Chapitre 2.1.2.

CHAPITRE 2.1.2.
STOMATITE VÉSICULEUSE
RÉSUMÉ
La stomatite vésiculeuse (SV) est une affection vésiculeuse des chevaux, des ruminants et des
porcs due à un vésiculovirus de la famille des Rhabdoviridae. Lorsque les chevaux ne sont pas
atteints par le processus morbide, cette maladie ne peut être cliniquement distinguée de la fièvre
aphteuse (FA), de l’exanthème vésiculeux (EV) ou de la maladie vésiculeuse des suidés (MVS).
Les moutons, les chèvres et de nombreuses autres espèces sauvages peuvent également être
atteints par cette maladie. L’homme est aussi sensible. La maladie est confinée au continent
américain ; autrefois cependant, elle fut décrite en France et en Afrique du Sud.
Bien que la stomatite vésiculeuse soit transmise directement par voie cutanéo-muqueuse, le virus
responsable de la maladie a été isolé de stomoxes ou de moustiques, suggérant qu’il puisse s’agir
d’une arbovirose. Elle manifeste cependant des variations saisonnières, disparaissant à la fin de la
saison pluvieuse dans les régions tropicales et dès l’apparition des premières gelées dans les
zones tempérées. Il se pourrait que le virus soit un virus de plantes et que les animaux se trouvent
en fin de chaîne épidémiologique. La pathogénie de cette affection n’est pas encore bien établie et
des observations montrent que les anticorps humoraux spécifiques ne protègent pas toujours
contre une infection par le virus de la stomatite vésiculeuse.
Bien que l’on puisse suspecter la présence de la stomatite vésiculeuse lorsque des chevaux sont
atteints en même temps que des porcs ou des bovins, il est nécessaire d’effectuer un diagnostic
différentiel au laboratoire car les signes cliniques ne sont pas différenciables de ceux de la FA
lorsque des bovins et des porcs sont affectés et de ceux de la MVS ou de l’EV lorsque seuls des
porcs sont atteints.
Identification de l’agent pathogène : Le virus de la SV peut être facilement isolé par inoculation à
diverses cellules en culture, à des souriceaux nouveau-nés ou à des œufs embryonnés. L’antigène
viral peut être isolé par une méthode immuno-enzymatique sandwich indirecte (IS-ELISA). Cette
épreuve est la plus rapide et la moins onéreuse. La fixation du complément est aussi une bonne
alternative. On peut aussi utiliser le test de neutralisation virale mais c’est une technique plus
élaborée et longue à mettre en œuvre.
Épreuves sérologiques : Les animaux convalescents développent des anticorps spécifiques dans
les 4 à 8 jours suivant l’infection. Ceux-ci peuvent être mis en évidence par un ELISA de blocage
en phase liquide (LP-ELISA), un ELISA de compétition (C-ELISA) et une séroneutralisation
virale (SN). D’autres tests tels que la fixation du complément, l’immunodiffusion en gélose et la
contre-immunoélectrophorèse ont été décrits.
Spécifications applicables aux vaccins et aux produits biologiques à usage diagnostique :
Des vaccins à virus inactivé adjuvés avec de l’hydroxyde d’aluminium ou un excipient huileux ont
été testés respectivement aux États-Unis d’Amérique et en Colombie. Les 2 vaccins engendrent
des titres élevés d’anticorps spécifiques dans les sérums des bovins vaccinés. Toutefois, on n’a
pas la certitude que ces anticorps sériques protègent effectivement contre la maladie. Un vaccin à
virus atténué a été mis au point mais son efficacité sur le terrain n’est pas connue.
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Chapitre 2.1.2. — Stomatite vésiculeuse
A. INTRODUCTION
La stomatite vésiculeuse a été décrite aux Etats-Unis d’Amérique (USA) en 1926 (18) et 1927 (7) comme une
maladie vésiculeuse affectant les chevaux et, un peu plus tard, les bovins et les porcs. Le virus engendre
l’apparition de vésicules sur la langue, les lèvres, les muqueuses buccales, les trayons et le bourrelet coronaire
du pied des bovins, chevaux, porcs, ainsi que chez d’autres espèces animales domestiques ou sauvages. De
nombreuses espèces d’animaux de laboratoire sont également sensibles. La maladie est confinée au continent
américain ; cependant elle a été décrite en France (en 1915 et 1917) et en Afrique du Sud (1886 et 1897) (11).
