REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE. MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE. UNIVERSITE D’ORAN FACULTÉ DES SCIENCES DÉPARTEMENT DE BIOLOGIE LABORATOIRE DE BIOTECHNOLOGIE DES RHYZOBIUMS ET AMELIORATION DES PLANTES. MEMOIRE POUR L'OBTENTION DU TITRE DE MAGISTER EN AMELIORATION DES PLANTES Par LACHACHI SARA Organogénèse et embryogénèse somatique directe chez la tomate. Jury composé de: President: Mr. Bekki A. Professeur Université d’Oran Rapporteur: Mme. Fyad-Lameche F/Z. . Professeur Université d’Oran Examinateur: Mr. Lothmani B. Maitre de conférence Université de Mostaganem Examinateur: Mr. Hadjadj-Aoul Seghir. . Maitre de conférence Université d’Oran Examinateur: Mr. Henni J. Professeur Université d’Oran 2009/2010 Remerciement Ce mémoire a été accompli sous la direction de Mme FyadLameche F/Z, Professeur à l’Université d’Oran Es-Sénia. Je tiens à lui exprimer ma plus profonde reconnaissance pour m´avoir épaulé tout au long de ce travail, pour m´avoir fait profiter de ses connaissances et pour son soutien précieux lors de la rédaction de ce mémoire malgré ses très nombreuses charges. Je souhaite remercier également toute l’équipe du laboratoire de génétique et amélioration des plantes pour l’aide, le temps et l’attention qu’ils m’ont accordés pendant ces années. Ma gratitude et mes vifs remerciements vont aussi à Mr Bekki Abdelkader, Professeur au Département de Biotechnologie de l’Université d’Oran Es-Sénia qui n’a pas hésiter à présider le jury de ce mémoire. J’exprime aussi mes vifs remerciements à Mr Lothmani B, Professeur à l’Université de Mostaganem, Mr Hadjadj A, Professeur à l’Université d’Oran Es-Sénia et à Mr Henni J, Professeur à l’Université d’Oran Es-Sénia de me faire l’honneur de participer à mon jury de thèse. Je voudrais remercier mon père, ma mère, mes frères, pour tout le soutien, la confiance et leurs mots d´encouragement qu´ils m´ont accordés. Mais surtout à toi, Djawed mon mari, mon confident, mon partenaire. Merci pour ton soutien, ta patience et tes encouragements. Enfin, merci à toute l’équipe du laboratoire de génétique et amélioration des plantes qui m’a accueillie chaleureusement. Je garderai un merveilleux souvenir de leur amitié et de leur aide. Table des matières 1 Introduction Chapitre I : Généralités sur la tomate I.1- Introduction 2 I.2- Intérêt de la culture de tomate 3 I.2.1- Alimentation humaine 3 I.2.2- Phytothérapie 3 I.3- Importance économique de la plante 4 I.3.1- Dans le monde 4 I.3.2- En Algérie 5 I.4- Origine phylogénétique de la plante 6 I.5- Les variétés cultivées 7 I.6- Biologie de la tomate 11 I.6.1- Morphologie de la plante 11 I.6.2- La biologie florale 11 I.6.3- La fructification et la maturation des tomates 12 I.6.4- La graine 12 I.6.5- La pollinisation des tomates 13 I.6.6- Types de croissance des pieds de tomates 14 I.6.6.1- Croissance indéterminée 14 I.6.6.2- Croissance déterminée 14 I.6.6.3- Croissance semi déterminée 14 I.7- Problèmes phytosanitaires 15 I.7.1-Variétés résistantes 15 I.7.2- Amendements organiques et minéraux 15 I.7.3- Moyens de lutte biologique 16 I.8- Amélioration de la plante et culture in vitro 16 I.8.1- Amélioration de la tomate pour la résistance aux maladies 17 I.8.2- Amélioration de la tomate pour la résistance à la sécheresse 17 I.8.3- Amélioration de la qualité gustative des tomates 17 I.8.4- Les tomates OGM créées 18 I.8.4.1- Tomates transgéniques 1401F, H282F, 11013F et 7913F 18 I.8.4.2- Tomate transgénique 1345-4 19 I.8.4.3- Tomate transgénique contre le cancer 19 Chapitre II : La culture in vitro II.1- Introduction 20 II.2- Qu'est-ce que la culture in vitro? 21 II.2.1- Définition 21 II.2.2- Historique et fondement de la culture in vitro 21 II.2.2.1- Historique 21 II.2.2.2- Fondement 22 a- La différenciation 22 b- La dédifférenciation 23 c- La totipotence 24 II.3- Les applications de la culture in vitro 24 II.3.1- Le sauvetage d'embryons 24 II.3.2- La micropropagation 24 II.3.2.1- Cultures de méristème 25 II.3.2.2- Organogenèse 26 a- Caulogenèse 26 b- Rhizogenèse 27 II.3.2.3- L'embryogenèse somatique 27 II.3.3- Production de plantes haploïdes 28 II.3.4- Culture et fusion des protoplastes 28 II.3.5- La variation somaclonale et la culture in vitro 28 II.4- Les bénéfices de la culture in vitro 29 II.4.1- Collection de génotypes et état physiologique du matériel conservé 29 II.4.2- Obtention de matériels indemnes de maladies 30 II.4.3- Développement de méthodes de production de plants 30 II.4.4- La culture in vitro au service de l'amélioration variétale II.5- Les problèmes liés à la culture in vitro 30 31 II.5.1- La vitrification 31 II.5.2- La perte de caractères intéressants 31 II.5.3- Problèmes inhérents à la technique 31 II.5.3.1- L’asepsie 31 II.5.3.2- L’acclimatation 32 II.5.3.3- L’apparition d’anomalies génétiques 32 II.6 - Le milieu de culture II.6.1- Les éléments minéraux 32 32 II.6.1.1- Les macroéléments 32 II.6.1.2- Les microéléments 32 II.6.2 - Les éléments organiques 33 II.6.2.1- Les sucres 33 II.6.2.2- Les vitamines 33 II.6.2.3- Les acides aminés 33 II.6.3 – Les régulateurs de croissance 33 II.6.3.1 - Les auxines 33 II.6.3.2- Les cytokinines 34 II.6.3.3- Les gibbérellines 34 II.6.4- Les géloses II.7 - Facteurs de la régénérabilité II.7.1- Effet de l'explant 34 34 34 II.7.1.1- L'âge physiologique et ontogénique de l'organe 35 II.7.1.2- L'époque du prélèvement 35 II.7.1.3- La taille de l'explant 35 II.7.2- Influence du génotype 35 II.7.3- Influence du milieu de culture 36 II.7.4- Les régulateurs de croissance 37 II.7.5- Influence de la source carbonée 39 Chapitre III : L’embryogénèse somatique III.1- Introduction 41 III.2- Présentation de l’embryogenèse somatique 41 III.3- Analyse de l’embryogenèse somatique par la génomique 43 III. 4- Les molécules signal participant au développement des embryons somatiques 43 III.5- Le contrôle hormonal de l’embryogenèse 44 III.5.1- Rôle de l’auxine 44 III.5.2- Rôle des cytokinines 45 III.6- Origine et développement des embryons somatiques 45 III.7- Différences entre l’embryogenèse somatique et l’embryogenèse zygotique 46 III.8- Intérêt de l'embryogenèse somatique 47 III.9- Les principaux stades de l’embryogenèse somatique 50 III.9.1- Initiation et prolifération du tissu embryogénique 50 III.9.2- Maturation des embryons somatiques 50 III.9.3- Germination des embryons somatiques 50 III.9.4- Culture en serre et transplantation sur le terrain 50 Chapitre IV : Matériels et méthodes IV.1- Objectif recherché 51 IV.2- Première expérience : essai préliminaire 51 IV.2.1- Matériel végétal 52 IV.2.2- Méthodes 52 IV.2.2.1- Désinfection des graines 52 IV.2.2.2- Germination des graines 52 IV.2.2.3- Choix du milieu de culture 52 IV.2.2.4- Mise en culture 53 IV.2.2.5- Dispositif de l’essai 54 IV.2.2.6- Méthode d’évaluation 54 IV.3- Deuxième expérience : Embryogenèse somatique directe à partir d’explants issus de jeunes plantules chez cinq variétés de tomate 55 IV.3.1- Condition de culture des plantes mère et obtention des explants 55 IV.3.2- Les explants 55 IV.3.3- La mise en culture 56 IV.3.4- Le repiquage 57 IV.3.5- Dispositif de l’essai 57 IV.4- Répétition de la deuxième expérience : Embryogenèse somatique directe à partir d’explants issues de jeunes plantules chez cinq variétés de tomate IV.4.1- La mise en culture IV.5- Troisième expérience : Embryogenèse somatique à partir d’embryons immatures 58 58 59 IV.5.1- Condition de culture des plantes mère et obtention des explants 59 IV.5.2- Les explants 59 IV.5.3- Milieux et conditions de culture 59 IV.5.4- Dispositif de l’essai 60 Chapitre V : Résultats et discussion V.1- Première expérience : Essai préliminaire 61 V.1.1- Résultats obtenus 61 V.1.2- Discussion et conclusion 69 V.2- Embryogenèse somatique directe à partir d’explants issues de jeunes plantules V.2.1- Résultats obtenus V.3- Embryogenèse somatique directe à partir d’embryons immatures 71 71 81 V.3.1- Résultats obtenus et discussion 81 V.3.2- Conclusion 83 Conclusion générale et perspectives 85 Chapitre VI : Références bibliographiques VI- Références bibliographiques 87-100 Liste des tableaux Tableau 1 : Valeur nutritive d’une portion de tomate 3 Tableau 2 : Production mondiale de tomate en tonnes 5 Tableau 3 : Espèces sauvages du genre Lycopersicon 7 Tableau 4 : Interfertilité des espèces sauvages avec l’espèce Lycopersicon esculentum 8 Tableau 5 : Caractères morphologiques et physiologiques de quelques variétés de tomate 9 Tableau 6 : Techniques de culture in vitro et leurs principales applications 29 Tableau 7 : Variétés testées 52 Tableau 8 : Différentes concentrations d’hormones testées 53 Tableau 9 : Dispositif de l’essai 54 Tableau 10 : Composition des différents milieux testés pour l’induction de l’embryogenèse somatique directe 55 Tableau 11 : Composition du milieu de MURASHIGE et SKOOG (M.S) en macro et microéléments 56 Tableau 12 : Solution de vitamines de MURASHIGE et SKOOG (M.S) 56 Tableau 13 : Dispositif de l’essai 57 Tableau 14 : Composition des différents milieux testés 59 Tableau 15 : Dispositif de l’essai 60 Tableau 16 : Pourcentage d’explants callogènes après 30 jours de mise en culture chez la variété AGO pour chaque milieu et chaque type d’explant 64 Tableau 17 : Pourcentage d’explants callogènes après 30 jours de mise en culture chez la variété RG pour chaque milieu et chaque type d’explant 65 Tableau 18 : Pourcentage d’explants callogènes après 30 jours de mise en culture chez la variété HZ pour chaque milieu et chaque type d’explant 66 Tableau 19 : Pourcentage d’explants callogènes après 30 jours de mise en culture chez la variété Top 48 pour chaque milieu et chaque type d’explant 67 Tableau 20 : Pourcentage d’explants embryogenèses chez les cinq variétés testées après deux mois de mise en culture cultivées sur milieu MSI. sur les milieux MS1, MS2, MS3 pour les plantes mères 77 Tableau 21 : Pourcentage d’explants embryogenèses chez les cinq variétés testées après deux mois de mise en culture sur les milieux MS1, MS2, MS3 pour les plantes mères cultivées sur milieu MSI 78 Tableau 22 : Pourcentage d’explants organogènes chez les cinq variétés testées après deux mois de mise en culture sur les milieux MS1, MS2, MS3 pour les plantes mères cultivées sur milieu MSI 79 Tableau 23 : Pourcentage d’explants organogènes chez les cinq variétés testées après deux mois de mise en culture sur les milieux MS1, MS2, MS3 pour les plantes mères cultivées sur milieu MSII 80 Liste des figures Figure 1 : Fleur de tomate 12 Figure 2 : Diagramme floral 12 Figure 3 : Fleur autogame 14 Figure 4 : Fleur allogame 14 Figure 5 : Embryogenèse somatique et zygotique chez la carotte 35 Figure 6 : Embryogenèse somatique : intégration dans un programme d’amélioration, pour la fabrication de variétés multi clonales et la diffusion de plants améliorés 42 Figure 7 : Cals formés chez la variété HZ sur milieu II2 après un mois de mise en culture 62 Figure 8 : Formation de racines sur les cals issus de cotylédons et d’hypocotyles d’AGO sur milieu I1 63 Figure 9 : Pourcentage d’explants callogènes chez la variété AGO après 30 jours de mise en culture sur le milieu I (MS +2,4D) 64 Figure 10 : Pourcentage d’explants callogènes chez la variété RG après 30 jours de mise en culture sur le milieu I (MS +2,4D) 65 Figure 11 : Pourcentage d’explants callogènes chez la variété HZ après 30 jours de mise en culture sur le milieu I (MS + 2,4D) 66 Figure 12 : Pourcentage d’explants callogènes chez la variété Top 48 après 30 jours de mise en culture sur le milieu I (MS + 2,4D) Figure 13 : Pourcentage d’explants callogènes chez les quatre 67 variétés testées après 30 jours de mise en culture sur le milieu I (MS +2,4D) Figure 14 : Pourcentage d’explants callogènes chez les quatre 68 variétés testées après 30 jours de mise en culture sur le milieu I (MS + 2,4D) 69 Figure 15 : Différents stades de développement des embryons somatiques 73 Figure 16 : Explants de cotylédons exprimant à la fois une réponse d’organogénèse et d’embryogénèse somatique chez la variété MCH. 74 Figure 17 : Explants de cotylédons exprimant à la fois une réponse d’organogénèse et d’embryogénèse somatique chez les variétés HZ et RG. 75 Figure 18 : Vitroplants régénérés par organogénese 76 Figure 19 : Vitroplants régénérés par embryogenèse somatique. 76 Figure 20 : Pourcentage d’explants embryogenèses chez les cinq variétés testées après deux mois de mise en culture sur les milieux MS1, MS2, MS3 pour les plantes mères cultivées sur milieu MSI. 77 Figure 21 : Pourcentage d’explants embryogenèses chez les cinq variétés testées après deux mois de mise en culture sur les milieux MS1, MS2, MS3 pour les plantes mères cultivées sur milieu MSII. 78 Figure 22 : Pourcentage d’explants organogènes chez les cinq variétés testées après deux mois de mise en culture sur les milieux MS1, MS2, MS3 pour les plantes mères cultivées sur milieu MSI. 79 Figure 23 : Pourcentage d’explants organogènes chez les cinq variétés testées après deux mois de mise en culture sur les milieux MS1, MS2, MS3 pour les plantes mères cultivées sur milieu MSII. 80 Figure 24 : Cals formes à partir d’embryons immatures chez deux variétés de tomates (HZ et MMD) après deux mois de mise en culture sur milieux d’initiations 84 Figure 25 : Structures globulaires apparaissant par cal après repiquage sur milieu de régénération MS8 84 Liste des abréviations MS : MURASHIGE et SKOOG, (1962) AIA : Acide - indolylacétique ANA : Acide naphtalène acétique 2,4-D : Acide 2,4- dichlorophénoxyacétique BAP : 6 - benzyladénine GA3 : Gibberélline mg/l : milligramme par litre H : Hypocotyle C : Cotylédon µM : Micromole MT : Méristème terminal ABSTRACT The tomato is an annuel plant belonging of the solanaceous familly, it was cultivated in the hold world. It is by volume of production, the second vegetable after potato. This present study representes an interest for the genetic improvement of tomato. The investigation ways are orgnogenesis and direct somatic embryogenesis (formation of somatic embryos without callogenesis phase), from explants of cotyledons, the hypocotyls, shoot apical meristems and immature embryos of five tomato varieties (Rio grande, Heinz, Agora, Merveille des marchés and Marmande). The culture was carried out on MS medium added with auxines (2,4D and ANA) and cytokinines (BAP and Kinetine) at various concentrations. The observations showed a variation in responses according to the nature, the hormone concentration and the explant origin. The results revealed that cytokinines rich medium (BAP) allowed induction of vegetative parts (caulogenesis) from hypocotyls and cotyledons explants and from shoot apical meristems with whole genotyps tested except for agora which appeared recalcitrant. The transfert of leafed seedling on MS medium added with ANA allowed their developement and also their rooting. The embryons are formed directly on the explant (directe somatic embryogenesis). The embryons were obtained after one month of the culture on MS medium containing cytokinine (BAP), with different concentrations. The best embryogenesis productions are obtained with cotyledons explants for Heinz and Merveille des marchés genotyps (case of mothers plants cultivated in MSI medium) and also from Heinz and Rio grande genotyps (case of mothers plants cultivated in MSII medium). The developement of somatic embryos requires their transfer on MS medium without growth regulators. In vitro micropropagation by somatic embryogenesis of the five varieties of tomatos tested on MS medium with various growth regulators opens a promising way for fast multiplication of theses varieties. Key words : Tomato, in vitro culture, direct organogenesis, direct somatic embryogenesis, culture medium, explant, growth regulators, micropropagation. RESUME La tomate est une plante annuelle de la famille des Solanacées. Elle est cultivée dans presque tous les pays du monde. C’est par le volume de production, le deuxième légume derrière la pomme de terre. Le présent travail représente un intérêt pour l'amélioration génétique de la tomate. Les voies à explorer sont l'organogenèse et l'embryogenèse somatique directe (formation d'embryons somatiques sans passage par la phase de callogenèse), à partir d’explants de cotylédons, d’hypocotyles, de méristèmes terminaux et d’embryons immatures de cinq variétés de tomates (Rio grande, Heinz, Agora, Merveille des marchés and Marmande). La mise en culture est réalisée sur le milieu MS additionné d’auxines (2,4D et ANA) et de cytokinines (BAP, Kinétine) à différentes concentrations. Les observations montrent une variabilité de réponses en fonction de la nature, la concentration de l’hormone et de l’origine de l’explant. Les résultats révèlent que les milieux riches en cytokinines (BAP) permettent l'obtention de parties végétatives (caulogenèse) à partir d'explants d’hypocotyles, de cotylédons et de méristèmes terminaux avec l'ensemble des génotypes testés sauf Agora qui se montre récalcitrante. Le repiquage des pousses feuillées, sur milieu MS additionné d’ANA a permis leur développement et aussi leur enracinement. Les embryons se forment directement sur l'explant (embryogenèse somatique directe). Les embryons sont obtenus après un mois de culture sur milieu de culture contenant une cytokinine, la BAP, à différentes concentrations. Les meilleures productions embryogènes sont obtenues avec les explants de cotylédons pour les génotypes Heinz et Merveille des marchés (cas des plantes mères cultivées sur milieu MSI) et les génotypes Heinz et Rio grande (cas des plantes mères cultivées sur MSII). Le développement des embryons somatiques nécessite leur transfert sur un milieu dépourvu de régulateurs de croissance. La micropropagation in vitro par embryogenèse somatique des cinq variétés de tomates testées sur milieu MS additionné de différents régulateurs de croissances ouvre une voie prometteuse pour la multiplication rapide de ces variétés. Mots clés : Tomate, culture in vitro, organogenèse directe, embryogenèse somatique directe, milieux de culture, explant, régulateurs de croissance, micropropagation. ﻣـــﻠﺨـــــــﺺ اﻟﻄﻤﺎﻃﻢ ﻫﻲ ﻧﺒﺎت ﺳﻨﻮي ﻳﻨﺘﻤﻲ إﻟﻰ ﻓﺼﻴﻠﺔ اﻟﺒﺎذﻧﺠﺎﻧﻴﺎت و ﺗﺰرع ﻓﻲ ﻛﻞ ﺑﻠﺪان اﻟﻌﺎﻟﻢ ﺗﻘﺮﻳﺒﺎ ﻛﻤﺎ ﺗﺤﺘﻞ اﻟﻤﺮﺗﺒﺔ اﻟﺜﺎﻧﻴﺔ ﻣﻦ ﺣﻴﺚ ﻛﻤﻴﺔ اﻹﻧﺘﺎج ﺑﻌﺪ اﻟﺒﻄﺎﻃﺎ. ﻳﻤﺜﻞ اﻟﻌﻤﻞ اﻟﺤﺎﻟﻲ ﻣﺼﻠﺤﺔ ﻣﻦ أﺟﻞ اﻟﺘﺤﺴﻴﻦ اﻟﻮراﺛﻲ ﻟﻨﺒﺎت اﻟﻄﻤﺎﻃﻢ و ﻣﻨﻪ ﻓﺈن اﻟﻄﺮق اﻟﻤﺴﺘﻌﻤﻠﺔ ﻫﻲ اﻟﺘﻜﺎﺛﺮ اﻟﻌﻀﻮي و اﻟﺘﻜﺎﺛﺮ اﻟﺠﻨﻴﻨﻲ ﻋﻦ ﻃﺮﻳﻖ اﻟﺨﻼﻳﺎ اﻟﻨﺴﻴﺠﻴﺔ . ﺗﺘﺤﻘﻖ اﻟﺰراﻋﺔ ﻓﻲ وﺳﻂ ) (Murachige et Skoogﻣﻀﺎف إﻟﻴﻪ ﻫﺮﻣﻮﻧﺎت اﻟﻨﻤﻮ ) 2,4Dو (ANAو ) (BAPﺑﺘﺮاﻛﻴﺰ ﻣﺨﺘﻠﻔﺔ اﻧﻄﻼﻗﺎ ﻣﻦ )اﻟﻔﻠﻘﺘﻴﻦ ,اﻟﺴﻮﻳﻘﺔ و اﻟﻨﺴﻴﺞ اﻹﻧﺸﺎﺋﻲ اﻟﻨﻬﺎﺋﻲ ( ﻟﻠﻔﺼﺎﺋﻞ اﻟﺨﻤﺴﺔ ﻣﻦ اﻟﻄﻤﺎﻃﻢ (RG, HZ, AGO, ). MMD, MCH ﺗﻈﻬﺮ اﻟﻤﻼﺣﻈﺎت ﺗﻐﻴﺮات ﻓﻲ اﻟﻨﺘﺎﺋﺞ و ذﻟﻚ ﺗﺒﻌﺎ ﻟﻄﺒﻴﻌﺔ و ﺗﺮﻛﻴﺰ اﻟﻬﺮﻣﻮن و ﻧﻮع اﻟﻘﻄﻌﺔ اﻟﺰراﻋﻴﺔ .