Chapitre 2.7.2.
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CHAPITRE 2.7.2. MALADIE DE MAREK RÉSUMÉ La maladie de Marek (MD pour Marek’s Disease) est une maladie causée par un herpèsvirus. Elle est caractérisée par une affection lymphomateuse et neuropathique chez les volailles domestiques. Le diagnostic est réalisé sur la base des signes cliniques et des lésions macroscopiques et microscopiques. Néanmoins, les poulets peuvent développer une infection latente par le virus de la MD (MDV) sans avoir montré de signes cliniques. L’infection par le MDV est révélée par l’isolement viral et/ou la mise en évidence d’antigènes viraux ou d’anticorps. La prophylaxie contre la MD recourt à la vaccination au moyen de vaccins mono- ou multivalents de différents types. Les vaccins peuvent être administrés in ovo ou chez le poussin d’un jour. Chez le poulet, la MD peut apparaître dès l’âge de 3 ou 4 semaines, mais elle est plus couramment rencontrée entre 12 et 30 semaines. La paralysie des pattes et des ailes, associée à un épaississement des nerfs périphériques est un signe pathognomonique. Cependant, l’atteinte des nerfs passe parfois inaperçue, particulièrement chez les adultes. En fonction de la souche de MDV infectante, une lymphomatose peut se produire principalement au niveau de l’ovaire, du foie, de la rate, des reins, du cœur, du proventricule succenturié et de la peau. Alors qu’une uniformité cellulaire est rencontrée dans les tumeurs associées au virus de la leucose aviaire, plusieurs types de cellules lymphoïdes constituent les infiltrations nerveuses et les lymphomes associés au MDV. Le diagnostic différentiel principal de la MD est la leucose lymphoïde. Des lésions associées au virus de la réticulo-endothéliose peuvent également être confondus avec ceux de la MD. Identification de l’agent pathogène : dans les conditions de terrains, la plupart des poulets s’infectent au cours des premières semaines de vie et deviennent porteurs latents de l’infection à vie, souvent sans développer de signes cliniques. L’infection est habituellement diagnostiquée par l’inoculation de cellules blanches du sang (buffy coat) sur des cultures de cellules rénales de poulet ou sur des fibroblastes embryonnaires de canard, sur lesquelles un effet cytopathogène (ECP) apparaît en quelques jours. Le MDV est divisé en 2 sérotypes principaux : MDV-1 et MDV-2, auxquels peut être ajouté un troisième représenté par l’herpèsvirus du dindon apparenté au MDV (HVT pour Herpesvirus of Turkeys). Le sérotype 1 comprend des souches virulentes et le sérotype 2 des souches naturellement avirulentes. Les antigènes viraux peuvent être détectés dans les hampes plumifères des oiseaux infectés par un test à la précipitine rayonnante. Épreuves sérologiques : les Anticorps spécifiques du MDV apparaissent 1 à 2 semaines après l’infection. Ils peuvent être détectés par différentes méthodes : une épreuve d’immunodiffusion en gélose (IDG) ; une épreuve d’immunofluorescence indirecte (IFI) ; ou une épreuve immuno-enzymatique (ELISA). Spécifications applicables aux vaccins et aux produits biologiques à usage diagnostique : la MD peut être prévenue par la vaccination des poulets in ovo ou chez le poussin d’un jour. Les vaccins utilisés sont du type à virus vivants atténués. Les souches virales les plus utilisées appartiennent au HVT. Les formulations vaccinales contiennent soit du virus libre (lyophilisé), soit du virus associé aux cellules (forme humide). Des souches atténuées issues des sérotypes 1 et 2 du MDV sont également utilisées pour des vaccins combinés, bivalents, qui associent le HTV à un virus MDV1 ou 2. Les formulations vaccinales contenant ces MDV1 et 2 contiennent toujours du virus associé aux cellules. Il existe également des vaccins trivalents, associant les sérotypes 1, 2 et 3. Les formulations bi- et trivalentes ont été mises sur le marché pour lutter contre les souches hypervirulentes de MDV pour lesquelles la vaccination monovalente était relativement inefficace. La vaccination réduit fortement la sévérité des signes cliniques associés au MDV mais n’empêche pas l’infection persistante. Les virus vaccinaux s’installent par ailleurs à l’état latent chez les volailles vaccinées. A. INTRODUCTION La maladie de Marek (MD) est une maladie de la volaille domestique (poulet) causée par un herpèsvirus (21, 24, 32). Elle peut se produire dès l’âge de 3 à 4 semaines, mais apparaît le plus souvent vers 12 à 30 semaines. Dans la forme classique chronique, la maladie se caractérise par une atteinte principalement nerveuse. La mortalité n’excède alors pas 10 à 15 % et survient au bout de quelques semaines à quelques mois. Manuel terrestre