRAN,1999). La nodulation est extrêmement sensible au NaCl ; la contrainte saline entraîne une réduction des sites d'infections sur la racine, du nombre des poils radiculaires et de la proportion de ceux qui portent les cordons d'infection (ZAHRAN et SPRENT,1986). Par la suite, le nombre de nodules et leur contenu en léghémoglobine diminuent (DELGADO et INTRODUCTION al.,1994), et une inhibition de l’activité de la nitrogénase (DELGADO et al.,1993 ; ZAHRAN,1999). La nitrate réductase est une enzyme primordiale dans la voie d’assimilation de l’azote. En effet, elle catalyse la réduction du nitrate (NO3-) en nitrite (NO2) (FLORES et al.,2002). L’effet dépressif de la salinité sur l’activité de la nitrate réductase est démontré dans de nombreux travaux, SILVEIRA et al.,(2001) ;MELONI et al.,(2001) ;DEBOUBA et al.,(2007). En effet, elle diminue l’expression de cette enzyme dans les parties aériennes (MEKHALDI ,2008) contre une stimulation dans la partie souterraine (MAROUF 1986). La tolérance des végétaux aux sels est un phénomène complexe. Les plantes en face des stress abiotiques mettent en œuvre des mécanismes de résistance et d’adaptation d’ordre morphologiques, physiologiques (PARIDA et DAS, 2005) et biochimiques entre autre par l’activation de la synthèse des enzymes spécifiques. Bien que d’autres travaux ont montré que la salinité stimule en générale l’activité de la nitrate réductase (MISRA et DWIVERDI, 1990 ; SAGI et al.,1997). Dans le présent travail, les expériences sont menées sur une variété d’haricot (Phaseolus vulgaris L), espèce appartenant à la famille des fabacées. Cette espèce est très répandue dans le monde à cause de ses valeurs nutritionnelles et son grand intérêt économique (SILVEIRA et al.,1988). L’objectif de cette expérimentation vise à étudier les effets de concentrations de NaCl et de NaCl + CaCl2 sur la réponse de l’activité enzymatique nitrate réductase, des variations des protéines solubles et de la nodulation. Notre travail se subdivise en trois parties : • Nous présenterons dans la première partie une synthèse des données bibliographiques, • Nous décrirons ensuite le protocole expérimental ainsi que la méthodologie du travail, • La troisième partie est consacrée à la présentation des résultats obtenus au cours de cette expérimentation. Synthèse bibliographique CHAPITRE I – RECHERCHE BIBLIOGRAPHIQUE I- L’AZOTE ET LA PLANTE. L’azote (N) est un macronutriment essentiel assimilé par les plantes en grandes quantités (MARSCHNER,1995).À ce titre, l’azote est un facteur limitant important pour la croissance et le développement des cultures (DIAZ et al.,2006; LEA et AZEVEDO,2006). Au cours des cinq dernières décennies, l’application des engrais azotés a augmenté de 20 fois (GLASS,2003).Toutefois, les plantes cultivées sont en mesure d'utiliser seulement 30% à 40% de cette application (RAUN et JOHNSON,1999); le reste est perdu par lessivage, la dénitrification, la volatilisation, l'érosion des sols et la consommation microbienne (GOOD et al.,2004). 1- Cycle de l’azote L'azote atmosphérique (78% en volume) représente la principale source d'azote dans la planète sous forme de N2, mais on le trouve également dans l'atmosphère en très faible quantité, de l'ammoniac (NH3) et des oxydes d'azote (NO2. NO2, NO) qui sont les produits des fumées industrielles, des feux de forêts, des activités volcaniques (SPRENT,1987) et des océans. Les organismes vivants, plantes et animaux peuvent aussi rejeter de faibles quantités de NH3 dans l'atmosphère (SLADE,2007).Le NO3- est surtout le produit de l'oxydation de N2 par O2 ou par l'ozone (O3) sous l'effet des éclairs et les radiations ultraviolets. En fait, une très faible partie de l'azote atmosphérique est entraînée au sol sous une forme ou une autre, par les précipitations et une autre partie de l'azote provient de la fixation de l'azote moléculaire par les micro-organismes (MOREAU et al.,2008).L'azote assimilé par les organismes vivants est restitué au sol après décomposition de la matière organique végétale et animale par les bactéries, champignons et protozoaires (BERMANAND et CHAVA,1999). La transformation par les micro-organismes de l'azote organique du sol en formes azotées minérales est appelée minéralisation, les composés organiques azotés dégradés sont utilisés comme source d'énergie et de carbone, l'azote non utilisé par les micro-organismes est libéré généralement sous forme d'ammonium MH4. La libération d'azote dans le sol dépend du Rapport C/N des résidus organiques et des conditions climatiques (OKAMOTO et OKADA,2004). ‐ 3 ‐ CHAPITRE I – RECHERCHE BIBLIOGRAPHIQUE 2- Assimilation de l'azote par les plantes L'azote (N) est un élément minéral essentiel, exigé en grande quantité par les plantes, il constitue entre 1.5% à 2% de la matière sèche des plantes et approximativement 16% des protéines végétales totales (FRINK et al.,1999).Les plantes peuvent utiliser une multitude d'espèces d’azote comprenant l'ammoniac volatile (NH3), les oxydes d'azote NO3- et NH4+, et l’azote organique (acides aminés, peptides, etc…) (VON WIREN et al.,1997).Cependant, dans la plupart des sols agricoles, le nitrate (NO3-) est la source la plus importante d’azote disponible (HIRSCH et SUSSMAN,1999 ; CRAWFORD et FORDE,2002 ; Diaz et al 2006 ;KANT et al.,2008). Dans les sols non acides, le nitrate est généralement plus abondant que l'ammonium (GORSKA et al.,2008). Cependant, l'assimilation mixte est souvent de règle (CRAWFORD et FORDE,2002). La proportion de nitrate et d'ammonium absorbée varie suivant les espèces et les conditions d'environnement (DIAZ et al.,2008). Quoiqu'il en soit, une grande partie du nitrate absorbé devra être réduite en ammonium dans les racines et/ou dans les feuilles, pour entrer dans les voies de synthèse des acides aminés et des protéines (DESCLOS et al.,2008). La plupart des plantes ne peuvent pas fixer directement l'azote de l'air, seulement quelques espèces peuvent être colonisées au niveau de leurs racines par les bactéries fixatrices d’azote moléculaire (de la famille des Rhizobiacées par exemple) (ALKHALFIOUI et al.,2008). Les bactéries transforment N2 en NH3 fournissant au plantes leurs besoins azotés, (PARSONS et ROBERT.,2001) en retour, les plantes assurent les besoins en carbone des bactéries (DANIELET et GAGE,2004). Ces associations bénéfiques pour les deux parties (symbioses) existent principalement chez les légumineuses (ALKHALFIOUI et al.,2008). Des associations plantes/champignons (ectomycorhyzes et endomycorhyzes) assurent également une meilleur alimentation minérale, notamment en azote (NO3- et NH4+) à la plupart des végétaux (GREGORY,2005). • Absorption des nitrates par la racine Depuis le milieu du dix-neuvième siècle, l'emploi d'engrais nitriques n'a cessé d'augmenter fournissant ainsi l’azote minéral aux plantes (GLASS,2003).L’absorption radiculaire constitue la principale voie d'entrée de l'azote dans les chaînes alimentaires des végétaux terrestres (SIENKIEWICZ-PORZUCEK et al.,2008). ‐ 4 ‐ CHAPITRE I – RECHERCHE BIBLIOGRAPHIQUE Les approches électro-physiologiques ont permis une caractérisation préliminaire des systèmes de transport membranaire de NO3- (DIAZ et al.,2008). Elles semblent utiliser des mécanismes chimiosmotiques classiques, qui échangent NO3- contre OH- ou peut être HCO3- (RUFFEL et al.,2008). Ce type de mécanisme fournit un cadre conceptuel pour expliquer l'intégration bien connue du transport et de l'assimilation de NO3- et du métabolisme acido-basique à l'échelle de la cellule et à celle de la plante entière (KANT et al.,2008). • Cheminement du nitrate Le nitrate absorbé est exporté dans le xylème, (SIEBRECHT et al.,2003) réduit dans les racines(MILLER,2007), stocké dans la vacuole ou rejeté dans le milieu (RUFFEL et al., 2008). La concentration de NO3- dans le cytoplasme dépend du bilan de plusieurs flux : l'influx à partir du milieu, l’efflux dans le milieu, le flux cytoplasme/vacuole, le flux invente vacuole/cytoplasme, le flux de réduction par la nitrate réductase et éventuellement le transport vers la stèle et la sécrétion dans le xylème (DE ANGELI et al.,2006). • Sécrétion dans le xylème La sécrétion de NO3- dans les vaisseaux du xylème est due à des transporteurs de la membrane plasmique des cellules de la stèle, qui expulsent NO3- dans l'apoplasme. (FAURE et al.,2001; MILLER et al.,2007). Les différenciations de l’endoderme empêchent ces derniers de retourner vers la surface de la racine, le système de sécrétion semble utiliser le potentiel de membrane (face cytoplasmique négative) pour entraîner NO3- hors de la cellule (SIEBRECHT et al.,2003). • Réduction du NO3- La nitrate réductase est particulièrement abondante dans les cellules de l'épiderme de la racine ce qui favorise probablement la réduction de NO3- au moment de l’absorption (FORDE et CLARKSON, 1999) la répartition de la fonction d'assimilation du NO3- entre racines et parties aériennes est variable (SARAH et al.,2005). Chez beaucoup d'herbacées, la réduction de NO3- se fait surtout dans les feuilles, tandis qu'elle est racinaire chez certains ligneux, Mais ceci ne constitue pas une règle absolue, d'une part parce qu'il y a de nombreuses exceptions et d'autre part parce que la répartition dépend des facteurs du milieu (GOJON et al.,2008). ‐ 5 ‐ CHAPITRE I – RECHERCHE BIBLIOGRAPHIQUE 3- Voie d'assimilation du nitrate chez les plantes supérieures Le nitrate est absorbé par la racine ensuite stocké dans la vacuole, soit en partie réduit sur place, soit transporté dans le xylème vers la partie aérienne où il sera stocké dans la vacuole ou réduit (FAURE et al.,2001). L'assimilation de nitrate commence par la réduction de nitrate au nitrite, par la nitrate réductase (NR) au cytosol. Le nitrite formé est transporté au chloroplaste et réduit en ammonium par la nitrite réductase (NiR) (KAISER et al., 2002). L’assimilation du nitrate au sens strict n'implique donc que les deux premières réactions catalysées par la NR et la NiR situées dans les racines et les feuilles (KATO et al.,2004; JOY,2008) L'assimilation du nitrate a lieu principalement dans les feuilles chez les plantes herbacées alors qu’elle est majoritairement racinaire chez les ligneux (GOJON et al.,1994). Chez le tabac par exemple, en présence d'offre élevée de nitrate, seulement un peu du nitrate pris par les racines est immédiatement assimilé à l'intérieur des racines, alors que la majorité est transportée aux feuilles où il sera réduit en ammonium (HÄNSCH et al.,2001). La réduction du nitrate en acides aminés est dépendante d'autres métabolismes, tels la respiration et la photosynthèse, pour la fourniture d'énergie, du pouvoir réducteur et des chaînes carbonées (TCHERKEZ et HODGES,2008). C'est une voie métabolique qui est aussi associée, suivant les espèces végétales, à différents tissus et nécessite la présence de divers compartiments cellulaires comme le cytoplasme, les chloroplastes et les peroxysomes (STITT,1999). 4- Structure et fonction de la nitrate réductase et de la nitrite réductase • La nitrate réductase La nitrate réductase (NR) est l'enzyme principale dans le processus global de l'assimilation des nitrates par les plantes (DATTA et SHARMA,1999 ;CAMPBELL,2001). Le nitrate absorbé par les racines est réduit au nitrite par la nitrate réductase puis le nitrite est réduit par le nitrite réductase à l'ion d'ammonium (De La HABA et al.,2001). L’ammonium est ensuite incorporé aux acides aminés par le système d'enzymes de la ‐ 6 ‐ CHAPITRE I – RECHERCHE BIBLIOGRAPHIQUE transaminase de la synthétase glutamine-2-oxoglutarate de glutamine (Gs-gogat-gogat) (ASLAM et al.,2001). La nitrate réductase catalyse le transfert de deux électrons à partir de NAD(P)H au nitrate pour produire le nitrite (WERNER et al.,2002). La forme de la NR utilisant spécifiquement le NADH (NADH : NR.EC 1.6-6.1) est la forme la plus commune chez les plantes supérieures et les algues. Il existe toutefois deux autres isoformes (DRUART et al.,2000). La (NADH;NR) est une enzyme homodimérique qui peut former des tétramères à haute concentration chez quelques plantes supérieures (REDINBAUGH et CAMPBELL., 1985). Les monomères de masse moléculaire de 100 à 110 kDa sont liés entre eux par un pont disulfure pouvant être réduit sans perte d'activité. Trois cofacteurs sont liés à chaque monomère : (KLEINHOFS et al.,1989). La flavine adénine dinucléotide (FAD). L’hème (de type cytochrome b557) et le cofacteur à molybdène (Mo-co), Chaque groupement prosthétique définit un domaine fonctionnel. L'interaction entre les monomères se fait au niveau du domaine à Mo-co, Les trois domaines avec leurs groupements prosthétiques. FAD-Hème-Mo-co dans l'ordre permettent le transfert des deux électrons provenant du NADH au nitrate (CABOCHE et ROUZE,1992). • La nitrite réductase La nitrite réductase catalyse la réduction du nitrite en ammonium avec l'apport de 6 électrons. L'enzyme est localisée dans les chloroplastes des feuilles vertes et dans les proplastes des racines (KLEINHOFS et al.,1989). Il s'agit d'une enzyme monomérique d'une masse moléculaire de 60-64 kDa avec un groupement prosthétique de type sirohéme et un groupement 4Fe-4S comme centre actif. Le sirohème est une tétrahydroporphyrine à fer ferreux du type de l’isobactériochlorine avec 8 chaînes latérales contenant des acides carboxyliques. Le donneur d'électrons physiologique dans les tissus photosynthétiques est la ferrédoxine. Pour les racines, le donneur d'électrons est une protéine de type ferrédoxine qui est réduite par une pyridine nucléotide réductase au moyen d'électrons provenant du cycle des pentoses phosphates. ‐ 7 ‐ CHAPITRE I – RECHERCHE BIBLIOGRAPHIQUE 5 - Régulation de la NR et de la NiR • Régulation par des facteurs de l'environnement Les diverses études indiquent que la nitrate réductase est favorisée par le nitrate, la lumière, les phytohormones et la photosynthèse (APPENROTH et al.,2000; DE LA HABA et al.,2001). ¾ Nitrate L'induction de l’activité NR par le nitrate a été décrite pour la première fois en 1960 par HAGEMAN et FLESHER chez le maïs (KlEINHOFS et al,1989), Depuis il a été confirmé chez de nombreuses espèces que cette induction est due à une augmentation du taux des ARNm . (VINCENTZ et CABOCHE,1991) ont confirmé la nature transcriptionnelle de l'induction par le nitrate. Cette induction est très rapide car elle se manifeste quelques minutes après l'addition de nitrate, inversement lors d'une carence en azote, l'activité NR ainsi que la quantité de protéine NR chutent rapidement. Similairement la NiR est aussi régulée positivement par le nitrate. L’apport de nitrate induit une augmentation des ARNm de la NiR chez l’épinard, le maïs, le riz et la moutarde (ROUZE et CABOCHE.,1992). ¾ Lumière La lumière est nécessaire avec le nitrate pour la complète expression de la NR et de la NiR. L'importance relative de la lumière et du nitrate varie entre les espèces, les tissus et les conditions expérimentales. L'étude de l'influence de la lumière sur l'expression de la NR et de la NiR est complexe car il est souvent difficile de dissocier l’effet lumière lié au photochrome ou autres récepteurs de la lumière de celui lié à l'activité du système photosynthétique qui serait un effet plus métabolique. Dans les cotylédons et les plantules étiolées, l'effet