Chapitre 2.1.2.
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CHAPITRE 2.1.2. STOMATITE VÉSICULEUSE RÉSUMÉ La stomatite vésiculeuse (SV) est une affection vésiculeuse des chevaux, des ruminants et des porcs due à un vésiculovirus de la famille des Rhabdoviridae. Lorsque les chevaux ne sont pas atteints par le processus morbide, cette maladie ne peut être cliniquement distinguée de la fièvre aphteuse (FA), de l’exanthème vésiculeux (EV) ou de la maladie vésiculeuse des suidés (MVS). Les moutons, les chèvres et de nombreuses autres espèces sauvages peuvent également être atteints par cette maladie. L’homme est aussi sensible. La maladie est confinée au continent américain ; autrefois cependant, elle fut décrite en France et en Afrique du Sud. Bien que la stomatite vésiculeuse soit transmise directement par voie cutanéo-muqueuse, le virus responsable de la maladie a été isolé de stomoxes ou de moustiques, suggérant qu’il puisse s’agir d’une arbovirose. Elle manifeste cependant des variations saisonnières, disparaissant à la fin de la saison pluvieuse dans les régions tropicales et dès l’apparition des premières gelées dans les zones tempérées. Il se pourrait que le virus soit un virus de plantes et que les animaux se trouvent en fin de chaîne épidémiologique. La pathogénie de cette affection n’est pas encore bien établie et des observations montrent que les anticorps humoraux spécifiques ne protègent pas toujours contre une infection par le virus de la stomatite vésiculeuse. Bien que l’on puisse suspecter la présence de la stomatite vésiculeuse lorsque des chevaux sont atteints en même temps que des porcs ou des bovins, il est nécessaire d’effectuer un diagnostic différentiel au laboratoire car les signes cliniques ne sont pas différenciables de ceux de la FA lorsque des bovins et des porcs sont affectés et de ceux de la MVS ou de l’EV lorsque seuls des porcs sont atteints. Identification de l’agent pathogène : Le virus de la SV peut être facilement isolé par inoculation à diverses cellules en culture, à des souriceaux nouveau-nés ou à des œufs embryonnés. L’antigène viral peut être isolé par une méthode immuno-enzymatique sandwich indirecte (IS-ELISA). Cette épreuve est la plus rapide et la moins onéreuse. La fixation du complément est aussi une bonne alternative. On peut aussi utiliser le test de neutralisation virale mais c’est une technique plus élaborée et longue à mettre en œuvre. Épreuves sérologiques : Les animaux convalescents développent des anticorps spécifiques dans les 4 à 8 jours suivant l’infection. Ceux-ci peuvent être mis en évidence par un ELISA de blocage en phase liquide (LP-ELISA), un ELISA de compétition (C-ELISA) et une séroneutralisation virale (SN). D’autres tests tels que la fixation du complément, l’immunodiffusion en gélose et la contre-immunoélectrophorèse ont été décrits. Spécifications applicables aux vaccins et aux produits biologiques à usage diagnostique : Des vaccins à virus inactivé adjuvés avec de l’hydroxyde d’aluminium ou un excipient huileux ont été testés respectivement aux États-Unis d’Amérique et en Colombie. Les 2 vaccins engendrent des titres élevés d’anticorps spécifiques dans les sérums des bovins vaccinés. Toutefois, on n’a pas la certitude que ces anticorps sériques protègent effectivement contre la maladie. Un vaccin à virus atténué a été mis au point mais son efficacité sur le terrain n’est pas connue. Manuel terrestre de l’OIE 2005 147 Chapitre 2.1.2. — Stomatite vésiculeuse A. INTRODUCTION La stomatite vésiculeuse a été décrite aux Etats-Unis d’Amérique (USA) en 1926 (18) et 1927 (7) comme une maladie vésiculeuse affectant les chevaux et, un peu plus tard, les bovins et les porcs. Le virus engendre l’apparition de vésicules sur la langue, les lèvres, les muqueuses buccales, les trayons et le bourrelet coronaire du pied des bovins, chevaux, porcs, ainsi que chez d’autres espèces animales domestiques ou sauvages. De nombreuses espèces d’animaux de laboratoire sont également sensibles. La maladie est confinée au continent américain ; cependant elle a été décrite en France (en 1915 et 1917) et en Afrique du