de l’OIE 2005 919 Chapitre 2.7.2. — Maladie de Marek Dans la forme aiguë, la maladie aboutit à la formation de lymphomes viscéraux. L’incidence au sein d’un groupe de volailles est alors de 10 à 30 %. Des épisodes impliquant jusqu’à 70 % des animaux peuvent survenir. La mortalité peut se maintenir de façon enzootique pendant des mois. La forme la plus prévalente actuellement est l’atteinte aiguë avec des lymphomes viscéraux étendus. Le signe clinique le plus fréquent de la forme chronique est la paralysie partielle ou complète des pattes et des ailes. Dans la forme aiguë, les oiseaux sont souvent apathiques et il n’est pas rare d’observer une mortalité sans aucun signe précurseur. Dans la forme classique, la lésion caractéristique est l’épaississement d’un ou de plusieurs nerfs. Les plus fréquemment atteints, et les plus aisément repérés à l’autopsie, sont les plexus brachiaux et sciatiques, le plexus cœliaque, le nerf vague abdominal et les nerfs intercostaux. Les nerfs atteints ont une épaisseur 2 à 3 fois supérieure à la normale ; leur apparence normale striée disparaît et leur couleur vire au gris ou au jaune ; ils sont parfois œdématiés. Des lymphomes peuvent apparaître dans la forme classique de la MD. Ils prennent le plus souvent l’aspect de petites tumeurs ovariennes molles et grises (parfois aussi dans les poumons, les reins, le cœur, le foie ou d’autres tissus). L’œil gris, fréquemment observé chez les oiseaux âgés (16 à 18 semaines) causé par une iridocyclitite, est parfois le seul signe de la forme classique. Cette affection entrave le réflexe d’accommodation de l’iris en face d’un stimulus lumineux. Cela peut également entraîner une torsion de la pupille. Dans la forme aiguë, la lésion classique consiste en un lymphome disséminé, diffus atteignant le foie, les gonades, la rate, les reins, les poumons, le proventricule et le cœur. Des lymphomes peuvent atteindre soit la peau autour des follicules plumeux, soit les muscles squelettiques. Les oiseaux atteints présentent généralement des nerfs périphériques épais tels que rencontrés dans la forme classique. Chez les jeunes volailles, l’hépatomégalie est souvent modérée, alors que les adultes auront une hépatomégalie manifeste dont l’apparence macroscopique est identique à celle rencontrée dans la leucose lymphoïde. Les lésions nerveuses sont souvent absentes chez les adultes. Dans les formes classique et aiguë de la MD, la maladie débute par une prolifération de cellules lymphoïdes qui progresse dans certains cas et régresse dans d’autres. Les nerfs périphériques peuvent présenter 3 types d’atteintes, soit proliférative, soit inflammatoire, soit légèrement infiltrante. Les lésions sont dénommées respectivement de types A, B et C. Les lésions du type A consistent en une infiltration par des lymphoblastes prolifératifs, des lymphocytes grands, moyens et petits et des macrophages. Ces lésions A ont un aspect néoplasique manifeste. Les lésions de type B sont caractérisées par un œdème interneural, une infiltration principalement de petits lymphocytes et de cellules sanguines, et une prolifération des cellules de Schwann. Leur aspect est inflammatoire. Les lésions de type C consistent en une légère infiltration par des petits lymphocytes. Ces lésions sont observées sur les oiseaux sans lésions macroscopiques ni signes cliniques ; elles pourraient être une lésion inflammatoire régressive. La démyélinisation se produit fréquemment dans les nerfs atteints par les lésions A et B et est responsable de la paralysie clinique. Les lymphomes qui se développent au niveau des viscères et des autres tissus ont une cytologie similaire aux lésions lympho-prolifératives et de type A nerveuses. Les cellules lymphoïdes sont souvent de plusieurs types à prédominance de lymphocytes moyen et petits. Il arrive que des grands lymphocytes et des lymphoblastes soient prédominants dans des formes aiguës des MD chez les adultes. La population hétérogène des cellules lymphoïdes rencontrées dans les lymphomes de la MD révélée sur des coupes colorées à l’hématoxyline-éosine ou des frottis colorés par le May-Grünwald Giemsa est un élément fondamental pour distinguer la maladie de la leucose lymphoïde dans laquelle l’infiltration lymphomateuse est composée de lymphoblastes uniformes. Par ailleurs, une autre différence se marque au niveau de la bourse de Fabricius. En effet, dans la leucose lymphoïde, des tumeurs macroscopiques s’y développent et ces tumeurs ont une origine intrafolliculaire et sont très proliférantes. Dans la MD, bien que la bourse soit parfois le siège d’infiltrations lymphoproliférantes, la tumeur est peu apparente, diffuse et se situe entre les