ﻛﻤﺎ ﺗﺒﻴﻦ اﻟﻨﺘﺎﺋﺞ أن اﻟﻮﺳﺎﺋﻂ اﻟﻐﻨﻴﺔ ﺑﺎﻟﺴﻴﺘﻮﻛﻴﻨﻴﻦ )(BAP ﺗﻤﻜﻦ اﻟﺤﺼﻮل ﻋﻠﻰ أﺟﺰاء زراﻋﻴﺔ )ﺗﻜﻮن اﻟﺴﺎق و اﻷوراق ( اﻧﻄﻼﻗﺎ ﻣﻦ )اﻟﻔﻠﻘﺘﻴﻦ , اﻟﺴﻮﻗﻴﺔ و اﻟﻨﺴﻴﺞ اﻹﻧﺸﺎﺋﻲ اﻟﻨﻬﺎﺋﻲ( ﻣﻊ ﻛﻞ أﻧﻮاع اﻟﻄﻤﺎﻃﻢ اﻟﻤﺨﺘﺒﺮة إﻻ ﻧﻮع . AGORAﺳﻤﺢ ﻧﻘﻞ اﻷﺟﺰاء اﻟﺰراﻋﻴﺔ اﻟﺘﻲ ﺣﺼﻠﻨﺎ ﻋﻠﻴﻬﺎ ﺑﺘﻄﻮرﻫﺎ و ﺗﺠﺪﻳﺮﻫﺎ ﻓﻲ وﺳﻂ MSﺑﺈﺿﺎﻓﺔ ﻫﺮﻣﻮن . ANA ﺗﺘﻜﻮن اﻷﺟﻨﺔ ﻣﺒﺎﺷﺮة ﻓﻮق اﻟﺠﺰء اﻟﺰراﻋﻲ اﻟﻤﺴﺘﻌﻤﻞ )ﺗﻜﺎﺛﺮ ﺟﻨﻴﻨﻲ ﻣﺒﺎﺷﺮ ( ﺗﻢ اﻟﺤﺼﻮل ﻋﻠﻴﻬﺎ ﺑﻌﺪ ﺷﻬﺮ ﻣﻦ اﻟﺰراﻋﺔ ﻓﻲ وﺳﻂ MSﻣﻀﺎف إﻟﻴﻪ ﺗﺮاﻛﻴﺰ ﻣﺨﺘﻠﻔﺔ ﻣﻦ BAPﻛﻤﺎ و ﻗﺪ ﺗﻢ اﻟﺘﺤﺼﻞ ﻋﻠﻰ أﻓﻀﻞ إﻧﺘﺎج ﻟﻨﻮع HZو MCHﻋﻦ ﻃﺮﻳﻖ اﻟﻔﻠﻘﺘﻴﻦ ﻓﻲ ﺣﺎﻟﺔ زراﻋﺔ اﻟﻨﺒﺎت اﻷم ﻓﻲ وﺳﻂ 60 μm) MSIﻣﻦ (BAPو ﻧﻮع HZو RGﻓﻲ ﺣﺎﻟﺔ زراﻋﺔ ﻧﺒﺎﺗﺎت اﻷﺧﺮ ﻓﻲ وﺳﻂ 90 μm) MSIIﻣﻦ (BAP ﻳﺤﺘﺎج ﺗﻄﻮر اﻷﺟﻨﺔ اﻟﺴﻮﻣﺎﺗﻴﻜﻴﺔ إﻟﻰ وﺳﻂ ﻣﺠﺮد ﻣﻦ ﻫﺮﻣﻮﻧﺎت اﻟﻨﻤﻮ. اﻟﺘﻜﺎﺛﺮ اﻟﻤﺨﺒﺮي ﻟﻠﻔﺼﺎﺋﻞ اﻟﺨﻤﺴﺔ ﻣﻦ اﻟﻄﻤﺎﻃﻢ اﻟﻤﺨﺘﺒﺮة ﻓﻲ وﺳﻂ ) (Murachige et Skoogﻣﻀﺎﻓﺔ إﻟﻴﻬﺎ ﻣﺨﺘﻠﻒ ﻣﻨﻈﻤﺎت اﻟﻨﻤﻮ ﺗﻔﺴﺢ ﻃﺮق واﻋﺪة ﻣﻦ أﺟﻞ اﻟﺘﻜﺎﺛﺮ اﻟﺴﺮﻳﻊ ﻟﻬﺬه اﻷﻧﻮاع. اﻟﻜﻠﻤﺎت اﻟﻤﻔﺘﺎﺣﻴﺔ : اﻟﻄﻤﺎﻃﻢ ،اﻟﺰراﻋﺔ اﻟﻤﺨﺒﺮﻳﺔ ،وﺳﺎﺋﻂ زراﻋﻴﺔ ،ﻣﻨﻈﻤﺎت اﻟﻨﻤﻮ ،اﻟﺘﻜﺎﺛﺮ اﻟﻌﻀﻮي اﻟﺘﻜﺎﺛﺮ اﻟﻤﺨﺒﺮي ,اﻟﺘﻜﺎﺛﺮ اﻟﺠﻨﻴﻨﻲ . INTRODUCTION : La tomate est la culture la plus répandue dans le monde après la pomme de terre. La production mondiale de la tomate en 2004 a atteint 115.950.851 Mt, dont les trois grands producteurs mondiaux sont la Chine, les Etats-Unis et la Turquie (Faostat, 2004). Elle est adaptée à des conditions de cultures très variées et est destinée à la consommation en frais ou à la transformation industrielle (Philouse, 1999). La culture de la tomate en Algérie a démarré dans les années 1920, dans la région de l’Est avec la création de la première conserverie TOMACOOP à Annaba. Les surfaces consacrées à la tomate d’industrie ont augmenté, pour passer de 100 hectares en 1930 à 2000 en1960, pour arriver à une fourchette comprise entre 24000 et 31000 hectares ces dernières années. La tomate est multipliée par graines et le marché des semences hybrides demeure de plus en plus tributaire de l’importation et on sait que le seul kilogramme de semences hybrides peut couter entre 300000 et 2000000 dinars. La culture in vitro permet de contourner ce problème, dans la mesure où les embryons somatiques obtenus à partir des explants de plantes hybrides constituent un matériel adéquat pour la multiplication conforme. Contrairement à d’autres espèces, la technique de la micropropagation de la tomate est loin d’être maitrisée en laboratoire et encore moins pour la production de plants à l’échelle industrielle. La capacité d’induction de l’organogenèse qui est la base fondamentale de la multiplication végétative et de l’embryogenèse somatique qui est la méthode de régénération la plus performante pour la propagation clonale du fait de son taux de multiplication élevé et la production des graines artificielles par cryoconservation des cultures embryogènes, laisse entrevoir la possibilité de disposer à volonté de matériel juvénile et d’un moyen de reproduction conforme pour les plantes à grande diffusion telle que la tomate. 1 CHAPITRE I GENERALITES SUR LA TOMATE I .1- Introduction : La tomate (Solanum lycopersicum L. ou Lycopersicon lycopersicum L.), est une plante annuelle de la famille des Solanacées (Guignard, 2001), Cette espèce est originaire du Nordouest de l'Amérique du Sud. Le terme désigne aussi ce fruit charnu, qui est l'un des aliments les plus importants dans l'alimentation humaine et qui se consomme frais ou transformé. Elle est cultivée sous presque toutes les latitudes, sur une superficie d'environ 3 millions d'hectares, ce qui représente près du tiers des surfaces mondiales consacrées aux légumes (Philouse et Laterrot, 1992). Longtemps appelée "pomme d'amour" ou "pomme d'or", son nom de « tomate » n'a été accepté par l'Académie française qu'en 1835. Elle a aussi été appelée Lycopersicon esculentum. Cependant, des études récentes en génomique classent la tomate dans le genre Solanum, le même que la pomme de terre. L'introduction en France fut lente. En 1600, Olivier de Serres, un des premiers agronomes français, classe la tomate parmi les plantes d’ornement. La tomate est originaire des Andes, en Amérique du Sud, où l’on trouve encore aujourd'hui des formes sauvages. On croit que l'ancêtre de l'espèce cultivée pourrait être la tomate cerise, Lycopersicon esculentum var. cerasiforme. Introduite en Amérique centrale et au Mexique à une époque préhistorique, il y a plus de 2 000 ans par le vent, les cours d'eau, les oiseaux ou les Indiens migrant vers le nord, elle a trouvé là un terrain fertile à son établissement. Elle a d'abord été introduite en Espagne au XVIe siècle. Les Espagnols et les Italiens ont été les premiers à l'adopter comme aliment. C'est que l'odeur peu engageante de ses feuilles et de ses tiges, de même que sa ressemblance avec les plantes toxiques de la famille des Solanacées inspirent alors la méfiance. Au XVIIIe siècle, on la cultive de façon intensive en Italie et, à un moindre degré, dans les autres pays d'Europe. Les Italiens effectueront un travail considérable de sélection dans le but d'obtenir des fruits plus gros, plus lisses et à la peau plus épaisse, et mettront au point une technique efficace pour les sécher au soleil. Beaucoup plus tard, lorsque, par vagues successives, ils quitteront leur pays pour l'Amérique, ils amèneront avec eux leurs traditions culinaires qu'ils feront connaître aux Nord-américains. La même chose s'est produite en Chine où on ne l'adoptera qu'au XXe siècle, bien qu'elle y ait été introduite trois siècles auparavant (Philouse, 1999). Victime de son succès, la tomate a perdu, au cours de la deuxième moitié du XXe siècle, les qualités organoleptiques qui la caractérisaient auparavant, afin de satisfaire aux exigences de la production industrielle. 2 GENERALITES SUR LA TOMATE CHAPITRE I I.2- Intérêt de la culture de tomate: I.2.1- Alimentation humaine : La tomate présente une bonne valeur nutritive, elle est riche en potassium qui sert à équilibrer le pH du sang et à stimuler la production d’acide chlorhydrique par l’estomac, favorisant ainsi la digestion, en manganèse qui a son tour agit comme cofacteur de plusieurs enzymes qui facilitent une douzaine de différents processus métaboliques, et en cuivre qui est nécessaire à la formation de l’hémoglobine et du collagène. La tomate est aussi très riche en vitamine B3, B6, C, A, E et K (Chagnon et al., 2000). Tableau 1 : Valeur nutritive d’une portion de tomate (INAF, 2008). Poids/volume Tomate rouge moyenne, mûre, 123 g Calories 22 Protéines 1 ,1 g Glucides 4,8 g Lipides 0,3 g Fibres alimentaires 1,5 g La tomate tient une place importante dans l'alimentation humaine. Elle s'utilise en frais, en salade et en jus, ou transformée, sous forme de purée, de concentré, de condiment et de sauce. Des industries de transformation de la tomate sont implantées dans toutes les régions du monde et sont approvisionnées par des milliers d'hectares de culture mécanisée, c’est un aliment diététique, très riche en eau (plus de 90 %) et très pauvre en calories (22 kcal pour 123 grammes) (tableau1). I.2.2- Phytothérapie : Plusieurs études prospectives et épidémiologiques ont démontré qu’une consommation élevée de fruits et de légumes diminuait le risque de maladies cardiovasculaires, de certains cancers et d’autres maladies chroniques (Bazzano et Serdula, 2003). Quelques mécanismes d’action ont été proposés pour expliquer cet effet protecteur, la présence d’antioxydants dans les fruits et les légumes pourraient jouer un rôle. Les caroténoïdes sont les principaux composés antioxydants de la tomate, dont le plus abondant est le lycopène (Khachik et al., 2002). La tomate contient aussi une quantité non 3 GENERALITES SUR LA TOMATE CHAPITRE I négligeable de différents composés phénoliques (Vinson et al., 1998) (Raffo et al., 2006) qui contribuent aussi à son activité antioxydante (Takeoka et al., 2001). La pelure de la tomate contient davantage d’antioxydants (composés phénoliques, vitamine C et lycopène) que sa chair et ses graines (Kaur et al., 2004) (Toor, 2005). Les tomates sont les principales sources de lycopène, fournissant 85 % de ce caroténoïde (Barber, 2002). Ce composé exerce une importante action antioxydante ainsi que d’autres fonctions dans l’organisme (Heber et Lu, 2002). On lui attribue entre autres des effets hypocholestérolémiant et anti-inflammatoires ainsi que la capacité à empêcher la prolifération de certains types de cellules cancéreuses (Heber et Lu, 2002). Ainsi, des concentrations élevées de lycopène dans le sang ont été associées à de plus faibles incidences de certaines maladies chroniques, telles les maladies cardiovasculaires (Arab et Steck, 2000). La tomate contient plusieurs nutriments essentiels (antioxydants, vitamines, minéraux, fibres) qui exercent différents effets sur la santé. Ces composés actifs agissent de façon synergique. Cet effet ne serait pas observé lorsque l’on consomme un supplément de lycopène. La consommation des tomates, demeure donc le meilleur moyen de se prévaloir des bienfaits qui leurs sont attribués (Basu et Imrhan, 2006). I.3- Importance économique de la plante : I.3.1- Dans le monde : La tomate est cultivée dans presque tous les pays du monde. C'est, par le volume de production, le deuxième "légume" au plan mondial, derrière la pomme de terre (tableau 2). Pour les principaux pays francophones les chiffres de la production mondiale pour l’année 2004 sont : la France avec 843 220 tonnes, le Canada avec 805 090 tonnes, la Belgique avec 245 900 tonnes et la Suisse avec 29 600 tonnes. En France plus des trois quarts des semences de tomates autorisées à la vente sont celles de plantes hybrides F1 et 98% des semences sont sous brevet (FAO, 2004). 4 GENERALITES SUR LA TOMATE CHAPITRE I Tableau 2 : Production mondiale de tomate en tonnes (FAO, 2006). Production en tonnes. Chiffres 2004-2005 Chine États-Unis Turquie Égypte Inde Italie Espagne Iran Brésil Mexique Russie Grèce Chili Maroc Ouzbékistan Ukraine Portugal Irak Syrie Tunisie Autres pays Total 30 143 929,00 12 867 180,00 9 440 000,00 7 640 818,00 7 600 000,00 7 682 504,00 4 441 800,00 4 200 000,00 3 515 567,00 2 148 130,00 2 017 860,00 1 932 000,00 1 200 000,00 1 201 230,00 1 245 470,00 1 145 700,00 1 200 930,00 988 000,00 920 000,00 1 118 000,00 21 780 606,00 124 429 724,00 24 % 10 % 8% 6% 6% 6% 4% 3% 3% 2% 2% 2% 1% 1% 1% 1% 1% 1% 1% 1% 18 % 100 % 31 644 040,00 11 043 300,00 9 700 000,00 7 600 000,00 7 600 000,00 7 187 016,00 4 473 573,00 4 200 000,00 3 303 530,00 2 148 130,00 2 100 000,00 1 713 580,00 1 230 000,00 1 201 230,00 1 200 000,00 1 200 000,00 1 175 000,00 1 000 000,00 920 000,00 920 000,00 20 752 357,00 122 311 756,00 26 % 9% 8% 6% 6% 6% 4% 3% 3% 2% 2% 1% 1% 1% 1% 1% 1% 1% 1% 1% 17 % 100 % I.3.2- En Algérie : L’Algérie continue d’importer la tomate. Le volume de production en tomate fraîche demeure encore faible comparativement aux pays voisins, notamment la Tunisie et le Maroc. Le rendement actuel est estimé à 15 tonnes/hectare contre 45 à 75 tonnes en Tunisie et à 68 tonnes tonnes/hectare en Italie. En Chine, il est de 66 tonnes/hectare. Donc, le rendement de l’Algérie reste, loin de celui des pays concurrents bien qu’elle dispose d’atouts importants pour le développement de cette filière. Des spécialistes estiment que la filière de la tomate industrielle dispose d’un tissu industriel expérimenté, un potentiel agricole important mais mal exploité, un coût de main-d’œuvre très compétitif et un coût énergétique très concurrentiel. Mais, elle est pénalisée par plusieurs obstacles dont un contexte tarifaire 5 CHAPITRE I GENERALITES SUR LA TOMATE défavorable, des cours mondiaux actuellement en baisse, des conditions de culture difficiles et des méthodes de production traditionnelles. Par conséquent, l’outil de production est sousexploité et le rendement faible. L’Algérie pourrait jouer un rôle important sur les marchés internationaux si elle parvient à améliorer sensiblement ses rendements agricoles et rationaliser son industrie. Cette filière dispose, de plusieurs atouts pour se développer davantage, à condition que les différents intervenants, en l’occurrence les agriculteurs, les industriels et l’État, travaillent en étroite collaboration pour lui permettre d’être plus compétitive. Il s’agit notamment d’une mise à niveau des méthodes de travail des fellahs qui continuent à travailler avec des moyens traditionnels. L’industrie locale assure 85% des besoins. La production nationale est évaluée à 55 000 tonnes de double concentré de tomate en 2004 pour une superficie totale de 27 642 hectares dont 7 000 à Annaba et 8 000 à El-Tarf. La taille moyenne des exploitations agricoles est de 2,5 hectares (Fayçal, 2004). La filière de la tomate en Algérie est en crise. Une douzaine d’entreprises sont fermées sur les 17 existantes. D’autres encore risquent de fermer. Même les banques ne veulent plus accorder de crédits aux transformateurs, car ils considèrent que ce secteur n’est plus rentable. Et pourtant, la capacité de production du concentré de tomate en Algérie est de 160 000 tonnes par an. Non seulement les besoins de la consommation nationale, qui sont de 70 000 tonnes par an, peuvent être satisfaits, mais il est possible d’exporter le double concentré de tomate et même le triple vers d’autres pays, pourvu que le secteur soit relancé par des mesures concrètes. La reprise de la filière est conditionnée en premier lieu par la relance de l’agriculture (Mourad, 2008). I.4- Origine phylogénétique de la plante : La tomate appartient à la famille des solanacées, au genre Lycopersicon et à l’espèce Esculentum. Ce genre comprend 9 espèces distinguées par la couleur des fruits à maturité, le nombre de feuilles entre les bouquets floraux, leurs modes de reproductions et leur répartition géographique (Rick et al ., 1990) (tableau 3). Les espèces sauvages du genre Lycopersicon sont restées inféodées à leur zone d’origine, à l’exception de Solanum lycopersicum cerasiforme (Philouze, 1999). 6 GENERALITES SUR LA TOMATE CHAPITRE I Tableau 3 : Espèces sauvages du genre Lycopersicon (d’après Philouze, 1999). Couleurs du Fruits Nombre de feuilles par sympode L .esculentum var. cersiforme Rouge 3 AF AUTO L. pimpinellifolium Rouge 3 AF AUTO FAC L. cheesmanii Orange 3 AF AUTO L. hirsutum Vert 3 AF L. parviflorum Vert 2 AF L. chmielewskii Vert 2 AF L.piravianum Vert 2 AI ALLO L. chilense Vert 2 AI ALLO L. pennellii Vert 2 AI ALLO Espèces (1) AF: auto fertile; Compatibilité (1) Mode de reproduction (2) AI FAC ALLO AUTO FAC AI: auto-incompatible, (2) AUTO: autogame; ALLO: allogame; FAC: facultatif I.5- Les variétés cultivées : Les caractéristiques que l'on favorise aujourd'hui chez les tomates que l'on trouve sur le marché sont : une couleur bien rouge, la fermeté et une longue durée de conservation. Le goût est secondaire par rapport à ces critères. Ces caractéristiques ont été obtenues en faisant des croisements entre différentes variétés. On distingue cependant plusieurs catégories de tomates, selon le mode de croissance de la plante indéterminé ou déterminé et surtout selon le type de fruit. On a les variétés à fruit plat et côtelé, type Marmande, dont le poids est élevé puisqu'il peut dépasser 1 kg ; les variétés à fruit arrondi, dont le poids varie de 100 à 300 grammes, pour lesquelles il existe des hybrides dont les fruits se conservent longtemps, et les variétés à fruit allongé avec une extrémité arrondie, de type Roma, ou pointue, de type Chico (tableau 5). Ces dernières variétés sont destinées à l'industrie. Elles ont toutes un port déterminé et leurs fruits répondent à un certain nombre de critères technologiques liés à leur transformation (Tomodori, 2008). 