Des signes grippaux, habituellement sans présence de vésicules, ont été observés chez l’homme en contact avec
des animaux malades ou avec du virus infectieux. Toute manipulation de virus de la stomatite vésiculeuse, y
compris de matériel infectieux issu d’animaux malades, doit être réalisée en appliquant les procédures de
biosécurité adéquates.
Il existe 2 grands types immunologiques de virus, New Jersey (NJ) et Indiana (IND). Ces 2 virus font partie du
genre Vesiculovirus et de la famille des Rhabdoviridae. Ils ont fait l’objet de nombreuses études moléculaires.
Plusieurs autres rhabdovirus apparentés ont été isolés d’autres animaux malades au cours des dernières
décennies. Ces souches dénommées Salto-Argentina/63 et Alagoas-Brazil/64 sont considérées respectivement
comme les sous-types 2 et 3 du sérotype IND (8). D’autres souches du sérotype NJ et du sous-type IND-1 ont été
isolées dans des zones où la maladie sévit à l’état enzootique : Sud-Est des USA, Mexique, Amérique Centrale,
Panama, Venezuela, Colombie, Équateur et Pérou. La souche IND-2 Salto-Argentina/63 a été isolée de chevaux
en Argentine en 1963. Cette souche, ainsi que la souche Maipù-Argentina/86 et 2 autres isolées en 1966 et
1979 au Brésil, ont été classées dans le même sous-type, et elles n’affectent que les chevaux (2, 3). Les bovins
cohabitant avec les chevaux atteints ne présentent pas de séroconversion (2). Le sous-type IND-3, représenté
par la souche IND-3 Alagoas-Brazil/64, a été isolé sporadiquement au Brésil uniquement. Jusqu’en 1977, les
souches du sous-type IND-3 n’ont été isolées que du cheval. La souche IND-3 Espinoza-Brazil/77 fut la première
souche à être isolée de bovins. Les souches IND-3 connues pour affecter les bovins sont moins pathogènes pour
les chevaux (2, 3). Ces faits confirment les premières descriptions de la maladie, en 1926 et 1927 (7, 18), mettant
en évidence les sérotypes NJ et IND chez les chevaux et, dans une moindre mesure, chez les bovins et chez les
porcs.
Le mécanisme de transmission du virus n’est pas encore bien défini. Le fait que le virus ait été isolé de stomoxes,
de moustiques et d’autres insectes sous-tend l’hypothèse qu’il pourrait être transmis par les insectes (6, 10, 17).
D’autres hypothèses font état du fait que le virus de la stomatite vésiculeuse pourrait être un virus végétal présent
sur les pâturages (17) et que les animaux seraient l’extrémité de la chaîne épidémiologique : dans certaines
circonstances, le virus pourrait s’adapter de façon à pouvoir infecter des animaux, processus qui serait suivi par
un mode de transmission directe entre animaux d’espèces sensibles. Au cours de l’épizootie de 1982 dans
l’ouest des USA, un certain nombre de cas ont été observés dont la transmission se faisait directement d’animal à
animal (20). Bien que la SV n’ait pas été mise en évidence aux USA chaque année dans le bétail, elle est
considérée comme enzootique chez le porc retourné à l’état sauvage sur l’île d’Ossabaw en Géorgie (5).
L’incidence de la maladie peut-être très variable dans les troupeaux infectés. Normalement, 10 à 15 % des
animaux présentent des signes cliniques. Les manifestations cliniques sont plus fréquemment visibles chez les
adultes. Les bovins et les chevaux de moins de 1 an sont rarement affectés. La mortalité est quasiment nulle
dans les 2 espèces. Cependant, on peut observer un taux de mortalité élevé chez les porcs atteints par le virus
NJ. Les animaux malades recouvrent leur état normal en 2 semaines. Les complications d’importance
économique les plus couramment observées sont des mammites et des chutes de production dans les troupeaux
laitiers (16). Aux USA en 1995, 1997 et 1998, ce sont les 2 sérotypes NJ et IND-1 qui étaient à l’origine des
foyers primaires, n’engendrant de signes cliniques que chez les chevaux, alors que seule une séroconversion
était observée chez les bovins.