de la lumière est dépendant du photochrome et induit la transcription de la NR et de la NiR suivie de l'expression de leurs activités (MEYER et STITT,2001). Une expérience menée par JANAKI (1982) et ses collaborateurs a montré que l'activité de la nitrate réductase (NR) était 8 fois plus grande à la lumière qu’à l’obscurité. ¾ Phytohormones L'effet de différentes hormones et plus particulièrement des cytokinines sur l'expression de la NR a été étudié. Ainsi, durant l'imbibition des graines d'Agrostemma githago à l’obscurité, l'activité NR est rapidement induite par la présence combinée de ‐ 8 ‐ CHAPITRE I – RECHERCHE BIBLIOGRAPHIQUE cytokinines et d'éthylène. La présence d'éthylène est nécessaire pour l'induction de la NR par les cytokinines, mais l'éthylène seul n'a pas d'effet. L'induction de la NR par les cytokinines peut être supprimée par l'application d'acide abscissique (LU et al,1992). La régulation de la nitrate réductase par l’acide abscissique a été révélée par le teste d’ELISA employant des anticorps de NR a prouvé que la protéine de NR s'est accumulée dans les racines traitées à l’ABA ; cette régulation est au moins en partie, au niveau de la transcription (GOUPIL et al.,2000). ¾ Spécificité tissulaire La NR et la NiR sont exprimées préférentiellement dans les feuilles chez la plupart des espèces. Toutefois, il existe plusieurs cas où il y a une forte activité NR ou NiR dans les racines (KATO et al.,2004; JOY,2008). La distribution de l'activité de la nitrate réductase (NR) dans diverses parties de la plante change selon le génotype, l'âge, et la disponibilité du nitrate ( STITT,1999).Dans la tribu de Phaseoleae, le nitrate est réduit principalement dans les feuilles avec une basse activité de NR dans la racine et les nodules (ANDREWS et al, 1990), Bien que plusieurs espèces de légumineuse réduisent simultanément le nitrate et le N2 dans les nodules et la racine au sujet du mécanisme moléculaire et du rôle physiologique de la réduction des nitrates dans les nodules est mal connu en nutrition des plantes (KANAYAMA et al.,1999).La réduction de nitrate dans les nodules est seulement une petite fraction (BECANA et SPRENT,1987).Cependant, il est suggéré que la combinaison de ces deux avenues de réduction d'azote pourrait être un facteur important dans le processus évolutionnaire des légumineuse sur l'optimisation de l'utilisation d'azote (CABA et al.,1990). 6- Assimilation symbiotique d’azote Certains procaryotes sont capables d'établir une symbiose avec les végétaux en induisant la formation d'organes spécifiques, les nodosités (BROUGHTON et al.,2000), à l'intérieur desquelles l'azote moléculaire atmosphérique est réduit en ammoniaque (MILLER et al.,2006). En retour, les bactéries utilisent les assimilas de la plante-hôte comme source d'énergie (DANIELET et GAGE,2004). Cette fixation biologique de l’azote atmosphérique est catalysée par un complexe enzymatique appelé complexe nitrogénase (REES et HOWARD.,2000). La réaction catalysée par cette enzyme est la suivante : ‐ 9 ‐ CHAPITRE I – RECHERCHE BIBLIOGRAPHIQUE La réaction de fixation de l’azote est très coûteuse en énergie (ATP et pouvoir réducteur) (RAYMOND et al.,2004). De ce fait, la fixation de l’azote par les bactéries diazotrophes à l’état libre est peu efficace de l’ordre de la dizaine de kg N/ha.an (FALKOWSKI,1997). L’association symbiotique entre des bactéries fixatrices d’azote et certaines plantes permet d’améliorer considérablement cette valeur pour atteindre une centaine de kg N.ha-1.an-1 (BOHLOOL et al.,1992). On distingue plusieurs types de symbioses fixatrices d’azote, les principaux types sont les symbioses nodulaires (actinorhiziennes et Légumineuses) et les symbioses avec les cyanobactéries (PARSONS et ROBERT.2001). Les symbioses avec les cyanobactéries ne conduisent pas à proprement parlé à la formation de nouveaux organes spécialisés dans la symbiose mais plutôt au détournement d’organes existants, à l’inverse des symbioses nodulaires où l’association est très étroite puisqu’elle nécessite la formation d’un nouvel organe végétal : le nodule, qui héberge la bactérie et au sein du quel ont lieu les échanges entre les deux symbiontes, La symbiose Rhizobium-Légumineuses (MIN-XIA et al.,2006). I-6-1 La formation et développement du nodule Pour la mise en place de la symbiose, des conditions doivent être remplis (KONDOROSI et KONDOROSI, 2000). une faible teneur en azote du sol une photosynthèse active pour assurer une source suffisante d’énergie La formation du nodule passe par trois étapes principales : ¾ Pré infection La plante permet une croissance des bactéries de la rhizosphère de manière sélective (SAVKA et al.,2002) les bactéries sont attirées vers les poils racinaires par les exsudas racinaire principalement les phénylpropanoïdes et les flavonoïdes (NOVAK et al.,2002), qui induisent l’expression des gènes nod ( PERRET et al.,2000).Les facteurs Nod induisent des événements morphologiques, physiologiques et moléculaires chez la plante hôte (déformation du poil racinaire en crosse de berger, courbés, renflés, entrelacés, déformés (KELLY et IRVING, 2002) et changements dans l’arrangement des microtubules (TIMMERS et al.,2007). ‐ 10 ‐ CHAPITRE I – RECHERCHE BIBLIOGRAPHIQUE ¾ Infertilité Deux types d’infection sont distingués : la voie intracellulaire et la voie intercellulaire (SIEBERER,2000). Au cours de l’infection intracellulaire, la pénétration de la bactérie est facilitée par la courbure du poil racinaire qui crée une zone confinée dans laquelle la bactérie est entourée par la paroi (XI-WAN et al.,2007), un cordon d’infection est initié à partir de ce point par hydrolyse de la paroi (MATEOS et al.,2001), invagination de la membrane végétale et production de matériel pariétal par la plante (GAGE et MARGOLIN,2000). Le cordon d’infection est une structure tubulaire qui croît à l’intérieur de la cellule et dans laquelle la bactérie prolifère. L’infection d’une cellule corticale (GAGE,2004). L’infection intercellulaire se fait généralement au niveau des passages libérés par l’émergence des racines latérales ou adventives, ou bien parfois directement à travers la lamelle moyenne entre deux cellules du rhizoderme (PAWLOWSKI et BISSELING, 1996).Les rhizobia progressent ensuite vers le primordium nodulaire de manière intercellulaire ou deviennent intracellulaires en formant des cordons d’infection (TSYGANOV,2002). ¾ Développement du nodule Il ya deux types de nodule, les nodules de type indéterminé (Pisum sativum) sont formés à partir du cortex interne (PAWEL et al.,2007) alors que les nodules de type déterminé (Phaseolus vulgaris) sont formés à partir du cortex externe (DANIEL et GAGE,2004). La persistance du méristème chez les espèces à nodules de type déterminé est très éphémère et la croissance en longueur du nodule est limitée, la croissance en épaisseur a lieu par hypertrophie des cellules corticales et par des divisions de cellules contenant déjà des Rhizobia. Ce processus de formation se traduit par une forme sphérique (STOUGAARD,2000). Dans les deux cas, les cellules du cortex se divisent de manière anticline puis péricline (TIMMERS et al.,1999 ; MATHESIUS et al.,2000a). Toutes les cellules du cortex ne se divisent pas, ce qui semble indiquer que la susceptibilité de ces cellules pourrait être liée à un statut particulier, notamment une modification de la concentration en hormones (MATEOS et al.,2001). De manière concomitante, les cellules voisines développent des cordons de pré infection, constitués de ponts cytoplasmiques alignés de façon radiale, ces structures guident la croissance des cordons d’infection en direction du primordium nodulaire en formation (SIEBERER et al.,2002). ‐ 11 ‐ CHAPITRE I – RECHERCHE BIBLIOGRAPHIQUE II- LES LEGUMINEUSES Compte tenu de leur aptitude à fixer l’azote atmosphérique, les légumineuses produisent des protéines en abondance (leurs grains contiennent 3 fois plus de protéines que ceux des céréales) sans fertilisation azotée. Ainsi, dans de nombreuses régions pauvres de la planète, ces espèces adaptées constituent une importante source de nourriture humaine (pois chiche, haricot, pois, lentilles, arachide…). Elles représentent pour source majore des apports en protéines, et huiles végétales (GRAHAM et VANCE,2003), de fourrage (luzerne, trèfle, …) et de bois (Acacia, Dalbergia, ...). Ainsi, les légumineuses couvrent globalement 66% des besoins de subsistance des communautés rurales dans les pays en voie de développement, tout en assurant un maintien durable de la fertilité des sols et de l’équilibre des écosystèmes. La famille des Fabaceae ou (Leguminosae) se classe au troisième rang du règne végétal par le nombre d’espèces représentées et se subdivise en trois sous-familles : les Caesalpinioideae, les Mimosoideae et les Faboideae (POLHILL,1981). L’une des principales caractéristiques des membres de la famille des Fabaceae est leur capacité à établir une association symbiotique avec des bactéries du sol de type rhizobia. Lors de cette symbiose, la bactérie induit la formation de nodosités chez le partenaire végétal au sein desquelles elle trouve les conditions physiologiques nécessaires à la fixation de l’azote de l’air. 1 Haricot commun (Phaseolus vulgaris L.). 1-1 Historique C’est une plante originaire d'Amérique centrale et d'Amérique du Sud. Le mot «haricot» désigne à la fois le fruit, la graine et la plante qui les produit. Il y a environ 7 000 ans, l’haricot était cultivé par les tribus indiennes du Mexique ainsi qu'au Pérou. Graduellement, la culture s'est répandue à travers l'Amérique au fil des migrations des Indiens, de sorte que par la suite les explorateurs espagnols du XVe et du XVIe siècle retrouvèrent cette plante dans toute l'Amérique latine et les colons anglais la retrouvèrent sur la côte américaine au XVIIe siècle. Les haricots et leur culture sont répandus en Afrique, en Asie et en Europe au début du XVIIe siècle grâce aux explorateurs espagnols et portugais. En Europe, cette plante fut d'abord cultivée pour ses grains; l’haricot vert frais ne fut consommé qu'à partir de la fin du XIXe siècle en Italie. Aujourd'hui, les grands producteurs d’haricots secs sont l'Inde, le Brésil, la Chine, les États-Unis, le Mexique et l'Indonésie. ‐ 12 ‐ CHAPITRE I – RECHERCHE BIBLIOGRAPHIQUE 1-2- Ecologie de l’espèce L’haricot est traditionnellement cultivé dans les zones subtropicales ou tempérées. Sous les tropiques, il est normalement trouvé dans les vallées de montagne (800-2000 m). L’haricot pousse mieux dans des sols bien drainés, sablolimoneux, limoneux ou argilolimoneux, riches en matières organiques à pH neutre. La température mensuelle optimale pour la croissance est de 15,6 °C à 21,1 °C, le maximum vers 27 °C, et le minimum vers 10 °C. Des températures de 5 à 6 °C sont nuisibles à la germination, entre 2 à 3 °C à la floraison, et entre 3 à 4 °C à la fructification. 1-3- Classification Royaume : Plantae Super division : Spermatophyta Division : Magnoliophyta Classe : Magnoliopsida Sous –classe : Rosidae Ordre : Fabales Famille : Fabaceae Genre : Phaseolus L. Espèce : vulgaris L. 1-4- Description : L’haricot est une plante herbacée avec un port qui peut changer d’une variété à une autre. Deux grands groupes sont distingués les variétés à tige volubile qui peut atteindre 3 m de hauteur ces variétés ont besoin de support pour soutenir la tige, et les variétés naines à tige ramifiée de 40 à 60 cm de hauteur (DUPONT et GUIGNARD,1989). Sur la tige, apparaissent des feuilles entières et opposées, de couleur verte, pétiolées, alternes et composées trifoliées. Les folioles ont une forme ovale-acuminée, presque losangée et ont de 6 à 15 cm de long sur 3 à 11 cm de large pointues à la fin (BELL,1994). Les pétioles, renflés à la base, et de petites stipules ou stipelles se trouvent à la base des pétioles supportant les folioles (SEIGNOBOS,1998). La racine est le siège du phénomène de la nodulation qui permet toutefois à la plante de fixer l’azote atmosphérique, la racine de l’haricot est pivotante avec des ‐ 13 ‐ CHAPITRE I – RECHERCHE BIBLIOGRAPHIQUE ramifications, elle peut atteindre 1 mètre de profondeur dans les conditions favorables (BARRETO,1983). Les fleures sont de 4 à 10 groupées en grappes déterminées, naissant à l'aisselle des feuilles. Ce sont des fleurs hermaphrodites, zygomorphes, au calice formé de cinq sépales soudés présentant cinq dents regroupées en deux lèvres, une corolle caractéristique des papilionacée, formée de cinq pétales inégaux et très différenciés : l'étendard est le pétale postérieur très développé et redressé, les ailes sont les deux pétales latéraux extérieurs, et la carène est formée des deux pétales inférieurs, partiellement soudés et recouverts par les ailes. La couleur des pétales varie du blanc verdâtre au carmin (BELL,1994). Des étamines au nombre de dix, neuf d'entre elles sont soudées par le filet, la dixième étant libre. Ovaire supère, est formé d'un seul carpelle à placentation pariétale, les ovules sont fixés sur la suture ventrale au nombre de 4 à 8 (PREVOST,1999). Après fécondation, apparait des gousses déhiscentes, appelées également « cosses », de forme et de longueur variable portant de 4 à 8 grains de forme réniforme et de couleur variable après maturité(TIRILLY et BOURGEOIS,1999). Les variétés à parchemin ne peuvent être consommées qu'en grain, ou en haricots verts à condition de récolter les gousses très jeunes. Celles dépourvues de parchemin sont dites « mangetout » et produisent des haricots verts consommables à un stade de maturité plus avancé correspondant au début de la formation des graines. 