7 GENERALITES SUR LA TOMATE CHAPITRE I Tableau 4 : Interfertilité des espèces sauvages (Wikipédia, 2008). Espèces avec l’espèce Caractéristiques lycopersicon esculentum Interfertilité avec lycopersicon esculentum Lycopersicon cheesmanii Tolérante au sel. + Lycopersicon chmielewskii Pousse dans les zones montagneuses + Lycopersicon hirsutum Fruits verts, pousse dans les zones montagneuses (500-3300 m) et humides de l'Amérique du Sud. + Solanum lycopersicoides Pousse dans les zones montagneuses + Lycopersicon parviflorum Pousse dans les zones montagneuses (1000-3000 m) et humides des Andes + Lycopersicon pennellii à Fruits verts, pousse dans les milieux montagneux (500-1500 m) et secs de l'Amérique du Sud, présente de nombreux stomates sur la face supérieure de ses feuilles. + (1000-3000 m) et humides des Andes. (1000-3000 m) et humides des Andes Naturellement très sucrée. Lycopersicon pimpinellifolium Fruits rouges. + Solanum rickii Fruits rouges. + Lycopersicon chilense Pousse dans les environnements secs du sud chilien, où son enracinement profond lui permet d'exploiter les rares réserves en eau. Elle a de longs bouquets floraux, de 14 à 20 centimètres. - Lycopersicon peruvianum Fruits verts. - 8 CHAPITRE I GENERALITES SUR LA TOMATE Tableau 5 : Caractères morphologiques et physiologiques de quelques variétés de tomate (tomodori, 2008). Variétés Absinthe African Beefsteak Aker's West Virginia Allegany Sunset Amana Orange Amana Pink Ambre Amritsar aus India Ananas Ananas Noire Anna Aasa Anna Hermann Anna Russian Arbuznyi Aunt Ginny's Purple Caractères Excellente tomate vert ambre, petit plant de 1,20 m. Un peu sensible au mildiou. Variété type chair de bœuf, légèrement en forme de cœur, parfois plus aplatie et un peu côtelée. Chair de bonne qualité. . Très grosse tomate, d'un beau rouge, un peu côtelée. Très charnue. Saveur intense de tomate du jardin à l'ancienne. Plant produisant un premier bouquet de 4 ou 5 tomates de plus de 500 g chacune. La production est moindre par la suite. Assez Tardive (80 à 85 jours). Variété à croissance indéterminée et à feuillage normal. Originaire des USA. Très belles tomates bigarrées, côtelées. Très bonne saveur. Belles tomates de type beefsteak, très charnues avec très peu de graines. Bonne saveur. Très belles tomates roses, charnues. Saveur excellente, parfumée. Tomate ronde légèrement aplatie, d'un bel orange. Fruits en grappes de quelques unités. Plant à croissance indéterminée, assez haut. Originaire de Russie. Variété de tomates rouge allongée, type Roma, avec un petit téton bien marqué. Adaptée pour faire sécher. Variété originaire du Pakistan ou d'Inde. Très belles tomates de couleur allant du jaune au rouge, bariolées. Tardive. Saveur excellente, parfumée et légèrement acidulée. Grosse tomate légèrement côtelée de couleur rouge sombre à maturité et verdâtre aux épaules. Très bonne saveur, charnue avec de nombreuses loges. Chair verte au bord et rouge sombre au centre. Productivité limitée. Petites tomates de taille cocktail (3 cm) légèrement aplaties, parfumées, rouges, juteuses. Variété très productive de petites tomates rondes avec un téton marqué, en bouquets de 5 à 10 tomates. Plant à croissance indéterminée, dépassant les 2 mètres. Variété de saison à feuilles normales, originaire des USA. Tomates généralement en forme de cœur, rose foncé, à la chair riche et au goût très parfumé, assez productive. Fruits rouge de 150 à 200 grammes, très sombre, presque noirs, avec des rayures vert foncé partant des épaules. Aplati à tendance ronde, aspect plus ou moins difforme. Les rayures apparaissent déjà sur les fruits verts. Texture juteuse, charnue et fondante. Peau très fine. Saveur musquée, légèrement sucrée, avec beaucoup de caractère, presque "sanguine ". Variété très productive et résistante. Variété russe au feuillage normal, de mi-saison. Très belles tomates d'un rose sombre, côtelées sur le dessus. La chair de ses tomates est ferme et la saveur est douce, juste équilibre entre le goût d'une tomate rose et la douceur d'une tomate noire. Variété proche de pruden's purple. Fruit de taille moyenne, légèrement côtelé, un peu aplati. Variété de saison. Croissance indéterminée. Origine: Allemagne. 9 CHAPITRE I GENERALITES SUR LA TOMATE Tableau 5 (suite) : Caractères morphologiques et physiologiques de quelques variétés de tomate (tomodori, 2008). Variétés Bengladesh Heart Bianca Cherry Marmande Merveille des Marchés Rio Grande Big Zebra Aunt Ruby's German Green Cherry Australian Oxheart Bali Banana Legs Banana Orange Banantchik Barbaniaka Baselbieter rötli Caractères Tomate de type cœur de bœuf, de taille moyenne et d'un beau rouge. Fruit charnu, de bonne saveur franche de tomate. Plant à croissance indéterminée, tardif et au feuillage normal. Originaire du Bengladesh. Une hydre qui pousse et repousse de partout. Conduite sur un pied, elle a colonisé 4 m et est montée jusqu'à plus de 3,5 m. Petites tomates cerises, presque groseilles, jaunes pâles en petites grappes de 6 ou 7 fruits, extrêmement sucrées. Les feuilles sont vert pâle, petites, ovales et dentelées. Production très longue, Bonne tomate côtelée, à la saveur typique. Précoce. Gros fruits rouge vif, lisses. Une tomate de type Roma, en grappes fournies. Fruits ovales, avec une légère pointe, d'environ 70 grammes. Plant à croissance indéterminée, à feuillage normal. Originaire d'Italie. Resistance VFF. Une très belle tomate rouge foncé zébré de vert doré à maturité. Fruit charnu, à la chair très colorée et juteuse. Saveur très parfumée, un peu acidulée avant complète maturité. Production intéressante de gros fruits, assez tardifs. Croissance indéterminée sur des plants à feuillage normal. Originaire des Etats Unis d'Amérique. Tomates de taille cocktail, en grappes de 3 à 6 fruits, ronds, de couleur verte, agrémentée d'irisations rosées. Saveur typique et prononcée de tomate verte. Assez sensible à l'éclatement. Plant à croissance importante, indéterminée et au feuillage normal. Variété de saison, un peu tardive. Belle tomate de type cœur de bœuf, d'un beau rouge. Un peu de vert au collet. Fruit très charnu à la bonne saveur de tomate. Variété à croissance indéterminée, de saison, à feuilles normales. Vient d'Australie. Variété de tomates d'assez petite taille, bien côtelées, rouge assez clair à rose soutenu. Les fruits sont en grappes fournies, la variété est bien productive. Croissance indéterminée. Originaire de Bali en Indonésie. Tomates très originales en forme de petites bananes jaunes. Peu de jus. Très productive, mais à croissance déterminée. Identique à Banana legs mais orange. Tomate de forme allongée et pointue. Excellente saveur. Croissance indéterminée. Feuillage normal, très découpé et retombant. Très belle variété de tomates allongées, orange. Fruit assez creux, sans jus, mais assez charnu : idéal pour faire sécher. Plant très productif à croissance indéterminée, produisant des grappes de 5 à 10 tomates. Variété assez tardive, à feuillage normal. Tomate cerise de saveur sucrée et agréable malgré le froid. Une vraie pieuvre. A ne pas tailler Résistante, insensible à l'éclatement et très productive. Petites tomates cocktail de forme oblongue, en grappe. Très bonne saveur. Variété de mi-saison, récoltes jusqu'aux gelées. Croissance indéterminée. Bon rendement. Feuillage normal. Convient aussi pour la culture en pots. 10 CHAPITRE I GENERALITES SUR LA TOMATE I.6- Biologie de la tomate : I.6.1- Morphologie de la plante : La tomate (Lycopersicon esculentum ou Solanum lycopersicum), est une plante herbacée de la famille des solanacées comme la pomme de terre. Elle est aussi parente de l’aubergine, des piments et poivrons, et du tabac. C'est une plante ramifiée, à tige sarmenteuse, se soutenant difficilement sans l'aide de supports artificiels. • Le système radiculaire est normalement très important avec enracinement profond (plus d'un mètre). • La tige et les feuilles sont charnues et velues. Les tiges sont grosses, presque ligneuses, renflées aux nœuds et recouvertes d'une écorce verte, rude au toucher. La migration vers les racines, vers les fruits et vers les divers organes de la plante, des produits élaborés dans les feuilles pendant la journée grâce à l'assimilation chlorophyllienne, ne se fait pratiquement que la nuit, à température plus basse que le jour, et à condition que cette température se maintienne plusieurs heures au dessus de 10°C. • Les feuilles sont composées, à folioles ovales, un peu dentées sur les bords, grisâtres à la face inférieure, souvent repliées en forme de cuillère ou même à bords roulés en dessus. • Les fleurs axillaires, de couleur jaunâtre, auxquelles succèdent des fruits, sortes de grosses baies charnues, de forme et de couleurs variables, sont sujettes à la coulure (non fécondation) pour les raisons suivantes, nutrition défectueuse de l'ovaire, température défavorable, maladies et insectes. I.6.2- La biologie florale : Les fleurs sont les organes sexuels de la tomate et elles sont hermaphrodites. Dans une fleur de tomate, les sépales (S) sont verts. Les pétales (Pé) généralement jaunes sont en partie soudés et forment une corolle étoilée (figure 1). Les étamines (E) sont soudées en un tube staminique et le pistil (Pi) est caché dans ce tube. Le nombre des sépales et des pétales varie de 5 à 8. Mais chez les espèces sauvages ces chiffres sont strictement : (5S) + (5Pé) + (5E) + (2C) (figure2) (Yves et Marcel, 1999). 11 CHAPITRE I GENERALITES SUR LA TOMATE Figure 1 : Fleur de tomate (Tomodori, 2007). S : sépales, Pé : pétales, E : étamines, Pi : pistil Figure 2 : Diagramme floral (Tomodori, 2007) I.6.3- La fructification et la maturation des tomates : Après la floraison, c’est le pistil qui se développe pour former le fruit. La paroi de l'ovaire s'épaissit et les ovules qui ont été fécondés se transforment en graines qui contiennent les embryons. Le reste du pistil (style et stigmate) disparaît, ainsi que les pétales et les étamines qui tombent. Ce qui peut favoriser la mise à fruit sont des températures pas trop fortes, un peu fraîches mais pas trop froides pendant la préfloraison et tout ce qui contribue à augmenter la pollinisation (le vent, les mouvements, le secouage des fleurs). Après la floraison, la moitié du temps est consacré à la croissance des tomates. L'autre moitié est consacrée à leur maturation. La maturation commence lorsque la croissance est terminée. Les caractéristiques de la maturation sont : un éclaircissement de la couleur du fruit, un ramollissement, une belle coloration et une acquisition des arômes. Ces processus de maturation irréversibles se poursuivent rapidement par le pourrissement du fruit. Les tomates ne peuvent pas se garder mûres longtemps. Les sélectionneurs essaient aujourd'hui de distinguer dans le processus de maturation les gènes qui contrôlent les différents aspects de cette maturation, pour réussir à obtenir des variétés qui se conservent et se transportent, tout en gardant des qualités organoleptiques satisfaisantes (Tomodori, 2007). I.6.4- La graine : Chez la tomate les semences sont des petites graines hérissées de petits poils de 1 à 5 mm environ selon les variétés, leur germination est épigée. C'est la forme de résistance de la plante. La graine peut résister au froid, à la sècheresse, à la digestion par les animaux etc. Les 12 CHAPITRE I GENERALITES SUR LA TOMATE graines sont situées dans les loges du fruit, initialement attachées par un pédoncule au placenta et entourées d'une gangue gélatineuse qui les protège et les empêche de germer dans la tomate. Le nombre de graines dans une tomate varie de 50 à 300 selon le nombre d’ovules fécondés (Achour, 1987). La faculté germinative des graines de tomates est de 4 à 10 ans environ. On rapporte que des graines plus âgées ont germé sans problème. Pour germer, les graines de tomate ont besoin d'eau et de chaleur. L'imbibition est la première étape de la germination. Elle consiste en l'absorption d'eau par la graine. La graine absorbe alors jusqu'à 3 fois sa masse. En pratique c'est la mise en présence d'eau de la graine sèche qui déclenche ce processus. La reprise de la respiration accompagne l'imbibition : dès que l'eau est entrée dans les cellules, les enzymes de la respiration s'activent et la graine commence à augmenter sa respiration. La graine à cet instant nécessite de l'oxygène. Elle doit donc être au contact de l'air (Tomodori, 2007). I.6.5- La pollinisation des tomates : La pollinisation est la rencontre du pollen mâle avec le stigmate du pistil femelle de la fleur. Elle est évidemment indispensable au développement de la fleur en fruit. Elle est suivie de la fécondation des ovules par les cellules polliniques mâles. Cette fécondation donne les cellules œufs, points de départ de la nouvelle génération qui se développe et forme l'embryon, contenu dans la graine jusqu'à la germination. La structure de la fleur chez la tomate assure une autogamie stricte, en effet la plupart des fleurs présentent cette particularité anatomique d'avoir le pistil enfermé dans le tube staminique (figure 3). Le pollen apporté par le vent ou même les insectes ne peut donc pas rentrer dans le tube et se déposer sur le stigmate du pistil. Seul le pollen des étamines de la fleur peut entrer en contact avec le stigmate. De plus la période de réceptivité du stigmate au pollen est courte : elle commence 1 jour avant l'ouverture de la fleur (ce qui favorise l'autogamie) et se poursuit entre 1 et 7 jours environ. Cependant les risques de pollinisation croisée ne sont pas nuls. Le critère qui permet de savoir quel est le risque d'allogamie chez la tomate est la forme de la fleur. Certaines fleurs ont le pistil qui dépasse du tube staminique au moment où il est réceptif (figure 4). Dans ce cas le pollen étranger peut venir se déposer sur le stigmate. Il y a donc possibilité de fécondation croisée ou allogamie. Les insectes butineurs sont alors les principaux vecteurs de pollen et donc les principaux responsables de la fécondation croisée. 13 CHAPITRE I GENERALITES SUR LA TOMATE Figure 3 : Fleur autogame : le stigmate du pistil Figure 4 : Fleur allogame : le stigmate dépasse n'est pas visible à l'extérieur du tube d'étamines. le tube staminique. I.6.6- Types de croissance des pieds de tomates : I.6.6.1- Croissance indéterminée : Le haut de la tige s'allonge régulièrement en produisant en continu une nouvelle pousse, de nouvelles feuilles et de nouvelles inflorescences. C'est la mort du pied qui arrête la croissance. On peut avoir, en une saison 6 ou 7 générations de fleurs, voire plus. Et des pieds qui peuvent atteindre quelques mètres de longueur (7mètres pour certaines variétés) (Exemples : Rose de Berne, Black Cherry). I.6.6.2- Croissance déterminée : La croissance se poursuit jusqu'à ce que les extrémités des tiges ne produisent plus que des fleurs. Il n'y a plus d'allongement possible. Le nombre d'inflorescences est fini. Souvent l'aspect de ses pieds est buissonnant et compact (si on ne les taille pas, ce qui est le cas généralement). La production de tomates est alors plus "concentrée"(Exemples : Siniy, Roma, Roma Jaune). I.6.6.3- Croissance semi déterminée : Il s'agit de la situation intermédiaire. Soit la croissance est déterminée mais assez tardivement, ce qui fait que les pieds s'allongent assez, soit la croissance est déterminée un temps, puis une nouvelle pousse démarre tardivement pour redonner une nouvelle étape végétative (Exemple : San Marzano). 14 CHAPITRE I GENERALITES SUR LA TOMATE I.7- Problèmes phytosanitaires : La Tomate, comme les autres Solanacées, peut être attaquée par de nombreux champignons, bactéries et virus. La régulation climatique des serres et abris, le paillage, le palissage précoce des plants présentent un grand intérêt dans la lutte contre la plupart des maladies. Les principaux ravageurs dans le cas des cultures sous serres sont l'Aleurode des serres (Trialeurodes vaporarium) et la mouche mineuse américaine (Liriomyza trifolii) sont les plus importants. La petite limace grise (Deroceras reticulatum), la noctuelle des moissons (Agrotis segetum) et la noctuelle ypsilon (Agrotis ipsilon) attaquent les plantules. Plusieurs espèces de nématodes provoquent la formation de nodosités sur le système racinaire. Le puceron vert du pécher (Myzus persicae) déforme les feuilles. On trouve quatre espèces de nématodes d'importance parasitant les racines de la tomate dans le monde. Il s'agit des nématodes des racines noueuses Meloidogyne incognita, M. arenaria, M. hapla et M. javanica, ce dernier ne vivant que dans les régions chaudes de la planète. Le signe le plus évident d'une infestation de ces nématodes est la présence de galles racinaires ou nodosité des racines. La lutte intégrée se fait conventionnellement au moyen de variétés résistantes, de rotations et de nématicides. Depuis les années 60, il s'est cependant fait beaucoup de recherches sur d'autres techniques susceptibles de réduire et/ou de repousser les nématodes de la tomate. I.7.1-Variétés résistantes : Les variétés de tomates résistantes aux nématodes sont en réalité des variétés tolérantes. Les nématodes infectent quand même leurs racines mais les plantes peuvent croître et porter des fruits malgré tout. Toutes les variétés résistantes disponibles portent le même gène appelé VFN. Il n'est donc pas conseillé d'utiliser ces variétés année après année car les nématodes pourront rapidement outrepasser la résistance. La variété Supersteak hybride VFN possède ce gène. I.7.2- Amendements organiques et minéraux : Les tourteaux d'oléagineux semblent particulièrement efficaces contre les nématodes. Ces substances augmentent les phénols et les acides aminés dans la plante ce qui rebute les nématodes (Singh et al., 1986). Le tourteau d'arachide réduit les populations de nématodes avec ou sans plants de tomate dans le sol. Le traitement est toutefois plus efficace suivi d'une jachère (Haq et al., 1986). 15 CHAPITRE I GENERALITES SUR LA TOMATE L'irrigation constante augmente l'efficacité nématicide des tourteaux d'oléagineux (Singh et al., 1980). Finalement, l'application de concentrés d'algues accroît la population de nématodes dans le sol mais elle réduit la population sur les racines de la tomate (Featonby-Smith et Staden, 1983). Il s'agit donc d'un répulsif à nématodes plutôt que d'un nématicide. Paracer et al. (1987) ont comparé plusieurs espèces d'algues des côtes de Floride et en ont conclu que seulement Spatoglossum schroederi est vraiment efficace contre les Meloidogyne. Cette algue peut être utilisée comme amendement de sol ou comme traitement racinaire avec des extraits au méthanol de l'algue. Plus il y a d'acide ascorbique dans les plants de tomates, moins les nématodes les attaquent. L'utilisation de vitamine C et de l'acide aminé arginine sont des moyens de contrôle potentiels de M. incognita (Al-Sayed et Thomason, 1988). I.7.3- Moyens de lutte biologiques : Les agents biologiques ayant fait l'objet du plus de recherches sont des champignons comme Paecilomyces lilacinus et Arthrobotrys irregularis. Ces champignons ne sont efficaces que dans des conditions très précises et prennent un certain temps avant d'agir ce qui implique l'introduction des champignons jusqu'à deux mois avant la culture. La lutte biologique n'est donc pas à utiliser en cas d'urgence. La bactérie Streptomyces avermitilis produit l'avermectine qui est une toxine très efficace contre toute sorte de nématodes. Garabedian et Van Gundy (1983) ont obtenu un contrôle aussi bon qu'avec les nématicides chimiques contre Meloidogyne incognita en appliquant l'avermectine à travers un système d'irrigation goutte-à-goutte. 