B. TECHNIQUES DE DIAGNOSTIC
La stomatite vésiculeuse ne peut être valablement différenciée cliniquement de la fièvre aphteuse (FA), de
l’exanthème vésiculeux (EV) et de la maladie vésiculeuse des suidés (MVS) lorsque les chevaux ne sont pas
affectés. Un diagnostic précoce de laboratoire devra être d’urgence mis en œuvre lors de toute suspicion de
stomatite vésiculeuse.
La collecte des échantillons et les techniques utilisées pour le diagnostic de la SV doivent être en accord avec la
méthodologie utilisée pour le diagnostic de la FA, de l’EV ou de la MVS afin de faciliter le diagnostic de ces
affections vésiculeuses. A noter que le virus de la SV est pathogène pour l’homme et que des précautions
particulières doivent être prises lorsque l’on manipule des tissus potentiellement infectés par le virus (voir le
Chapitre I.1.6., « La biosécurité au laboratoire de microbiologie vétérinaire »).
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Chapitre 2.1.2. — Stomatite vésiculeuse
Le liquide vésiculaire, l’épithélium de la paroi des vésicules non rompues, les fragments d’épithélium provenant
de vésicules récemment rompues ou les écouvillons réalisés à partir des vésicules rompues sont les
prélèvements les plus adéquats. Ces prélèvements peuvent être issus de lésions buccales, de lésions podales ou
de tout autre zone où se développent des vésicules. Il est recommandé de tranquilliser les animaux avant
d’effectuer les prélèvements afin d’éviter la survenue d’accidents chez les aides en particulier, ainsi qu’en raison
du bien-être animal. Les fragments d’épithélium doivent être placés dans des flacons contenant du tampon Tris
additionné de bouillon tryptose et de rouge de phénol, à pH 7,6. Si la fixation du complément (FC) doit être mise
en œuvre pour la détection de l’antigène, les prélèvements peuvent être placés en tampon glycérol/phosphate à
un pH situé entre 7,2 et 7,6. A noter que le glycérol est toxique pour le virus de la SV et qu’il diminue la sensibilité
de l’isolement viral. Son utilisation n’est recommandée que pour la récolte d’échantillons destinés à la fixation du
complément. Les prélèvements doivent être conservés sous froid et s’ils peuvent arriver au laboratoire dans les
48 h suivant leur récolte, ils doivent être envoyés réfrigérés. S’ils doivent être envoyés congelés en carboglace, il
faut s’assurer que le CO2 ne pénètre pas dans l’échantillon et ne détruise pas le virus. Il est nécessaire d’utiliser
des emballages spéciaux pour l’envoi des prélèvements en carboglace (pour plus d’informations sur l’envoi des
prélèvements destinés au diagnostic, voir le Chapitre I.1.1., « Méthodes de prélèvement »).
Chez les bovins, lorsque l’on ne peut disposer de tissu épithélial, on peut faire appel à des prélèvements de
liquide oesophago-pharyngé prélevés à l’aide d’une curette oesophagienne (pour prélèvement d’expectorations).
Chez les porcs, des écouvillons de gorge peuvent être adressés au laboratoire en vue d’un isolement viral. Ce
matériel doit être envoyé sous froid en tampon Tris additionné de bouillon tryptose. Si les prélèvements doivent
voyager durant plus de 48 h après leur récolte, ils doivent être envoyés congelés sous carboglace comme décrit
précédemment. Les prélèvements de liquide oesophago-pharyngé ne doivent pas être traités avec des solvants
tels que le chloroforme. Le virus peut être isolé des tissus nasaux ou buccaux plus de 7 jours après l’infection
initiale.
Lorsqu’il n’est pas possible de réaliser des prélèvements pour l’identification de l’agent, on collectera des sérums
d’animaux convalescents ou guéris afin de détecter la présence éventuelle d’anticorps spécifiques et de les
quantifier. Il faudra privilégier la récolte de couples de sérums prélevés sur les mêmes animaux à 1 ou
2 semaines d’intervalle, afin d’évaluer les modifications du titre des anticorps.