1-5- Description du cycle de développement de l’haricot La plante entame son cycle dans environ 3 à 4 mois selon les variétés et les conditions environnementales (LECOMTE,1997). Le cycle comprend une phase de germination qui dure entre 4 à 8 jours (suivant la température et l’humidité du sol). La germination est du type hypogé, les cotylédons sortent du sol et laissent apparaître les premières paires de feuilles (HUBERTE,1978). Une phase végétative dure un mois, c’est une phase de croissance à sa fin le plant d’haricot apparait avec une tige de 30 à 40 cm de hauteur pour les variétés naines et plus de 1 mètre pour les variétés langues (DUPONT et GUIGNARD,1989). Sur cette tige s’insère une dizaine de feuilles. Une phase de floraison de 1 mois, où les inflorescences apparaissent à l’aisselle des feuilles, après leur fécondation elles donnent naissance à des gousses qui prennent entre 20 à 30 jours pour atteindre la taille définitive (LECOMTE,1997), et 15 à 20 jours pour finir leur maturation. ‐ 14 ‐ CHAPITRE I – RECHERCHE BIBLIOGRAPHIQUE 1-6- Utilisation L’haricot commun est cultivé pour ses gousses comestibles immatures et pour les graines mûres sèches. En Amérique latine et dans certaines parties de l'Afrique tropicale, il est surtout cultivé pour la matière sèche pouls. En Europe, les États-Unis et d'autres pays tempérés, il est cultivé pour les gousses vertes immatures qui sont consommées comme légume et sont également en conserve et surgelées (PURSEGLOVE,1974). III- LES STRESS ABIOTIQUES Il est difficile pour le moment de faire des prévisions précises sur les effets des changements climatiques sur l’évolution des plantes et des écosystèmes en raison des différentes combinaisons climatiques qui pourront exister tant au niveau interannuel qu’intrannuel, et de la complexité des phénomènes concernés (WHITE et al.,1999). Il n’est de toute façon pas vraiment possible de prédire de manière globale les conséquences de l’effet de serre sur les écosystèmes, en partie justement parce que les écosystèmes naturels réagissent différemment suivant la géographie (WESSOLEK et ASSENG,2006). L’augmentation régulière des gaz à effet de serre notamment le CO2 pose la question d’un accroissement significatif de la température de l’air à la surface de la terre et de possibles changements climatiques avec des conséquences probables sur la végétation et les pratiques agricoles (WOLF et VAN OIJEN,2003). Pour envisager les impacts attendus des modifications environnementales, il est important de distinguer les effets directs des effets indirects de ces changements sur la production des cultures (MIRSCHEL et al.,2005). Les premiers recouvrent les modifications de l’activité photosynthétique des tissus chlorophylliens ainsi qu’un certain nombre d’effets connexes, tels que l’amélioration de l’efficacité d’utilisation de l’eau (LONG et BERNACCHI,2003); les seconds sont dus aux modifications du climat: l’augmentation de la température de l’air, par exemple, se traduit par un raccourcissement des cycles de végétation, soit, toutes choses égales par ailleurs, par une diminution du temps disponible pour mettre en place la production et donc par une diminution de celle-ci (LEUNING,2002). Mais elle peut aussi se traduire par une apparition plus fréquente de températures très élevées, handicapantes pour la production finale. Toutes ces influences se combinent négativement ou positivement pour déterminer la production végétale (JAME et al.,1998). ‐ 15 ‐ CHAPITRE I – RECHERCHE BIBLIOGRAPHIQUE Les changements prédits du climat, spécialement une hausse du CO2 atmosphérique, de la température et des précipitations, associée à des changements du dépôt azoté, des niveaux d'ozone troposphérique et stratosphérique, du rayonnement UVB, etc. peuvent avoir de grands impacts sur les modes de production et d'approvisionnement agricoles du monde (BAZZAZ et SOMBROEK,1997) Le bilan de ces divers effets sera vraisemblablement différent suivant que l’on considère des cultures annuelles (plantes à grains ou à tubercules, graminées ou légumineuses), des cultures pérennes herbacées, (plantes fourragères et prairies permanentes) ou ligneuses (vigne, arbres fruitiers). On est actuellement loin d’avoir examiner par simulation ou expérimentation les réactions de chacun de ces types de culture aux modifications attendues du milieu (YIN et VAN LAAR,2005). 1- Définition du stress La plante dans son environnement est exposée aux différentes contraintes biotiques et abiotiques. La contrainte abiotique est le résultat des différentes conditions environnementales que ce soit climatiques ou édaphiques défavorables à la croissance des plantes (MUNNE-BOSCH et ALEGRE,2004). La plante du fait qu’elle ne peut pas se déplacer, elle doit s’adapter à ces conditions stressantes de manière à réduire leurs impacts sur son bon fonctionnement (LEXER,2005). Un stress abiotique est toute condition environnementale défavorable empêchant la plante de se développer normalement et de se reproduire (KOTCHONI et al.,2006). Ce stress peut être induit par une forte salinité (LEE et al.,2004; KIM et al.,2005; YAN et al., 2005; ASKARI et al., 2006; PARKER et al.,2006), des hautes températures (MAJOUL et al., 2003,2004), des basses températures (RENAUT et al.,2004; CUI et al.,2005; AMME et al., 2006), du déficit hydrique (JONES, 2004 ; VINCENT et al., 2005; ALI et KOMATSU, 2006; JORGE et al., 2006, GORANTLA,2006), de la lumière (NAM et al., 2003; PHEE et al.,2004), des métaux (REQUEJO et TENA,2005; SARRY et al., 2006), d'un stress oxydatif (COUEE et al.,2007), de la pollution et du déficit nutritionnel (MUNNE-BOSCH et ALEGRE,2004) ou d'une combinaison entre eux (LANGRIDGE et al.,2006). ‐ 16 ‐ CHAPITRE I – RECHERCHE BIBLIOGRAPHIQUE 2- Stress thermique 2-1- Les basses températures L'un des défis environnementaux les plus graves aux plantes est les basses températures (YAN et al.,1999). La capacité de tolérer les basses températures change considérablement d’une espèce à une autre (LEUNING,2002). Les espèces tropicales sont les plus sensibles aux basses températures qui induisent des dommages irréparables même à des températures sensiblement plus hautes que la température de congélation des tissus (THOMASHOW,1999 ;BECK et al.,2004).Des dommages sont provoqués par l'affaiblissement des processus métaboliques, par des changements dans des propriétés de membrane, des changements de la structure des protéines (AMME, et al.,2006) et des interactions entre les macromolécules aussi bien que l'inhibition des réactions enzymatiques. Les plantes sensibles tolèrent des températures légèrement en-dessous de zéro, mais leurs tissus sont sévèrement endommagés. D'autre part, les plantes tolérantes le gel peuvent survivre à des niveaux variables des températures de congélation. Le degré de tolérance dépend de l'espèce, du stade de développement, et de la durée du stress (VISWANATHAN et al.,2004). L'exposition des plantes aux températures inférieures à zéro a comme conséquence le givrage extracellulaire, le flux de l'eau, et la déshydratation cellulaire. Par conséquent, la tolérance de congélation est fortement corrélée avec la tolérance à la déshydratation (provoquée par exemple par la sécheresse ou la salinité élevée) (ZHU et al.,2005). La déshydratation induite par le gel peut causer de diverses perturbations dans les structures de membrane, y compris des fusions de membrane (ÓRVAR et al.,2000). Bien que la déshydratation cellulaire causée par le gel soit une cause centrale des dommages de congélation, les facteurs additionnels contribuent aux dommages de congélation. Les cristaux de glace croissants peuvent endommager mécaniquement les cellules et les tissus. Les températures de congélation et la déshydratation peuvent causer la dénaturation des protéines et la rupture des complexes macromoléculaires (MEDLYN et al.,2002). 2-2 Les hautes températures L’augmentation soudaine de la température (choc de chaleur), provoque une dénaturation des enzymes et des protéines (AMME, et al.,2006). Les températures élevées peuvent également mener à accroître le déficit en eau pendant que les plantes évaporent plus d'eau pour refroidir leurs tissus de surface. ‐ 17 ‐ CHAPITRE I – RECHERCHE BIBLIOGRAPHIQUE Une réponse commune aux températures élevées est la biosynthèse des protéines spécifiques (HSPs), les facteurs de transcription qui induisent un sous-ensemble de gènes qui sont alors traduits en HSPs (NICOT et al.,2005). Il existe plusieurs classes de HSPs, qui ont la fonction de réparation des structures cellulaires endommagées (XIONG et al., 2002 ; WANG et al.,2004). Tandis que d'abord détectée pendant le stress de hautes températures, l'expression de HSP peut également être déclenchée par exposition à différents genres de stress, tels que l'infection ou l'exposition des cellules aux toxines, aux métaux lourds ou à la lumière UV, et au déficit hydrique (SACHETTO-MARTINS et al.,2000). Il s'avère que la présence et l'accumulation des membranes et des protéines endommagées fournit un signal pour l'induction rapide de la réponse au choque de chaleur (JENKS, 2006). 2-3- Réponse des plantes face au stress thermique Les plantes ont évolué un mécanisme adaptatif qui leur permet de survivre à la saison froide (Beck et al., 2004).L'adaptation au froid est associée à beaucoup de processus physiologiques et métaboliques, qui exigent des changements aux niveaux moléculaires et biochimiques et mène à une remise en ordre complète de métabolisme de cellules (KAYE et GUY,1995). La résistance froide peut être considérée ainsi comme un trait multigenic impliquant beaucoup de gènes dans le processus de tolérance au froid, un grand nombre de gènes a été isolé et caractérisé à partir de plusieurs plantes, mais seulement certains d'entre eux code pour les protéines dont la fonction biochimique est connue (JUNG et al., 2003). L'accumulation des molécules protectrices des métabolites contre la dégradation est associée à la tolérance au froid et/ou de gel (IBA,2002). Les changements de la composition des lipides et l'accumulation des sucres, qui sont susceptibles de contribuer à la tolérance de basse température, ne se fondent pas nécessairement sur des changements d'expression de gène, mais ils peuvent être provoqués complètement ou en partie par la nodulation et les enzymes de translation impliquées dans leur métabolisme (COSSINS et al.,2002; STITT et HURRY, 2002). La synthèse et l’accumulation des osmoprotecteurs même aux concentrations plus élevées sans interférer des processus physiologiques, collectivement connue sous le nom d'osmolytes compatibles, jouent un rôle central dans la réponse de la cellule au gel et plusieurs stress abiotiques (YANCEY, 2004). ‐ 18 ‐ CHAPITRE I – RECHERCHE BIBLIOGRAPHIQUE D’autres composés de faible poids moléculaire, comme les mono et les disaccharides (glucose, fructose, sucrose, et tréhalose), les amines (bétaïne de glycine), les polyols (mannitol, sorbitol), et les acides aminés (principalement proline), agissent en évitant la déshydratation des cellules par leur contribution à l'ajustement osmotique(HASEGAWA et al.,2000) et en stabilisant la structure quaternaire des protéines et des membranes (YANCEY, 2005).Au moins dans le cas de la proline, un rôle en tant qu'extracteur radical a été également rapporté (YOSHIBA et al.,1997). 3- Stress Hydrique L’eau occupe une place importante dans les phénomènes métaboliques, de part son rôle dans la photosynthèse (MAZLIAK,1995), le transport et l’accumulation ainsi que dans la multiplication et le grandissement cellulaire (HELLER et al.,1998), l’eau a un rôle essentiel dans la croissance et le développement des plantes (HOPKINS,2003). HSIAO (1973) a défini le déficit hydrique comme étant la situation dans laquelle le potentiel hydrique et la turgescence de la plante sont assez réduits au point de perturber le déroulement optimal des différentes fonctions. La dessiccation est une perte d’eau plus accentuée qui peut potentiellement conduire à une interruption du métabolisme, une déstructuration cellulaire et éventuellement un arrêt de l’activité enzymatique (SMIRNOFF,1993; MARTRE,1999). Les contraintes hydriques connues sont de deux types ; édaphiques et atmosphériques (MARTRE et al.,2000). Les contraintes édaphiques, qui correspondent à une disponibilité en eau réduite dans le sol (LIANG et al.,2002). En ce qui concerne les contraintes atmosphériques, lorsque la demande évaporatoire augmente, les pertes d’eau par transpiration créent un flux d’eau dans la plante, qui du fait des résistances aux mouvements d’eau dans le sol et la plante, entraînent une altération de l’état hydrique de la plante (MARTRE et al.,2000). 1- Effets du déficit hydrique sur les plantes Le manque d’eau s’agit d’un simple flétrissement limitant la photosynthèse et se traduisant par un arrêt de croissance ou un manque d’accumulation de réserves (HELLER et al.,1998). Bien qu’utilisé pour la mise à fleur de certaines plantes, un manque d’eau peut aussi provoquer l’avortement des organes sexuels, la chute des fleurs, des fruits, et même des feuilles en commençant par les vieilles (HOPKINS,2003). ‐ 19 ‐ CHAPITRE I – RECHERCHE BIBLIOGRAPHIQUE La résistance à la sécheresse dépend de l’aptitude de la plante à développer un système radiculaire important et à limiter ses pertes d’eau cuticulaires ou stomatiques. Cette résistance dépend également du passé de chaque individu (TURNER,1990). Le stress hydrique diminue l’indice foliaire et la durée de vie de la feuille, et par voie de conséquence, la capacité photosynthétique (TURNER et al.,1987). L’acide abscissique (ABA), qualifié «d’hormone de stress», est synthétisé rapidement et semble avoir un rôle important dans la réponse au stress, dans l’inhibition de la photosynthèse et le ralentissement de la croissance des feuilles (MALAMY,2005). 2- Les paramètres d’adaptation et de résistance à la sécheresse Certains paramètres d’adaptation caractérisent le calage du cycle vis-à-vis des évènements climatiques en évitant la coïncidence des phases critiques du cycle avec les dates d’occurrence maximale de certains accidents climatiques (MONNEVEUX,1991). La plante doit abaisser son potentiel hydrique par l'accumulation active des osmolytes minéraux ou organiques afin que sa valeur s'ajuste à celle du milieu qui diminue sous l'effet de la sécheresse ou l'accumulation des sels (MUNNS et al.,2000). 4- Le stress salin 4-1- Généralités sur la salinité La présence de fortes doses de sels dans le sol surtout avec un mauvais drainage constitue un immense danger pour l’agriculture car elle conduit généralement à une dégradation des sols, une baisse de leur fertilité et elle occasionne une toxicité aux végétaux ce qui réduit le nombre d’espèces dont la culture est possible sur ces terres (OMAMI, 2005). La salinité peut être définie comme étant un processus pédologique suivant lequel le sol s’enrichit anormalement en sels solubles acquérant ainsi le caractère salin (EILERS et al.,1995; GREGORY,2005). Un sol salé est caractérisé par un surplus de sels est en particulier l’ion Na+ dans le profile (SCHUT,1996). La formation d'un sol salin résulte généralement de l'accumulation de sels dans les horizons de surface (LEVY,2000; BRADY et WEIL,2002; ESSINGTON,2004). Ce processus dépend essentiellement du régime hydrique du sol et des sources de sel. Lorsque le climat est chaud et sec, entraînés par les eaux capillaires suivant le flux d'évaporation, les sels sont accumulés en surface. Les sels les plus communs présents dans la solution du sol correspondent aux cations Ca2+, Mg2+, Na+, K+, et aux anions Cl-, SO4-- , CO3--, NO3- . ‐ 20 ‐ CHAPITRE I – RECHERCHE BIBLIOGRAPHIQUE D'autres sels moins courants et plus toxiques à faibles concentrations sont également à considérer. Ces éléments traces sont le bore, le sélénium, l'arsenic et le molybdène (ESSINGTON 2004; GREGORY,2005). Les sels peuvent avoir deux origines ; I) une origine primaire qui dérive de l’altération de la roche mère, les sels résultants de cette altération sont entrainés dans les canaux capillaires en surface, cette action est accentuée beaucoup plus par l’aridité du milieu (ANTIPOLIS,2003). II) une origine secondaire liée étroitement à l’activité humaine dont les sels proviennent soit des eaux d’irrigation en présence d’un mauvais drainage ou de l’utilisation abusive des engrais chimiques ainsi que des apports alluviaux (MASHALI et al.,2005). Généralement la salinité d’un sol est mesurée par la conductivité électrique de l’extrait de la pâte saturée à 25°C (KENFAOUI,1997) en effet un sol est considéré salé quand sa conductivité électrique devient supérieure à 4millimhos.cm-1 (HALITIM,1986). 