1.8- Amélioration de la plante et culture in vitro : Depuis qu’il s’est organisé en communautés sédentaires pratiquant l’agriculture, l’homme, de manière empirique d’abord, puis en utilisant les données scientifiques ensuite, a toujours œuvré pour l’augmentation de la productivité des agro écosystèmes : en choisissant dans les populations naturelles les plantes les plus productrices et surtout aptes à produire dans différentes conditions de culture, en protégeant les semences en les conservant dans des silos clos ou des greniers enfumés et en utilisant des plantes à cycles courts qui arrivent à maturité avant la période de grande multiplication du parasite. 16 CHAPITRE I GENERALITES SUR LA TOMATE I.8.1- Amélioration de la tomate pour la résistance aux maladies : L’amélioration de la tomate pour la résistance aux maladies, et particulièrement le flétrissement bactérien provoqué par Pseudomonas solanacearum par la voie classique des hybridations, permet d’obtenir des résultats qui satisfont aux exigences de la culture en sols contaminés pendant au moins deux cycles de culture. Du fait de la ségrégation de l’hybride, les caractères parentaux réapparaissent et le nombre d’individus présentant la résistance se réduit au cours des générations. Après avoir fait le point sur l’un des systèmes de culture qui permet, dans les conditions de culture paysannes, d’atténuer les effets du flétrissement, il a été envisagé l’utilisation de la voie biotechnologique, en espérant obtenir des variants soma clonaux présentant une tolérance qui pourrait se conserver à travers le passage par la méiose. Sur des cals obtenus par mise en culture des cotylédons excisés des jeunes plants de tomate, des bactéries appartenant à une souche de Pseudomonas solanacearum ont été inoculées avant la formation des racines, des tests effectués sur les plantes régénérées et sur le terrain montrent une conservation du caractère tolérance obtenue. Un recours constant est fait aux biotechnologies dans la résolution des problèmes qui se posent en phytopathologie et en amélioration des plantes. Dans la recherche de la variété tolérante, la culture in vitro a été pratiquée en référence aux travaux de Sibi, Nsika-Mikoko, Chagvardieff et Demarly (Nsika et Mikoko, 1995). I.8.2- Amélioration de la tomate pour la résistance à la sécheresse : Afin de cultiver la tomate dans les régions désertiques situées en bordure de l'océan, des scientifiques des États-Unis ont mis au point des variétés de tomate que l'on peut irriguer avec de l'eau salée. Mais cette solution inquiète : l'irrigation des terres par l'eau de mer risquant de faire augmenter les dépôts de sel dans le sol de ces régions, tandis que c'est justement à cause du sel qu'il a été rendu stérile. De leur côté, quelques multinationales de l'agroalimentaire travaillent à la création d'une tomate transgénique résistante à la sécheresse (Paulette, 2007). I.8.3- Amélioration de la qualité gustative des tomates : Afin de répondre aux souhaits des consommateurs, l'amélioration de la qualité organoleptique du fruit est devenue un nouvel enjeu pour les sélectionneurs. C’est l’objet d’un important programme de recherche à l’INRA, basé sur l’exploitation de la biodiversité de la tomate. A la demande des consommateurs, la qualité des fruits est aujourd'hui prise en compte dans les programmes de sélection. Il s'agit d'un critère composite, multi caractères (aspect externe et interne du fruit, saveurs, arômes, texture), fortement influencé par les conditions 17 CHAPITRE I GENERALITES SUR LA TOMATE environnementales, avec des relations antagonistes fréquentes, notamment entre qualité et quantité. Des études de diversité ont permis aux chercheurs d'identifier une lignée, de l’espèce Lycopersicon esculentum, aux fruits de très petite taille, de type cerise et aux caractéristiques aromatiques remarquables. Cette lignée a été croisée avec une lignée de la même espèce, à gros fruits mais à valeur gustative limitée. Une population composée de 150 lignées issues de ce croisement a été créée et une carte génétique a été construite à l’aide de marqueurs moléculaires. La qualité des fruits de chaque lignée a été évaluée pour des composantes physiques (poids, couleur, fermeté), chimiques (teneurs en sucres, acides, pigments et composés volatils) et sensorielles (saveur sucrée, acide, intensité aromatique, arôme pharmaceutique, agrume, bonbon, texture ferme, farineuse, juteuse, fondante). De nombreuses régions chromosomiques impliquées dans la variation des caractères ont été détectées, certaines expliquant une part importante de la variation de la qualité. Les gènes favorables proviennent principalement du parent à petits fruits (INRA, 2005). Un programme visant à transférer les QTL de la lignée de type cerise dans plusieurs lignées fermes et de bonne valeur agronomique a été ensuite conduit. Il a permis de créer des génotypes de bonne qualité organoleptique mais dont les fruits sont trop petits pour que ces prototypes soient exploités directement par les circuits de production et de distribution. Un second niveau d'approche s'avère donc nécessaire pour faire progresser les connaissances fondamentales et les intégrer en vue de l'innovation variétale (INRA, 2005). I.8.4- Les tomates OGM créées : Comme pour d'autres fruits ou légumes, des tentatives de tomates génétiquement modifiées ont été effectuées. Un OGM est un organisme génétiquement modifié. C'est donc un organisme dont le programme génétique a été modifié, généralement par ajout d'un gène provenant d'une autre espèce, ou par modification de l'expression d'un gène. En France la moitié des études sur les fruits et les légumes sont consacrées à la tomate. Elles sont financées aux deux tiers par le secteur privé. Une tomate OGM avait été créée dès la fin des années 1980. Le fruit se conservait plus longtemps. Mais la production a été abandonnée car le produit ne présentait pas d'intérêt pour l'industrie agroalimentaire. 18 CHAPITRE I GENERALITES SUR LA TOMATE I.8.4.1- Tomates transgéniques 1401F, H282F, 11013F et 7913F : Cette tomate transgénique a été mises au point pour réduire la dégradation de la pectine en supprimant l’activité de la polygalacturonase. Il y a eu hybridation avec une lignée consanguine transgénique, la lignée F0, issue d’une modification génétique spécifique qui vise à réduire l’activité de la polygalacturonase (PG). La lignée F1 transgénique a été développée à partir de la lignée consanguine commerciale de tomate de transformation, TGT7, en introduisant un gène PG tronqué qui a entraîné une « régulation à la baisse » du gène PG endogène. L’enzyme PG active la dégradation de la pectine dans la tomate, ce qui fait ramollir le fruit. Les nouveaux hybrides produits par transgénèse mûrissent normalement. Cependant, la dissociation de la pectine y est moindre. Le fruit ramollit donc moins vite, ce qui présente un avantage pour toutes les étapes de récolte et de transformation. I.8.4.2- Tomate transgénique 1345-4 : Elle a été mise au point pour réduire l’accumulation d’éthylène et, par conséquent, retarder la maturation. La lignée de tomate 1345-4 a l’activité de l’enzyme 1aminocyclopropane-1-acide carboxylique (ACC) synthase réduite. Cette enzyme endogène provoque la conversion de s-adénosylméthionine en ACC, le précurseur immédiat de l’éthylène, une phytohormone reconnue pour jouer un rôle clé dans la maturation des fruits. L’accumulation in situ d’éthylène dans les tomates transgéniques ne représente qu’environ 1/50 du niveau trouvé dans la lignée parentale non modifiée et le fruit ne parvient pas à une maturité complète sans l’application d’une source extérieure d’éthylène. I.8.4.3- Tomate transgénique contre le cancer : Elle est mauve et aurait la capacité de protéger contre certains types de cancers et maladies dégénératives liées à l’âge. La tomate n’avait jamais disposé de tant de propriétés médicinales. Mis au point au « John Innes Centre » de Norwich, en Angleterre, l’organisme génétiquement modifié serait capable d’empêcher l’apparition du cancer, de prévenir les maladies cardio-vasculaires et de ralentir le vieillissement. Il a en effet été enrichi en anthocyanes, des pigments naturels abondants dans les végétaux bleus et mauves comme la mûre, la prune, le raisin noir ou encore l’aubergine. Ces pigments sont responsables de la teinte de ces derniers sont également connus pour leurs propriétés antioxydantes et leur capacité à prévenir le cancer. Ainsi, la tomate mauve est devenue la variété la plus riche en anthocyanine jamais observée et un véritable alicament (Cohignac, 2008). 19 CHAPITRE II GENERALITES SUR LA CULTURE IN VITRO II.1- Introduction: Depuis les débuts de l'agriculture l'homme a cherché à améliorer les plantes qu'il cultivait par rapport à des critères de qualité ou de rendement correspondant à ces besoins. Tout d'abord assez empiriques, ces techniques d'amélioration ont évolué grâce, en particulier à l'apport de la génétique. L'objectif de l'amélioration des plantes est de créer de nouvelles variétés combinant un certain nombre de caractères définis par le sélectionneur. Les méthodes classiques de création variétales ont donné beaucoup de résultats mais présentent certaines limites par exemple : • La stabilisation du matériel demande beaucoup de temps, obligeant le sélectionneur à prévoir à long terme l'évolution de la demande et des marchés. • Au plan biologique, fécondation et méiose représentent des contraintes importantes. En particulier, des signaux de reconnaissance pollen-pistil rendent vaines toutes les pollinisations biotechnologies étrangères (incompatibilité cellulaires et pollinique). moléculaires laisse Mais le entrevoir développement des possibilités des de contourner ces difficultés (Scriban, 1993). Les méthodes de culture in vitro sont de plus en plus employées pour assurer la propagation clonale des génotypes élites afin de satisfaire les besoins en agriculture et horticulture. La culture in vitro est par ailleurs un outil très efficace au service de la recherche biologique et physiologique (Haicour, 2002). Le développement fulgurant des biotechnologies dans les pays industrialisés commande une analyse spécifique de leur application dans les régions chaudes du globe dont l'agriculture joue un rôle socio-économique majeur. Plusieurs niveaux doivent être distingués en l'occurrence. Certaines méthodes de type biotechnologie ont été mises en œuvre et transférées depuis près d'un demi-siècle. Enfin, l’utilisation du génie génétique des plants, couplées aux hybridations somatiques, à l'haploïdie, au embryons somatiques, au variant somaclonaux et gamétoclonaux, ouvre des perspectives quasi infinies pour l'obtention de cultivars possédant des propriétés nouvelles requises en vue d'usages déterminés (Semal et Lepoivre, 1989). 20 CHAPITRE II GENERALITES SUR LA CULTURE IN VITRO II.2- Qu'est-ce que la culture in vitro? II.2.1- Définition : De très nombreux ouvrages ont traité de la culture in vitro au cours de la deuxième moitié de ce siècle décrivant toutes les méthodes déployées aussi bien dans le domaine animal que végétal (Augé et al., 1989 ; Margara, 1989). Nous pouvons retenir qu'il s'agit globalement d'une méthode de culture des plantes en conditions aseptiques, c'est à dire sans champignon et sans bactérie, utilisant des milieux de culture assez complexes (hormones, sucres, vitamines, acides aminés, sels minéraux) qui peuvent être liquides, gélosés, voire même solides avec l'emploi de la vermiculite (Jay-Allemand et al., 1992). La culture in vitro permet de cultiver des tissus ou des fragments d'organes isolés d'une plante tels que des apex, des bourgeons, des nœuds pouvant régénérer des pousses, mais aussi des racines ayant une croissance de type infini, ou encore des feuilles maintenues en survie. Cette technique permet également de cultiver des cellules isolées voire même des protoplastes capables de se diviser, de former des cals, des tissus organisés et même de régénérer une plante entière. La culture in vitro permet donc d'utiliser toutes les potentialités régénératrices d'une plante, jusqu'à la totipotence cellulaire qui peut se traduire suivant cette formule simple : 1 cellule = 1 plante entière (Jay-Allemand et Capelli, 1997). II.2.2- Historique et fondement de la culture in vitro : II.2.2.1- Historique : La culture in vitro est par comparaison, une technique très récente puisqu'elle fut développée seulement au début de ce siècle (Jay-Allemand et Capelli, 1997). Les premiers pas de culture in vitro sont dus à un allemand Haberlandt en 1902. Il obtient ainsi, sur un milieu KNOP amélioré, la survie durant plusieurs mois de petits amas cellulaires. Mais il n'y avait pas de multiplication cellulaire (Augé et al., 1989). En 1912 Alexie Carrel réussissait la culture indéfinie de cellules de cœur d'embryon de poulet par repiquages successifs. Il fallut attendre 1922 et les travaux de Rablens pour voir apparaître une croissance chez les pointes de racines isolées sur milieu synthétique. Mais la date qui marque réellement le début de la culture in vitro est 1932 avec les travaux de White au USA sur la croissance indéfinie en milieu liquide de racines de tomates. Ce succès fut sans doute à l'origine du regain d'effort qui se portera sur la culture de tissus végétaux. Dés 1934 Gautheret obtient à partir de prélèvement de tissus cambiaux d'arbre des proliférations de tissus qui malheureusement, ne dépassèrent pas huit mois (Morel , 1952) (Scriban, 1988). Après les travaux de White au USA en 1932 sur le Tabac, Nobecourt en France sur la Carotte, Limasset et Cornuet en 1949 qui publiaient leurs observations sur l'absence de virus dans les 21 CHAPITRE II GENERALITES SUR LA CULTURE IN VITRO méristèmes de Tabac virosé. Morel & Martin, en 1952 mirent à profit ces observations et entreprirent de mettre en culture in vitro des méristèmes de Dahlia et de pomme de terre atteints de maladies à virus. A partir de ces méristèmes, ils obtinrent in vitro des plantes entières qui furent remises en culture normale et se révélèrent saines au contrôle (Augé et al., 1989). C'est ainsi qu'est née en 1952 cette technique universellement employée actuellement pour assainir toutes sortes de plantes virosées. Un dernier point longtemps contesté, est la possibilité d'obtenir une prolifération de tissus à partir d'une cellule végétale mise en culture in vitro. Torrey, en 1957 réussit à suivre au microscope l'évolution de cellules isolées de pois, mises en culture à proximité d'un tissu nourricier. La culture in vitro de tissus végétaux connaitra un essor particulier. Aujourd'hui avec l'évolution de la recherche agronomique, la culture in vitro occupe une place importante dans l'agriculture moderne (Augé et al., 1989). II.2.2.2- Fondement : Chez les végétaux, l’organogenèse est assurée par les méristèmes qui sont constitués de massifs de cellules non différenciées, conservant la capacité de se diviser activement. L’organogenèse implique une différenciation cellulaire, à l’inverse d'une dédifférenciation, dans les tissus déjà spécialisés, peut conduire à la formation de nouveaux massifs méristématiques. Cette particularité illustre la totipotence des cellules végétales, c’est à dire l'aptitude des cellules à se diviser puis à se différencier de nouveau en fonction des conditions expérimentales (Larpent-Gourgaud et Sanglier, 1992). C'est à cette remarquable capacité de la cellule végétale que la culture in vitro doit toute son extension, et peut on dire, son pouvoir. A cause de cela, tout individu du règne végétal peut ou pourra être cultivé in vitro, il n'y a pas d'exception. Cependant cela ne veut pas dire que le développement actuel des milieux de culture, et les connaissances que l'on peut avoir du comportement de différentes espèces sur ces milieux de culture, permettent de réaliser immédiatement et sans problème la culture in vitro de toutes les plantes existant sur la terre (Augé et al., 1989). a- La différenciation: Tout individu est issu d'une cellule indifférenciée, la cellule-œuf. Cette cellule se multiplie et donne des masses cellulaires qui se différencient pour construire l'individu. Cette différenciation se fait sous la pression d'un certain nombre d'informations de différents types : • Les régulateurs de croissance : ex : l'auxine pour former des racines • Les ressources : les carences/disponibilités orientent les métabolismes et la 22 CHAPITRE II GENERALITES SUR LA CULTURE IN VITRO différenciation • Le troisième facteur pouvant jouer sur l'orientation de la différenciation est l'échange d'énergie. Toute synthèse cellulaire, nécessaire à la différenciation, nécessite de l'énergie et dépend donc, entre autres, de la disponibilité en molécules de type NTP. b- La dédifférenciation : Il est bien évident que le passage d'un état différencié à l'état de cellules méristématiques proliférantes, ne se fait pas sans que des modifications profondes n'apparaissent dans la structure de la cellule. Ces modifications ramènent la cellule adulte à l'état juvénile (recouvrer les caractéristiques cytologiques et les potentialités des cellules embryonnaires), capable de s'orienter vers la formation de n'importe quel organe. Suivant la composition du milieu de culture, les cellules dédifférenciées continueront à proliférer pour ainsi dire a l’infini, elles deviennent parfois capables de poursuivre leur prolifération, même en l'absence de substances stimulantes, telle que les auxines et les cytokinines. Les cellules végétales se dédifférencient et retournent à l'état cellulaire indifférencié (embryonnaire ou méristématique). Cette perte de l'inhibition corrélative permet l'expression de toutes les possibilités embryonnaires (Rajnchapel, 1987). En 1964 l'équipe de Steward obtenait une plantule de carotte à partir d'une seule cellule in vitro en milieu liquide agité. Depuis beaucoup d’autres chercheurs ont obtenu des résultats semblables. Toutes les cellules qui forment un organisme sont, à l'origine, totipotentes. Au cours de l'ontogenèse (formation d'un individu, croissance, mort), chaque cellule, sous la pression des différents paramètres, est programmée pour une fonction. Ceci se fait en exprimant seulement une partie du programme génétique disponible et en réprimant le reste. Ce phénomène a la particularité, chez les végétaux, d'être réversible, ce qui permet l'existence de la dédifférenciation. Ce phénomène n'est absolument pas possible chez les animaux. Donc, comme pour la différenciation, il y a une pression du milieu sur le devenir de la cellule. Ceci prouve que la répression du programme génétique, lors de la différenciation, n'altère pas ce programme. Les fonctions non usitées sont encore disponibles. D'autre part, si la cellule ne subit aucune pression du milieu, elle se dédifférencie. Il y a donc entretien des fonctions par le milieu. Par exemple : Une cellule chlorophyllienne maintenue à la lumière reste chlorophyllienne, mais si elle est placée à l'obscurité, ses chloroplastes s'étiolent et redeviennent des protoplastes indifférenciés. Dans une plante vasculaire, si un vaisseau est détruit par blessure (attaque de parasites, etc), les cellules voisines changent d'environnement direct (la sève ne circule plus). Elles redeviennent totipotentes et peuvent reformer le vaisseau en quelques jours. 