Sud (1886 et 1897) (11). Des signes grippaux, habituellement sans présence de vésicules, ont été observés chez l’homme en contact avec des animaux malades ou avec du virus infectieux. Toute manipulation de virus de la stomatite vésiculeuse, y compris de matériel infectieux issu d’animaux malades, doit être réalisée en appliquant les procédures de biosécurité adéquates. Il existe 2 grands types immunologiques de virus, New Jersey (NJ) et Indiana (IND). Ces 2 virus font partie du genre Vesiculovirus et de la famille des Rhabdoviridae. Ils ont fait l’objet de nombreuses études moléculaires. Plusieurs autres rhabdovirus apparentés ont été isolés d’autres animaux malades au cours des dernières décennies. Ces souches dénommées Salto-Argentina/63 et Alagoas-Brazil/64 sont considérées respectivement comme les sous-types 2 et 3 du sérotype IND (8). D’autres souches du sérotype NJ et du sous-type IND-1 ont été isolées dans des zones où la maladie sévit à l’état enzootique : Sud-Est des USA, Mexique, Amérique Centrale, Panama, Venezuela, Colombie, Équateur et Pérou. La souche IND-2 Salto-Argentina/63 a été isolée de chevaux en Argentine en 1963. Cette souche, ainsi que la souche Maipù-Argentina/86 et 2 autres isolées en 1966 et 1979 au Brésil, ont été classées dans le même sous-type, et elles n’affectent que les chevaux (2, 3). Les bovins cohabitant avec les chevaux atteints ne présentent pas de séroconversion (2). Le sous-type IND-3, représenté par la souche IND-3 Alagoas-Brazil/64, a été isolé sporadiquement au Brésil uniquement. Jusqu’en 1977, les souches du sous-type IND-3 n’ont été isolées que du cheval. La souche IND-3 Espinoza-Brazil/77 fut la première souche à être isolée de bovins. Les souches IND-3 connues pour affecter les bovins sont moins pathogènes pour les chevaux (2, 3). Ces faits confirment les premières descriptions de la maladie, en 1926 et 1927 (7, 18), mettant en évidence les sérotypes NJ et IND chez les chevaux et, dans une moindre mesure, chez les bovins et chez les porcs. Le mécanisme de transmission du virus n’est pas encore bien défini. Le fait que le virus ait été isolé de stomoxes, de moustiques et d’autres insectes sous-tend l’hypothèse qu’il pourrait être transmis par les insectes (6, 10, 17). D’autres hypothèses font état du fait que le virus de la stomatite vésiculeuse pourrait être un virus végétal présent sur les pâturages (17) et que les animaux seraient l’extrémité de la chaîne épidémiologique : dans certaines circonstances, le virus pourrait s’adapter de façon à pouvoir infecter des animaux, processus qui serait suivi par un mode de transmission directe entre animaux d’espèces sensibles. Au cours de l’épizootie de 1982 dans l’ouest des USA, un certain nombre de cas ont été observés dont la transmission se faisait directement d’animal à animal (20). Bien que la SV n’ait pas été mise en évidence aux USA chaque année dans le bétail, elle est considérée comme enzootique chez le porc retourné à l’état sauvage sur l’île d’Ossabaw en Géorgie (5). L’incidence de la maladie peut-être très variable dans les troupeaux infectés. Normalement, 10 à 15 % des animaux présentent des signes cliniques. Les manifestations cliniques sont plus fréquemment visibles chez les adultes. Les bovins et les chevaux de moins de 1 an sont rarement affectés. La mortalité est quasiment nulle dans les 2 espèces. Cependant, on peut observer un taux de mortalité élevé chez les porcs atteints par le virus NJ. Les animaux malades recouvrent leur état normal en 2 semaines. Les complications d’importance économique les plus couramment observées sont des mammites et des chutes de production dans les troupeaux laitiers (16). Aux USA en 1995, 1997 et 1998, ce sont les 2 sérotypes NJ et IND-1 qui étaient à l’origine des foyers primaires, n’engendrant de signes cliniques que chez les chevaux, alors que seule une séroconversion était observée chez les bovins. B. TECHNIQUES DE DIAGNOSTIC La stomatite vésiculeuse ne peut être valablement différenciée cliniquement de la fièvre aphteuse (FA), de l’exanthème vésiculeux (EV) et de la maladie vésiculeuse des suidés (MVS) lorsque les