Des réactifs spécifiques de diagnostic de la SV ne sont pas commercialisés à l’heure actuelle et chaque
laboratoire doit préparer les siens ou utiliser ceux fournis par un laboratoire de référence. Les 2 laboratoires de
référence de l’OIE pour la stomatite vésiculeuse (se reporter à la liste de la partie 3 de ce Manuel terrestre) ainsi
que l’Institut de la Santé Animale de Pirbright1 produisent et distribuent ces réactifs de diagnostic à la demande.
1. Identification de l’agent pathogène
Pour l’identification tant du virus de la SV que des affections vésiculeuses qui font l’objet de son diagnostic
différentiel, des suspensions clarifiées préparées à partir de prélèvements supposés contenir du virus doivent être
soumises à différentes épreuves immunologiques. En ce qui concerne l’isolement du virus, les mêmes
prélèvements doivent être inoculés à des cultures cellulaires appropriées. L’inoculation de ces prélèvements à
différents types de cellules en lignée continue, tels que du rein de singe vert africain (Vero), du rein de hamster
nouveau-né (BHK-21) ou du rein de porc (IB-RS-2) permet d’effectuer la différenciation entre les différentes
maladies vésiculeuses : le virus de la SV provoque un effet cytopathogène (ECP) sur les 3 types de lignée ; le
virus de la fièvre aphteuse n’engendre d’ECP que sur les cellules BHK-21 et IB-RS-2, tandis que le virus de la
MVS ne provoque d’ECP que sur les cellules IB-RS-2. De nombreuses autres cellules, en particulier les cellules
en culture primaire d’origine animale, sont sensibles au virus de la SV.
Le virus de la SV se réplique sur la membrane chorio-allantoïdienne d’œufs embryonnés de 8 à 10 jours ; il peut
également être isolé de souriceaux de 2 à 7 jours infectés par différentes voies et de souris de 3 semaines
inoculées par la voie intra-cérébrale. Dans les 3 cas, le virus de la SV engendre la mort en 2 à 5 jours.
Chez les chevaux et les bovins, l’administration la plus efficace est l’inoculation intradermo-linguale. Les porcs
doivent être inoculés par voie sous-cutanée dans le bourrelet coronaire des onglons ou dans le groin. Les lésions
vésiculeuses peuvent être observées sur les muqueuses buccales, la peau des trayons et des pattes dans les 2 à
4 jours suivant l’inoculation. La présence de vésicules secondaires consécutive à l’inoculation chez les bovins et
les chevaux dépend essentiellement de la souche virale utilisée. Chez les porcs, le groin est habituellement
affecté.
Si l’on observe un ECP dans les cultures, le liquide surnageant peut être utilisé pour l’identification de l’agent par
différentes réactions immunologiques et les tapis cellulaires peuvent être colorés par un conjugué-anticorps
fluorescent spécifique de la SV. Des épreuves similaires peuvent être effectuées avec les suspensions
homogénéisées issues du broyat de tissu des muscles squelettiques de souris ou d’embryons de poulet morts de
1 Insitute for Animal Health, Pirbright Laboratory, Ash Road, Pirbright, Woking, Surrey GU24 0NF, Royaume-Uni.
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Chapitre 2.1.2. — Stomatite vésiculeuse
maladie, ainsi qu’avec les suspensions obtenues par broyage de fragments épithéliaux. Le tissu cérébral des
souris et souriceaux est une excellente source de virus.
En raison des caractéristiques morphologiques différentes des rhabdovirus (virus de la SV), picornavirus (virus de
la FA et de la MVS), calicivirus (virus de l’EV), et du grand nombre de virions présents dans le liquide vésiculaire
et les tissus épithéliaux, il est possible de faire appel à la microscopie électronique pour différencier les familles
des différents virus en cause.
Les méthodes immunologiques recommandées pour l’identification des antigènes viraux au laboratoire sont la
méthode immuno-enzymatique (ELISA) (2, 9), la fixation du complément (2, 13) et l’immunofluorescence. La
séroneutralisation du virus à l’aide de sérums contenant des anticorps dirigés contre le virus de SV ainsi que les
sérotypes NJ et IND, peut être réalisée sur les cultures de tissu, les souriceaux nouveau-nés ou les œufs
embryonnés mais cela nécessite davantage de temps de manipulation.