23 CHAPITRE II GENERALITES SUR LA CULTURE IN VITRO c- La totipotence : La théorie de la totipotence énoncée en 1902 par Haberlandt a été reprise et banalisée par Steward (1967). Cette théorie se base sur le fait que toutes les informations génétiques et donc le programme de l'embryogenèse sont présents dans le noyau de chaque cellule vivante (Norreel, 1973). Un tissu ou une cellule dédifférencié peut évoluer dans toute sorte de direction cela manifeste la totipotencialité de la cellule végétale. Cette totipotence de la cellule végétale se retrouve aussi au niveau des cellules reproductrices : grains de pollen ou ovules. Elle a été mise a profit avec le succès que l'on connait depuis 1966, pour obtenir des haploïdes dont on peut ensuite doubler les chromosomes par cholchicine. Cette propriété est également à l'origine du succès remporté par l'isolement et la culture des protoplastes. Théoriquement, chaque protoplaste est capable de reproduire une plante parfaitement identique à la plante mère. Une cellule végétale même très différenciée est souvent capable de revenir à l'état juvénile en se dédifférenciant, elle peut ensuite se diviser pour donner tel ou tel tissu dépendant des circonstances (Djennane et Klifatti, 1996). La totipotence est une dédifférenciation expérimentale qui peut être déclenchée par la perturbation de corrélations organiques, par des traumatismes, de l'action des phytohormones ou par leur suppression (Demarly et Sibi, 1996). II.3- Les applications de la culture in vitro: La culture in vitro d'explants ou de fragments prélevés sur la plante permet différentes applications : II.3.1- Le sauvetage d'embryons : Les embryons obtenus après la fécondation peuvent être prélevés, mis en culture in vitro et donner un nouvel individu. Le sauvetage d'embryons consiste à prélever un embryon précocement, pour le cultiver in vitro, soit pour accélérer les cycles végétatifs, soit parce qu'il ne pourrait pas se développer dans les tissus maternels. II.3.2- La micropropagation : La multiplication végétative par culture in-vitro ou micropropagation présente plusieurs avantages sur les méthodes classiques dites "conventionnelles" de propagation. Cette technique a rendu possible la multiplication d'espèces chez lesquelles les semences sont rares, ou présentant des difficultés de germination et/ou dont les techniques de bouturage ou de greffage sont inapplicables, ce qui a conduit à une plus grande diversité des plantes commercialisées. 24 CHAPITRE II GENERALITES SUR LA CULTURE IN VITRO La micropropagation est utilisé dans un but de multiplication en masse, puisqu'elle permet, en partant d'un seul individu (plant), l'obtention d'un nombre considérable de plantes génétiquement identiques à la plante mère (Ferry et al., 1998 ; Semal, 1998). Les plants reproduits ne sont pas seulement conformes mais présentent aussi une grande uniformité. Par ailleurs, l'usage de cette technique nécessite peu d'espace et peu être programmé indépendamment des saisons. La technique représente donc sans contexte un outil puissant aux perspectives industrielles et économiques importantes (Margara, 1982 ; Boxus, 1995; Semal, 1998 ; Skirvin et al., 2000). Les techniques de micropropagation empruntent essentiellement deux voies : L'une qui utilise des tissus méristématiques (méristème ou apex de tige, bourgeons axillaires ) potentiellement capable de donner suite, au développement normal, d'un individu est appelée microbouturage (Saadi, 1991) cette technique est souvent appelée "multiplication conforme" car elle part de méristème préexistant dans les quels , les cellules sont génétiquement très stables (Amato, 1977 in Boxus, 1995) l'individu est généralement obtenu en deux étapes successives, d'abord la production de tige, puis son enracinement . L'autre voie, utilise toute sorte de tissus différenciés (fragments de tige, de racines, de pétiole, de feuilles, d'embryons matures et immatures, d'hypocotyles, de cotylédons...etc) pour aboutir à la néoformation soit de tiges (caulogenèse) et de racines (Rhizogenèse), c’est l’organogenèse soit d'embryons somatique et c’est l’embryogenèse somatique. II.3.2.1- Cultures de méristèmes : Les premiers résultats de cultures de méristèmes appelées communément "cultures d'apex" furent obtenus par Kotte et Robbins, dès 1922 à partir de méristème radiculaires de fève et de maïs (Toute, 1998). Dix ans plus tard, White (1934) obtiendra une culture indéfinie de racines de tomate. En même temps, il s'apercevait que si le virus de la mosaïque du tabac pouvait se multiplier dans des racines de tomate isolées, le virus n'atteignait pas les cellules méristématiques. Plus tard, Limasset et Cornuet (1949) montrent que les organes jeunes de tabac ne renferment que très peu de virus et que les méristèmes apicaux n'en contiennent pas. En 1952, partant de ces observations, Morel et Martin tentent de prélever des pointes méristèmatiques de dahlias virosés pour reproduire des dahlias génétiquement semblables aux parents, mais exempts de virus. Ils réussiront à éliminer la mosaïque du dahlia et le " spotted wilt virus". En 1955, ils régénéreront de façons analogues des pommes de terre atteintes de virus A et Y (Boxus, 1995). 25 CHAPITRE II GENERALITES SUR LA CULTURE IN VITRO Depuis lors, la culture de méristèmes a conduit à des applications nouvelles, originales concernant le domaine du phytosanitaire, notamment pour l'éradication de nombreuses maladies (viroses, mycose, mycoplasmoses, bactérioses) et a permis la régénération d'un grand nombre d'espèce saines (Toute, 1998). Les méristèmes qui sont des tissus de formation, en expansion continue, confèrent à la plante une organogenèse permanente chez les végétaux supérieurs. Ils représentent des petits massifs de cellules indifférenciées (0.1mm) et conservent la capacité de se diviser activement. Ces zones méristèmatiques gardent jusqu'à leur mort le caractère juvénile. Elles jouent un rôle capital dans le développement végétal puisqu’elles édifient tous les organes (Camefort, 1977; Margara, 1989). En multipliant le méristème prélevé au sommet d'une plante ou dans le bourgeon axillaire, le plus souvent indemne de maladies, on pourra très rapidement obtenir de nombreuses plantes, toutes semblables du point de vue génétique et débarrassées de maladies dont elles étaient affectées (Schmid et Keller, 1984 ; Sama et al., 1998). Il est même possible de reconstituer des clones indemnes de maladies à partir de pieds-mères malades. D'après Toute, 1998 ; Fletcher et al., 1998, il existe plus de 50 espèces végétales qui ont été ainsi assainies c'est le cas de la pomme de terre, la canne à sucre, du dahlia ..etc. La culture de méristème est la méthode la plus généralisable et la plus sûre pour éviter l'apparition de plantes non conformes à la plante mère ou variantes (Saadi, 1991). Elle paraît plus intéressante chez les plantes allogames où il est généralement impossible de conserver des génotypes intacts par reproduction sexuée classique. II.3.2.2- Organogenèse : L’organogenèse est la base fondamentale de la multiplication végétative, laquelle s'appuie toujours sur la formation de méristèmes nouveaux. a- Caulogenèse : La caulogenèse désigne à la fois l'initiation et le développement des tiges. Les tiges néoformées in vitro peuvent apparaître sur l'explant initial ou sur un cal. Ils sont induits sur n'importe quel type d'organe ou de tissu y compris sur ceux qui ne les produisent pas dans les conditions naturelles (Camefort, 1977 ; Zryd, 1988 ; Margara, 1989). Les études cytologiques, conduites dans le but de déterminer l'origine des tiges néoformés à partir d'un fragment d'organe contenant divers tissus montrent souvent que l'aptitude à la caulogenèse se manifeste à partir de certaines catégories de tissus telles que: le cambium, le parenchyme vasculaire ou libérien (Belanger, 1998 ; Fortes et Pais, 2000). 26 CHAPITRE II GENERALITES SUR LA CULTURE IN VITRO L'intensité de cette néoformation est nettement dépendante de la nature des tissus contenus dans l'explant. Elle est maximale pour les tissus cambiaux, élevée pour les tissus du phloème et du xylème, très faible ou nulle pour le parenchyme cortical ou médulaire (Margara, 1989). b- Rhizogenèse : La rhizogenèse désigne la néoformation et la croissance de racine. Les méristèmes de racines se répartissent en plusieurs catégories selon leurs origines. Les racines néoformées, au sein d'un cal, en culture in-vitro, peuvent être considérées comme un cas particulier de méristèmes adventifs (rhizogenèse indirecte) ou l'émission de racines sur un explant dans des endroits inhabituelles (rhizogenèse directe). La rhizogenèse est un phénomène complexe, il comporte différentes phases: la dédifférenciation, formation d'amas de cellules méristèmatiques, différenciation et organisation des amas méristèmatiques en primordium racinaire qui se développeront en jeunes racines (Margara, 1989 ; Boxus, 1995). II.3.2.3- Embryogénèse somatique : Les embryons somatiques peuvent être induits à partir de cellules cultivées en suspension, ce qui rend possible une production en fermenteur et réduit considérablement le coût de production. Ainsi les taux de multiplication sont généralement importants et chez certaines espèces, les embryons peuvent être encapsulés et traités comme des graines artificielles. Des plantes complètes sont obtenues directement suite au processus de germination. Les manipulations sont donc simplifiées par rapport à la micropropagation traditionnelle qui nécessite plusieurs milieux différents pour le développement des tiges et des racines et l'obtention de plantules complètes. Cependant, plusieurs difficultés subsistent en embryogenèse somatique : L'induction du potentiel embryogène et la régénération restent souvent difficiles. Les cultures de cals, et plus encore les cultures de cellules isolées, sont propices à l'apparition de mutations géniques pouvant être responsable d'une variabilité des plantes issues de la culture. Toutefois, dès que cette variabilité sera maîtrisée, l'embryogenèse somatique permettra de produire des quantités très élevées de plantes à faible coût. Certaines espèces, telles que le palmier dattier ou certains conifères font déjà l'objet d'une production industrielle par embryogenèse somatique. 27 CHAPITRE II GENERALITES SUR LA CULTURE IN VITRO II.3.3- La production de plantes haploïdes : Cette technique présente un grand intérêt pour l’amélioration des plantes, elle permet d’accélérer les cycles de sélection. Pour l’androgenèse, on part d’anthères immatures. A partir des microspores, il peut y avoir apparition d’embryons directement ou après formation d’un cal haploïde. II.3.4- Culture et fusion des protoplastes : Le terme protoplaste désigne une cellule végétale débarrassée de sa paroi : elle apparaît alors sous forme d’une cellule sphérique, limitée par sa membrane plasmique. L’intérêt de ces cellules réside dans le fait qu’il est possible de faire pénétrer dans la cellule des molécules diverses dont de l’ADN, des organites (chloplaste, mitochondrie), des noyaux (fusion) et effectuer des manipulations génétiques. Toutes les espèces ne peuvent pas régénérer à partir de protoplastes et le rendement est faible. II.3.5- La variation somaclonale et la culture in vitro : Un taux élevé de variation peut être induit en culture in vitro lorsque les cultures sont réalisées dans des conditions particulières. Plus précisément, les plantes régénérées à partir de cultures initiées d'explants différenciés (ne contenant pas de méristèmes préexistant) ou à partir de cultures de cals présentent des taux parfois importants de non-conformité. Cette variabilité semble de plus être proportionnelle au temps de culture. Des mutations induites pendant la culture ont été détectées chez de nombreuses espèces végétales. L'existence de ces variations spontanées a stimulé l'intérêt de la culture de cellules ou de tissus pour l'isolement de plantes présentant des caractéristiques nouvelles. La majorité des lignées isolées à ce jour se sont toutefois révélées sans intérêt agronomique. Dans quelques cas cependant, l'existence de cette variation somaclonale a permis d'isoler des plantes présentant des caractères intéressants d'un point de vue agronomique. Par exemple, des plants de canne à sucre présentant un taux de sucre plus important ont été isolés. De même, des génotypes résistants à certains virus, ont été obtenus chez la tomate et la pomme de terre (Evans, 1989). 28 CHAPITRE II GENERALITES SUR LA CULTURE IN VITRO Tableau 6 : Techniques de culture in vitro et leurs principales applications : Techniques de culture in vitro Applications Culture d'embryons zygotiques Sauvegarde de génotypes Embryogenèse somatique Production et transformation génétique Culture de nœuds et de bourgeons Rajeunissement et microboutures Culture d'apex Etat sanitaire et rajeunissement Microgreffage Etat sanitaire et rajeunissement Micropropagation Rajeunissement et production Androgenèse et gynogenèse Amélioration (haploïdes) Culture de cellules isolées Modèle d'études et de recherches Culture de tissus, de cals Substances pharmacologiques II.4- Les bénéfices de la culture in vitro: II.4.1- Collection de génotypes et état physiologique du matériel conservé: A partir d'un matériel sélectionné en forêt, en verger ou en pépinière, il est possible de produire par culture de nœuds et/ou micropropagation des copies végétatives qui serviront à l'installation de parcs à pieds-mères. Grâce à la culture d'embryons zygotiques, à la micropropagation et à l'embryogenèse somatique, des génotypes peuvent être conservés in vitro (tubes, bocaux ou boites de pétri) sur de longues périodes pouvant dépasser les 10 ans (cas de l'orme, du noyer, des portegreffes fruitiers...). Cette technique demande d'importants moyens humains pour entretenir les souches in vitro tout au long de l'année sur la base de repiquages mensuels. Cependant, on peut envisager de conserver les génotypes clonés dans l'azote liquide par cryoconservation (Engelmann et Baubault, 1986) de méristèmes (cas du merisier et du noyer), d'embryons somatiques (cas du mélèze) et zygotiques (cas du palmier à huile). Enfin, l'application des techniques de culture 29 CHAPITRE II GENERALITES SUR LA CULTURE IN VITRO in vitro (Micropropagation et microgreffage) permet de maintenir le matériel sélectionné dans un état proche de la juvénilité favorable à la multiplication végétative, au bouturage en particulier (Franclet, 1980). Cette opération est généralement couplée à des techniques dites de rajeunissement (taille sévère, recépage) des pieds-mères ou des arbres âgés sélectionnés qu'il est nécessaire d'utiliser pour obtenir de bons résultats en culture in vitro (prolifération, croissance des pousses feuillées et formation des racines adventives). II.4.2- Obtention de matériels indemnes de maladies : Grâce à la culture de méristèmes ou à la technique de microgreffage on peut produire des variétés indemnes de virus en particulier (cas du fraisier, de la pomme de terre, de la vigne et des porte-greffes fruitiers) et éviter ainsi des pertes de productivité voire même la dégénérescence des plants cultivés. Ces variétés peuvent être conservées soit en culture in vitro soit en pépinière. Un suivi de ces variétés peut être effectué grâce à des tests sérologiques attestant la qualité de l'état sanitaire des plants commercialisés. II.4.3- Développement de méthodes de production de plants : La culture in vitro a depuis longtemps fait ses preuves comme outil de production de plants par sa rapidité à amplifier une variété donnée, par sa capacité à raccourcir les cycles de production et à stocker de grandes quantités de matériel dans un espace réduit, par sa puissance de production en masse sur des temps courts permettant une programmation précise de la sortie