chevaux ne sont pas affectés. Un diagnostic précoce de laboratoire devra être d’urgence mis en œuvre lors de toute suspicion de stomatite vésiculeuse. La collecte des échantillons et les techniques utilisées pour le diagnostic de la SV doivent être en accord avec la méthodologie utilisée pour le diagnostic de la FA, de l’EV ou de la MVS afin de faciliter le diagnostic de ces affections vésiculeuses. A noter que le virus de la SV est pathogène pour l’homme et que des précautions particulières doivent être prises lorsque l’on manipule des tissus potentiellement infectés par le virus (voir le Chapitre I.1.6., « La biosécurité au laboratoire de microbiologie vétérinaire »). 148 Manuel terrestre de l’OIE 2005 Chapitre 2.1.2. — Stomatite vésiculeuse Le liquide vésiculaire, l’épithélium de la paroi des vésicules non rompues, les fragments d’épithélium provenant de vésicules récemment rompues ou les écouvillons réalisés à partir des vésicules rompues sont les prélèvements les plus adéquats. Ces prélèvements peuvent être issus de lésions buccales, de lésions podales ou de tout autre zone où se développent des vésicules. Il est recommandé de tranquilliser les animaux avant d’effectuer les prélèvements afin d’éviter la survenue d’accidents chez les aides en particulier, ainsi qu’en raison du bien-être animal. Les fragments d’épithélium doivent être placés dans des flacons contenant du tampon Tris additionné de bouillon tryptose et de rouge de phénol, à pH 7,6. Si la fixation du complément (FC) doit être mise en œuvre pour la détection de l’antigène, les prélèvements peuvent être placés en tampon glycérol/phosphate à un pH situé entre 7,2 et 7,6. A noter que le glycérol est toxique pour le virus de la SV et qu’il diminue la sensibilité de l’isolement viral. Son utilisation n’est recommandée que pour la récolte d’échantillons destinés à la fixation du complément. Les prélèvements doivent être conservés sous froid et s’ils peuvent arriver au laboratoire dans les 48 h suivant leur récolte, ils doivent être envoyés réfrigérés. S’ils doivent être envoyés congelés en carboglace, il faut s’assurer que le CO2 ne pénètre pas dans l’échantillon et ne détruise pas le virus. Il est nécessaire d’utiliser des emballages spéciaux pour l’envoi des prélèvements en carboglace (pour plus d’informations sur l’envoi des prélèvements destinés au diagnostic, voir le Chapitre I.1.1., « Méthodes de prélèvement »). Chez les bovins, lorsque l’on ne peut disposer de tissu épithélial, on peut faire appel à des prélèvements de liquide oesophago-pharyngé prélevés à l’aide d’une curette oesophagienne (pour prélèvement d’expectorations). Chez les porcs, des écouvillons de gorge peuvent être adressés au laboratoire en vue d’un isolement viral. Ce matériel doit être envoyé sous froid en tampon Tris additionné de bouillon tryptose. Si les prélèvements doivent voyager durant plus de 48 h après leur récolte, ils doivent être envoyés congelés sous carboglace comme décrit précédemment. Les prélèvements de liquide oesophago-pharyngé ne doivent pas être traités avec des solvants tels que le chloroforme. Le virus peut être isolé des tissus nasaux ou buccaux plus de 7 jours après l’infection initiale. Lorsqu’il n’est pas possible de réaliser des prélèvements pour l’identification de l’agent, on collectera des sérums d’animaux convalescents ou guéris afin de détecter la présence éventuelle d’anticorps spécifiques et de les quantifier. Il faudra privilégier la récolte de couples de sérums prélevés sur les mêmes animaux à 1 ou 2 semaines d’intervalle, afin d’évaluer les modifications du titre des anticorps. Des réactifs spécifiques de diagnostic de la SV ne sont pas commercialisés à l’heure actuelle et chaque laboratoire doit préparer les siens ou utiliser ceux fournis par un laboratoire de référence. Les 2 laboratoires de référence de l’OIE pour la stomatite vésiculeuse (se reporter à la liste de la partie 3 de ce Manuel terrestre) ainsi 1 que l’Institut de la Santé Animale de Pirbright produisent et distribuent ces réactifs de diagnostic à la demande. 