follicules. Enfin, les lésions nerveuses périphériques très communes dans la MD ne se manifestent pas dans la leucose lymphoïde. Les formes les plus difficiles à différencier dans la MD de la leucose proviennent de cas d’oiseaux adultes présentant des tumeurs lymphoblastiques avec une hépatomégalie marquée et sans atteinte nerveuse. Dans ces cas, il est nécessaire de recourir à des examens complémentaires tels que la détection par immunofluorescence d’antigènes présents à la surface des lymphocytes T activés dans les cellules tumorales de la MD ou d’antigènes ou d’IgM des cellules B présentes à la surface des cellules tumorales. Quoi qu’il en soit, le diagnostic peut être la plupart du temps posé sur base des lésions macroscopiques et d’un examen histopathologique si plusieurs oiseaux sont autopsiés. Certaines souches du virus de la réticuloendothéliose (RE) induisent des lésions nerveuses et des proliférations lymphomateuses similaires à ceux de la MD à la fois macro- et microscopiquement. Bien que le virus de la RE soit rare dans les élevages de poulets, il ne faut pas l’oublier dans les causes potentielles de tumeurs lymphoïdes. Sa mise en évidence repose sur des examens virologiques et sérologiques de l’élevage. Le virus de la RE est également responsable de maladies néoplasiques chez la dinde, le canard, la caille et d’autres espèces. Par ailleurs, la dinde peut être infectée par un autre rétrovirus responsable également d’affections proliférantes. Même si un élevage de poulet est séropositif pour le virus de la RE, les maladies néoplasiques sont rares. Le résumé du diagnostic différentiel de la MD, de la leucose lymphoïde et de la RE est repris dans le tableau 1. 920 Manuel terrestre de l’OIE 2005 Chapitre 2.7.2. — Maladie de Marek Il n’y a pas de risque d’infection reconnu pour les humains travaillant au contact du virus MD ou de l’herpèsvirus de la dinde (HVT) qui lui est apparenté. B. TECHNIQUES DE DIAGNOSTIC 1. Identification de l’agent pathogène L’infection par le MDV peut être révélée par l’isolement viral réalisé sur des tissus de poulets infectés. Les tissus les plus utilisés sont les cellules du buffy coat d’échantillons de sang hépariné ou des suspensions de cellules extraites de lymphomes ou de cellules de rate. Quand ces échantillons sont prélevés sur le terrain, il est conseillé de les transporter sous froid. Le MDV étant un virus très fortement associé aux cellules, il est essentiel que les suspensions contiennent des cellules viables. Ces suspensions sont inoculées sur des cultures en monocouches de cellules rénales de poulet ou de fibroblastes embryonnaires de canard (les fibroblastes embryonnaires de poulet sont moins sensibles pour l’isolement viral primaire). Cependant, les sérotypes 2 et 3 du MDV sont plus facilement isolés à partir de fibroblastes de poulet que de cellules rénales de poulet. L’inoculation est réalisée en 6 7 double dans les conditions suivantes : 0,2 ml d’une suspension cellulaire contenant 10 à 10 cellules sont inoculés à des monocouches cellulaires contenues dans des puits de plaques de culture (diamètre de 60 mm). Des témoins positif et négatif sont incubés dans les mêmes conditions à 38°C et en atmosphère humide sous 5 % de CO2. Il est possible de réaliser les isolements en bouteilles de culture fermées. Le milieu doit être remplacé à intervalle de 2 jours. Des effets cytopathogènes (ECP) confinés à des zones délimitées appelées plages virales se manifestent après 3 à 5 jours. Ils peuvent être dénombrés au bout de 7 à 10 jours. Tableau I : Caractéristiques clés permettant le diagnostic différentiel entre la maladie de Marek, la leucose lymphoïde et la réticuloendothéliose Caractéristique Age Maladie de Marek Leucose lymphoïde Réticuloendothéliose 1 Tout âge, habituellement vers 6 semaines ou plus Paralysie fréquente Pas en dessous de 16 semaines Non spécifiques Pas en dessous de 16 semaines Non spécifiques Souvent plus de 5 % dans les élevages non vaccinés Rare dans les élevages vaccinés Rarement plus de 5 % Rare Fréquente Absente Rare Hypertrophie diffuse ou atrophie Tumeurs nodulaires Tumeurs nodulaires Normalement absentes Absentes Oui Souvent périvasculaire Non Focale ou diffuse Rare Focale Diffuse Tumeur interfolliculaire et /ou atrophie des follicules Souvent focale Tumeurs intrafolliculaires Focale ou diffus Tumeurs intrafolliculaires Oui Non Non Oui Non Non Cytologie des tumeurs Cellules lymphoïdes pléiomorphes comprenant des lymphoblastes, des lymhocytes de toute taille et des cellules réticulées. Rarement des lymphoblastes seuls Lymphoblastes Lymphoblastes Catégorie des cellules néoplasiques Cellules T Cellules B Cellules B Signes