a) Isolement du virus
i) Inoculer les cultures cellulaires en tubes de Leighton et en flacons de 25 cm² avec la suspension
clarifiée de broyat de tissu ou de liquide vésiculaire ;
ii) Incuber les cultures cellulaires inoculées à 37°C pendant 1 h ;
iii) Eliminer l’inoculum et laver les cultures cellulaires 3 fois avec du milieu de culture et remplacer le
dernier milieu de lavage par du milieu de culture contenant 2,5 % de sérum fœtal de veau ;
iv) Mettre à incuber les tubes de culture cellulaire entre 33 et 35°C et observer régulièrement l’apparition
de l’ECP ;
v) Après une incubation de 18 à 24 h, une lamelle de chaque série de tubes de culture cellulaire inoculée
avec le même prélèvement est colorée respectivement avec un conjugué SV fluorescent anti-New
Jersey et anti-indiana ;
vi) Les autres tubes de Leighton ainsi que les flacons de culture sont incubés entre 35 et 37°C pendant
plus de 6 jours et observés quotidiennement pour observer l’apparition de l’ECP ;
vii) Au 7e jour après l’inoculation, les lamelles des tubes de Leighton restants sont colorées avec le
conjugué anticorps fluorescent. Si aucune fluorescence n’est observée ou si aucun ECP n’est
décelable dans les flacons de culture cellulaire, les prélèvements sont considérés négatifs pour
l’isolement de virus ;
viii) Lorsqu’un ECP est observé et que la coloration avec l’antisérum conjugué fluorescent est négative, un
second passage doit être réalisé comme décrit précédemment, en utilisant des cellules en flacons de
25 cm².
b) Méthode immuno-enzymatique
L’ELISA sandwich indirect (IS-ELISA) (2, 9) est la méthode de diagnostic de choix pour l’identification des
sérotypes viraux de la stomatite vésiculeuse ou d’autres maladies vésiculeuses. L’ELISA utilisant un panel
d’antisérums polyvalents de lapin/cobaye préparés contre les virions appartenant aux souches
représentatives des 3 sous-types du sérotype IND permet l’identification de toutes les souches du sérotype
IND du virus de la SV (2). Pour la mise en évidence des souches NJ du virus de la SV, il est préférable
d’utiliser d’un jeu d’antisérums monovalents de lapin / cobaye (2, 9).
• Protocole
i) Phase solide : Les plaques d’ELISA sont sensibilisées durant 1 h à 37°C ou 1 nuit à 4°C avec des
antisérums de lapin et un sérum de lapin normal (comme décrit dans les réf. 2 et 4) dilués de façon
adéquate dans du tampon carbonate/bicarbonate à pH 9,6. Elles sont ensuite lavées avec une solution
physiologique tamponnée au phosphate (PBS) et traitée pendant 1 h à la température du laboratoire
dans une solution bloquante de PBS additionné de 1 % d’ovalbumine. Les plaques ainsi préparées
peuvent être utilisées immédiatement ou congelées à –20°C après 3 lavages avec du tampon PBS.
ii) Prélèvements à tester : Les suspensions antigéniques des prélèvements à tester (suspension de tissus
épithéliaux, de tissu musculaire d’embryon de poulet ou de souriceau en PBS entre 10 et 20 % ou,
encore, de surnageant clarifié non dilué de culture cellulaire) sont déposées dans les puits
correspondants et les plaques sont incubées pendant 30 min à 37°C sur un agitateur rotatif.
iii) Révélation : Des antisérums monovalents et polyvalents de cobaye dirigés respectivement contre les
sérotypes NJ et IND de la stomatite vésiculeuse, qui sont homologues au sérum de lapin qui a servi à
la sensibilisation et qui ont été dilués de façon appropriée dans du PBS contenant 0,05 % de Tween
20, 1 % d’ovalbumine, 2 % de sérum de lapin normal et 2 % de sérum normal de veau (PBSTB), sont
ajoutés aux puits correspondants et placés pendant 30 min à 37°C sur un agitateur rotatif.
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Chapitre 2.1.2. — Stomatite vésiculeuse
iv) Conjugué : un conjugué d’immunoglobulines IgG de lapin ou de chèvre anti-immunoglobuline de
cobaye et couplé à la peroxydase, dilué dans du PBSTB, est ajouté et mis à réagir pendant 30 min à
37°C sous agitation.
v) Substrat : Un substrat activé à l’H2O2 est additionné et les plaques sont placées à la température du
laboratoire pendant 15 min. Après addition d’acide sulfurique pour stopper la réaction, les valeurs
d’absorbance sont mesurées à l’aide d’un lecteur d’ELISA.