4-2- Effets des sels sur les plantes Les effets nocifs sont habituellement associés au bas potentiel osmotique de la solution du sol et à la toxicité de l'ion sodium, qui cause de multiples effets défavorables sur le métabolisme, la croissance et le développement des plantes aux niveaux moléculaires, biochimiques et physiologiques (ZHU,2001; APSE et BLUMWALD,2002). L’expérience menée par GREENWAY et OSMOND (1972) a prouvé que les activités des enzymes extraites à partir des halophytes étaient également aussi sensibles au NaCl que celles extraites à partir des glycophytes (haricots ou pois). Le NaCl affecte les activités enzymatiques moins dans les racines que dans des feuilles (DEBOUBA et al.,2007). C’est l’ion Na+ qui est accusé dans le blocage de la plupart des enzymes à une concentration au-dessus de 100Mmmol (FLORES et al.,2000). Par conséquent, les possibilités des plantes de soutenir une concertation en Na+ cytosolique minime sont considérées comme facteurs décisifs de la tolérance au sel (FLOWERS,2004). Généralement, le stress salin réduit le potentiel hydrique causant un déséquilibre et une perturbation dans l'homéostasie d'ion (HOPKINS,2003), également, la toxicité d'ion empêche les fonctions enzymatiques des principaux processus biologiques (BLUMWALD et al.,2004). Avec ces effets primaires, les effets secondaires tels que des dommages oxydatifs qui se produisent suite à l’augmentation des concentrations ioniques perturbant ainsi l'homéostasie cellulaire (DAT et al.,2000). ‐ 21 ‐ CHAPITRE I – RECHERCHE BIBLIOGRAPHIQUE Puisque le stress salin implique un stress osmotique et un stress ionique (HAYASHI et MURATA,1998), la réduction de croissance est directement liée à la concentration totale des sels solubles ou au potentiel osmotique hydrique du sol (GREENWAY et MUNNS,1980). Ces effets mènent à la limitation de la productivité végétale, aux changements de la structure des feuilles et l'ultrastructure des chloroplastes et la perturbation du métabolisme azoté (CARILLO et al.,2005) aussi bien que l'assimilation d'hydrate de carbone et l’efficience de la photosynthèse (GHANEM et al.,2008). On peut observer les effets néfastes de la salinité élevée sur les plantes telle que la réduction significative de croissance, diminution de la productivité, et même la mort des plantes (MILLER et al.,2006). L'accumulation de Na+ dans les tissus des feuilles a habituellement comme conséquence des dommages de vieilles feuilles, qui raccourcissent leur vie. De ce fait, le rendement photosynthétique se baisse induisant la chute de la productivité végétale (GHANEM et al.,2008). Une concentration élevée en NaCl a comme conséquence une diminution de la biomasse racinaire et foliaire (MELONI et al.,2001).En outre, la contrainte saline peut également induire ou accélérer la sénescence des organes reproducteurs (ASCH et WOPEREIS,2001). Dans le coton cultivé aux champs, le stress salin provoque d’importants avortements de ses organes reproducteurs menant à la perte de rendement et à la mauvaise qualité de fibre (DAVIDONIS et al.,2000). • Effets de salinité sur la feuille La salinité augmente l'épaisseur épidermique, l'épaisseur du tissu mésophyllien, la longueur des cellules palissadiques, le diamètre de palissade et le diamètre des cellules spongieuses dans des feuilles d'haricot, de coton et d'Atriplex (LONGSTRETH et NOBEL, 1979). La microscopie électronique prouve que la structure thylakoïdale des chloroplastes devient désorganisée, le nombre et la taille des plastoglobulines, et leur teneur en amidon diminue dans les plantes traitées avec du NaCl (HERNANDEZ et al.,1995).Dans le mésophile des feuilles de la patate douce, les membranes de thylakoïde du chloroplaste sont gonflées, et la plupart d’elles est perdue, ainsi que les membranes des cellules qui sont devenues tordues, ridées sous un fort stress salin (MITSUYA et al., 2000). ‐ 22 ‐ CHAPITRE I – RECHERCHE BIBLIOGRAPHIQUE • Effets de salinité sur la photosynthèse La croissance des plantes, telle que la production de la biomasse, est une mesure principale de la photosynthèse nette et donc, la plupart des stress environnementaux et en particulier le stress salin diminuent la croissance et réduisent nettement le taux de la photosynthèse (KAWASAKI et al.,2001; CHAVES et al.,2008). Quelques études ont montré que la salinité n'a aucun effet négatif sur le photosystème II (PSII) (MORALES et al.,1992) , alors que récemment d’autres études ont prouvé que la contrainte saline inhibe l'activité du PSII (GHANEM et al.,2008). Bien que la photosynthèse n’est pas toujours ralentie par la salinité mais elle est également stimulée par des basses concentrations en sels dans quelques espèces (KURBAN et al.,1999). La salinité diminue l'assimilation de CO2 par des réductions de surface des feuilles (MUNNS et al.,2000), conductibilité des stomates (PARIDA et al.,2003), conductibilité mésophyllienne, efficacité des enzymes photosynthétiques (REDDY et al.,1992) et le bon fonctionnement de photosystèmes (REDONDO-GOMEZ et al.,2008). • Effet de la salinité sur le métabolisme azoté Chez les légumineuses, le métabolisme azoté et la synthèse protéique sont sévèrement affectés par le stress salin, limitant ainsi fortement la productivité et le développement normal des plantes (PESSARAKLI et al.,1989). Cette contrainte provoque aussi la diminution de l’activité de la nitrogénase et d’autres enzymes impliquées dans l’assimilation de l’azote (Delgado et al.,1993), la salinité peut même affecter la vie microbienne du sol et donc la minéralisation de l’azote. • Effets de salinité sur l’activité de la nitrate réductase (NR) et l’assimilation de l’azote La réduction de NO3- en NO2- catalysée par la nitrate réductase (NR) est considérée comme étape clé dans l'assimilation d'azote (DEBOUBA et al.,2007). La salinité peut affecter négativement l'expression et l'activation du NR et peut également influencer sa stabilité (HUBER et KAISER 1996 ; DEBOUBA et al.,2006). L'activité de la nitrate réductase dans les feuilles diminue chez beaucoup de plantes sous stress salin (MELONI et al.,2001). La cause primaire de la réduction de l'activité de NR dans les feuilles est la présence d'une concentration élevée de Cl- et de Na +, qui mène à une diminution de l’absorption du NO3- et en conséquence la diminution de la concentration en NO3- dans les feuilles (SILVEIRA et al.,2001). Ceci peut mener à de ‐ 23 ‐ CHAPITRE I – RECHERCHE BIBLIOGRAPHIQUE graves conséquences pour l'assimilation entière des nitrates par les plantes. La déclinaison de l’activité du nitrate réductase (ANR) et la baisse du niveau des nitrates dans les conditions de salinité élevée peuvent être responsables d'une réduction de croissance des plantes et de la production de biomasse sous stress salin (DEBOUBA et al.,2007). L'activité du NADP et du ICDH (déshydrogénase d'isocitrate), qui est une enzyme cytosolique principale qui relie le métabolisme du carbone et d'azote en fournissant des squelettes de carbone pour l'assimilation primaire d'azote chez les plantes, augmente dans les feuilles et diminue dans les racines, alors que l'activité du synthase ferredoxin- dépendant de glutamate, qui est l'enzyme principale de l'assimilation d'azote et de la biosynthèse des acides aminés, diminue dans des feuilles en réponse à la salinité élevée (POPOVA et al.,2002). • La symbiose sous stress salin L'établissement de la symbiose est extrêmement sensible au stress salin (HUNGRIA et VARGAS,2000), tandis que les nodules entièrement développés qui avaient été formés sous contrainte saline peuvent continuer à fixer l'azote (SINGLETON et BOHLOOL,1984). La capacité bactérienne de s'adapter à la salinité est importante pour la fonction de fixation d'azote bactéroïde à l'intérieur des nodules des légumineuses (FERRI et al.,2000). Parmi plusieurs espèces de rhizobium examinées pour leurs tolérance au sel, le meliloti a exprimé une capacité beaucoup plus élevée de survivre dans le milieu salin comparant au leguminosarum et particulièrement japonicum (BERNARD et al.,1986). La tolérance à la salinité du rhizobia est partiellement associée à l'osmorégulation réalisée par l'accumulation des composés solubles (IMHOFF, 1986). En outre, l'activité du nitrogénase, le nombre de nodule et l'accumulation de matière sèche dans le soja (ABDALLA et al.,1998) et la luzerne (SERRAJ et DREVON, 1998) ont été affectées par le stress salin. • La survie des bactéries symbiotiques sous contrainte saline Plusieurs revues se sont concentrées sur les réponses des bactéries aux variations de la teneur en sels dans leur environnement (MILLER et BOIS,1996). Le milieu hypertonique cause l'efflux rapide de l'eau, la perte de turgescence ce qui mène à la plasmolyse des cellules bactériennes (CSONKA,1989 ; POOLMAN et GLAASKER,1998). Dans les sols salés l'osmolarité de la rhizosphère, (la surface de la racine) est légèrement supérieure de quelques centimètres plus loin, ou à la surface parce ‐ 24 ‐ CHAPITRE I – RECHERCHE BIBLIOGRAPHIQUE que les tissus des racines excluent des sels et les bactéries sécrètent les aliments et le mucilage organique (MILLER et WOOD, 1996). On suppose que plusieurs facteurs abiotiques dans le sol, tel que le stress hydrique, la température élevée du sol, la salinité, le déficit nutritif, l’alcalinité et l’acidité peuvent limiter la croissance, la nodulation et la fixation du N2 chez les légumineuses (HUNGRIA et VARGAS,2000). • La fixation du N2 sous stress salin De nombreuses études ont prouvé que la contrainte hydrique, saline et thermique réduisent nettement la fixation du N2 et l’activité de nitrogénase des nodules des légumineuses (ZAHRAN,1999). Des phénomènes semblables étaient observés chez l’acacias et d'autres légumineuses boisées (MARCAR et al.,1991; PURWANTARI et al., 1991). L’activité nitrogénase est limitée du fait de la perturbation de la photosynthèse par la salinité (DELGADO et al.,1993, SERRAJ et al.,1998). L'activité de Nitrogénase peut même être plus sensible à une diminution de potentiel hydrique du sol induite par une sécheresse ou salinité (PARARAJASINGHAM et KNIEVEL,1990). Plusieurs changements dans le métabolisme des nodules sont associés à l'activité réduite de la fixation du N2 ou de nitrogénase, réduction résultante d’une diminution leghémoglobine et de la disponibilité en O2 (HUNGRIA et VARGAS,2000). Il n'est pas encore clair, comment les stress abiotiques causent un déclin dans la fixation du N2 et une des hypothèses communes est que les effets des stress environnementaux sont négociés par des variations de résistance nodulaire de diffusion de gaz (SUTHERLAND et SPRENT,1993). Plus précisément, le taux de fixation du N2 peut être limité par l'approvisionnement en O2 (WALSH,1995). Dans les nodules soumises à une contrainte, la fourniture O2 aux bactéroïdes peut être limitée de deux manières : I) l'emballage de différentes couches des cellules corticales limite la diffusion d' O2 (GUERIN et al.,1990) et II) les protéases alcalines dégradent le O2 binding leghemoglobin (GUERIN et al.,1991). La salinité modifie la teneur en sucres solubles et des composés azotés dissous dans le cortex de nodule, ayant pour résultat des changements de turgescence des cellules corticales, plus tard, cet événement affecte la forme des cellules corticales et la teneur en eau intercellulaire, davantage changeant la perméabilité du cortex de nodule aux gaz (SUTHERLAND et SPRENT,1993) et par conséquent, parce que l'anatomie de nodule et la physiologie sont hétérogènes pour les légumineuses, les réponses de la fixation du N2 ‐ 25 ‐ CHAPITRE I – RECHERCHE BIBLIOGRAPHIQUE aux contraintes environnementales peuvent être une propriété des espèces spécifiques (WALSH,1995). 4-3- Réponses des plantes face au stress salin 4-3-1- Glycophytes et Halophytes La plupart des plantes sont des glycophytes qui ne peuvent pas tolérer le stress salin, à l’opposé les halophytes répandues parmi les divers ordres des plantes supérieures sont capables de se développer naturellement sous la salinité élevée (REDONDO-GOMEZ et al.,2007). Considérons que des glycophytes sont sévèrement troublés ou même tués par 100 à 200 mmol.l-1 de NaCl, les halophytes peuvent survivre une salinité au-dessus de 300 mmol.l-1 (BELKHODJA,1996).Quelques halophytes peuvent tolérer des niveaux extrêmement élevés de sels (TAJI et al.,2004).Par exemple, l’Atriplex vesicaria peut produire des hauts rendements en présence de 700 mmol.l-1 de NaCl, alors que Salicornia europaea resterai vivante à une concentration de 1000 mmol.l-1 de NaCl (REDONDOGOMEZ et al.,2007). Sur l'autre extrémité sont les glycophytes, très sensibles aux sels, par exemple les arbres fruitiers sont sensibles à quelques millimoles par litre de NaCl (HU,2007). Les plantes ne peuvent pas physiquement se déplacer pour s’éloigner des stress environnementaux qui peuvent affecter négativement leur croissance. Par conséquent, les plantes ont dû évoluer des stratégies pour faire face à ces stress abiotiques (LEXER et FEE, 2005). Les plantes doivent sentir le stress avant de pouvoir répondre convenablement. Après son identification initiale, une cascade de transduction du signal, activant finalement les gènes pour agir contre cette contrainte produisant de la réponse initiale au stress. Des produits provoqués par la tension de gène peuvent être divisés en deux groupes principaux ; ceux impliqués dans la tolérance à la contrainte et ceux impliqués dans la transduction du signal. Ces derniers peuvent inclure la synthèse des chaperons et des enzymes pour la biosynthèse, la désintoxication des osmolytes et des changements dans la composition des lipides de la membrane (RAO et al.,2002). Les produits de gène peuvent également agir en tant que régulateurs de transcription commandant des ensembles de gènes soumettes à une contrainte spécifique ou soient impliqués dans la production des molécules de normalisation, telle que l'hormone ABA (HASEGAWA et al.,2000). RABBANI et al (2003) ont également démontré le chevauchement dans l'expression de gène entre les stress environnementaux. ‐ 26 ‐ CHAPITRE I – RECHERCHE BIBLIOGRAPHIQUE Autrement, les plantes sous l’effet des sels peuvent montrer des modifications morphologiques adaptatives tel que, le faible allongement des organes, le raccourcissement des entre-nœuds des tiges et la diminution de la surface des feuilles qui deviennent charnues (HAMZA,1982). 