Incidence Lésions macroscopiques Atteinte nerveuse Atteinte de la bourse de Fabricius Tumeurs au niveau de la peau, des muscles, et du proventricule, œil gris Parfois Lésions microscopiques Atteinte nerveuse Tumeur du foie Atteinte de la rate Bourse de Fabricius Système nerveux central Prolifération lymphoïde au niveau de la peau et des follicules plumeux 1 Le virus de la réticuloendothéliose peut causer plusieurs syndromes différents. Le lymphome bursal apparaît le plus souvent lorsque les animaux sont en plein air et est décrit ici. Manuel terrestre de l’OIE 2005 921 Chapitre 2.7.2. — Maladie de Marek Un autre tissu est plus rarement utilisé pour l’isolement viral : la hampe plumifère à partir de laquelle des virions libres du MDV peuvent être isolés. Des embouts de plumes de 5 mm de long ou de minces biopsies cutanées contenant le follicule plumeux sont suspendus dans un tampon d’extraction SPGA/EDTA (Sucrose, Phosphate, Glutamate et Albumine/Acide éthylène diamine tétra-acétique). La composition du tampon est la suivante : 0,218 M de saccharose (7,462 g) ; 0,0038 M de phosphate monopotassique (0,052 g) ; 0,0072 M de phosphate dipotassique (0,125 g), 0,0049 M de L-glutamate de sodium (0,083 g) ; 1 % de poudre d’albumine bovine (1,0 g), 0,2 % d’EDTA (0,2 g) dans 100 ml d’eau distillée. Le tampon est stérilisé par filtration et son pH doit être de 6,5. La suspension est soumise aux ultra-sons et filtrée sur un filtre 0,45 µm avant d’être inoculée sur des monocouches de cellules rénales de poulet fraîchement passées de 24 h. Après une période d’adsorption de 40 min, le milieu de culture est ajouté et les cultures sont incubées pendant 7 à 10 jours. Ces méthodes permettent l’isolement des sérotypes 1 et 2 du MDV. Il est possible d’isoler le sérotype 3 du MDV (HVT) qui peut être isolé à la suite d’une vaccination. Un observateur expérimenté est capable de faire la distinction entre les plages virales induites par les différents sérotypes viraux en se basant sur la cinétique d’apparition, la rapidité d’évolution et la morphologie des plages virales. Les plages HVT apparaissent plus précocement et sont plus grandes que les plages du sérotype 1. Le sérotype 2 induit l’apparition encore plus tardive de plages plus petites que celles du sérotype 1. L’identification des plages virales peut être réalisée grâce à des anticorps spécifiques de poulets couplés à des molécules fluorescentes. Des anticorps monoclonaux (AcM) peuvent être utilisés pour faire la distinction sérotypique (15, 27). • Amplification en chaîne par polymérase Les génomes des 3 sérotypes du MDV ont été séquencés (1, 14, 16). Des réactions d’amplification en chaîne par polymérase (PCR) permettent la différenciation entre les souches oncogènes et non-oncogènes du sérotype 1 du MDV et la distinction des souches vaccinales du MDV appartenant aux sérotypes 2 et 3 (2, 3, 26, 33). La PCR peut également être utilisée pour quantifier la charge virale dans les tissus (3, 4, 23) ou pour différencier le MDV du HVT sur les échantillons de sang ou de plumes (11, 13). 2. Épreuves sérologiques La présence d’anticorps spécifiques du MDV chez des poulets non-vaccinés âgés de 4 semaines est révélatrice d’une infection par le MDV. Avant cette limite d’âge, les anticorps peuvent être la trace d’anticorps maternels transmis par le jaune d’œuf. Pour les différentes épreuves décrites ci-après, les virus, antigènes et sérum peuvent être obtenus auprès des Laboratoires de référence de l’OIE spécialisés dans la MD (se reporter à la liste de la partie 3 de ce Manuel terrestre). Cependant, des réactifs standards internationaux n’ont pas encore été produits. a) Immunodiffusion en gélose Bien qu’elle ne soit pas prescrite pour les échanges internationaux, l’épreuve d’immunodiffusion en gélose (IDG) est la plus utilisée pour la détection des anticorps envers le MDV. L’épreuve est réalisée sur des lames porte-objet recouvertes d’une solution saline tamponnée par du phosphate à 1 % d’agarose et 8 % de chlorure de sodium. Les puits adjacents sont remplis alternativement avec des sérums et de l’antigène viral. Une incubation de 24 h en atmosphère humide donne le temps à la diffusion de se produire. Les sérums positifs exhibent une réaction similaire à celle des témoins positifs. L’antigène utilisé peut être de 3 types : soit il provient de culture de cellules infectées, soit il est extrait de hampes plumifères, soit il est obtenu à partir de biopsies cutanées contenant les follicules plumeux de poulets infectés. L’antigène en culture de cellules est obtenu par multiplication du MDV sur des cellules rénales de poulet ou sur des fibroblastes embryonnaires de poulets. Les cellules sont détachées et suspendues dans le milieu lorsque l’ECP a atteint 7 sa confluence à une concentration proche de 1 x 10 cellules/ml. Il faut que le milieu de resuspension soit dépourvu de tryptose phosphate (ce dernier pourrait produire des lignes non spécifiques de précipitine). La suspension cellulaire doit subir 3 cycles de congélation-décongélation pour pouvoir être utilisée comme antigène. 