1. Identification de l’agent pathogène Pour l’identification tant du virus de la SV que des affections vésiculeuses qui font l’objet de son diagnostic différentiel, des suspensions clarifiées préparées à partir de prélèvements supposés contenir du virus doivent être soumises à différentes épreuves immunologiques. En ce qui concerne l’isolement du virus, les mêmes prélèvements doivent être inoculés à des cultures cellulaires appropriées. L’inoculation de ces prélèvements à différents types de cellules en lignée continue, tels que du rein de singe vert africain (Vero), du rein de hamster nouveau-né (BHK-21) ou du rein de porc (IB-RS-2) permet d’effectuer la différenciation entre les différentes maladies vésiculeuses : le virus de la SV provoque un effet cytopathogène (ECP) sur les 3 types de lignée ; le virus de la fièvre aphteuse n’engendre d’ECP que sur les cellules BHK-21 et IB-RS-2, tandis que le virus de la MVS ne provoque d’ECP que sur les cellules IB-RS-2. De nombreuses autres cellules, en particulier les cellules en culture primaire d’origine animale, sont sensibles au virus de la SV. Le virus de la SV se réplique sur la membrane chorio-allantoïdienne d’œufs embryonnés de 8 à 10 jours ; il peut également être isolé de souriceaux de 2 à 7 jours infectés par différentes voies et de souris de 3 semaines inoculées par la voie intra-cérébrale. Dans les 3 cas, le virus de la SV engendre la mort en 2 à 5 jours. Chez les chevaux et les bovins, l’administration la plus efficace est l’inoculation intradermo-linguale. Les porcs doivent être inoculés par voie sous-cutanée dans le bourrelet coronaire des onglons ou dans le groin. Les lésions vésiculeuses peuvent être observées sur les muqueuses buccales, la peau des trayons et des pattes dans les 2 à 4 jours suivant l’inoculation. La présence de vésicules secondaires consécutive à l’inoculation chez les bovins et les chevaux dépend essentiellement de la souche virale utilisée. Chez les porcs, le groin est habituellement affecté. Si l’on observe un ECP dans les cultures, le liquide surnageant peut être utilisé pour l’identification de l’agent par différentes réactions immunologiques et les tapis cellulaires peuvent être colorés par un conjugué-anticorps fluorescent spécifique de la SV. Des épreuves similaires peuvent être effectuées avec les suspensions homogénéisées issues du broyat de tissu des muscles squelettiques de souris ou d’embryons de poulet morts de 1 Insitute for Animal Health, Pirbright Laboratory, Ash Road, Pirbright, Woking, Surrey GU24 0NF, Royaume-Uni. Manuel terrestre de l’OIE 2005 149 Chapitre 2.1.2. — Stomatite vésiculeuse maladie, ainsi qu’avec les suspensions obtenues par broyage de fragments épithéliaux. Le tissu cérébral des souris et souriceaux est une excellente source de virus. En raison des caractéristiques morphologiques différentes des rhabdovirus (virus de la SV), picornavirus (virus de la FA et de la MVS), calicivirus (virus de l’EV), et du grand nombre de virions présents dans le liquide vésiculaire et les tissus épithéliaux, il est possible de faire appel à la microscopie électronique pour différencier les familles des différents virus en cause. Les méthodes immunologiques recommandées pour l’identification des antigènes viraux au laboratoire sont la méthode immuno-enzymatique (ELISA) (2, 9), la fixation du complément (2, 13) et l’immunofluorescence. La séroneutralisation du virus à l’aide de sérums contenant des anticorps dirigés contre le virus de SV ainsi que les sérotypes NJ et IND, peut être réalisée sur les cultures de tissu, les souriceaux nouveau-nés ou les œufs embryonnés mais cela nécessite davantage de temps de manipulation. a) Isolement du virus i) Inoculer les cultures cellulaires en tubes de Leighton et en flacons de 25 cm² avec la suspension clarifiée de broyat de tissu ou de liquide vésiculaire ; ii) Incuber les cultures cellulaires inoculées à 37°C pendant 1 h ; iii) Eliminer l’inoculum et laver les cultures cellulaires 3 fois avec du milieu de culture et remplacer le dernier milieu de lavage par du milieu de culture contenant 2,5 % de sérum fœtal de veau ; iv) Mettre à incuber les tubes de culture cellulaire entre 33 et 35°C et