Pour réaliser de ce test, on utilise des volumes de réactif de 50 µl. Les plaques sont lavées à 5 reprises
entre chaque étape avec du PBS contenant 0,05 % de Tween 20. Les témoins négatifs de la réaction sont
incubés de la même manière.
vi) Interprétation des résultats : Un antisérum donnant une absorbance supérieur de 20 % aux autres
antisérums, le sérum négatif et les témoins est considéré comme positif vis-à-vis du sous-type viral
correspondant.
c) Test de fixation du complément
Il est préférable d’utiliser le test ELISA par rapport à la fixation du complément, ce test étant plus sensible et
non influencé par d’éventuels facteurs pro- ou anti-complémentaires. Toutefois, lorsque les réactifs
permettant de mettre en œuvre l’ELISA ne sont pas disponibles, le test de fixation du complément peut être
utilisée. Ce test doit être réalisé dans des plaques de microtitration à fond en U en utilisant les réactifs titrés
par le test de fixation du complément à 50 % comme décrit plus bas.
• Protocole
i) Antisérums : Des sérums de cobaye monovalents anti-virus NJ de la SV et polyvalents anti-virus IND
dilués dans du tampon Véronal (VB) à une dilution contenant 2,5 UFC50 (50 % d’unités fixant le
complément) contre le virus homologue sont déposés dans les cupules. Ces antisérums sont les
réactifs utilisés dans l’ELISA.
ii) Prélèvements à tester : La suspension contenant les antigènes à tester, préparée comme décrit pour
l’IS-ELISA, est placée dans les puits contenant le sérum.
iii) Complément : 4 UHC50 (Unités hémolytiques de complément à 50 %) sont ajoutées au sérum et à
l’antigène. (Une alternative consiste à utiliser 7,5, 10 et 20 UHC50 dans le but d’atteindre 4 UHC50 dans
la réaction). Le mélange antisérums, échantillon à tester et complément, est mis en incubation à
37°C pendant 30 min.
iv) Couple hémolytique : Une suspension de globules rouges de mouton en tampon véronal sensibilisés
avec 10 UH50 ( 50 % d’unités hémolytiques) de sérum de lapin anti-globules rouges de mouton est
placée dans les puits. Le couple hémolytique a une absorbance de 0,66 lue à 545 nm, dans la
proportion de 2 volumes de couple hémolytique + 3 volumes d’eau distillée. Le mélange est incubé
durant 30 min à 37°C. Les plaques sont ensuite centrifugées et la réaction est observée à l’œil nu.
La réaction se fera sous un volume de 25 µl pour les antisérums, la suspension à tester et le complément, et
de 50 µl pour le couple hémolytique. Des témoins antisérums, antigène, complément et couple hémolytique
doivent être inclus dans la réalisation des tests.
Il est possible de réaliser les tests de fixation du complément à 50 % en tubes (2) en utilisant des volumes
de réactifs 8 fois plus importants que ceux indiqués pour la réalisation de cette réaction en microplaques. Si
l’on utilise ce test, la réaction peut être exprimée par l’absorbance lue à l’aide d’un spectrophotomètre à 545
nm.
v) Interprétation des résultats : Si les contrôles sur les témoins sont corrects, les puits dans lesquels se
produit une hémolyse < 20 % pour un antisérum donné par rapport aux autres antisérums et aux
témoins sont considérés comme positifs pour le type correspondant.
Les prélèvements de terrain qui sont négatifs en ELISA ou en fixation de complément doivent être inoculés
à des cultures cellulaires ou des souriceaux nouveau-nés. S’il n’y a aucun signe d’infection virale après
3 passages, le prélèvement est considéré comme exempt de virus de la SV.
d) Méthodes d’identification de l’acide nucléique
La réaction d’amplification en chaîne par polymérase (PCR) peut être utilisée pour amplifier de petits
fragments génomiques du virus de la SV (12, 19). Cette technique permet la détection de l’ARN viral dans
les tissus, le liquide vésiculaire et le surnageant de culture cellulaire mais elle ne permet pas de savoir si le
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