922 • Protocole i) Préparer une solution saline contenant 1 % de Difco Bactoagar (8 % de NaCl) ; ii) Déposer 4 ml de cette solution d’agarose sur une lame porte objet (7,5 cm x 2,5 cm) ; iii) Découper des puits dans l’agarose solidifié en utilisant un pochoir. Le diamètre des puits doit être de 5 mm. Les puits doivent être séparés de 2 mm. Enlever les blocs d’agar au moyen d’une pointe de stylet ; Manuel terrestre de l’OIE 2005 Chapitre 2.7.2. — Maladie de Marek iv) Déposer les sérums à tester dans les puits des rangées du haut et du bas. L’antigène et le sérum positif de référence sont déposés alternativement dans les puits de la rangée du milieu ; v) Incuber les lames pendant 24 h à 37 °C dans une étuve humide. Les résultats sont visualisés sous une lampe dans une chambre noire. Si des hampes plumifères sont utilisées pour détecter la présence du MDV, le protocole doit être adapté comme suit. Les lames sont préparées avec une solution saline (8 % NaCl) à 0,7 % d’agar avec un sérum anti-MDV inclus dans cette solution. Les hampes provenant d’oiseaux suspects de MD sont insérées verticalement dans l’agarose et l’épreuve est réalisée comme décrite plus haut. L’apparition de zones radiales de précipitation autour des hampes révèle la présence de l’antigène dans les hampes testées. b) Autres épreuves Il est possible de recourir à d’autres techniques pour détecter les anticorps anti-MDV comme par exemple l’immunofluorescence directe ou indirecte. Dans ces épreuves, le sérum testé va montrer ou non sa capacité à mettre en évidence des plages du MDV en culture de cellules (15, 28). Ces épreuves sont plus sensibles que l’IDG. Elles sont de plus spécifiques des sérotypes de MDV. Un test de séroneutralisation virale peut également être utilisé. Il repose sur la capacité d’un sérum à neutraliser ou non la formation de plages par des virions libres du MDV (5). Ce test convient davantage à des fins de recherche qu’à un but diagnostic. Un test immuno-enzymatique (ELISA) permettant la détection des anticorps anti-MDV a été mis au point (7, 12). L’antigène utilisé pour sensibiliser les puits des plaques de 96 puits est préparé à partir de cultures de fibroblastes embryonnaires de poulets infectés par le MDV (7, 24). C. SPÉCIFICATIONS APPLICABLES AUX VACCINS ET AUX PRODUITS BIOLOGIQUES À USAGE DIAGNOSTIQUE Les substances utilisées pour le contrôle du MDV sont des virus atténués libres ou associés aux cellules du MDV ou du HVT. Des formulations nouvelles non commercialisées actuellement ont été mises au point. Il s’agit de vaccins recombinants produits par génie génétique (19, 22). Les vaccins de la MD sont soit injectés in ovo aux jours 17 ou 18 de l’incubation, soit injecté par voie sous-cutanée au moment de l’éclosion (25). Les exigences pour la fabrication des vaccins sont reprises ci-dessous. Elles peuvent également être consultées au Chapitre I.1.7. ou à partir de documentations publiées pour la fabrication des vaccins à usage vétérinaire (8-10, 17, 18, 20, 29, 31). Les protocoles sont décrits dans la monographie 589 de la pharmacopée britannique et dans le volume 19, partie 113 du code fédéral des Etats-Unis d’Amérique (30). Les lignes de conduites émises par le Manuel terrestre sont générales. Elles doivent être mises en œuvre par les recommandations nationales ou régionales en vigueur. 1. Gestion des semences virales a) Caractéristiques de la semence virale Les virus du groupe MDV sont classés en 3 sérotypes (MDV-1, -2 et -3) sur la base de relations antigéniques. Sérotype 1 : il inclut toutes les souches pathogènes du virus ; elles sont classées en hypervirulentes (par ex. 648A), très virulentes (par ex. Md/5, Md/11, Ala-8, RB-1B), virulentes (par ex. HPRS-16, JM GA), moyennement virulentes (par ex. HPRS-B14, Conn A) et finalement faiblement virulentes (par ex. CU-2, CVI-988). Ces souches peuvent être atténuées par passages successifs en culture de cellules, au cours desquels elles perdent leur pouvoir pathogène mais conservent leur caractère immunogène, de manière à pouvoir être utilisées comme souches vaccinales. Deux souches atténuées par ce procédé et qui ont été mises sur le marché sont HPRS-16 et CVI-988 (Rispens). Des souches atténuées de souches hypervirulentes ont été utilisées dans des protocoles