4-3-2- Réponse de croissance Le stress salin provoque une augmentation de la concentration en acide abscissique (ABA) dans la partie aérienne ou une réduction des concentrations en cytokinine (FINKELSTEIN,2002).Ceci résulte d’une croissance et une transpiration réduites (ITAI,1999). L’effet le plus commun des stress abiotiques sur la physiologie des plantes est ainsi la réduction de la croissance (ZHU,2001). La réduction de la croissance est une capacité adaptative nécessaire à la survie d’une plante exposée à un stress abiotique (ZHU,2001).En effet, ce retard de développement permet à la plante d’accumuler de l’énergie et des ressources pour combattre le stress avant que le déséquilibre a l’intérieur et l’extérieur de l’organisme n’augmente jusqu’à un seuil où les dommages sont irréversibles. Pour illustrer cette tendance, dans la nature, la croissance est inversement corrélée à la résistance au stress salin d’une espèce/variété (ZHU,2001).L’essentiel de la recherche portant sur les stress - en l’occurrence, ceux provoqués par la salinité - tend à comprendre l’origine, les processus et les raisons de cette limitation. En plus du contrôle de la croissance par les signaux hormonaux, la réduction de croissance résulte de la dépense de ressources dans les stratégies d’adaptation. Dans le cas d’un stress salin ou hydrique, la disponibilité de l’eau du sol est réduite. Or une plante pour survivre et croître doit faciliter le flux d’eau conduit par la transpiration contre les forces osmotiques, matricielles et gravitationnelles du sol. Ainsi, pour s’adapter au manque d’eau et maintenir l’hydration et la turgescence de ses tissus, la plante va par exemple faciliter l’entrée d’eau au niveau des racines. L’absorption d’eau peut être facilitée notamment en augmentant la conductivité hydraulique (composition membranaire) ou en ‐ 27 ‐ Matériel et méthodes CHAPITRE II- MATERIEL ET METHODES I - Matériel végétal Nous avons utilisé comme matériel végétal une variété d’haricot de couleur noire (Aljadida) d’une taille moyenne. Les graines ont séjourné dans un réfrigérateur avant leur utilisation. Cette expérimentation a été réalisée dans une serre au niveau de l’université d’Es Senia à Oran dont les conditions sont semi contrôlées. II - Méthodes 1 - Préparation des pots Les graines sont mises à germer dans des boîtes de Pétri en verre stérilisées. Pour la culture, les graines germées sont repiquées dans des pots de 20 cm de hauteur et 15 cm de diamètre, perforés en bas, tapissés par une couche de gravier pour permettre l’évacuation de l’eau en excès (drainage), sur cette couche est déposée une bande à gaze pour retenir le substrat. 2 - Préparation du substrat Le substrat utilisé est un mélange de sable prélevé au bord de la mer, lavé plusieurs fois à l’esprit de sel puis avec de l’eau distillée. Pour tester la pureté de ce sable, il a été procédé à l’utilisation du nitrate d’argent. Ce sable est étalé sur du papier pour sécher. Dans les pots ce sable est mélangé avec du terreau commercial (2V/1V). 3 - Déroulement de l’expérimentation - Test préliminaire de la germination La germination est une étape facultative mais elle nous permet de tester la faculté germinative des grains d’une part et d’avoir une certaine homogénéité des plantes après la transplantation. Des graines choisies soigneusement, désinfectées par trempage dans l’eau de javel (5 %) puis rincées à l’eau distillée, sont mises à germer dans des boîtes de Pétri à une température de 22 °C. - 33 - CHAPITRE II- MATERIEL ET METHODES Fig.1- Graines mises en germination - Repiquage des graines germées Après 5 jours, les graines germées (apparition de la radicule) sont mises en pots à raison de 1 à 2 graines par pot à une profondeur convenable (0,5 à 1 cm) avec un léger tracement immédiatement arrosées avec de l’eau distillée pour permettre un bon contacte sol-graine. Après l’apparition des premières feuilles, une seule plante par pot est conservée, l’eau distillée est remplacée par la solution nutritive de HOAGLAND (1938). Tableau A - Composition de la solution nutritive de HOAGLAND (1938). produit Nitrate de potassium Nitrate de calcium Nitrate d'Ammonium Sulfate de magnésium Phosphate monopotassique Hydrogenophosphate di-potassium Chlorure de manganèse Sulfate de cuivre Formule chimique KN03 (N03)2 Ca 4H20 NO3 NH4 iS04Mg 7H20 PO4H2K PO4K2H 3H20 Cl2Mn 4H20 CuS045H20 Concentration en mg.l-1 191.90 129.80 210 61.5 54.40 34.23 1.80 0.176 Sulfate de zinc Zn SO4 7H20 0.219 Acide borique H3BO3 2.861 Molybdate d'ammonium M07024(NH4)7H20 0.285 Complexe ferrique EDTAferrique (C10H12FeN2Na08) 0.050 - 34 - CHAPITRE II- MATERIEL ET METHODES - Dispositif expérimental Nous avons réalisé cette expérimentation à l’aide de 25 pots avec 5 traitements, à raison de 5 pots par traitement (5 répétitions). Les plantes après repiquage sont irriguées à la capacité au champ. Fig.2- Dispositif expérimental 4- Les traitements salins appliqués Deux types de traitements salins sont réalisés; l’un au NaCl à 100 meq.l-1 et 200 meq.l-1 ; le deuxième au NaCl + CaCl2 à 100 meq.l-1 et 150 meq.l-1 ; les plantes témoins sont alimentées à l’eau de robinet. L’irrigation est réalisée une fois par semaine. 5 - Paramètres mesurés - Dosages des protéines solubles • Principe La concentration en protéines solubles des différents organes a été déterminée en utilisant le bleu brillant de Comassie avec de l'albumine de sérum bovin pour établir la courbe étalon (BRADFORD,1976). • Préparation du broyat végétal Pour le dosage des protéines solubles, toutes les parties de la plante (feuille, tige et racine), coupée en petits morceaux, ont été broyés indépendamment à froid dans de l'azote liquide en utilisant un mortier en porcelaine, maintenu tout le long de la manipulation sous la glace jusqu’à l’obtention d’une poudre fine. - 35 - CHAPITRE II- MATERIEL ET METHODES Fig.3 - Préparation du broyat végétal. • Préparation des extraits protéiques De chaque broya, on prend 1g auquel on ajoute 10 ml de tampon d'extraction, bien homogénéisé dans un deuxième mortier, la solution obtenue est centrifugée à 6000 tours pendant 25 mn. • Préparation du réactif Le réactif de BRADFORD (1976) est composé de : • 9 100 mg de Bleu de Coomassie G250, 9 50 ml d’éthanol à 95° 9 100 ml d’acide phosphorique à 85%, 9 le volume est ajusté à 1000 ml avec de l’eau déminéralisée. Etablissement de la gamme étalon La quantité des protéines de l’échantillon est déterminée par référence à une courbe d’étalonnage établie avec le sérum albumine bovine. - 36 - CHAPITRE II- MATERIEL ET METHODES A partir d’une solution mère de SBA (1 mg.ml-1), on prépare une gamme étalon de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 et 100 ug.ml-1. On ajoute à 100 µl de chaque solution 5 ml de réactif de Bradford et Après 5 minutes, on lit les densités optiques à 595 nm pour établir une courbe étalon. 0,25 DO 0,2 y = 0,0022x 2 R = 0,9797 0,15 0,1 0,05 0 0 20 40 60 80 100 120 µg.ml-1 Fig.4- Gamme étalon de BSA. • Dosage des protéines solubles De même comme la courbe étalon, 100 µl de l’extrait protéique sont mis dans un tube à essai bien propre auquel on ajoute 5 ml de réactif de Bradford. Après 5 mn on lit l’absorbance à 595 nm. 2 - Détermination de l’activité du nitrate réductase (ANR). La mesure de l'activité de nitrate réductase (ANR) in situ, mise au point par Robin et al., (1983) et améliorée par OBATON (1993), consiste à doser le nitrite produit par réduction du NO3– dans un échantillon intact de végétal. La partie végétale excisée au niveau du collet après avoir été pesée est introduite dans un tube de 13 ml (Venoject Térumo) contenant 1 ml de KNO3. Le tube est fermé hermétiquement avec un bouchon en caoutchouc traversé par deux aiguilles de seringues creuses. L'anoxie est réalisée en injectant par une des aiguilles de l'azote gazeux sous pression (1.5 à 2 bars) réglée à l'aide d'un manomètre à la sortie de bouteille, la deuxième aiguille permet la sortie de l'air. Le balayage d'azote est interrompu après une minute par retrait simultané des deux aiguilles. Après l'incubation dans l'azote gazeux et à l'obscurité pendant 25 minutes, l'extraction du nitrite est réalisée par addition de 5 ml d'eau déminéralisée bouillante et passage au bain-marie à 100°C pendant 10 minutes. - 37 - CHAPITRE II- MATERIEL ET METHODES Le nitrite produit est alors révélé en ajoutant 2 ml de sulfanilamide (10g.l–1 dans HCl 1.5N) et 2 ml de (N-Naphtyl – Ethylène Diamine Dichlorure 0.2g.l–1). Après 20 minutes de réaction, la lecture de l'absorbance est effectuée à 540 nm. Un blanc constitué par un échantillon laissé à l'air et à la lumière est traité de la même façon permet de soustraire l'absorbance due aux pigments des tissus. La quantité de nitrite formée est exprimée en micromoles par heur et par gramme de matière fraîche (µmol de NO2.h-1.g-1 MF) (Voir annexe 04). 3 - Les paramètres de la nodulation • Nombre de nodules par plante Les racines après être séparées de la partie aérienne, sont soigneusement lavées puis déposées dans un récipient en verre rempli d’eau, qui nous facilite le comptage manuel des nodules. Fig.5- Dénombrement des nodules - 38 - CHAPITRE II- MATERIEL ET METHODES • Détermination du poids frais Après lavage des racines, les nodules sont soigneusement récupérées dans des boites de pétries, puis leur poids frais est mesuré à l’aide d’une balance. Après, les racines sont récupérées dans des boites de pétries préalablement pesées qui sont introduites dans l’étuve à une température de 80 à 85 0c pondant 48 heures afin de déterminer leurs poids secs. 6 - Analyse statistique Le dispositif expérimental procédé dans cette étude est en bloc aléatoire complet. Les données ont été analysées en utilisant le logiciel SPSS, l'analyse statistique a été exécutée en utilisant le test de Student suivie par une analyse de corrélation afin de mettre en évidence les relations qui existent entre les différents paramètres étudiés. Les valeurs sont mentionnées dans le tableau par leur moyenne plus au moins leur écart type pour les cinq échantillons de chaque traitement. - 39 - Résultats obtenus CHAPITRE III- RESULTATS I – TENEURS EN PROTEINES SOLUBLES DANS LES DIFFERENTS ORGANES DES PLANTES STRESSEES. 1 – Au NaCl La figure 6 montre que les teneurs en protéines solubles diminuent lorsque la concentration en NaCl augmente. Cette réduction du composé protéique évolue de manière très lente particulièrement dans les feuilles ; les teneurs passent de 329.36 µg.ml-1 chez les 400 Feuilles Tiges Racines Proteines (µg.ml-1) 350 300 250 200 150 100 50 0 Témoin 100 meq 200 meq NaCl Fig.6 – Teneurs en protéines solubles des feuilles, des tiges et des racines des plantes d’haricot âgées de 6 semaines, stressées au NaCl. feuilles des plantes témoins à 80 % dans les feuilles des plantes recevant la solution à 100 meq.l-1 de NaCl pour atteindre un taux de protéines solubles de 64% dans celles des plantes Tableau 2 – Test de signification de Student à P= 5% des teneurs en protéines solubles (µg.ml-1) des feuilles, des tiges et des racines des plantes d’haricot âgées de 6 semaines, stressées au NaCl. Témoin Feuilles Racines Tiges ** s 100 meq.l-1 200 meq.l-1 329,36±26,95 264,05±40,04** 121,08±19,66** 146,90±16,65 219,11±29,56** 52,37±2,62** s s 74,23±10,57 59,60±6,99 44,23±4,36** s s s variabilité entre les traitements variabilité entre les organes ‐ 40 ‐ CHAPITRE III- RESULTATS stressées à 200 meq.l-1 de sel. Au niveau des tiges, les teneurs sont manifestement les plus faibles soit pour les plantes témoins ou celles traitées à la salinité ; les valeurs enregistrées représentent un taux de 22 % par rapport aux feuilles témoins et celles des plantes sous stress à 100 meq.l-1 de NaCl alors que cette teneur passe à 43% pour les plantes qui recoivent 200 meq.l-1 de NaCl. Au contraire dans les racines , les protéines solubles varient en augmentant sous le traitement salin jusqu’à une teneur de 219,11 µg.ml-1; cette teneur chute brusquement dans les racines des plantes nourries à 200 meq.l-1, soit un taux de réduction de 58 %. L’analyse de la variance à l’aide du test de Student à P=5% révèle l’existence d’un effet significatif de la salinité sur les protéines solubles. 2 - Au NaCl+CaCl2 La figure 7 montre qu’il y a une augmentation de la teneur des protéines solubles dans les racines au fur et à mesure de l’augmentation de la salinité ; elle passe de 146,9 µg.ml-1 à 203,53 et 221,58 µg.ml-1 successivement sous les traitements 100 et 150 meq.l-1 de NaCl+CaCl2 ce qui donne des taux d’augmentation respectivement de 38% et 50 %. Au niveau des feuilles et des tiges (fig 7), il faut noter une diminution de 18 % du taux des protéines solubles chez les plantes nourries à 100 meq.l-1 par rapport aux plantes témoins, puis une légère augmentation de ces composés se produit. Feuilles Tiges Racines Proteines (µg.ml-1) 400 350 300 250 200 150 100 50 0 Témoin 100 meq 150 meq NaCl + CaCl2 NaCl+CaCl2 Fig.7 – Teneurs en protéines solubles des feuilles, des tiges et des racines des plantes d’haricot âgées de 6 semaines, stressées au NaCl+CaCl2. Les teneurs des protéines solubles chez les tiges demeurent toujours les plus basses sous tous les traitements ; elles représentent entre 22% et 23 % des teneurs en protéines ‐ 41 ‐ CHAPITRE III- RESULTATS foliaires et 50 % de celles notées chez les racines des plantes témoins ; tandis que ces teneurs deminuent sous stress salin pour atteindre un taux de 28 %. Tableau 3– Test de signification de Student à P= 5% des teneurs en protéines solubles (µg.ml-1) des feuilles, des tiges et des racines des plantes d’haricot âgées de 6 semaines, stressées au NaCl+CaCl2. Témoin 100 meq.l-1 150 meq.l-1 Feuilles 329,36±26,95 269,92±18** 279,07±27,08** Tiges 74,23±10,57 s 59,16±7,58** s 62,83±8,06 s Racines 146,90±16,65 s 203,53±22,04** s 221,58±20,41** s L’analyse statistique (tableau 3) révèle un effet significatif de la salinité sur les teneurs en protéines solubles au niveau des feuilles et des racines sous tous les traitements.Cependant, aucun effet significatif n’est observé sur les teneur en protéines des tiges des plantes conduites à 200 meq.l-1 NaCl+CaCl2. II - ETUDE DU RATIO DES PROTEINES SOLUBLES 1 - Ratio partie aérienne/partie souterraine sous stress au NaCl Les plantes sous stress salin 100 meq.l-1 présentent un ratio des protéines solubles faibles (1.24) par rapport aux plantes témoins qui affichent un ratio de (2.79) ; cette faiblesse est due essentiellement à une dimunution du taux des protéines solubles dans la ratio des protéines solubles partie aérienne alors qu’une remarquable augmentation dans les racines se manifeste. 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 Témoin 100 meq 200 meq NaCl Fig.8 – Ratios des protéines solubles parties aériennes (feuilles+tiges)/ racines des plantes d’haricot âgées de 6 semaines, stressées au NaCl. ‐ 42 ‐ CHAPITRE III- RESULTATS Chez les plantes traitées à 200 meq.l-1 le ratio devient supérieur à celui des plantes témoins (tableau 4). Tableau 4 –Ratios des protéines solubles parties aériennes (feuilles+tiges)/ racines des plantes d’haricot âgées de 6 semaines, stressées au NaCl. Témoin 100 meq.l-1 200 meq.l-1 2,79 1.24 3.31 Ratio des protéines solubles 2 - Ratio partie aérienne/partie souterraine sous stress au NaCl+CaCl2 Sous ce traitement, le ratio des protéines solubles baisse simultanément avec l’augmentation des concentrations salines ; cette baisse est de 35 % chez les plantes nourries à 100 meq.l-1, elle passe à 40 % chez celles iriguées par la solution saline à une ratio des protéines solubles concentration de 150 meq.l-1. 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 Témoin 100 meq 150 meq NaCl+CaCl2 NaCl + CaCl2 Fig.9 – Ratio des protéines solubles parties aériennes (feuilles+tiges)/ racines des plantes d’haricot âgées de 6 semaines, stressées au NaCl+CaCl2. Tableau 5 –Ratio des protéines solubles parties aériennes (feuilles+tiges)/ racines des plantes d’haricot âgées de 6 semaines, stressées au NaCl+CaCl2. Ratio des protéines solubles Témoin 100 meq.l-1 150 meq.l-1 2,79 1.81 1.66 Le tableau 5 montre quil y a une tendance du ratio vers l’unitéce qui correspond à une répartition équilibrée des protéines solubles entre la partie aérienne et souterraine. ‐ 43 ‐ CHAPITRE III- RESULTATS III - ACTIVITE DE LA NITRATE REDUCTASE DES PLANTES STRESSEES. 