des plants commandés. Dans le domaine de l'horticulture, deux principales méthodes sont aujourd'hui utilisées : la micropropagation et l'embryogenèse somatique. La première est bien adaptée à la production de plantes herbacées, d'arbres fruitiers et de feuillus forestiers, alors que la seconde est performante pour les conifères et certaines monocotylédones telles que le palmier dattier par exemple (Jay-Allemand et al., 1992). De nombreuses entreprises ou pépinières privées ont intégré cette technique en tant qu'outil de production leur permettant de gérer la quantité de plants selon les commandes. Mais plus rares sont celles qui l'utilisent comme un outil central de gestion du matériel et de production, situé en permanence à l'interface pieds mères et élevage en serre. C'est le cas de l'entreprise BIOFORESTA située à Oyarzun en Espagne qui a construit son laboratoire au cœur de la pépinière constituée de plus de 250 variétés différentes, toutes élevées en pot. II.4.4- La culture in vitro au service de l'amélioration variétale : L'amélioration génétique traditionnelle tient et tiendra encore toute sa place pour les années à venir afin de sélectionner des variétés bien adaptées à l'environnement dans lequel elles seront cultivées, tolérantes aux maladies et possédant des caractéristiques agronomiques intéressantes. Cependant, là encore la culture in vitro joue et jouera un rôle déterminant à trois 30 CHAPITRE II GENERALITES SUR LA CULTURE IN VITRO principaux niveaux : • La sauvegarde de génotypes produits par fécondation contrôlée grâce à la culture d'embryons zygotiques ou d'axes embryonnaires. • La production d'haploïdes par androgenèse (culture d'anthères) ou gynogenèse (sacs embryonnaires, oosphères non fécondés) permettant d'obtenir des lignées homozygotes après diploïdisation, recherchées par les améliorateurs. • La production de plants génétiquement modifiés via Agrobacterium tumefaciens par l’utilisation de techniques de régénération faisant appel à l'embryogenèse somatique au bourgeonnement adventif et à la micropropagation. II.5- Les problèmes liés à la culture in vitro: II.5.1- La vitrification : Certains accidents, non prévisibles au départ, peuvent intervenir en cours de culture in vitro, comme des malformations dues à un déséquilibre hormonal. II.5.2- La perte de caractères intéressants : La production répétée de grands nombres de plants uniformes (clones) peut entraîner la perte des gènes nécessaires, par exemple, à la résistance aux maladies nouvelles, il faut donc conserver les pieds mères et à certains moments, repasser par la reproduction sexuée. II.5.3- Problèmes inhérents à la technique : II.5.3.1 - L’asepsie : La technique de culture in vitro exige beaucoup de soin pour le maintien des cultures en condition d’asepsie. Lorsque l’on a des cultures infectées, cela peut provenir de différentes causes. Il peut s’agir d’un champignon (moisissure) ou d’une bactérie. S’il s’agit d’un champignon, on voit un développement mycélien qui a une texture feutrée, souvent blanche ou grisâtre. S’il s’agit d’une bactérie, on voit alors un voile d’aspect laiteux, développé à l’intérieur du milieu et à la surface. Si l’infection part de la zone de contact entre les tissus et le milieu, ce sont les tissus eux-mêmes qui sont la source de l’infection. Si l’infection part d’un point quelconque du milieu, la source de l’infection peut être soit l’air, soit une mauvaise stérilisation du milieu, soit une infection de l’air ambiant par l’intermédiaire de l’eau de condensation au niveau du couvercle (Auger et al., 1989). 31 CHAPITRE II GENERALITES SUR LA CULTURE IN VITRO II.5.3.2- L’acclimatation : Le passage à des conditions de culture normale est parfois délicat. En effet, durant son séjour in vitro, la plante est à l’abri des stress. II.5.3.3- L’apparition d’anomalies génétiques : Certains cas d’hyperfloraison, perte de sexualité chez certaines espèces, apparition d’organes anormaux : c’est la variation somaclonale. II.6 - Le milieu de culture : En 1962, Murashige et Skoog étudient la multiplication végétative du tabac et mettent au point le premier milieu de base pour la culture in vitro. Ce milieu contient des sels minéraux, des sucres, des vitamines B, des auxines et des cytokinines. Ce milieu rend possible la culture et la prolifération de méristèmes de tiges jusqu’alors réfractaires à la multiplication végétative in vitro. L'explant doit trouver dans le milieu de culture tout ce dont il a besoin pour survivre, se multiplier et éventuellement régénérer un nouvel individu, en fait, tout ce que la plante mère peut fournir, par les racines et les feuilles. II.6.1 – Les éléments minéraux : Les besoins des cultures de tissus en éléments minéraux ont été étudiés par différents auteurs et le fruit de leurs recherches a donné lieu à différentes compositions minérales toujours utilisées aujourd’hui. Ces formulations portent souvent le nom de leurs auteurs tels que Gamborg (Canada), Gautheret (France), Heller (France), Murashige et Skoog (EtatsUnis), White (Etats-Unis), Morel (France), etc. La composition du milieu de culture Murashige et Skoog est sans doute la plus utilisée car elle convient à un très grand nombre de plantes. Ce milieu est très riche en sels minéraux. II.6.1.1- Les macroéléments : Il s'agit de 6 éléments présents à des concentrations élevées tels que l’azote (N), le calcium (Ca), le potassium (K), le soufre (S), le magnésium (Mg) et le phosphore (P). II.6.1.2- Les microéléments : Appelés parfois oligo-éléments, et bien qu'ils ne soient nécessaires à la plante qu'en faibles concentrations, leur rôle est essentiel. Les principaux d'entre eux sont le fer (Fe), le cuivre (Cu), le zinc (Zn), le manganèse (Mn), le molybdène (Mo), le bore (B) et le chlore (Cl), le cobalt (Co), le nickel (Ni), etc... 32 CHAPITRE II GENERALITES SUR LA CULTURE IN VITRO II.6.2 - Les éléments organiques : II.6.2.1- Les sucres : Dans le cas de tissus végétaux placés en culture in vitro, l'assimilation chlorophyllienne est nulle ou insuffisante pour assurer la survie et le développement de l'explant. Dès lors, on ajoute des sucres, le plus souvent du saccharose, aux milieux de culture pour fournir à l'explant une source de carbone. II.6.2.2- Les vitamines : Les vitamines sont des substances organiques reconnues pour stimuler la croissance. Elles sont particulièrement utiles en micropropagation lorsqu’un fragment seulement de la plante est utilisé pour générer la culture de plantes entières. On comprendra que dans ces circonstances, la synthèse endogène (par le tissu végétal lui-même) de vitamines risque d’être insuffisante et que le milieu devra y suppléer en conséquence. Les vitamines les plus fréquemment utilisées sont la thiamine HCL, la pyridoxine, la biotine, le pantothénate de calcium et le myo-inositol (le myo-inositol est parfois considéré comme un sucre). II.6.2.3- Les acides aminés : Il a parfois été observé que l'apport d'acides aminés favorisait la prolifération. II.6.3 – Les régulateurs de croissance : On les appelle aussi « phytohormones » ou « hormones végétales », mais considérant qu’il s’agit variablement de produits de synthèse ou de produits synthétiques, il est préférable d’utiliser le terme régulateur de croissance. Ces substances sont utilisées à des doses très faibles. Les trois principaux groupes de régulateurs de croissance d’usage fréquent sont les auxines, les cytokinines et les gibbérellines. Le choix du ou des régulateurs utilisés ainsi que leur quantité est généralement guidé par la littérature. II.6.3.1 - Les auxines : Elles favorisent la croissance des cals, les divisions cellulaires, l’allongement cellulaire, le développement des bourgeons adventifs ainsi que l’enracinement. a - Acide indole-3-acétique (AIA) : L’AIA est une substance naturelle pouvant être obtenue par synthèse chimique. b - Acide naphtalène acétique (ANA) : Cette molécule est souvent utilisée pour favoriser la rhizogénèse. 33 CHAPITRE II GENERALITES SUR LA CULTURE IN VITRO c - Acide indole butyrique (AIB) d- Acide 2,4 dichlorophénoxyacétique (2,4-D) : Le 2,4-D est largement utilisée comme herbicide et pour la production de cals surtout. II.6.3.2- Les cytokinines : Elles stimulent les divisions cellulaires, la croissance des bourgeons axillaires, régularisent la morphogenèse et contribuent au renouvellement de la chlorophylle. a - Zéatine : C’est une substance naturelle. b - Isopenthényladédine (2-i-P) : C’est une substance naturelle. c - Kinétine : La Kinétine est une substance de synthèse. d - 6-benzylaminopurine (BAP) et benzyladénine (BA) : La BAP est une substance de synthèse, largement utilisé en raison de sa grande activité et de son faible coût. II.6.3.3- Les gibbérellines : Elles favorisent le grandissement cellulaire, l’allongement des entre-nœuds et lèvent la dormance des graines. Seul l’acide gibbérellique (Ga3) est utilisé. II.6.4 – Les géloses : La gélose (ou agar) ajoutée au milieu nutritif permet l’obtention d’un milieu semi solide ou solide dans lequel les explants peuvent être repiqués et supportés. La gélose a l’avantage de retenir très peu les ions mais en contrepartie elle fournit un milieu de vie pauvre en oxygène lorsqu’elle est utilisée à forte concentration. La qualité d’un milieu gélosé est donc dépendante d’une part de sa fermeté, indispensable au support des plantes, et d’autre part de sa souplesse, qui facilite la diffusion des éléments nutritifs. La concentration utilisée varie selon le niveau de pureté de la gélose et l’objectif de la culture. La gélose la plus utilisée c’est l’Agar-agar. Il s’agit d’une substance naturelle extraite de différentes espèces d’algues marines. On la classe parmi les sucres parce qu’elle est identifiée comme un polyoside (donc un glucide). II.7- Facteurs de la régénérabilité : Les facteurs influant sur la régénérabilité in vitro peuvent être schématiquement répartis en deux groupes. Le premier représente les facteurs internes, (ceux liés à la plante) et concerne d'une part le génotype, la nature et l'âge ontogénique de l'explant et d'autre part l'état physiologique de la plante mère sur laquelle, l'explant a été prélevé. Le second réunit les différents facteurs externes qui englobent et les milieux (notamment leur composition en régulateurs de croissance et les sucres) et les conditions de cultures. 34 CHAPITRE II GENERALITES SUR LA CULTURE IN VITRO II.7.1- Effet de l'explant : Un des atouts majeurs de la culture in vitro est de montrer que des cellules somatiques (à 2n chromosomes), pouvaient produire, soit des structures comparables à des embryons somatiques, soit des bourgeons dont le développement permet de régénérer des plantes conformes à la plante mère. Pratiquement, n'importent quel organe (bourgeon, racine, feuille, anthère, etc.) ou fragment d'organe (explant), prélevé sur celle-ci, peut être cultivé isolément sur milieu nutritif synthétique, mais le choix de celui-ci est d'une importance primordiale. On retiendra cependant que la réponse in vitro est sous la dépendance de nombreux facteurs. II.7.1.1- L'âge physiologique et ontogénique de l'organe : Généralement dans les cultures in vitro, on privilégiera les explants les plus jeunes (embryons immatures, jeunes feuilles, méristèmes etc.) car c'est l'état juvénile qui semble offrir le plus de possibilités de régénération (Davis, 1986 ; Saadi, 1991). Souvent, ce sont les tissus provenant d'embryons qui expriment le plus souvent, d'une manière nette et reproductible, l'aptitude à la régénération. C'est le cas par exemple du pois (Saadi, 1991), du lupin (Desire, 1988), du coton (Brar et al., 1998), du soja (Santarem et al., 1997), du tournesol (Charniere et al., 1999), Pinus sylvestris ( Haggman et al., 1999) et bien d'autres espèces. II.7.1.2- L'époque du prélèvement : Ce problème se pose surtout pour les espèces vivaces, on peut distinguer un stade de vie active et un stade de vie ralentie de la plante ce qui conduit les explants à développer des réactions différentes en culture in vitro. Cette différence peut être expliquée par la modification des équilibres internes des régulateurs de croissance (auxines, cytokinines, gibbérellines ...) lors des différentes saisons (Auge et al., 1989). II.7.1.3- La taille de l'explant : Plus la taille est importante et plus les équilibres endogènes sont déterminants et les conditions extérieures seront influentes. La taille choisie variera selon la nature de l’explant. Si le tissu végétal est de nature organisée, un ensemble assez complet sera nécessaire (soit un nœud, un apex, ou un bourgeon entier) mais dans le cas d'une structure différenciée (éléments de feuilles, de tige, de racines, inflorescence..) des fragments de 5 à 10 mm suffiront (Zryd, 1988 ; Auge et al., 1989 ; Hannweg et al., 1996). D'une manière générale, il existe des tissus privilégiés appelés «tissus cibles » qui répondent à un stimulus indicateur qui orientera le programme morphogénétique vers une voie particulière de développement contrairement à certains tissus récalcitrants aux 35 CHAPITRE II GENERALITES SUR LA CULTURE IN VITRO manipulations in vitro, due essentiellement à un manque de compétence cellulaire (Coleman et Ernst, 1990 ; Ronchi, 1995 ; Yadav et Rajam, 1998). II.7.2- Influence du génotype La plupart des plantes montrent une régénération génotypique spécifique liée à l'espèce. A l'intérieur d'une même espèce, un génotype donne des bourgeons tandis qu'un autre ne peut fournir que des embryons (Auge et al., 1989) . Cependant, plusieurs auteurs mentionnent que seulement certains génotypes paraissent posséder la capacité d'induire une embryogenèse somatique. Cette capacité, chez beaucoup d'espèces semble être génotypiquement contrôlée (George et Sherrington, 1984 ; Brown, 1988 ; Dodeman et al., 1997). Un tel contrôle de la régénération (par la voie de l'embryogenèse somatique ou de la caulogenèse) a été rapporté chez les Légumineuses fourragères et spécialement chez la luzerne par Brown et Atanasov (1985) ; Trifolium repens par Parrot (1991) et bien d'autres espèces. Bencheikh et Gallais (1996) indiquent la présence de quelques gènes majors pouvant contrôler l'embryogenèse somatique chez le pois. De même Bingham et al (1975) ont réussi à augmenter considérablement la fréquence embryogène chez Medicago sativa après deux étapes de sélection récurrente. Reisch et Bingham, (1980) trouvent chez un génotype de luzerne diploïde que la différenciation de bourgeons à partir de cal est contrôlée par deux gènes dominants désignés Rn1 et Rn2 dont la présence simultanée permet un taux élevé de régénération (plus de 75 % des explants) . L'hétérogénéité existante chez les Légumineuses fourragères, permet d'expliquer la facilité à identifier les génotypes favorables à la régénération. II.7.3- Influence du milieu de culture : Avec le développement des cultures de tissus, divers milieux de base comprenant des sels inorganiques, des composés organiques (sucres, vitamines et régulateurs de croissances) ont été progressivement utilisés. Certains milieux proposés dans un but donné sont en fait utilisables d'une manière beaucoup plus étendue. Les milieux de culture sélectionnés doivent être le plus parfaitement adaptés aux besoins nutritifs de la plante soumise à l'étude afin de laisser s'exprimer pleinement son potentiel génétique. Les principaux constituants d'un milieu de culture sont généralement représentés par les macro et les micro-éléments, une source carbonée et azotée, des vitamines et des régulateurs de croissance. Selon Evans et al, (1981), dans 70% des cas, des milieux de culture de base de type Murashige et Skoog (MS) ont été utilisés. Le milieu MS a été employé d'une manière générale pour tous les types de cultures in vitro. Mais c'est essentiellement pour le déclenchement de 36 CHAPITRE II GENERALITES SUR LA CULTURE IN VITRO l’organogenèse, en particulier pour la néoformation de bourgeons qu’il s'est révélé nettement supérieur à d'autres milieux (Margara, 1989). Le milieu de Murashige et Skoog est caractérisé principalement par une très forte teneur en sels minéraux, en particulier en potassium et par une concentration également élevée en azote (sous forme de nitrate et d’ammonium) dont 1/3 apporté sous forme réduite (ionsNH4+); le rapport nitrate / ammonium, dans ce milieu est très favorable à l'induction de l'embryogenèse somatique, en particulier chez Feijoa sellowiana (Delvesco et Guerra, 2001). II.7.4- Les régulateurs de croissance : Un régulateur de croissance est défini comme étant, une substance qui, suivant sa concentration absolue ou relative dans le milieu, peut supprimer, permettre ou modifier sous certaines conditions les processus de cytodifférenciation (Street, 1977). Aucun régulateur de croissance ne provoque une initiation directe du phénomène d'organogenèse ou d'embryogenèse somatique, mais il interfère dans de nombreux métabolismes internes de la cellule végétale. L'organogenèse est fortement influencée par les régulateurs de croissance. Les deux hormones, les plus souvent utilisés, d'une manière conjointe ou séquentielle, sont les auxines et les cytokinines. Nitsh et Nougarede, (1967) ont montré que des explants de parenchyme médullaire de tabac cultivés in vitro dans un milieu ne contenant ni auxine, ni cytokinine ne prolifèrent pas. Il en était de même lorsque seulement une auxine ou une cytokinine était incorporée au milieu. Par contre, la prolifération cellulaire se déclenchait lorsque ces deux substances sont présentes dans le même milieu de culture. Le rapport hormonal (auxine/cytokinine) conditionne, en grande partie, le type de néoformation obtenu. Ce rapport a conduit, dans le cas de la culture in vitro du parenchyme médullaire de tabac, par exemple, à l'orientation des tissus, soit vers la caulogenèse, soit vers la rhizogenèse (Skoog et