vaccinaux destinés à mettre au point des vaccins contre la forme aiguë de la maladie. Aux États-Unis d’Amérique, la souche vaccinale R2/23 obtenue à partir de la souche Md/5 est commercialisée. Les vaccins du sérotype 1 sont préparés sous la forme associée aux cellules (humide), et doivent par conséquent être conservés dans de l’azote liquide. Sérotype 2 : il inclut les souches naturellement avirulentes du MDV (par ex. SB-1, HPRS-24, 301 B/1, HN-1). Plusieurs d’entre-elles ont démontré qu’elles conféraient une protection contre les souches virulentes du sérotype 1. Les souches SB-1et 301 B/1 ont été commercialisées et sont utilisées, souvent sous la forme de vaccins bivalents associant le HVT, pour protéger les poulets contre les souches hypervirulentes. Les vaccins du sérotype 2 sont préparés uniquement sous la forme humide, et doivent par conséquent être conservés dans de l’azote liquide. Manuel terrestre de l’OIE 2005 923 Chapitre 2.7.2. — Maladie de Marek Sérotype 3 : il contient les souches naturellement avirulentes du HVT (par ex. FC126 et PB1). Ces souches sont fréquemment utilisées comme vaccins monovalents ou en combinaison avec des souches des sérotypes -1 et/ou -2. Les vaccins bi- ou trivalent sont utilisés pour la protection envers les souches hypervirulentes. Le HVT peut être préparé sous la forme de virions libres lyophilisables. Il peut cependant être préparé sous la forme associée aux cellules. b) Méthode de culture Les cellules utilisées pour la préparation des vaccins commercialisés sont des cultures primaires de fibroblastes d’embryons de poulets (CEF pour Chicken Embryo Fibroblasts) obtenus à partir d’élevages exempts d’organismes pathogènes spécifiques (EOPS) ou de canards (DEF pour Duck Embryo Fibroblasts). Les CEF obtenus à partir d’élevages EOPS sont préférées aux DEF en raison de la meilleure connaissance des pathogènes touchant ces cellules et des méthodes pour les détecter. c) Validation de la semence candidate comme semence vaccinale Les méthodes permettant de tester l’indemnité de maladie des élevages EOPS sont publiées (18, 29). Les élevages de poulets EOPS doivent être indemnes des adénovirus aviaires, incluant le virus 76 (syndrome de la chute de ponte), du virus de l’encéphalomyélite aviaire, du virus de la leucose aviaire (sous-groupes A, B et J), du virus de la néphrite aviaire, des rétrovirus aviaires, des rotavirus aviaires, du virus de l’anémie du poulet, du virus de la peste aviaire, du virus de la bronchite aviaire, du virus de la bursite infectieuse, du virus de la laryngotrachéite infectieuse, des influenza virus de type A, du MDV, des Mycoplasma gallisepticum et M. synoviae, du virus de la maladie de Newcastle, du virus de la réticuloendothéliose, de Salmonella spp., et du virus de la trachéite du dindon. Les élevages de canards EOPS doivent être indemnes des adénovirus aviaires, du réovirus aviaire, de Chlamydia, du virus de l’entérite du canard, des virus des hépatites I et II du canard, des influenza virus de type A, du virus de la maladie de Newcastle, de Pasteurella anatipestifer (maintenant Riemerella), du virus de la réticuloendothéliose, et d’infections à Salmonella spp. En cas d’émergence d’une nouvelle maladie, l’exigence d’indemnité envers cette nouvelle infection sera de mise. L’innocuité des souches de références vaccinales sera démontrée par l’inoculation de 10 fois la dose recommandée à des poulets de 1 jour pour toute souche susceptible de causer la MD. Les poulets inoculés seront autopsiés à l’âge de 120 jours pour s’assurer de l’absence de développement de lésions macroscopiques et de lésions microscopiques étendues typiques de la MD. Il faut noter que certaines souches du MDV et du HVT peuvent provoquer des lésions nerveuses mineures et transitoires acceptables dans ces conditions expérimentales. L’absence de réversion vers la virulence sera démontrée par la réalisation de 6 passages successifs de la souche vaccinale sur des poulets de 1 jour EOPS de la MD. La dose initiale administrée sera un inoculum 10 fois supérieur à celui utilisé en routine. Le passage est réalisé par transfert de sang infecté hépariné à intervalle régulier de 5 à 7 jours. Les sangs transférés sont testés pour vérifier qu'ils contiennent du virus e infectieux. Les oiseaux qui se sont vus administrés le 5 passage sont maintenus jusqu’à 120 jours. Ils sont examinés et autopsiés pour vérifier l’absence de lésions imputables au MDV. Cependant, certaines souches comme Rispens peuvent provoquer le développement de lésions mineures. Il est capital de constater qu’aucune modification de virulence n’a eu lieu pendant le passage du virus. Ce test est difficile à mettre