1 – Au NaCl L’activité de la nitrate réductase chez les plantes témoins est principalement localisée dans la partie aérienne. L’ANR des racines ne représente que 10 % de celle des feuilles, par contre chez les plantes irriguées à la solution saline, cette activité enzymatique reste beaucoup plus élevée dans les racines que dans les feuilles. Les plantes qui se développent sous stress salin au NaCl ont montré une grande sensibilité de l’activité de la nitrate réductase des feuilles qui subissent une diminution importante sous l’effet du traitement à 100 meq.l-1 de NaCl (140µmol de NO2.h-1.g -1 de MF), alors qu’elle s’annule complétement dans le traitement 200 meq.l-1. ANR (µmol de NO2.h-1.g-1MF) feuilles racines 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 Témoin 100 meq 200 meq NaCl Fig.10 – Activité de la nitrate réductase des feuilles et des racines des plantes d’haricot âgées de 6 semaines, stressées au NaCl. Par contre l’augmentation des concentrations de sel a un effet stimulateur de l’ activité nitrate réductase au niveau des racines. Les resultats du tableau 6 montrent que l’activité de cette enzyme au niveau racinaire est amplifiée en présence de NaCl pour atteindre un niveau de 249.23 µmol de NO2.h-1.g-1 MF dans le traitement 200 meq.l-1 alors qu’elle est de 39.54 µmol de NO2.h-1.g-1MF chez les plantes témoins. Tableau 6 – Test de signification de Student à P= 5% de l’activité de la nitrate réductase des feuilles et des racines des plantes d’haricot âgées de 6 semaines, stressées au NaCl. Feuilles Racines Témoin 100 meq.l-1 200 meq.l-1 373±29.9 140.81±15.12** 0±0** 39,54±5,0 161,16±19.36** 249,23±18,65** s s s ‐ 44 ‐ CHAPITRE III- RESULTATS Le traitement statistique des résultats (tableau 6) révèle l’existence d’un effet significatif de la salinité sur les différentes parties de la plante ainsi qu’un effet significatif entre les organes. 1 – Au NaCl+CaCl2 Les résultats obtenus (fig.11) montrent que l’activité de la nitrate réductase au niveau des racines est inférieure à celle des feuilles dans les différents traitements. Cette activité représente 10 % chez les plantes témoins, 55 % et 36 % succecivement chez les ANR (µmol de NO2.h-1.g-1MF) plantes stressées à 100 et 150 meq.l-1 de sels. Feuilles 450 Racines 400 350 300 250 200 150 100 50 0 Témoin 100 meq 150 meq NaCl NaCl++CaCl CaCl22 Fig.11– Activité de la nitrate réductase des feuilles et des racines des plantes d’haricot âgées de 6 semaines, stressées au NaCl+CaCl2. Chez les plantes stressées,l’activité de la nitrate réductase se trouve sous le contrôle des concentrations de sel appliquées ; elle est ralentie de 18 % dans les feuilles des plantes recevant 100 meq.l-1 ( 121.43 µmol de NO2 . h-1.g-1MF), puis une reprise sous le traitement à 150 meq.l-1 (151.19 µmol de NO2 . h-1. g-1MF est signalée. Tableau 7 – Test de signification de Student à P= 5% de l’Activité de la nitrate réductase des feuilles et des racines des plantes d’haricot âgées de 6 semaines, stressées au NaCl+CaCl2. Feuilles Racines Témoin 373±29.9 39,54±5,0 s 100 meq.l-1 121.43±11.72** 67,84±10.46** s 150eq.l-1 151.19±17.85** 55,48±8.91** s Dans les racines l’activité de la nitrate réductase a montré une fluctuation, soit une augmentation puis une légère baisse respectivement sous les salinités à 100 et 150 meq.l-1 où sont enregistrées des valeurs de 67,84 et 55,48 µmol de NO2.h-1. g-1MF. ‐ 45 ‐ CHAPITRE III- RESULTATS IV - ETUDE DES RATIOS DE L’ACTIVITE DE LA NITRATE REDUCTASE 1 - Ratio partie aerienne/partie souterraine sous stress au NaCl La figure 12 montre que le stress salin au NaCl n’a pas le même effet sur l’activité de la nitrate réductase dans les differentes parties de la plante. En effet l’ANR foliaire est nettement différente comme il est présenté sur le graphe. ratio de ANR (Pa/R) 10 8 6 4 2 0 Témoin 100 meq 200 meq NaCl Fig.12 – Ratio de l’activité de la nitrate réductase (ANRparties aériennes /ANR racinaire) des plantes d’haricot âgées de 6 semaines, stressées au NaCl. Les résultats présentés dans le tableau 8 montrent que le raport de ANR p.a/ANRrac diminue d’une manière trés prononcée chez les plantes conduites à 100 meq.l-1 soit un taux de chute de 90 % comparativement au ratio des plantes témoins. Tableau 8 – résultats moyens des ratios de l’activité de la nitrate réductase (parties aériennes / racines) des plantes d’haricot âgées de 6 semaines, stressées au NaCl. Témoin Ratio ANRpa /ANRrac 100 meq.l-1 9,43 0,87 200 meq.l-1 0 Le ratio des plantes nourries à 200 meq.l-1 est nul ce qui correspond à une activité enzymatique de la nitrate réductase beaucoup plus racinaire que foliaire. ‐ 46 ‐ CHAPITRE III- RESULTATS 2 - RATIO PARTIE AERIENNE/PARTIE SOUTERRAINE SOUS STRESS AU NaCl+CaCl2 Sous NaCl+CaCl2 le ratio de l’ANRpa/ ANRrac chez les plantes témoins est de 9,43 ; ce ratio chute de 81 % chez les plantes qui reçoivent la solution saline à la ratio d e l'AN R (Pa/R) concentration de 100 meq.l-1. 10 8 6 4 2 0 Témoin 100 meq 150 meq NaCl + CaCl2 NaCl + CaCl2 Fig.13 – Ratio de l’activité de la nitrate réductase (parties aériennes / racines) des plantes d’haricot âgées de 6 semaines, stressées au NaCl + CaCl2 Le tableau 9 montre que le ratio de l’activité de la nitrate réductase augmente remarquablement par rapport au traitement précédent de 52 % mais demeure toujours faible par rapport au ratio des plantes témoins (29 %). Tableau 9 – résultats moyens des ratios de l’activité de la nitrate réductase (parties aériennes / racines) des plantes d’haricot âgées de 6 semaines, stressées au NaCl + CaCl2. 100 meq.l-1 Témoin Ratio ANRpa /ANRrac 9,43 1,79 150 meq.l-1 2,73 V – CARACTERISATION DES NODULES 1-Nombre de nodules/plante des plantes stressées • Au NaCl Les résultats montrent que la nodulation est extrêmement sensible à la salinité au NaCl. En effet, le nombre de nodules au niveau des racines des plantes témoins arrive jusqu’à 282 nodules par plantes ; l’effectif en nodules subit une nette réduction équivalente à un taux de 66% de nodules. Lorsque la concentration en NaCl double, la nodulation est inhibée. ‐ 47 ‐ CHAPITRE III- RESULTATS 350 Nodosité 300 250 200 150 100 50 0 Témoin 100 meq 200 meq NaCl Fig.14 – Nombre de nodules/plante des plantes d’haricot âgées de 6 semaines, stressées au NaCl Tableau 10 – Test de signification de Student à P= 5% de nombre de nodules/plante des plantes d’haricot âgées de 6 semaines, stressées au NaCl. Nombre des nodules/plante Témoin 100 meq.l-1 200 meq.l-1 282±32.53 98.2±10.03** 0±0** Ces variations dans le nombre de nodules selon les conditions de traitement indiquent des différences significatives (tableau 10). • Au NaCl+CaCl2 La salinité au NaCl + CaCl2 a fait chuté visiblement le nombre de nodule par plante. En effet, le taux de diminution arrive à 65 % chez les plantes traitées à100 meq.l400 Nodosité 350 300 250 200 150 100 50 0 Témoin 100 meq 150 meq NaCl+CaCl2 NaCl + CaCl2 Fig.15 – Nombre de nodules/plante des plantes d’haricot âgées de 6 semaines, stressées au NaCl + CaCl2. ‐ 48 ‐ CHAPITRE III- RESULTATS Le nombre de nodules par plante est passé de 282 nodules/plante chez les plantes témoins à 97,80 nodules/plante puis une sensible augmentation par rapport au traitement précédent (100 meq de NaCl + CaCl2 ) avec un taux de 25% pour les plantes nourries à 150 meq.l-1 (122,40 nodules/plante). Tableau 11 – Test de signification de Student à P= 5% de nombre de nodules/plante des plantes d’haricot âgées de 6 semaines, stressées au NaCl + CaCl2 Nombre des nodules/plante Témoin 100 meq.l-1 150 meq.l-1 282±32.53 97,8±10,32** 122,4±14,77** A travers le traitement statistique des résultats du tableau 11, il est constaté qu’il existe un effet significatif de la salinité au NaCl+CaCl2 sur le nombre de nodules par plante ; cet effet est noté sous tous les traitements et se traduit par une réduction de ce nombre en nodules. 2 - Le poids frais des nodules des plantes stressées • Au NaCl La figure 16 présente la variation de la masse fraîche des nodules en fonction des différentes concentrations de sel. En effet, il est observé que chez les plantes irriguées à la Pf des nodules/plant (g) 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 Témoin 100 meq 200 meq NaCl Fig.16 – poids frais des nodules/plante en (g) des plantes d’haricot âgées de 6 semaines, stressées au NaCl solution saline à une concentration de 100 meq.l-1 des poids frais très bas à ceux enregistrés chez les plantes témoins avec une réduction du poids frais de 83 %.Cependant, nodulation est inhibée pour les plantes irriguées à 200 meq.l-1 de NaCl. ‐ 49 ‐ la CHAPITRE III- RESULTATS L’analyse statistique (tableau 12) révèle un effet significatif de la salinité sur le poids frais des nodules ; cet effet est accentué à une concentration de 200 meq.l-1 où la nodulation est absente. Tableau 12 – Test de signification de Student à P= 5% du poids frais des nodules/plante en (g) des plantes d’haricot âgées de 6 semaines, stressées au NaCl. Poids frais des nodules/plante • Témoin 100 meq.l-1 200 meq.l-1 1.97±0.23 0.33±0.03** 0 ±0** Au NaCl+CaCl2 Un effet de la salinité est observé chez les plantes traitées à 100 meq.l-1 où il est remarqué une chute de 70 % de poids frais des nodules. Chez les plantes recevant 150 meq.l-1 de sels, le poids frais des nodules demeure faible pour représenter seulement 40 % du poids frais des nodules des plantes témoins mais sensiblement plus élevé de celui des plantes nouries à 100 meq.l-1. Pf des nodules/plante (g) 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 Témoin 100 meq NaCl+CaCl2 NaCl + CaCl 150 meq 2 Fig.17 – poids frais des nodules/plante en (g) des plantes d’haricot âgées de 6 semaines, stressées au NaCl+CaCl2 Tableau 13 – Test de signification de Student à P= 5% du poids frais des nodules/plante en (g) des plantes d’haricot âgées de 6 semaines, stressées au NaCl+CaCl2. Poids frais des nodules/plante Témoin 100 meq.l-1 150 meq.l-1 1.97±0.23 0.58±0.06** 0.81±0.1** ‐ 50 ‐ CHAPITRE III- RESULTATS Le tableau 13 montre l’existence d’un effet significatif du sel sur le poids frais des nodules, ce poids passe de 1.97g chez les plantes témoins à 0.58g et 0.81g respectivement chez les plantes des traitements 100 meq.l-1 et 150 meq.l-1. 3 - Nombre de nodules par unité de masse sèche racinaire • Au NaCl Daprés les résultas mentionés dans la fegure 14, le nombre de nodules par unité de nobre de nodules par unité de MS des racines masse seche des racines s’est montré particulierement sensible à la salinité au NaCl. 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 Témoin 100 meq 200 meq NaCl Fig.18 – Nombre de nodules par unité de masse sèche racinaire (mg) des plantes d’haricot âgées de 6 semaines, stressées au NaCl. Il chute progressivement dés la concentration de 100 meq.l-1 où il a été réduit de 26 %, puis une réduction totale de la nodulation se produit chez les plantes irriguées à la concentration 200 meq.l-1. Tableau 14 – Test de signification de Student à P= 5% Nombre de nodules par unité de masse sèche racinaire (mg) des plantes d’haricot âgées de 6 semaines, stressées au NaCl. Nombre de nodules/unité de MS des racines Témoin 100 meq.l-1 200 meq.l-1 0.79±0.13 0.58±0.03** 0 ± 0** Le traitement statistique des résultats (tableau 14) révèle un effet significatif bien visible de la salinité sur ce paramètre, cet effet apparaît sous tous les traitements de NaCl apliqués. ‐ 51 ‐ CHAPITRE III- RESULTATS • Au NaCl+CaCl2 La réduction du nombre de nodules par unité de matière sèche racinaire est le résultat aperçu (fig19) de l’application de différentes concentrations salines sur les plantes nombre de nodule par unité de MS des racines d’haricot. 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 Témoin 100 meq NaCl+CaCl2 NaCl + CaCl 150 meq 2 Fig.19 – Nombre de nodules par unité de masse sèche racinaire (mg) des plantes d’haricot âgées de 6 semaines, stressées au NaCl+CaCl2. Une diminution de 36% est notée chez les plantes traitées à 100 meq.l-1 par rapporte au plantes témoins, l’élévation de la concentration saline fait réduire le nombre de nodules par unité de matière sèche racinaire de 49%. Tableau 15 – Test de signification de Student à P= 5% Nombre de nodules par unité de masse sèche racinaire (mg) des plantes d’haricot âgées de 6 semaines, stressées au NaCl+CaCl2. Témoin Nombre de nodules/unité de MS des racines 0.79±0.13 100 meq.l-1 150 meq.l-1 0.50±0.08** 0.40±0.05** L’étude statistique des résultats (tableau 15), fait resortir une différence significative entre les traitements salins appliqués, le nombre de nodules par unité de matière sèche racinaire progrèsse en diminuant suit à l’augmentation de la concentration saline en NaCl+CaCl2. VI - COMPARAISON ENTRE LES TRAITEMENTS SALINS 1 - La teneur en protéines solubles • dans les feuilles Les résultats montrent qu’il existe un effet significatif de la salinité sur les teneurs en protéines solubles des feuilles, un apport du NaCl fait diminuer remarquablement cette teneur surtout chez les plantes traitées à 200 meq.l-1 de NaCl où il est enregistré une valeur de 121.6 µg.ml-1, alors qu’elle est de 329µg.ml-1 chez les feuilles des plantes témoins. ‐ 52 ‐ CHAPITRE III- RESULTATS Proteines (µg,ml-1) Feuilles 400 350 300 250 200 150 100 50 0 Témoin 100 meq 200 meq NaCl NaCl 100 meq 150 meq NaCl+CaCl2 NaCl + CaCl2 Fig.20 – Teneurs en protéines solubles des feuilles des plantes d’haricot âgées de 6 semaines, stressées au NaCl et au NaCl+CaCl2 La substitution du NaCl par du NaCl+CaCl2 a significativement augmenté la teneur des protéines solubles par rapport aux plantes traitées avec du NaCl. Tableau 16 – Test de signification de Student à P= 5% des teneurs en protéines solubles des feuilles des plantes d’haricot âgées de 6 semaines, stressées au NaCl et au NaCl+CaCl2 Organe Témoin NaCl 100 meq.l-1 NaCl+CaCl2 200 meq.l-1 100 meq.l-1 150 meq.l-1 feuilles 329,36±26,95 264,05±40,04** 121,08±19,66** 269,92±18** 279,07±27,08** Chez les plantes qui ont reçu 100 meq.l-1 de NaCl+CaCl2 , il faut noter une teneur moyenne de 269.92 µg.ml-1 qui augmente légérement chez les plantes traitées à 150meq.l-1 de NaCl+CaCl2 (279.08µg.ml-1), mais cette teneur reste au dessus des valeurs enregistrées chez les plantes témoins. Le traitement statistique des résultats (tableau 16) montre un effet significatif de la salinité que ce soit au NaCl ou au NaCl+CaCl2 sur la teneur en protéines solubles des feuilles.Les deux types de stress agissent en diminuant le taux des protéines solubles chez les feuilles mais le NaCl parait le plus agressif que le NaCl+CaCl2. ‐ 53 ‐ CHAPITRE III- RESULTATS • des racines Les teneurs en protéines solubles dans les racines des plantes stressées uniquement au NaCl montrent une fluctuation ;en effet, ces teneurs ont doublé sous l’effet du traitement à 100 meq.l-1de sel par rapport aux plantes temoins (219.11µg.ml-1), puis une chute importante réapparaît (52,37µg.ml-1) sous le traitement 200 meq.l-1 de NaCl. Proteines (µg,ml-1) Racines 400 350 300 250 200 150 100 50 0 Témoins 100 meq 200 meq 100 meq 150meq Témoin 100 meq 200 meq 100 meq 150 meq NaCl NaCl NaCl NaCl + +CaCl2 CaCl2 Fig.21 – Teneurs en protéines solubles des racines des plantes d’haricot âgées de 6 semaines, stressées au NaCl et au NaCl+CaCl2. Tableau 17 – Test de signification de Student à P= 5% des teneurs en protéines solubles des racines des plantes d’haricot âgées de 6 semaines, stressées au NaCl et au NaCl+CaCl2 Organe Témoin NaCl 100 meq.l-1 