Miller, 1957). Ainsi la néoformation de bourgeons est souvent favorisée par des teneurs élevées en cytokinine (Frett, 1977; Walker et al., 1979; Margara, 1989; Abrie et Stadn, 2001; Compton et al., 2001; Tang et Guo, 2001 ) alors que les fortes doses en auxines stimulent la formation de racines et améliorent leurs qualités (Druart, 1992 ; Hobbie, 1998; Abrie et Stadn, 2001; Compton et al., 2001). L'influence de ce rapport hormonal n'est, cependant, pas une règle générale pour toutes les espèces végétales. En effet, il suffit, dans certains cas, d'ajouter au milieu de culture l'un ou l'autre des deux régulateurs précités pour parvenir à une réponse morphogénétique (Seon et al., 1998). Dans ce cas précis, nous pouvons citer deux exemples : le premier, concerne le Triticale où l'organogenèse a été obtenue en se servant uniquement d'auxine (milieu dépourvu 37 CHAPITRE II GENERALITES SUR LA CULTURE IN VITRO de cytokinine) (Vikrant et Rashid, 2001) ; le second, touche l'espèce Piper barberi gamble où l'équipe d'Anand et Rao, (2000) a obtenu des bourgeons néoformés en utilisant des cytokinines seules dans le milieu d'induction Par ailleurs, il est important de dire, en se basant sur la diversité des réponses obtenues dans ce domaine, qu'il n'existe pas de règle générale, concernant l'efficacité des différentes auxines et cytokinines sur la caulogenèse ou sur la rhizogenèse. Les effets paraissent varier essentiellement avec le matériel végétal employé. Tout comme à l'organogenèse, les régulateurs de croissance de type auxine et cytokinine sont aussi indispensables à l'embryogenèse somatique. La production d'embryons somatique est généralement obtenue en deux phases de culture, sur des milieux qui différent essentiellement par leurs concentrations en régulateurs de croissance (Auge et al., 1989). Par exemple, chez la carotte ou la luzerne, les embryons sont obtenus en deux phases: Une phase dite d'induction réalisée sur un milieu souvent riche en régulateurs de croissance en particulier en auxines permet la formation et / ou la prolifération des cellules embryogènes. Ces cellules n'évolueront en embryons qu'au cours d'une deuxième phase dite de développement qui se réalise au moyen d'un transfert de tissus induits, sur un nouveau milieu moins riche, voir dépourvu de régulateurs de croissance essentiellement en auxines (Saadi, 1991 ; Giorgetti et al.,1995). Cette façon de faire ou plutôt ce schéma de transfert a été appliqué avec succès dans de nombreux travaux de recherche portant sur l'obtention de l'embryogenèse somatique. Nous citons, à titre d'exemple, les travaux réalisés à partir d'embryons immatures de graminées (Jullien, 1991), de pois (Saadi, 1991), de coconut (Nair et al., 1999), de Pinus sylvestris (Haggman et al., 1999), d'Arabidopsis thaliana (Gaj, 2001), de boutons floraux du bananier (Escalant et al., 1994), d'hypocotyles du tournesol (Laparra et al., 1997), des feuilles du Santalum album et Santalum spicatum (Rugkhla et Jones, 1998) etc... Le transfert des tissus d'un milieu riche en auxine vers un milieu pauvre n'est pas toujours indispensable pour le déroulement des différentes phases annoncées précédemment. L'exemple des travaux de Maheswaren et Williams (1984), portant sur l'embryogenèse du trèfle et la luzerne, est très significatif puisque ces auteurs ont réussi à obtenir, des embryons somatiques, directement sur les explants d'embryons immatures cultivés sur un milieu riche en cytokinines et totalement dépourvu d'auxines. C'est l'exemple aussi des travaux de Kristen et al (2000), réalisés sur les explants de pétioles d’Echinecea purpurea L. Par contre d'autres cultures exigent en phase inductive, la présence conjointe d'une auxine et d'une cytokinine, 38 CHAPITRE II GENERALITES SUR LA CULTURE IN VITRO c'est le cas de la luzerne (Jullien, 1991), du papayer (Monmarson et al., 1994), du cocotier (Serge, 1998) et bien d'autres espèces. Les auxines les plus souvent utilisées en embryogenèse somatique sont le 2,4-D, l'AIA, l'AIB et l'ANA. A cause de son bon pouvoir inducteur, le 2,4 -D semble détenir, d'après Evans et al, (1981), le record d'utilisation dans les études portant sur l'embryogenèse somatique (puisque 57 % des travaux de recherche l'utilisent comme régulateur). Quand aux cytokinines, elles sont représentées par la Kinétine, la benzyladenine (BA), la 2isopentenyladénine et la zéatine. Outre, les auxines et les cytokinines, d'autres régulateurs de croissance peuvent intervenir dans le processus d'embryogenèse somatique tels que les gibbérellines et l'acide abscissique (ABA) ; cependant, leur utilisation reste limitée. Les gibbérellines, selon Jayasree et al, (2001), stimulent fortement la production de bougeons néoformés chez la pomme de terre lorsqu'elles sont combinées aux cytokinines. Par contre, d'après Margara (1989), les gibbérellines ont la réputation d'inhiber l'organogenèse et particulièrement la rhizogenèse chez le Chou-fleur. L’acide abscissique (ABA) quant à lui, est employé par certains auteurs dans le but de corriger ou d'améliorer la qualité morphologique des embryons (Unnikrishan et al., 1990 ; Dodeman et al., 1997). Son usage peut inhiber, en même temps, le déclenchement éventuel d'une embryogenèse secondaire et empêcher la germination précoce des embryons somatiques (Milena et al., 1998 ; Svobodova et al., 1999). II.7.5- Influence de la source carbonée : Les tissus en cultures in vitro sont largement hétérotrophes vis à vis du carbone en raison de l'absence ou de l'insuffisance de l'assimilation chlorophyllienne. Il est donc indispensable d'ajouter une source carbonée (des glucides) au milieu de culture. Les glucides remplissent deux fonctions principales dans les milieux de culture ; ils fournissent de l'énergie nécessaire pour la croissance des tissus et maintiennent une pression osmotique donnée du milieu de culture (Zryd, 1988). Cette pression osmotique, appelée aussi « effet osmoticum », peut avoir diverses actions sur les tissus. Elle agit, dans certains cas, sur l'orientation ou l'expression morphogénétique des tissus (Belaizi et Boxus, 1995 ; Charniere et al., 1999), dans d'autres, sur la maturation des embryons somatiques produits (Walker et Parrot, 2001). Les glucides, les plus généralement utilisés sont le saccharose et le glucose (Margara, 1989 ; Druart et Samyn, 1995). Selon certains auteurs, le maltose peut constituer une bonne source carbonée puisqu'il permet, dans certains travaux portant sur l'embryogenèse, d'améliorer à la fois, et la qualité et la quantité des embryons somatiques produits (Saadi, 1991). 39 CHAPITRE II GENERALITES SUR LA CULTURE IN VITRO L'embryogenèse somatique ne semble pas être influencée uniquement par la nature des sucres mais aussi, et pour un même sucre, par sa concentration dans le milieu de culture. Généralement, selon Piatti, (1988), les doses employées oscillent entre 2 et 12 %. L'effet dose peut avoir une grande influence sur le devenir morphogénétique des cultures. Dans ce cas, l'exemple du tournesol est très significatif, l'usage d'une concentration de 12% en saccharose peut orienter le processus vers la voie de l'embryogenèse somatique, alors qu'une concentration de 3 % conduirait vers la néoformation de bourgeons (Charniere, 1999). 40 CHAPITRE III GENERALITES SUR L’EMBRYOGENESE SOMATIQUE III.1- Introduction : L’embryogenèse somatique est potentiellement la méthode de régénération la plus performante pour la propagation clonale du fait de son taux de multiplication élevé. L’intérêt de cette technologie pour l’amélioration génétique est indéniable. La cryoconservation des cultures embryogènes (dans l’azote liquide à –196°C) laisse entrevoir la possibilité de disposer à volonté de matériel juvénile et la conservation des ressources génétiques. L’embryogenèse somatique représente aussi un outil de développement en foresterie. De fait, cette technologie est déjà utilisée à l’échelle industrielle pour les épicéas et différents pins au Canada, aux USA et en Nouvelle Zélande (Laurence et al., 2006). III.2- Présentation de l’embryogenèse somatique : L’embryogenèse somatique est une particularité des végétaux. C’est le processus par lequel des cellules somatiques, non-gamétiques, produisent des embryons normaux du point de vue morphologique et du développement. Dans ce cas, une cellule diploïde se dédifférencie de sorte que, mise dans un milieu adéquat, elle se développe en un embryon qui donne, par la suite, une plante entière. La production d’embryons somatiques a été décrite pour la première fois chez la carotte en 1958 (Steward et al., 1958) (Figure 1). Les explants (morceaux de la plante d’origine) sont cultivés dans un milieu riche en auxine. Les cellules de l’explant se dédifférencient et se divisent, elles deviennent compétentes pour initier un programme embryogène, mais ce n’est que lorsqu’elles sont mises en culture dans un milieu sans auxine que le développement des embryons somatiques a lieu. Depuis, des embryons somatiques ont été obtenus chez différentes plantes en utilisant des techniques très variées et à partir de différents explants : microspores, protoplastes, embryons immatures, explants tissulaires et cellules en culture in vitro (Van Englen et De Vries, 1992 ; De Jong et al., 1993 ; Zimmerman, 1993 ; Mordhorst et al., 1997). L'embryogenèse somatique est une technique qui s'adapte bien à la production industrielle. Les embryons somatiques peuvent être initiés dans des bioréacteurs, afin de produire des semences artificielles en les encapsulant dans un gel nutritif, ou pour la synthèse de métabolites secondaires utilisés dans des médicaments, colorants, etc. 41 CHAPITRE III GENERALITES SUR L’EMBRYOGENESE SOMATIQUE Figure 5 : Embryogenèse somatique et zygotique chez la carotte (Steward et al., 1958). De toutes les techniques de culture in vitro, l’embryogénèse somatique conduit sans aucun doute au taux de multiplication le plus élevé. D'autre part, l'embryon somatique est une structure bipolaire qui développe simultanément un pôle racinaire et un pôle caulinaire opposés. Ainsi, par rapport à l'enracinement de bourgeons (axillaire ou adventif) l'obtention de plants par embryogenèse somatique est plus rapide puisqu'il n'existe pas d'étape d'enracinement proprement dite. Habituellement, l'embryon s'édifie à partir d'une cellule initiale, le zygote, formé lors de la reproduction sexuée (embryon zygotique). Cependant, d'autres types d’embryons peuvent également se développer à partir de cellules du sporophyte ou du gamétophyte, embryons qui ne sont pas le produit d'une fusion gamétique et qui sont appelés « embryons somatiques ». Parfois, chez certaines espèces, ils résultent d'une embryogenèse somatique naturelle qualifiée d’embryogenèse adventive spontanée. Dans certains cas en effet, les anthérozoïdes, l’oosphère, voire d'autres cellules gamétophytiques peuvent engendrer des embryons parthénogénétiques. Dans d'autres cas, certaines cellules sporophytiques localisées au niveau des tissus intra-ovulaire, en particulier le nucelle, fournissent naturellement des 42 CHAPITRE III GENERALITES SUR L’EMBRYOGENESE SOMATIQUE embryons appelés « embryons nucellaires ». Ce type d'embryogenèse est très développé dans la famille des Rutacées, spécialement chez les Citrus (Tisserat et al., 1979 ; Vardi et al., 1990) Toutefois, cette appellation est essentiellement appliquée, selon certains auteurs comme Piatti, (1988) et Margara, (1989), aux embryons obtenus à partir de culture de tissus in-vitro du sporophyte . III.3- Analyse de l’embryogenèse somatique par la génomique : Différentes études menées sur des embryons somatiques ont permis d’identifier divers gènes participant à l’embryogenèse somatique. Ainsi, Thibaud-Nissen (Thibaud-Nissen et al., 2003) ont mis en évidence une activation des gènes de détoxification, de défense ou de maintien du statut redox chez le soja. Ceci suggère la possibilité d’un « burst » oxydatif en réponse au 2,4-D cela avait été décrit par Pfeiffer (Pfeiffer et Hoftberger, 2001). L’équipe de Vries a mis en évidence par « Differential Display » l’existence d’un gène codant pour un récepteur kinase avec des motifs LRR (Schmidt et al., 1997). Ce gène est exprimé par les cellules de carotte ayant acquis la compétence embryogène, il a été appelé SERK (Somatic Embryogenesis Receptor Kinase). Chez Arabidopsis AtSERK1 marque les cellules compétentes pour produire des embryons et il interviendrait dans l’acquisition de la compétence embryogène (Hecht et al., 2001). L’expression de SERK est transitoire pendant l’embryogenèse somatique et zygotique, il s’exprime jusqu’au stade cœur. AtSERK1 s’exprime aussi avant la fécondation de façon polaire dans l’ovule en développement puis dans tout le gamétophyte femelle. Son expression persiste dans l’oosphère et dans les synergides jusqu’à la fécondation, puis dans toutes les cellules de l’embryon et du suspenseur jusqu’au stade cœur. La surexpression d’AtSERK1 induit une augmentation de la compétence à former des embryons somatiques. En 1998, Jung et al décrivent le clonage par « differential display » de deux gènes différentiellement exprimés dans des cultures embryogènes de riz. Le premier de ces gènes, REC1 ne présente pas d’homologie avec des gènes connus alors que le deuxième, REC2, est similaire à une protéine nickel-cobalt résistante. Le rôle de cette protéine au cours de l’embryogenèse somatique reste à déterminer, mais elle pourrait participer au contrôle du niveau de production d’éthylène. III.4- Les molécules signal participant au développement des embryons somatiques : L’embryogenèse somatique a permis d’étudier le rôle de l’auxine au cours de l’embryogenèse. L’induction de l’embryogenèse somatique nécessite la présence d’auxine dans le milieu de culture, mais son développement se fait dans un milieu sans hormone. 43 CHAPITRE III GENERALITES SUR L’EMBRYOGENESE SOMATIQUE L’utilisation d’inhibiteurs du transport polaire d’auxine bloque le développement de l’embryon somatique alors que ce traitement a un effet moindre sur les embryons zygotiques (Liu et al., 1993), ce qui suggère l’existence chez ces derniers de deux mécanismes régulant la morphogenèse, un intrinsèque à l’embryon et un maternel (Zimmerman, 1993). En 1992, De Jong a montré que le développement embryonnaire de cellules de carotte ts11 sensibles à la température reprend grâce à une endochitinase (De Jong et al., 1992), et que les facteurs Nod, molécules bactériennes contenant de la chitine, lèvent aussi cette inhibition (De Jong et al., 1993). Ainsi, l’endochitinase serait nécessaire à la production de molécules similaires aux facteurs Nod à partir d’un substrat de plante jouant un rôle lors de l’embryogenèse somatique. L’embryogenèse somatique nécessiterait aussi la présence de certaines protéines qui seraient des composés de la paroi cellulaire et qui contrôleraient l’extension de la paroi (Van Englen et de Vries, 1992 ; van Engelen et al., 1993). III.5- Le contrôle hormonal de l’embryogenèse : Lors du développement embryonnaire chez les plantes, il n’y a pas de phénomènes de migration cellulaire, ainsi le développement est dépendant de la position des cellules. Les molécules signal qui agissent à courte et à longue distance sont donc potentiellement importantes pour l’organisation de l’embryon. III.5.1- Rôle de l’auxine : L'identification de mutants affectés pour le transport de l'auxine montre que cette hormone joue un rôle essentiel au cours de l’embryogenèse. Elle pourrait jouer un rôle majeur dans la coordination du patron embryonnaire à partir du stade globulaire. Le transport de l'auxine pendant l'embryogenèse précoce est organisée en deux vagues. L'auxine est d'abord transportée vers le pole apical (Friml et al., 2003). Ce transport se ferait par le biais de PIN7, une protéine localisée dans les membranes apicales de la cellule basale et de ses cellules filles, et participerait au complexe à « efflux » de l'auxine. Par la suite, au stade globulaire, le transport de l'auxine se fait vers la partie basale de l'embryon, ce qui marque la formation de l'axe embryonnaire. Puis, le passage de la symétrie radiale à la bilatérale traduit une redistribution de cette hormone associée avec la mise en place d’un transport actif dirigé de la partie basale vers le méristème apical (Liu et al., 1993). Du point de vue génétique, Pin1 code pour une protéine de transport putative appartenant au complexe « efflux carrier » (Galweiler et al., 1998). Son expression devient polarisée vers la moitié du stade globulaire avant que les cotylédons ne commencent à se développer : lors du passage 16-32 cellules, il est exprimé par les cellules internes de la partie centrale de l’embryon. La protéine PIN1 s’accumule dans les membranes basales induisant une polarité apico-basale. Pinoid code pour une serine-thréonine 44 CHAPITRE III GENERALITES SUR L’EMBRYOGENESE SOMATIQUE kinase (Christensen et al., 2000). Son expression débute au stade globulaire et il régulerait négativement le signal auxinique. Le phénotype des mutants pinoid, pin-formed et monopteros, caractérisé par des malformations des cotylédons ou leur fusion, témoigne du rôle joué par l’auxine lors de la transition de symétrie radiale à bilatérale. Ces gènes seraient nécessaires pour le transport correct et la localisation coordonnée de l’auxine. Ainsi, l’auxine pourrait agir comme un messager intercellulaire dans les processus d’établissement du patron morphologique et son rôle dans le signalement de longue distance intègrerait aussi la morphogenèse. III.5.2- Rôle des cytokinines : Le rôle des cytokinines au cours de l’embryogenèse précoce reste à déterminer. Un mutant présentant un niveau élevé de cytokinines, amp1 est affecté dans la photomorphogenèse et le moment de floraison. De plus, les plantules présentent un