en œuvre parce que (1) la résistance génétique des poulets a une influence importante sur la virulence apparente du virus, (2) le type d’inoculum influence également le résultat. Ces tests d’innocuité en laboratoire seront complétés par des essais de terrain à grande échelle. Les souches de référence doivent être indemnes des agents énoncés plus haut pour les élevages EOPS. Par ailleurs, aucune trace de contaminants ou de réactifs de laboratoire ne doit être détectée. Toute souche vaccinale obtenue à partir de dindes doit en plus être indemne du virus de la maladie lymphoproliférative et du virus de l’entérite hémorragique. Il faut déterminer l’efficacité à conférer une protection envers la MD de toute souche vaccinale, et de ses passages successifs utilisés pour la production vaccinale (généralement 5 passages au maximum sont autorisés). Les tests de protection standardisés ont été publiés. Ils comprennent la vaccination de poulets EOPS d’un jour, sensibles à la MD et la réalisation d’épreuves virulentes au moyen de souches virulentes de MD 8 jours plus tard. Les souches utilisées doivent produire la MD avec une incidence minimale de 70 % chez les poulets non vaccinés. Deux types de test sont décrits. (1) Dans le premier, un indice de protection est calculé suite à l’administration d’une dose unique de 1.000 unités formant plages (UFP) du vaccin. Les incidences de MD faisant suite à l‘épreuve virulente sont calculées dans les groupe vacciné et témoin. L’indice de protection doit être supérieur à 80 %. Cela signifie que les animaux vaccinés montrent 924 Manuel terrestre de l’OIE 2005 Chapitre 2.7.2. — Maladie de Marek une réduction d’au moins 80 % d’incidence de MD macroscopique par rapport aux contrôles non vaccinés. (2) Un second test est décrit, il s’agit du test de la dose qui confère 50 % de protection (DP50). Ce test consiste à inoculer une série de 5 dilutions de facteur 4 du virus vaccinal. Suite à l’épreuve virulente réalisée 8 jours après la vaccination, il faut repérer les 2 dilutions qui confèrent d’une part plus et d’autre part moins de 50 % de protection de la MD. Il est alors possible de calculer la valeur de la DP50. Ce test doit inclure une souche vaccinale standard à titre de comparaison. La DP50 peut avoir une valeur inférieure à 4 UFP. Il est possible également d’obtenir des valeurs supérieures. Les facteurs qui affectent le résultat sont les variables souche vaccinale, nature du virus vaccinal (associé au non aux cellules), présence ou absence d’anticorps maternels chez les poulets soumis aux tests. Sur la base des tests de DP50, il est recommandé de fournir une dose vaccinale de terrain qui dépasse de 2 valeurs le résultat obtenu, soit 1 000 UFP ou 100 DP50. Pour garantir l’efficacité et la persistance de l’immunité, des essais de terrain à grande échelle au moyen de souches vaccinales nouvelles doivent être réalisés avec des souches de MD actuelles en réalisant les essais sur différents élevages, en présence et en absence d’anticorps maternels. Des résultats expérimentaux suggèrent que l’immunité vaccinale une fois acquise perdure tout au long de la vie. 2. Méthode de fabrication Les cultures de cellules sont réalisées dans des bouteilles à fond plat ou dans des flacons roulants en fonction du type d’incubation, stationnaire ou rotatif. Les milieux les plus utilisés sont le milieu essentiel minimum d’Eagle (MEM) ou le milieu 199. Ils sont tamponnés par du bicarbonate de sodium et additionné de 5 % de sérum de veau. L’incubation est réalisée à 38-39 °C pendant 48 h. Pour la fabrication des vaccins associés aux cellules, les cultures sont infectées avec une souche de MDV ou de HTV produite en stock, sous la forme associée aux cellules, généralement passée 2 fois par rapport à la souche de référence. Au terme d’une incubation de 48 h, les cellules sont récoltées par un traitement au moyen d’une solution de trypsine/EDTA qui permet le détachement des cellules. Après une brève incubation à 38°C, le détachement cellulaire est complet. Les cellules récupérées sont centrifugées à faible vitesse et resuspendues ensuite dans un milieu de congélation. Ce milieu est constitué du milieu de culture additionné de 7,5 à 15 % de diméthylsulfoxyde. Les cellules sont alors refroidies à 4°C et conditionnées dans les fioles vaccinales, généralement des ampoules en verre, scellées à la flamme et congelées dans l’azote liquide. Pour les souches de HTV, des vaccins sont disponibles sous la forme de virions libres lyophilisés. Pour leur fabrication, les cultures infectées par le HVT sont incubées pendant 72 h. Les cellules sont alors détachées comme décrit plus haut. Les cellules récoltées