NaCl+CaCl2 200 meq.l-1 100 meq.l-1 150 meq.l-1 146,90±16,65 203,53±22,04** 221,58±2041** 203,53±22,04** 221,58±20,41** Racines L’apport du NaCl+CaCl2 a augmenté progressivement la quantité des protéines solubles pour atteindre des niveaux significativement élevés par rapport à ceux enregistrés chez les plantes témoins et celles traitées à 200 meq.l-1 du NaCl. 2 - L’activite de la nitrate reductase • au niveau foliaire Le traitement des résultats a montré une baisse significative de l’activité de la nitrate réductase dans les feuilles des plantes traitées au NaCl ; cette activité s’annule complétement sous la salinté à 200meq.l-1 ‐ 54 ‐ ANR (µmol de NO2.h-1.g-1MF) CHAPITRE III- RESULTATS Feuilles 500 400 300 200 100 0 Témoin 100 meq 200 meq 100meq NaCl NaCl 150meq NaCl+CaCl2 NaCl + CaCl2 Fig.22 – Activité de la nitrate réductase des feuilles des plantes d’haricot âgées de 6 semaines, stressées au NaCl et au NaCl+CaCl2. Tableau 18 – Test de signification de Student à P= 5% de l’activité de la nitrate réductase des feuilles des plantes d’haricot âgées de 6 semaines, stressées au NaCl et au NaCl+CaCl2. Organe Témoin Feuilles 373±29,9 NaCl NaCl+CaCl2 100 meq.l-1 200 meq.l-1 140,81±15,12** 0±0** 100 meq.l-1 150 meq.l-1 121,43±11.72** 151,19±17.85** L’addition du CaCl2 améliore cette activité par rapport au traitement 200 meq de NaCl alors que cette activité reste toujours inférieure à celle enregistrée chez les plantes témoins. Les resultats du tableau 18 montrent que le NaCl comme le NaCl+CaCl2 ont un effets depressif sur l’activité enzymatique de la nitrate réductase; cet effet est plus prononcé chez les plantes nourries au NaCl seul. • dans les racines La salinité au NaCl a un effet significatif sur l’activité de la nitrate réductase au niveau des racines ; cet effet se traduit par une augmentation importante par rapport aux racines des plantes témoins. Les résultats du tableau 19 montrent que l’activité de la nitrate réductase chez les plantes témoins est de 39.54, cette activité s’amplifie de 300 % chez les plantes nourres à100 meq.l-1 de NaCl, elle atteind son maximum chez les plantes irriguées à 200 meq.l-1 de NaCl où il est signalé une augmentation de 500 % par rapport aux plantes témoins. ‐ 55 ‐ ANR (µmol de NO2.h-1.g-1MF) CHAPITRE III- RESULTATS Racines 300 250 200 150 100 50 0 Témoin 100 meq 200 meq NaCl NaCl 100meq 150meq NaCl+CaCl2 NaCl + CaCl2 Fig.23 – Activité de la nitrate réductase des racines des plantes d’haricot âgées de 6 semaines, stressées au NaCl et au NaCl+CaCl2. L’apport du 100 meq.l-1 du NaCl+CaCl2 accroît l’activité enzymatique de la nitrate réductase mais d’une manière plus faible en comparaisant avec celle induite par le NaCl. Tableau 19 – Test de signification de Student à P= 5% de l’activité de la nitrate réductase des racines des plantes d’haricot âgées de 6 semaines, stressées au NaCl et au NaCl+CaCl2. Organe Témoin Racines 39,54±5,0 NaCl 100 meq.l-1 NaCl+CaCl2 200 meq.l-1 100 meq.l-1 150 meq.l-1 161,16±19.36** 249,23±18,65** 67,84±1.46** 55,48±8.91** Cette activité decrois avec l’augmentation de la concentration du NaCl+CaCl2 ce qui n’est pas le cas chez les plantes qui recoivent uniquement du NaCl. VII – CARACTERISTIQUE DES NODULES • le nombre de nodule Le nombre de nodules est significativement affecté par la salinité que ce soit au NaCl ou au NaCl+CaCl2. . Chez les plantes témoins le nombre est de 282 nodules/plante ensuite il diminue sous le traitement à 100 meq.l-1 (98,20 nodules/plante), puis s’annule complètement à 200 meq.l-1 de NaCl. ‐ 56 ‐ CHAPITRE III- RESULTATS 400 350 Nodosité 300 250 200 150 100 50 0 Témoin 100 meq 200 meq 100 meq NaCl NaCl 150 meq NaCl + CaCl2 NaCl+CaCl2 Fig.24 – Nombre de nodules des plantes d’haricot agées de 6 semaines, stressées au NaCl et au NaCl+CaCl2. Tableau 20 – Test de signification de Student à P= 5% du nombre de nodules des plantes d’haricot agées de 6 semaines, stressées au NaCl et au NaCl+CaCl2. Témoin Nombre de nodule/plante NaCl 100 meq.l -1 282±32.53 98.2±10.03** De même, sous stress au NaCl+CaCl2 200 meq.l 0±0** NaCl+CaCl2 , -1 100 meq.l -1 150 meq.l -1 97,8±10,32** 122,4±14,77** le nombre de nodule reste plus bas comparativement aux plantes témoins et proche à celui du traitement 100 meq.l-1du NaCl. Le traitement statistique des résultats tableau 20 révèle que la salinité au NaCl influe négativement sur le nombre de nodules par plante où la nodulation peut être inhibée avec des concentrations de 200 meq.l-1 ; par contre l’accroissement de la concentration du NaCl+CaCl2 semble avoir un effet inverse de celui du NaCl. . • poids frais des nodules par plante Les résultats présentés dans la figure 25 montrent que les sels que ce soit du NaCl ou du NaCl + CaCl2 affectent dangerement le poids des nodules quelle que soit la concentration de ces sels. ‐ 57 ‐ CHAPITRE III- RESULTATS Pf des nodules/plante (g) 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 Témoin 100 meq 200 meq 100 meq NaCl NaCl 150 meq NaCl + CaCl2 NaCl+CaCl2 Fig. 25 – Poids frais des nodules/plante des plantes d’haricot âgées de 6 semaines, stressées au NaCl et au NaCl+CaCl2. En particulier l’action du NaCl est nettement visble sur le poids des nodules ; une chute de 83 % est observée chez les plantes nousries à 100 meq.l-1 de NaCl, cette dimunition progresse avec l’augmentation de la concentration saline jusqu'à une inhibition totale de la nodulation au niveau des racines des plantes recevant 200 meq.l-1 de NaCl. Tableau 21 – Test de signification de Student à P= 5% du poids frais des nodules des plantes d’haricot agées de 6 semaines, stressées au NaCl et au NaCl+CaCl2. Témoin Poids frais des nodules/plante NaCl 100 meq.l-1 1,97±0,23 0,33± 0,03** NaCl+CaCl2 200 meq.l-1 100 meq.l-1 150 meq.l-1 0±0** 0,58± 0,06** 0,81± 0,10** Une addition du CaCl2 à la solution d’irrigation semble avoir un effet contradictoire de celui exercé par le NaCl seul (tableau 21) ; en effet malgré que le poids des nodules enregistrés chez les plantes irriguées à 100 meq.l-1 et à 150 meq.l-1 de NaCl+CaCl2 demeure toujours inférieur à celui noté chez les plantes témoins mais il est nettement supérieur comparativement au poids relevés chez les plantes nourries au NaCl seul une augmentation qui s’eleve à 145 %. ‐ 58 ‐ Discussion et conclusion générales CHAPITRE IV- DISCUSSION ET CONCLUSION GENERALE DISCUSSION ET CONCLUSION GENERALE Cette étude a permet de mettre en évidence l’effet de la salinité sur le statut protéique, l’activité enzymatique et la nodulation chez une variété d’haricot et la réponse des différents organes vis-à-vis de cette contrainte. La salinité, quelque soit la nature du sel et sa concentration dans le milieu, a entraîné une chute remarquable des teneurs en protéines solubles au niveau des feuilles des plantes traitées par rapport aux témoins avec une corrélation négative hautement significative sous stress NaCl (r = -0,934**) et stress NaCl+CaCl2 (r= - 0,711**). Les tiges ont montré une légère sensibilité à la salinité où leurs taux de protéines solubles qui représentent une faible proportion par rapport aux feuilles et aux racines, n’ont pas changé d’une manière significative sous l’effet des différents traitements. En effet, une baisse de ces composés est provoquée par la salinité croissante au NaCl, par contre une accumulation des protéines solubles est induite suite à des concentrations croissantes du NaCl+CaCl2.Toutefois la teneur en protéines solubles des tiges est fortement corrélée à la salinité au NaCl (r = - 0.871**) et légèrement corrélée au NaCl+CaCl2 (r = - 0.560*). Une forte accumulation des protéines solubles au niveau des racines est le résultat de l’application d’une concentration saline à 100 meq.l-1 de NaCl ; mais le doublement de cette concentration provoque une réduction très prononcée du taux de ces composés. L’apport de la solution saline sous forme de NaCl + CaCl2 a amplifié les teneurs protéiques au niveau des racines par rapport aux plantes témoins et celles traitées seulement au NaCl. La nitrate réductase est l'enzyme clé du processus de l’assimilation de l’azote. Nos résultats ont montré que l’activité de cette enzyme se manifestait principalement au niveau des feuilles que dans les racines chez les plantes témoins. Sous l’effet des différents traitements du NaCl appliqués, l’ANR a significativement diminué dans les feuilles de 60% chez les plantes traitées à 100 meq.l-1 tandis que la concentration à 200 meq.l-1 constitue un inhibiteur de cette activité qui s’annule complètement au niveau de ce traitement où une corrélation négative est hautement significative est observée (r = - 0,963**). Par contre, une combinaison entre le NaCl et le CaCl2 a un effet stimulateur de l’ANR qui s’améliore progressivement avec l’augmentation de la concentration saline. - 59 - CHAPITRE IV- DISCUSSION ET CONCLUSION GENERALE Cependant, dans les racines, le NaCl a un effet stimulateur de l’activité de la nitrate réductase ; des augmentations de 300 % et de 500 % sont enregistrées respectivement sous les traitements 100 meq.l-1 et 200 meq.l-1 par rapport aux racines des plantes témoins, une corrélation significative et positive et notée (r = + 0,983**). L’addition du CaCl2 à la solution d’irrigation renverse l’effet du NaCl ; en effet l’apport du CaCl2 freine l’évolution de l’activité de cette enzyme dans les racines contre une stimulation de cette dernière dans les feuilles. En ce qui concerne la nodulation, les concentrations croissantes de la salinité au NaCl inhibent le développement des nodules, en nombre et en poids frais ; cet effet apparaît clairement lorsque la concentration saline s’élève à 200 meq.l-1 ou tout le phénomène de la nodulation est inhibé. Outre la corrélation observée est hautement significative r = - 0,974** et r = - 0,944**. L’apport de la solution saline sous forme de NaCl + CaCl2 a des incidences sur la nodulation ; en effet le nombre de nodules par plante augmente avec l’accroissement de la concentration saline. Cela est attribué principalement à l’addition du CaCl2 qui atténue l’effet dépressif du NaCl ; ceci est aussi remarqué quand les plantes sont nourries à 150 meq.l-1 de NaCl + CaCl2 où le nombre de nodules par plante a tendance à la hausse. Au niveau de ce traitement, le nombre de nodules par plante ainsi que le poids frais des nodules sont fortement corrélés à la salinité au NaCl + CaCl2, avec respectivement des valeurs de corrélation de r = - 0,909** et r = - 0,892**. D’autre part le poids frais des nodules semble subir l’effet de l’addition du CaCl2 au NaCl. Dans ce cas, la taille des nodules et leurs poids frais sont beaucoup plus supérieures à ceux enregistrés chez les plantes traitées seulement au NaCl. A partir des observations, Il faut signaler aussi que les nodules ont pris une coloration rose présente chez les plantes témoins et celles nourries à la solution saline de NaCl + CaCl2 alors que cette couleur n’a pas apparu chez les plantes traitées seulement au NaCl. La diminution des teneurs en protéines solubles dans les différents organes sous contrainte saline est dû probablement à une dégradation de ces composés pour fournir des acides aminées qui jouent un rôle important dans l’ajustement osmotique (SVENSSON, 2001; MOHAMMADKHANI et HEIDARI., 2007) et une baisse de leur synthèse; en effet le stress salin freine l'assimilation d'ammonium (CHANDRA et al.,2001), induisant ainsi des perturbations dans la synthèse des acides aminés(ASHRAF et BASHIR,2003). Ceci - 60 - CHAPITRE IV- DISCUSSION ET CONCLUSION GENERALE peut être du aussi à la baisse de l’activité photosynthétique suite à la dégradation des pigments chlorophylliens, ou la fermeture des stomates et à la réduction de la surface foliaire provoquée par la salinité élevée (SANTIAGO et al.,2000) ayant des conséquences sur le fonctionnement global de la plante. En effet la photosynthèse fournit les squelettes carbonées pour la synthèse des acides aminés (DESCLOS et al.,2008). D’autre part, cette diminution des teneurs foliaires en protéines solubles sous stress salin serait en partie due à l’effet inhibiteur du NaCl sur la nodulation et sur la fixation symbiotique de l’azote (ZAHRAN,1999). Plusieurs auteurs rapportent que l’inhibition de l’activité enzymatique de la glutamine synthétase (GS) et la glutamate synthétase dépendante de NADH (NADHGOGAT) sous la contrainte saline sont parmi les facteurs limitant de la biosynthèse protéique (LUCH et al.,1995). Le sodium en forte concentration entre en compétition avec le potassium qui est un élément essentiel pour l'osmoregulation, la synthèse et l'activation de protéines, le maintien de la turgescence des cellules et stimulateur de la photosynthèse (BUSCHMANN et al.,2000).Ainsi il modifie la perméabilité membranaire par le déplacement du Ca++ dans les racines, causant donc un déséquilibre alimentaire et une inhibition de la croissance (HASEGAWA et al.,2000). L’accumulation des protéines solubles au niveau des racines est considérée comme une réponse de ces organes face à la salinité. En effet, une telle accumulation est notée chez Nicotiana rustica (VIEGAS et al.,2004) et Anacardium occidentale (OLIVEIRA et al., 2006). Des protéines spécifiques, de différents poids moléculaires, s’accumulent en présence des sels ; ces protéines jouent un rôle primordial dans la stabilité et la conductance membranaire (XINBO et al.,2002 ; JOSE et al.,2006). L’amélioration des teneurs en protéines solubles observée chez les plantes nourries au NaCl +CaCl2 par rapport à celles nourries seulement au NaCl, est attribuée au rôle du cation Ca++. Une expérience mené par DEMIDCHIK et TESTER (2002) sur des plantes d’orge cultivées sur un milieu hydroponique à divers rapports de Na+/Ca++ cinq semaines à 50 et 100 mmol.l-1 ont montré que ; le NaCl a causé une réduction significative dans le contenu de chlorophylle, les caractéristiques de fluorescence de chlorophylle, et la conductibilité des stomates, dans des feuilles des plantes développées à des niveaux bas de calcium, les résultats ont montré aussi que le Ca++ supplémentaire a permet de reconstituer - 61 - CHAPITRE IV- DISCUSSION ET CONCLUSION GENERALE la chlorophylle à 80-90% et d’améliorer légèrement la conductance stomatique ce qui favorise la synthèse des protéines en présence des squelettes carbonées. Cet effet est également observé avec l’utilisation d’autres cations bivalents, en particulier Ba++ et Mg++, qui ont diminué l'effet toxique du NaCl (DEMIDCHIK et TESTER,2002). D’autre part le Ca++ a un rôle important dans le maintien du rapport élevé de K+/Na+ exigé pour la photosynthèse optimale (SHABALA et al.,2003). La diminution rapide de l’activité de la nitrate réductase observée dans les feuilles des plantes traitées au NaCl peut résulter d'une faible disponibilité de nitrate pour la NR, ou par l'inactivation de NR par des accumulations de Na+ et Cl- dans le cytosol contre une augmentation de l’ANR dans les racines,considérée comme réponse face au stress salin (CRAMER et al.,1995). Ces résultats confirment celles trouvées par MAROUF (1986) sur deux espèces de luzernes et celles de DEBOUBA et al., (2006) sur la tomate. Ces auteurs ont remarqué que les activités de la nitrate réductase et de la glutamine synthétase ont été réprimées dans les feuilles, alors qu'elles augmentent dans les