observer régulièrement l’apparition de l’ECP ; v) Après une incubation de 18 à 24 h, une lamelle de chaque série de tubes de culture cellulaire inoculée avec le même prélèvement est colorée respectivement avec un conjugué SV fluorescent anti-New Jersey et anti-indiana ; vi) Les autres tubes de Leighton ainsi que les flacons de culture sont incubés entre 35 et 37°C pendant plus de 6 jours et observés quotidiennement pour observer l’apparition de l’ECP ; vii) e Au 7 jour après l’inoculation, les lamelles des tubes de Leighton restants sont colorées avec le conjugué anticorps fluorescent. Si aucune fluorescence n’est observée ou si aucun ECP n’est décelable dans les flacons de culture cellulaire, les prélèvements sont considérés négatifs pour l’isolement de virus ; viii) Lorsqu’un ECP est observé et que la coloration avec l’antisérum conjugué fluorescent est négative, un second passage doit être réalisé comme décrit précédemment, en utilisant des cellules en flacons de 25 cm². b) Méthode immuno-enzymatique L’ELISA sandwich indirect (IS-ELISA) (2, 9) est la méthode de diagnostic de choix pour l’identification des sérotypes viraux de la stomatite vésiculeuse ou d’autres maladies vésiculeuses. L’ELISA utilisant un panel d’antisérums polyvalents de lapin/cobaye préparés contre les virions appartenant aux souches représentatives des 3 sous-types du sérotype IND permet l’identification de toutes les souches du sérotype IND du virus de la SV (2). Pour la mise en évidence des souches NJ du virus de la SV, il est préférable d’utiliser d’un jeu d’antisérums monovalents de lapin / cobaye (2, 9). 150 • Protocole i) Phase solide : Les plaques d’ELISA sont sensibilisées durant 1 h à 37°C ou 1 nuit à 4°C avec des antisérums de lapin et un sérum de lapin normal (comme décrit dans les réf. 2 et 4) dilués de façon adéquate dans du tampon carbonate/bicarbonate à pH 9,6. Elles sont ensuite lavées avec une solution physiologique tamponnée au phosphate (PBS) et traitée pendant 1 h à la température du laboratoire dans une solution bloquante de PBS additionné de 1 % d’ovalbumine. Les plaques ainsi préparées peuvent être utilisées immédiatement ou congelées à –20°C après 3 lavages avec du tampon PBS. ii) Prélèvements à tester : Les suspensions antigéniques des prélèvements à tester (suspension de tissus épithéliaux, de tissu musculaire d’embryon de poulet ou de souriceau en PBS entre 10 et 20 % ou, encore, de surnageant clarifié non dilué de culture cellulaire) sont déposées dans les puits correspondants et les plaques sont incubées pendant 30 min à 37°C sur un agitateur rotatif. iii) Révélation : Des antisérums monovalents et polyvalents de cobaye dirigés respectivement contre les sérotypes NJ et IND de la stomatite vésiculeuse, qui sont homologues au sérum de lapin qui a servi à la sensibilisation et qui ont été dilués de façon appropriée dans du PBS contenant 0,05 % de Tween 20, 1 % d’ovalbumine, 2 % de sérum de lapin normal et 2 % de sérum normal de veau (PBSTB), sont ajoutés aux puits correspondants et placés pendant 30 min à 37°C sur un agitateur rotatif. Manuel terrestre de l’OIE 2005 Chapitre 2.1.2. — Stomatite vésiculeuse iv) Conjugué : un conjugué d’immunoglobulines IgG de lapin ou de chèvre anti-immunoglobuline de cobaye et couplé à la peroxydase, dilué dans du PBSTB, est ajouté et mis à réagir pendant 30 min à 37°C sous agitation. v) Substrat : Un substrat activé à l’H2O2 est additionné et les plaques sont placées à la température du laboratoire pendant 15 min. Après addition d’acide sulfurique pour stopper la réaction, les valeurs d’absorbance sont mesurées à l’aide d’un lecteur d’ELISA. Pour réaliser de ce test, on utilise des volumes de réactif de 50 µl. Les plaques sont lavées à 5 reprises entre chaque étape avec du PBS contenant 0,05 % de Tween 20. Les témoins négatifs de la réaction sont incubés de la même manière. vi) c) Interprétation des résultats : Un antisérum donnant une absorbance supérieur de 20 % aux autres antisérums, le sérum négatif et les témoins est considéré comme positif vis-à-vis du sous-type viral correspondant. Test de fixation du complément Il est préférable