sont suspendues dans un petit volume de milieu de culture, centrifugée et resuspendues dans une solution tampon à 8 % de saccharose, mais dépourvue de protéine afin d’éviter la formation de mousse. La suspension cellulaire est soumise aux ultra-sons pour libérer les virions. Après avoir ôté les débris cellulaires, la solution virale est diluée dans un tampon adéquat (par ex. du SPGA). Les fioles vaccinales sont remplies et le virus est lyophilisé. La dilution finale pour la préparation des vaccins des 2 types est réalisée sur la base de l’expérience acquise lors des préparations précédentes. Il n’est pas possible de procéder au titrage d’une production avant son conditionnement. Le titrage a posteriori est réalisé sur chaque lot. L’information peut être indiquée alors sur le lot. 3. Contrôles en cours de fabrication De manière à obtenir des résultats optimaux pour la préparation des vaccins associés aux cellules, il est essentiel d’avoir une vitesse de congélation lente (1 à 5°C par min) et au contraire une vitesse de décongélation rapide. Le titre infectieux des cellules infectées ou des virions lyophilisés, par conséquent la dose virale par ampoule, est déterminée après remplissage des fioles. 4. Contrôles des lots a) Identité Afin de vérifier que le produit conditionné présente une spécificité identique à la souche de référence utilisée, des tests de neutralisation par un sérum monospécifique peuvent être réalisés. Des anticorps monoclonaux sont le plus souvent utilisés. b) Innocuité et stérilité Il est nécessaire de procéder à plusieurs tests qui démontrent la sécurité du vaccin et du produit fini. Les cellules sur lesquelles sont produits les vaccins doivent provenir d’élevages EOPS, surtout indemnes d’agents pathogènes transmis par voie verticale. Toutes les substances d’origine animale (sérum, trypsine, Manuel terrestre de l’OIE 2005 925 Chapitre 2.7.2. — Maladie de Marek et albumine sérique bovine) utilisées pendant le processus de fabrication doivent aussi être exemptes d’agents infectieux. Les lots de vaccins produits doivent être testés pour toute contamination par les levures, bactéries, mycoplasmes et virus énoncés pour les élevages EOPS. La pureté du produit doit également être démontrée. Les tests adéquats à chaque étapes du processus de fabrication doivent être réalisés tels que recommandés par les organismes officiels (18, 20, 29) et dans le Chapitre I.1.5., « Contrôle de la stérilité ou de l’absence de contamination des matériels biologiques ». Dix doses de vaccins ou une quantité équivalente de dilutions de 2 doses vaccinales doivent être inoculées à des groupes séparés de 10 poulets EOPS d’un jour. Aucun effet indésirable ne peut apparaître dans les 21 jours qui suivent l’administration. c) Activité La dose standard de chaque type de vaccin est 1 000 UFP par poulet ou par œuf. Des titrages viraux sont réalisés sur les lots de vaccins conditionnés afin de garantir la dose pour chaque oiseau vacciné. d) Durée de l’immunité Les tests de durée d’immunité ne doivent être réalisés que sur les souches de référence. L’immunité conférée par ce vaccin devrait perdurer à vie. e) Stabilité Des tests de stabilité sont réalisés sur 6 lots représentatifs de chaque vaccin pour démontrer le maintien du titre infectieux dans les vaccins conditionnés. Les tests doivent être réalisés dans les conditions de stockage habituelles du vaccin. Les produits lyophilisés doivent avoir une durée de conservation de 12 mois s’ils sont conservés entre 2 et 8°C. Le fabricant peut doubler le contenu viral du vaccin pour compenser les pertes occasionnées par un stockage de longue durée. Un liquide de dilution est fourni par les fabricants pour les 2 formes vaccinales (liquide et lyophilisée). La stabilité du vaccin resuspendu doit avoir été testée pendant une période de 2 h. f) Agents de conservation Aucun agent de conservation n’est ajouté dans les vaccins ou les diluants. g) Précautions d'emploi et mise en garde Des précautions particulières doivent être mises en œuvre pour la manipulation des vaccins associés aux cellules lorsqu’ils sont retirés de l’azote liquide afin d’éviter toute blessure liée aux explosions fortuites qui se produisent à la décongélation. Il est recommandé de porter des lunettes de protection. Les vaccins reconstitués doivent être maintenus au froid pendant leur utilisation. Les formes associées aux cellules doivent être agitées pour maintenir les suspensions cellulaires homogènes. 5. Contrôles du produit fini a) Innocuité Voir section C.4.b. b) Activité Voir section C.4.c. RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES 1. 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