racines, et que l’activité de la nitrite réductase a diminué dans les feuilles et les racines. Par contre une étude menée par MEKHALDI (2008), sur Vigna radiata L. Wilczek a démontré que des concentrations croissantes de salinité font chuter l’ANR plus dans les feuilles que dans les racines. La dépression de l’ANR pourrait être liée à la non disponibilité du NO3- dans les feuilles traitées au sel. En effet, le NO3- règle la transcription, la traduction et l'activation de NR chez les plantes supérieures (WANG et al.,2004). Cette non disponibilité du NO3est liée en partie à la réduction du flux du NO3- provenant des racines aux feuilles et provoquant un ralentissement de l’ANR dans les feuilles (GOUIA et al.,1994; OYER et al.,1998). La diminution des concentrations en NO3- par le NaCl peut aussi résulter d'une rupture d'intégrité membranaire des racines (CARVAJAL et al.,1999) et une inhibition de l’absorption du NO3- (PARIDA et DAS,2004). Le chlorure en concurrence avec le NO3- vis-à-vis des transporteurs entraîne une diminution de la concentration en ce dernier dans les racines et les feuilles (DEANEDRUMMOND,1986) et/ou une inactivation des transporteurs du NO3- par les effets toxiques des ions de sel (LIN et al.,1997) d’où une chute plus grande de la concentration du NO3- dans les feuilles. Alternativement le Cl- peut avoir un effet direct sur l’ANR chez des jeunes plantes de tomate (FLORES et al.,2000). - 62 - CHAPITRE IV- DISCUSSION ET CONCLUSION GENERALE CARILLO et al. (2005) ont constaté que la diminution de l’ANR des jeunes plantes de blé traitées par le sel était due à la faible teneur de la protéine de la NR et à un transport limité des nitrates vers les pousses. Au niveau des plantes irriguées à la solution saline de NaCl + CaCl2 l’activité de la nitrate réductase est restituée au niveau de la partie aérienne, ceci suggère que cette reprise de l’activité enzymatique est due probablement à l’addition du Ca++ dans le milieu. En effet, l’application de ces cations cause une meilleure absorption du K+ par rapport au Na+.Ceci suggère que, en plus de leur capacité connue de bloquer les canaux non sélectifs des cations (NSCC) responsables de l'entrée du Na+, les cations bivalents commandent également l'activité ou les propriétés de déclenchement des transporteurs de K+ au niveau de la membrane plasmique (ELPHICK et al.,2001; DEMIDCHIK et TESTER,2002).Cela est bénéfique pour la photosynthèse qui fournit à l’enzyme de la NR le pouvoir réducteur nécessaire pour son fonctionnement. Les plantes d’haricot soumises à un stress salin ont produit un nombre réduit de nodules par plante. Cela est dû probablement à l’effet de la salinité sur les bactéries symbiotiques du sol. En effet, la salinité diminue la survie des rhizobiums (ALEXANDER et al.,1984; DUA,1992), inhibe l’expansion et la courbure des poils absorbants(SPRENT et ZAHRAN,1988) ce qui entraîne une réduction du nombre de ces organes symbiotiques. ZAHRAN et SPRENT (1986) rapportent que le processus d’installation des nodules est plus sensible au stress osmotique que l’est le métabolisme des racines et des parties aériennes de la plante. Chez le trèfle, LAAZIZA et al.,(2003) ont observé une chute du nombre de nodules par unité de masse racinaire en fonction du degré de la salinité accompagnée d’une résistance relative de la croissance des racines. Une étude menée par SAADALLAH et al.,(2001) sur l’haricot, a montré qu’il y avait une chute de la croissance de racines associée à une augmentation du rapport nombre de nodule/unité de matière sèche racinaire ; nos résultats ne confirment pas les données rapportées par ces auteurs. Ainsi, la réponse des plantes face à la contrainte saline dépend de l’espèce, des concentrations salines et des conditions environnementales de l’expérimentation. La réduction du poids frais des nodules occasionnée par le NaCl, est le résultat de la réduction de la croissance des nodules et leur nombre par plante. En effet le NaCl a des effets dépressifs sur la croissance et le développement des nodosités de plusieurs espèces, comme il a été démontré chez le soja (DELGADO et al.,1994 ;GORDON et al.,1997) et - 63 - CHAPITRE IV- DISCUSSION ET CONCLUSION GENERALE chez l'haricot commun (DELGADO et al.,1994). Ces effets toxiques du stress salin sur les nodules sont dus probablement à une inhibition de la photosynthèse des plantes soumises au sel qui mène à une restriction du transport des produits élaborés vers les nodules (BEKKI et al.,1987 ; SUTHERLAND et SPRENT,1993).Cependant, d'autres auteurs suggèrent que la réduction de croissance des nodules est liée à l'inhibition de certaines enzymes (GORDON et al.,1997 ; GONZALEZ et al., 2001). D'autres chercheurs ont rapporté que le sel réduit la diffusion de l’oxygène dans les nodules (HUNGRIA et VARGAS,2000). Par contre l’addition du Ca++ à la solution d’irrigation sous forme de CaCl2 corrige ces effets. Donc une carence en calcium inhibe l’établissement de la nodulation (ZAHRAN et SPRENT,1986). D’autre part la nodulation peut être affectée indirectement par la salinité, car elle peut directement limiter la croissance des racines des légumineuses, affectant la réponse des racines à l’activité bactérienne (TU,1981) et aux facteurs nods chez japonicum (WANG et STACEY,1990). Des concentrations élevées de salinité (255 mmol.l-1 et 340 mmol.l-1 de NaCl) ont causé un rétrécissement des poils de racine de soja, affectant ainsi les premières étapes de la symbiose, en particulier la déformation des cheveux des racines, ayant pour résultat une inhibition du procédé d'infection (ELSHEIKH,1998). En conclusion de ce travail, il semble intéressant de proposer certaine orientation pour apporter un complément d’informations afin d’évaluer le niveau de tolérance de cette espèce au stress salin. Par exemple, mettre en œuvre des tests de comportement en utilisant des concentrations en CaCl2 plus élevées pour bien définir le rôle important du calcium dans le phénomène de tolérance des végétaux aux stress abiotiques. En générale les résultats obtenus sont une première contribution dans l’analyse du métabolisme azoté des plantes sous contrainte saline. Il est souhaitable de s’orienter vers d’autres approches par les réponses moléculaires, hormonales, génétiques pouvant apporter davantage de données pour comprendre les mécanismes d’adaptation des végétaux aux contraintes environnementales. - 64 - Références bibliographiques REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES REFFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES Abdalla M.H., Vuong T.,D and Harper J.E., 1998 - Genotypic differences in dinitrogen fixation response to NaCl stress in intact and grafted soybean. Crop Sci; 38: p 72-77. 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Annexes Annexe Annexe. 1- Calcule de la capacité de rétention du substrat L’arrosage des plantes est réalisé en tenant compte de la capacité de rétention du substrat calculé de la manière suivante : Nous avons déposé 100 g de sol (P1) dans un petit pot en plastique perforé à sa base, le tout est posé dans une boite de pétri, ensuite l’eau est versée dans le pot jusqu’à saturation, ce dernier est déposé sur la paillasse pour décantation ; au bout de 24h, le pot et le sol sont pesés, le poids est égal à 129.4 (P2) : - Soit P1 – P2 = 29.4 g (densité de l’eau = 1) d’où le volume d’eau pour 100 g. de terre est égal à 29.4 ml. - Il faut réduire le poids du pot = 4g soit le volume final de l’eau est de 25.4 ml pour 100 g de terre. Nous avons pour 100g de terre 25.4 ml d’eau, pour 1300 g de terre le volume est de 330.2 ml d’eau utilisé, pour l’arrosage de chaque plante à 100% de la capacité de rétention du sol. Annexe. 2 - Détermination de l’activité nitrate réductase anoxie Dosage au spectro 540nm Coloration 20 mn Incubation 25 mn a l’obscurité Révélation Extraction dans le bain de marie (10mn) Annexe Calcule de la’ANR « in situ » Un échantillon végétal dont le poids de matière fraiche est P (en g), accumule des nitrates pendant un temps t (en mn). Ces derniers sont extraits dans un volume V (en ml) puis dosés par réaction colorée de diazotation et lues au spectrophotomètre à 540 nm : soit DO, la densité optique lue. On à DO = ε.c.l = ε.n/v.l (1) c : concentration en nitrites ; n : nombre de moles de nitrites (en µmoles) présentes dans le volume d’extraction v (en l) ; l : longueur de la cuve de mesure du spectrophotomètre = 1 cm ; ε : Coefficient d’extinction molaire du chromophore rose formé par diazotation des nitrites en présence de sulfanilamide et de NNEDD. Sa valeur à 540 nm est égale à 47,8.103 m.l-1. cm-1. donne n = DO . V / ε . l par ailleurs ANR = n . 60 / P .t donc ANR = DO . V . 60 / P . t . ε . l en µmoles de NO2- .h-1 .ε-1 .g-1MF Annexe Annexe. 3- Tableau des résultats pour les teneurs en protéines solubles des plantes d’haricot stressées à la salinité au NaCl Traitements salins répétions 1 2 témoins 3 4 5 1 2 100 meq.l-1 du NaCl 3 4 5 1 2 200 meq.l-1 du NaCl 3 4 5 organe F T R F T R F T R F T R F T R F T R F T R F T R F T R F T R F T R F T R F T R F T R F T R Teneur en protéines solubles 326,75 82,765 146,6 310,55 71,4 134,15 298,2 67,25 163,25 345,85 87,45 163,6 365,45 62,3 126,9 268,6 56,8 262,25 218,4 58,7 235,4 286,7 67,55 195,45 230,7 49,9 210,4 315,85 65,05 192,05 134,4 50,6245 55,819 128,6 44,4 50,05 141,3 45,65 54,55 95,05 39,45 50,9 106,05 41,05 50,55 Annexe Annexe. 4- Tableau des résultats pour les teneurs en protéines solubles des plantes d’haricot stressées a la salinité au NaCl +CaCl2 Traitements salins répétions 1 2 témoins 3 4 5 1 2 100 meq.l-1 du NaCl 3 4 5 1 2 200 meq.l-1 du NaCl + CaCl2 3 4 5 organe F T R F T R F T R F T R F T R F T R F T R F T R F T R F T R F T R F T R F T R F T R F T R Teneur en protéines solubles 326,75 82,765 146,6 310,55 71,4 134,15 298,2 67,25 163,25 345,85 87,45 163,6 365,45 62,3 126,9 285,5 49,55 184,8 257,05 59,9 204,3 279,3 63,3 213,75 244,81 68,9 234,4 282,95 54,15 180,4 265,7 74,85 205,6 281,145 65,95 254,55 295,8 53,4 218,9 241,325 60,51 204,05 311,415 59,45 224,8 Annexe Annexe. 5- Tableau des résultats de l’Activité de la nitrate réductase des plantes d’haricot stressées a salinité au NaCl Traitements Salins Répétions 1 2 Témoins 3 4 5 1 2 -1 100 meq.l du NaCl 3 4 5 1 2 -1 200 meq.l du NaCl 3 4 5 organe F R F R F R F R F R F R F R F R F R F R F R F R F R F R F R ANR(µmol de NO2.h-1.g-1MF) 376,57 46,25 368,20 34,63 340,71 35,86 420,87 37,66 358,64 43,28 83,68 155,82 107,59 130,17 92,22 167,36 118,92 179,32 115,35 173,14 0,00 251,05 0,00 270,36 0,00 237,10 0,00 224,62 0,00 263,00 Annexe Annexe. 6- Tableau des résultats de l’Activité de la nitrate réductase des plantes d’haricot stressées a salinité au NaCl + CaCl2 Traitements Salins Répétions 1 2 Témoins 3 4 5 1 2 -1 100 meq.l du NaCl + CaCl2 3 4 5 1 2 -1 150 meq.l du NaCl + CaCl2 3 4 5 organe F R F R F R F R F R F R F R F R F R F R F R F R F R F R F R ANR(µmol de NO2.h-1.g-1MF) 376,57 46,25 368,20 34,63 340,71 35,86 420,87 37,66 358,64 43,28 105,91 55,11 122,30 58,46 137,56 69,44 115,87 83,68 125,52 72,52 140,74 64,10 127,81 57,74 167,36 51,94 170,06 41,84 149,66 61,80 Annexe Annexe.7- Tableau des résultats des caractéristiques de la nodulation des plantes d’haricot stressées a salinité au NaCl 1 poids sec des racines 0,28 nombre des nodules 264 poids frais des nodules 1,85 Témoins 2 3 4 0,34 0,47 0,39 308 313 290 2,16 2,19 2,03 100 meq.l-1 du NaCl 5 1 2 3 4 5 0,35 0,16 0,18 0,15 0,16 0,2 235 95 112 88 91 105 1,64 0,32 0,38 0,30 0,31 0,36 1 0,09 0 0 2 0,08 0 0 3 0,05 0 0 4 0,06 0 0 5 0,1 0 0 traitements salins 200 meq.l-1 du NaCl répétitions Annexe. 8- Tableau des résultats des caractéristiques de la nodulation des plantes d’haricot stressées a salinité au NaCl + CaCl2 traitements salins Témoins 100 meq.l-1 du NaCl + CaCl2 150 meq.l-1 du NaCl + CaCl2 1 poids sec des racines 0,28 nombre des nodules 264 poids frais des nodules 1,85 2 3 0,34 0,47 308 313 2,16 2,19 4 0,39 290 2,03 5 1 0,35 0,19 235 111 1,64 0,65 2 3 0,17 0,26 99 103 0,58 0,61 4 0,19 92 0,54 5 0,18 84 0,49 1 0,3 115 0,76 2 0,28 122 0,80 3 4 0,33 0,3 147 120 0,97 0,79 5 0,34 108 0,71 répétitions Annexe Annexe. 9- tableau des corrélations des paramètres mesurés àla salinité au NaCl NaCl Protéines_F Protéines_T Protéines_R ANR_F ANR_R Nre_Nodpte PF_Nod ** * NaCl Protéines_F Protéines_T Pearson Correlation 1 -,934(**) -,871(**) Sig. (2-tailed) 0 0 N 15 15 15 Pearson Correlation -,934(**) 1 ,875(**) Sig. (2-tailed) 0 0 N 15 15 15 Pearson Correlation -,871(**) ,875(**) 1 Sig. (2-tailed) 0 0 N 15 15 15 Pearson Correlation -,547(*) ,643(**) 0,488 Sig. (2-tailed) 0,035 0,01 0,065 N 15 15 15 Pearson Correlation -,963(**) ,854(**) ,864(**) Sig. (2-tailed) 0 0 0 N 15 15 15 Pearson Correlation ,983(**) -,881(**) -,850(**) Sig. (2-tailed) 0 0 0 N 15 15 15 Pearson Correlation -,974(**) ,855(**) ,856(**) Sig. (2-tailed) 0 0 0 N 15 15 15 Pearson Correlation -,944(**) ,917(**) ,858(**) Sig. (2-tailed) 0 0 0 N 15 15 15 Correlation is significant at the 0.01 level (2-tailed). Correlation is significant at the 0.05 level (2-tailed). Protéines_R ANR_F ANR_R Nre_Nodpte PF_Nod -,547(*) -,963(**) ,983(**) -,974(**) -,944(**) 0,035 0 0 0 0 15 15 15 15 15 ,643(**) ,854(**) 0,01 15 -,881(**) 0 15 ,855(**) 0 15 ,917(**) 0 15 0 15 0,488 ,864(**) -,850(**) ,856(**) ,858(**) 0,065 0 0 0 0 15 15 15 15 15 1 15 0,327 0,234 15 0,327 0,234 15 -0,482 0,069 15 1 -,967(**) 15 -0,482 -,967(**) 0,069 0 15 15 0,409 ,725(**) 0,131 0,002 15 15 ,980(**) 0 15 ,847(**) 0 15 1 -,980(**) 15 0,409 ,980(**) -,980(**) 0,131 0 0 15 15 15 0 15 -,907(**) 0 15 0 15 1 ,879(**) 15 ,725(**) ,847(**) -,907(**) ,879(**) 0,002 0 0 0 15 15 15 15 0 15 1 15 Annexe. 10- tableau des corrélations des paramètres mesurés à la salinité au NaCl + CaCl2 NaCl+CaCl2 Protéines_F Protéines_T Protéines_R ANR_F ANR_R Nre_Nodpte PF_Nod ** * NaCl+CaCl2 Protéines_F Protéines_T Pearson Correlation 1 -,711(**) -,560(*) Sig. (2-tailed) 0,003 0,03 N 15 15 15 Pearson Correlation -,711(**) 1 0,342 Sig. (2-tailed) 0,003 0,212 N 15 15 15 Pearson Correlation -,560(*) 0,342 1 Sig. (2-tailed) 0,03 0,212 N 15 15 15 Pearson Correlation ,873(**) -,677(**) -0,314 Sig. (2-tailed) 0 0,006 0,254 N 15 15 15 Pearson Correlation -,926(**) ,775(**) ,664(**) Sig. (2-tailed) 0 0,001 0,007 N 15 15 15 Pearson Correlation ,635(*) -,542(*) -0,306 Sig. (2-tailed) 0,011 0,037 0,268 N 15 15 15 Pearson Correlation -,909(**) ,686(**) ,599(*) Sig. (2-tailed) 0 0,005 0,018 N 15 15 15 Pearson Correlation -,892(**) ,565(*) ,532(*) Sig. (2-tailed) 0 0,028 0,041 N 15 15 15 Correlation is significant at the 0.01 level (2-tailed). Correlation is significant at the 0.05 level (2-tailed). Protéines_R ANR_F ,873(**) -,926(**) 0 15 ANR_R Nre_Nodpte PF_Nod ,635(*) -,909(**) -,892(**) 0 0,011 0 0 15 15 15 15 -,677(**) ,775(**) -,542(*) ,686(**) ,565(*) 0,006 0,001 0,037 0,005 0,028 15 15 15 15 15 -0,314 ,664(**) 0,254 0,007 15 15 1 -,814(**) -0,306 ,599(*) ,532(*) 0,268 0,018 0,041 15 15 15 ,653(**) -,770(**) -,810(**) 0,008 0,001 0 15 15 15 15 0 15 0 15 1 -,779(**) ,961(**) ,822(**) 0,001 0 0 15 15 15 15 -,814(**) ,653(**) -,779(**) 0,008 0,001 15 15 1 -,822(**) 15 -,770(**) ,961(**) -,822(**) 0,001 0 0 15 15 15 -,810(**) ,822(**) 0 15 0 15 0 15 -,626(*) 0,013 15 1 ,829(**) 15 -,626(*) ,829(**) 0,013 0 15 15 0 15 1 15