d’utiliser le test ELISA par rapport à la fixation du complément, ce test étant plus sensible et non influencé par d’éventuels facteurs pro- ou anti-complémentaires. Toutefois, lorsque les réactifs permettant de mettre en œuvre l’ELISA ne sont pas disponibles, le test de fixation du complément peut être utilisée. Ce test doit être réalisé dans des plaques de microtitration à fond en U en utilisant les réactifs titrés par le test de fixation du complément à 50 % comme décrit plus bas. • Protocole i) Antisérums : Des sérums de cobaye monovalents anti-virus NJ de la SV et polyvalents anti-virus IND dilués dans du tampon Véronal (VB) à une dilution contenant 2,5 UFC50 (50 % d’unités fixant le complément) contre le virus homologue sont déposés dans les cupules. Ces antisérums sont les réactifs utilisés dans l’ELISA. ii) Prélèvements à tester : La suspension contenant les antigènes à tester, préparée comme décrit pour l’IS-ELISA, est placée dans les puits contenant le sérum. iii) Complément : 4 UHC50 (Unités hémolytiques de complément à 50 %) sont ajoutées au sérum et à l’antigène. (Une alternative consiste à utiliser 7,5, 10 et 20 UHC50 dans le but d’atteindre 4 UHC50 dans la réaction). Le mélange antisérums, échantillon à tester et complément, est mis en incubation à 37°C pendant 30 min. iv) Couple hémolytique : Une suspension de globules rouges de mouton en tampon véronal sensibilisés avec 10 UH50 ( 50 % d’unités hémolytiques) de sérum de lapin anti-globules rouges de mouton est placée dans les puits. Le couple hémolytique a une absorbance de 0,66 lue à 545 nm, dans la proportion de 2 volumes de couple hémolytique + 3 volumes d’eau distillée. Le mélange est incubé durant 30 min à 37°C. Les plaques sont ensuite centrifugées et la réaction est observée à l’œil nu. La réaction se fera sous un volume de 25 µl pour les antisérums, la suspension à tester et le complément, et de 50 µl pour le couple hémolytique. Des témoins antisérums, antigène, complément et couple hémolytique doivent être inclus dans la réalisation des tests. Il est possible de réaliser les tests de fixation du complément à 50 % en tubes (2) en utilisant des volumes de réactifs 8 fois plus importants que ceux indiqués pour la réalisation de cette réaction en microplaques. Si l’on utilise ce test, la réaction peut être exprimée par l’absorbance lue à l’aide d’un spectrophotomètre à 545 nm. v) Interprétation des résultats : Si les contrôles sur les témoins sont corrects, les puits dans lesquels se produit une hémolyse < 20 % pour un antisérum donné par rapport aux autres antisérums et aux témoins sont considérés comme positifs pour le type correspondant. Les prélèvements de terrain qui sont négatifs en ELISA ou en fixation de complément doivent être inoculés à des cultures cellulaires ou des souriceaux nouveau-nés. S’il n’y a aucun signe d’infection virale après 3 passages, le prélèvement est considéré comme exempt de virus de la SV. d) Méthodes d’identification de l’acide nucléique La réaction d’amplification en chaîne par polymérase (PCR) peut être utilisée pour amplifier de petits fragments génomiques du virus de la SV (12, 19). Cette technique permet la détection de l’ARN viral dans les tissus, le liquide vésiculaire et le surnageant de culture cellulaire mais elle ne permet pas de savoir si le Manuel terrestre de l’OIE 2005 151 Chapitre 2.1.2. — Stomatite vésiculeuse virus est infectieux ou non. En général, la PCR n’est pas utilisée pour l’identification en routine du virus de la SV. 2. Épreuves sérologiques L’ELISA et la séroneutralisation sont les 2 tests sérologiques qu’il convient d’utiliser pour l’identification et le titrage des anticorps spécifiques dans le sérum. La réaction de fixation du complément peut être employée pour e e le titrage des anticorps précoces. L’apparition des anticorps se situe entre le 5 et le 8 jour qui suit la contamination. Leur durée n’a pas été déterminée avec précision dans chacun des 3 tests, mais elle devrait être relativement courte pour les anticorps fixant le complément et plus étendue pour les anticorps détectés par la séroneutralisation ou l’ELISA (14). a) Méthode immuno-enzymatique (épreuve prescrite pour les échanges internationaux) L’ELISA bloquant en phase liquide (LP-ELISA) est la méthode de choix pour la détection et le titrage des anticorps. L’emploi des glycoprotéines virales comme antigène est à recommander car elles ne sont pas infectieuses, elles détectent les anticorps neutralisants et donnent moins de résultats faussement positifs que la séroneutralisation (4). • • Protocole i) Phase solide : Comme décrite dans la section B. 1. a. pour l’IS-ELISA. ii) Phase liquide : des séries de dilutions de 2 en 2 de chaque sérum à tester en commençant au ¼ sont réalisées en double et réparties dans des plaques de micro-titrage à fond en U. On ajoute à chacun des puits un volume égal de glycoprotéine virale NJ ou IND à la dilution permettant la lyse de 70 % des cellules, et les plaques sont incubées durant 1 h à 37°C. 50 µl de ce mélange sont ensuite transférés dans chacun des puits de la plaque ELISA en phase solide et placés à 37°C pendant 30 min sur un agitateur rotatif afin que la réaction puisse se faire. iii) Détecteur, conjugué et substrat : Devront être utilisés les mêmes méthodes et réactifs que ceux préconisés pour l’IS-ELISA. iv) Interprétation des résultats : Les titres sont exprimés en log10 de la dilution finale qui donne 50 % d’inhibition de la D.O. par rapport au sérum négatif de référence, comme indiqué par la méthode de Spearmann-Kärber. Les titres supérieurs à 1,3 (1/20) sont considérés comme positifs. ELISA de compétition (épreuve prescrite pour les échanges internationaux) Un ELISA de compétition a été mis au point pour la détection des anticorps. La procédure décrite ici est basée sur celle décrite par Afshar et coll. (1). Elle fait appel aux antigènes recombinants des souches de virus NJ et IND-1 de la S.V. comme l’ont décrit Katz et coll. (15). 152 • Protocole i) Phase solide : Les antigènes sont dilués dans du tampon carbonate/bicarbonate à pH 7,6, et 50 µl sont placés dans chacun des puits de la plaque ELISA à 96 trous. Les plaques sont alors incubées une nuit à 4°C ; les plaques sensibilisées peuvent être conservées congelées pendant plus de 60 jours. Ces plaques sont ensuite décongelées, l’antigène est décanté et on leur additionne 100 µl de solution de blocage. Les plaques sont alors lavées 3 fois avec une solution de PBS / Tween 20 à 0,05 %. ii) Phase liquide : 50 µl de sérum dilué au 1/8 dans 1 % de lait en poudre écrémé en suspension dans du PBS sont additionnés à chacun des 2 puits de chaque échantillon. Un témoin sérum positif et négatif de chaque sérotype doit être placé sur chaque plaque ELISA. Les plaques sont alors incubées à 37°C pendant 30 min. Elles ne subissent ensuite aucun lavage, mais on rajoute dans chacun des puits 50 µl de liquide d’ascite polyclonal. Elles sont alors remises à incuber à 37°C pendant 30 min. iii) Révélation : Les plaques sont lavées 3 fois et 50 µl de sérum de chèvre anti-souris conjugué à la peroxydase de radis dilué à 1 % dans du lait dégraissé en poudre sont additionnés à chaque puits. Les plaques sont alors incubées à 37°C pendant 30 min, lavées 3 fois et 50 µl d’une solution de tétraméthyl-benzidine (TMB) sont additionnés à chaque puits. Les plaques sont alors incubées à 25°C pendant 5 à 10 min, et 50 µl d’acide sulfurique 0,05 M sont placés dans chacun des puits. Les plaques sont lues à 450 nm sachant que la densité optique des témoins doit être supérieure à 1,0. iv) Interprétation des résultats : Un échantillon est considéré comme positif si l’absorbance est inférieure ou égale à l’absorbance du témoin. Manuel terrestre de l’OIE 2005 Chapitre 2.1.2. — Stomatite vésiculeuse b) Séroneutralisation virale (épreuve prescrite pour les échanges internationaux) Le test de séroneutralisation s’effectue sur des cultures de cellules en microplaques à puits à fond plat en utilisant des sérums à tester inactivés, 1 000 DICT50 (Dose infectieuse pour 50 % des cultures de tissu) de virus NJ ou IND, et des tapis préformés de cellules Vero M (4) ou une suspension de cellules IB-RS-2. On recherchera la présence de virus non neutralisé. c) • Protocole i) Virus : on utilisera du virus cultivé sur tapis de cellules Vero conservé dans l’azote liquide ou congelé à –70° C. ii) Echantillons à tester : Les sérums seront inactivés à 56°C pendant 30 min avant d’être testés. Des sérums témoins standard positifs et négatifs devront être inclus dans le test. iii) Séroneutralisation : Les sérums placés sur les microplaques sont dilués de demi en demi à partir d’une dilution initiale au quart. On utilisera 2 rangées de puits par sérum. 25 µl de suspension de virus NJ ou IND contenant environ 1 000 DICT50 seront ajoutés à chaque puits et les microplaques seront incubées à 37°C pendant 60 min pour permettre à la réaction de neutralisation de se faire. 50 µl du mélange sont ensuite déposés sur les tapis cellulaires pré-établis dans les puits des plaques de titrage ou bien 150 µl d’une suspension de cellules Vero ou de cellules IB-RS-2 à raison de 300 000 cellules/ml sont ajoutés à chaque puits contenant le mélange sérum/virus. Les plaques sont ensuite soit recouvertes d’un couvercle lâche et mises à incuber durant 48 à 72 h à 37°C sous atmosphère de 5 % de CO2, soit recouvertes de façon étanche par du ruban adhésif et mises à incuber en atmosphère normale. (Il a été établi qu’un titre viral de 1 000 DICT50 réduit les réactions non spécifiques tout en maintenant une grande sensibilité). iv) Interprétation des résultats : Les puits ne présentant pas d’ECP sont considérés comme contenant un sérum protecteur. Les titres limites des sérums témoins sont calculés par la méthode de Spearmann-Kärber lorsque les titres viraux sont compris entre 750 et 1 330 DICT50 et lorsque les titres des sérums standard positif et négatif ont une valeur 2 fois inférieure à celle déterminée au préalable. Les titres de neutralisation 100 % de chaque sérum sont exprimés en log10. Les sérums dont les titres sont égaux ou supérieurs au 1/32 sont considérés comme positifs vis-à-vis de la SV. Fixation du complément (épreuve prescrite pour les échanges internationaux) Une description détaillée de ce test est donnée dans la Section B. 1. b. Elle est modifiée comme suit. La réaction de fixation du complément peut être utilisée pour quantifier les anticorps précoces. Pour ce faire, des dilutions de sérum de demi en demi sont mélangées à 2 UFC50 d’antigène connu et à 5 % de sérum de veau ou de bovin normal contenant 4 UHC50 de complément. Ce mélange est incubé pendant 3 h à 37°C ou une nuit à 4°C. Le couple hémolytique est ensuite rajouté et une nouvelle incubation de 30 min à 37°C est réalisée. Le titre du sérum est déterminé par la plus grande dilution dans laquelle aucune hémolyse n’est observée. Les sérums dont les titres sont égaux ou supérieurs à 1/5 sont considérés comme positifs. La fixation du complément est une méthode de faible sensibilité qui est en outre fréquemment mise en défaut par des facteurs anti-complémentaires ou non spécifiques. C. SPÉCIFICATIONS APPLICABLES AUX VACCINS ET AUX PRODUITS BIOLOGIQUES À USAGE DIAGNOSTIQUE Des vaccins à virus atténué ont été éprouvés sur le terrain aux États-Unis d’Amérique, à Panama, au Guatemala, au Pérou et au Venezuela (16, 17). Leur efficacité n’est pas connue. A ce jour, aucun vaccin à virus vivant ou atténué n’est disponible sur le marché. REMERCIEMENTS Certains éléments de ce chapitre ont été utilisés ou sont repris du chapitre sur la stomatite vésiculeuse des précédentes éditions de ce Manuel terrestre. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES Manuel terrestre de l’OIE 2005 153 Chapitre 2.1.2. — Stomatite vésiculeuse 1. AFSHAR A., SHAKARCHI N.H. & DULAC G.C. (1993). Development of a competitive enzyme linked immunosorbent assay for detection of bovine, equine, ovine and porcine antibodies to vesicular stomatitis virus. J. Clin. Microbiol., 31, 1860–1865. 2. ALONSO A., MARTINS M., GOMES M.P.D., ALLENDE R. & SONDAHL M.S. (1991). Development and evaluation of an enzyme-linked immunosorbent assay for detection, typing and subtyping of vesicular stomatitis virus. J. Vet. Diagn. Invest., 3, 287–292. 3. ALONSO FERNANDEZ A. & SONDAHL M.S. (1985). 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