plus grand nombre de cotylédons (Jurgens et al., 1991 ; Chaudhury et al., 1993). Ainsi, un changement local de la balance auxine/cytokinines influe sur la formation des primordia cotylédonaires en bonne quantité et orientation dans l’embryon globulaire tardif. De par leur fonction, les cytokinines devraient être aussi impliquées au cours de l’embryogenèse précoce. Cependant, à ce jour, aucune implication claire n’a été mise en évidence. Cette absence de données signale une fois de plus le manque d’information concernant les premières étapes du développement embryonnaire. III.6 - Origine et développement des embryons somatiques : Les donnés cytologiques montrent que les embryons somatiques ont pour origine des cellules particulières dites embryogènes. Elles présentent des caractères de cellules méristèmatiques primaires: petites tailles, cytoplasme dense, gros noyaux aux nucléoles proéminents et petites vacuoles. Elles fixent de manière intense les colorants ce qui les rend aisément repérables en cytologie (Jullien, 1991 ; Loiseau et al .,1998 ; Vaslenko et al, 2000). Sharp et al (1980) in Piatti (1988) décrivent deux voies pour l'embryogenèse somatique: La première dite est l'embryogenèse somatique directe où les embryons sont initiés à partir de tissus en absence de prolifération de cal. Ceci se produit à partir des cellules préembryogéniques déterminées (P.E.D.C) ou bien les cellules sont déjà engagées dans un développement embryogène et elles ont besoin seulement d'être libérées (Piatti, 1988 ; Rouget, 1989). Elles semblent préexister dans les tissus de certains explants comme les embryons immatures ou les fragments de très jeunes plantes (Saadi, 1991). Dans le cas de cette embryogenèse somatique (qui se reproduit rarement), les embryons apparaissent sur la 45 CHAPITRE III GENERALITES SUR L’EMBRYOGENESE SOMATIQUE surface des explants. Le processus commence tout d'abord par l'apparition de petits gonflements, au niveau de l'épiderme des explants, qui évoluent en petites structures de forme sphérique et à aspect lisse verdâtre. Ces structures traversent, par la suite, les mêmes stades de développement morphologique que traversent habituellement les embryons zygotiques. La seconde dite est l'embryogenèse somatique indirecte, pour la quelle une prolifération cellulaire est requise. Les travaux de Sharp (1980) et d'Evans (1981) in Piatti (1988) ont également pu servir à mettre en évidence, l'existence de cellules initiatrices qui sont déjà différenciées mais dépourvues de capacité embryogènes. Ils les nomment des cellules pré-embryogènes indéterminées (PEIC). Les cellules embryogènes apparaissent tardivement au sein du cal produit par la réactivation mitotique des cellules différenciées et/ ou la prolifération des cambiums obtenus à partir d'explants de type racines, tige ou de feuille (Jullien, 1991 ; Rugkhla & Jones, 1998). Leurs multiplications aboutissent à la formation de groupes de cellules embryogènes "nodules méristèmatiques" dispersés, parmi les autres cellules du cal et qui sont généralement de type parenchymateux. A la suite de leur repiquage sur des milieux dépourvus d'auxines, ces nodules évoluent en des embryons somatiques comme c'est le cas chez la carotte (Saadi, 1991). Les embryons somatiques connaissent les mêmes stades de développement morphologiques que traversent habituellement les embryons zygotiques à savoir : stade globulaire, cordiforme, torpille et cotylédonaire (Egertsdotter et Arnold, 1998). Ils ont une structure chromosomique souvent semblable à celle de la plante- mère dont ils sont issus (Ranchi, 1995). Le critère qui permet de reconnaître un embryon somatique est certainement sa structure bipolaire, qui développe précocement et simultanément un méristème caulinaire et un méristème racinaire (Norrel, 1973 ; Ranchi, 1990). Généralement les embryons somatiques produits présentent souvent des malformations morphologiques (embryons monocotylé, tricotylé, en forme de bouteille.....etc.). On enregistre cependant, un faible taux d'embryons somatiques à morphologie normale. III.7- Différences entre l’embryogenèse somatique et l’embryogenèse zygotique : Quelques différences existent entre l’embryogenèse somatique et l’embryogenèse zygotique. Cette dernière débute toujours à partir d’une seule cellule, le zygote, qui se forme à la suite de la fécondation, alors que l’embryogenèse somatique peut être indirecte, c’est à dire d’origine multicellulaire, ou directe lorsqu’elle dérive d’une seule cellule (Williams et Maheswaran, 1986). Une autre différence concerne le suspenseur qui peut soit ne pas se former lors de l’embryogenèse somatique ou bien avoir une morphologie très différente (Yeung et Meinke, 1993). 46 CHAPITRE III GENERALITES SUR L’EMBRYOGENESE SOMATIQUE Pour finir, les embryons somatiques ne rentrent pas en dormance. En revanche, l’expression des gènes semble être similaire chez les deux types d’embryons (Perez-Grau et Goldberg, 1989 ; De Jong et al., 1993). III.8- Intérêt de l'embryogenèse somatique : L’embryogenèse somatique est un bon modèle d’étude du développement embryonnaire : Aujourd’hui, l’embryogenèse somatique est reconnue comme modèle d’étude de l’embryogenèse. Ce système permet d’étudier le développement embryonnaire sans l’influence maternelle. Ce dernier intérêt est d’autant plus important que, dans ce cas, les embryons se développent libres, ils ne sont pas entourés par les tissus maternels, leur étude est donc aisée et l’obtention de matériel est facilitée. Elle présente aussi un grand intérêt en tant que modèle in vitro pour l’analyse de la régulation de gènes essentiels pour l’embryogenèse ainsi que pour la validation de résultats. L’embryogenèse chez les dicotylédones débute par une division asymétrique qui est à l’origine du suspenseur et de l’embryon. Les méthodes classiques de mutagenèse mises en œuvre pour élucider les mécanismes de ce processus développemental ne sont pas adaptées pour mettre en évidence les mécanismes d’acquisition de la polarité embryonnaire à l’origine de cette division asymétrique. L’embryogenèse somatique est reconnue comme un modèle d’étude de l’embryogenèse zygotique chez les végétaux supérieurs. Notamment, le modèle d’embryogenèse somatique in vitro du tournesol. Dans ce modèle, un protoplaste de tournesol mis en culture enrobé dans une matrice d’agarose (condition embryogène) se divise asymétriquement donnant une structure appelée embryoïde alors que lorsqu’il est mis en culture en milieu liquide (condition non-embryogène), il se divise de façon symétrique pour donner un tissu somatique (Tamborindeguy, 2004). L’embryogenèse somatique des plantes est un outil biotechnologique utilisé à différentes fins : Elle constitue tout d’abord un outil de recherche. Intégrée aux programmes d’amélioration (figure 6), elle permet d’étudier les mécanismes qui régissent, entre autres, les phénomènes de dédifférenciation cellulaire, de programme ontogénétique permettant d’accréditer le concept de totipotence cellulaire. Par ailleurs, disposer d’un système fiable et efficace de régénération, c’est-à-dire reproductible et performant par le nombre de plants régénérés, est un pré-requis aux études de la fonctionnalité de gènes via la transformation génétique. 47 CHAPITRE III GENERALITES SUR L’EMBRYOGENESE SOMATIQUE Comparativement aux autres voies de multiplication végétative in vitro, l'embryogenèse somatique se montre plus séduisante en terme de performance et d'efficacité (Harkman et Arnold, 1985 ; Piatti, 1988). En effet, la maîtrise de la production d'embryons, chez certaines espèces, via les suspensions cellulaires permet d'obtenir des milliers d'embryons par litre de milieu de culture et par conséquent la régénération de milliers de plants. L'embryogenèse somatique permet aussi en un temps très court de produire des plantes entières sans passer par les contraintes que connaît habituellement l'organogenèse (phase de caulogenèse et de rhizogenèse) (Daikh et Demarly, 1987 ; Rouget, 1989). L’embryogenèse somatique est actuellement intégrée dans de nombreux schémas de sélection puisqu'elle permet de diminuer sensiblement la longueur des cycles d'amélioration comme par exemple, le temps nécessaire à la valorisation du matériel sélectionné âgé ou juvénile ou la production de parents hybrides nécessaires à la diffusion de nouvelles variétés (Demarly et Sibi, 1989 ; Demarly, 1994 ; Stanantino et al., 1998 ; Tremblay et al., 1999). De telles applications ont été réalisées chez plusieurs espèces comme la carotte (Toute, 1998), la luzerne (Redenbough et al., 1986 ; Fujii et al., 1987 ; Stuart et al., 1987 ; Ray et Bingham, 1989), Asparagus officinalis (Mamiya et Sakamot, 2001), le palmier dattier (Ferry et al., 1998). 48 CHAPITRE III GENERALITES SUR L’EMBRYOGENESE SOMATIQUE Figure 6 : Embryogenèse somatique : intégration dans un programme d’amélioration, pour la fabrication de variétés multi clonales et la diffusion de plants améliorés (Lelu et Thompson, 2007) : Population d’Amélioration Matériel sélectionné Phase de sélection Masses embryogènes Plants acclimatés Pépinière Tests comparatifs Tests Clonaux Clones sélectionnés Masses embryogènes congelées Pieds mères de bouture Production pilote de plants Multiplication végétative horticole Phase de diffusion de plants améliorés Plantations 49 CHAPITRE III GENERALITES SUR L’EMBRYOGENESE SOMATIQUE III.9- Les principaux stades de L’embryogenèse somatique : L’embryogenèse somatique comporte quatre stades principaux (Laurence et al., 2006): III.9.1- Initiation et prolifération du tissu embryogéniques : L’embryogenèse somatique débute avec un embryon de plante que l’on a retiré d’un grain, ou par un explant. L’embryon, ou l’explant, est placé dans une boîte de Pétri contenant un milieu d’initiation, c’est-à-dire un milieu contenant les éléments nutritifs dont l’embryon ou l’explant a besoin pour commencer à se développer. Au bout de quelques « semaines », une partie du tissu végétal produit se transforme en tissu embryogénique présentant un aspect blanc, duveteux et translucide unique en son genre. Il s’agit du stade d’initiation de l’embryogenèse somatique. Le tissu embryogénique continue à proliférer tant qu’il est maintenu dans ce milieu d’initiation. Pendant la phase de prolifération, il est possible de le cryoconserver dans l’azote liquide afin de l’utiliser plus tard pour relancer le processus d’embryogenèse. III.9.2- Maturation des embryons somatiques : Dès que la quantité de tissu embryogénique est suffisante, la prolifération est interrompue pour permettre la maturation des embryons somatiques. Des amas de tissus sont alors transférés dans un milieu de maturation contenant un régulateur de croissance des plantes qui favorise la maturation des embryons somatiques. Au bout de quelques « semaines », des embryons somatiques matures, ressemblant aux embryons que l’on trouve dans les graines, commencent à apparaître sur les amas. III.9.3- Germination des embryons somatiques : Les embryons somatiques matures sont extraits des amas de tissu et placés dans un milieu de germination contenant un mélange des éléments nutritifs nécessaires aux premiers stades de développement de la plante. Les embryons somatiques germent et forment des racines et des pousses, tout comme les plantes germant à partir de graines. Les plantes propagées par embryogenèse somatique sont souvent appelées « plantules somatiques », « semis somatiques » ou « plantules dérivées d’embryons somatiques ». III.9.4- Culture en serre et transplantation sur le terrain : Lorsque les plantules cultivées ont atteint une taille suffisante et forme des racines, elles sont mises en terre pour favoriser leur croissance et assurer leur acclimatation. Après une période normale de culture en serre, les plantules sont transplantées sur le terrain. 50 CHAPITRE IV MATERIEL ET METHODES IV.1- Objectif recherché : L'objectif essentiel visé par ce travail consiste à essayer de régénérer in vitro des plantes entières de tomate via l'embryogenèse somatique et l’organogenèse. Pour parvenir à cela, nous avons testé trois principaux facteurs susceptibles d'influencer la régénération qui sont le milieu de culture, la nature de l'explant et le génotype. L’embryogenèse somatique une des plus remarquable technique qu'offrent les cultures in vitro et la biotechnologie en général permet d'obtenir des individus semblables et génétiquement "conformes" aux plantes d'origine, devrait fournir un moyen efficace pour multiplier par exemple des individus hybrides très performants à des fin de production commerciale. En effet partant d'un fragment de végétal, placé en conditions aseptique, la plante mère peut être multipliée en un temps très court, en plusieurs millions d'exemplaires et cela à l'infini. Il s'agit là probablement d'un objectif lointain dont l'intérêt technico-économique doit être soumis à évaluation. Le présent travail représente un prélude pour l'amélioration génétique de la tomate. Cette tentative s'appuyait sur les résultats déjà obtenus avec les autres plantes. Les voies à explorer sons l’embryogenèse somatique directe (formation d’embryons somatiques) sans passage par une phase de callogenèse et l’organogenèse directe. La démarche scientifique suivie pour essayer d'atteindre les objectifs que nous étions fixés consiste à tester trois principaux paramètres pouvant influencer ce processus. Il s'agit d'abord de la nature de l'explant, puis l'effet génotypique et aussi la nature du milieu (régulateurs de croissance). IV.2- Première expérience : essai préliminaire Nous étions amené donc à nous inspirer, dans une première série d'expérience, que nous avons qualifiée de préliminaire, d'un certains nombre de travaux réussis portant sur l'embryogenèse somatique de plusieurs espèces appartenant à la famille des Solanacées en vue d'établir un protocole expérimental susceptible de nous conduire à résoudre notre problématique. Cette problématique qui se résume en fait à essayer d'obtenir des embryons somatiques et par la même, réussir dans la mesure de possible, à régénérer des plantes entières via cette méthode de micropropagation. 51 CHAPITRE IV MATERIEL ET METHODES IV.2.1- Matériel végétal : Le matériel végétal qui a fait l’objet de cette étude est issu de quatre variétés de tomate (Solanum lycopersicum L. ou Lycopersicon lycopersicum L.) (Tableau 7). Tableau 7: Variétés testées Variétés Abréviations Rio Grande RG Heinz 1350 HZ 1350 Top 48 (hybride) TOP48 Agora (hybride) AGO IV.2.2- Méthodes : IV.2.2.1- Désinfection des graines : Les graines ont été lavées avec de l’eau contenant quelques gouttes d’agent mouillant pendant 3 minutes puis rincées avec l’eau du robinet pendant 30 min avant la désinfection. Celle-ci consiste en une immersion dans l’éthanol à 70° pendant 2 secondes puis dans une solution d’hypochlorite de sodium (1 à 2%) pendant 15 à 20 minutes. Cette dernière immersion est suivie de plusieurs rinçages à l’eau distillée stérile pendant 10 min chacun. IV.2.2.2- Germination des graines : Les graines sont mises à germer dans des boites de pétri contenant 25 ml de milieu de Murashige et Skoog (1962) à raison de 10 graines par boite pour produire des plantules d’où proviendront les explants. Les différents explants utilisés proviennent de plantules de 15 jours. IV.2.2.3- Choix du milieu de culture : Un milieu de culture est une solution aqueuse comprenant des sels minéraux, des éléments organiques et éventuellement des phytohormones ou régulateurs de croissance. Le milieu de culture le plus utilisé est sans doute celui de Murashige et Skoog (1962) enrichi des hormones de croissance. Le milieu de base MS est additionné de 10 g d’agar, 30 g de saccharose. L’autoclavage des milieux a lieu à 115 °C pendant 30 min sous une pression de 1,6 kg.cm-2 après ajustement du pH à 5,7. 52 CHAPITRE IV MATERIEL ET METHODES IV.2.2.4- Mise en culture : Les explants de cotylédons et d’hypocotyles ont été introduits dans des boites de Pétri renfermant les milieux d’initiation de l’ESD qui contient les éléments de Murashige et Skoog (1962) enrichis de régulateurs de croissance : auxines (2,4 D et ANA) (Tableau 8). Le 2,4D est choisie pour son aptitude à stimuler l'embryogenèse somatique. Un bon nombre d'auteurs parlent de l'importance de l'utilisation des auxines seules (en particulier celui du 2,4-D), à l'obtention des embryons somatiques chez plusieurs espèces comme le Castanea sativa (Piagnani et Eccher., 1990); le pois (Saadi, 1991); le sorgho (Patil et Kuruvinashetti, 1998); le Pinus sylvestris (Haggman et al., 1999) et le coton (Zhang et al., 2001). Une fois la mise en culture terminée les boites de Pétri sont scellées avec du papier film. Chaque boite porte des indications relatives à la date de la mise en culture, le nom de la variété introduite, la nature de l’explant et le milieu de culture. Le repiquage des explants à lieu un mois après la mise en culture. Il peut être précoce si le milieu de culture est envahi par des composés phénoliques. Chaque repiquage dure environ un mois. Toutes les cultures ont été placées dans une salle à une température de 26 ± 1 °C, une photopériode de 16 h d’éclairement. Tableau 8 : Différentes concentrations d’hormones testées : Milieu I : MS additionné de différentes concentrations de 2,4 D et milieu II : MS additionné de différentes concentrations d’ANA. Hormones Milieux ANA mg/l 2,4 D mg/l I1 0 0,2 I2 0 0,5 I3 0 1 I4 0 2 II1 0,2 0 II2 0,5 0 II3 1 0 II4 2 0 53 CHAPITRE IV MATERIEL ET METHODES IV.2.2.5- Dispositif de l’essai (tableau 9) : Explants C1 C2 H1 H2 H3 Milieux Total explants I1 4 4 4 4 4 20 I2 4 4 4 4 4 20 I3 4 4 4 4 4 20 I4 4 4 4 4 4 20 II1 4 4 4 4 4 20 II2 4 4 4 4 4 20 II3 4 4 4 4 4 20 II4 4 4 4 4 4 20 Total explants 32 32 32 32 32 160 C : cotylédon et H : hypocotyle Le nombre total des explants de l’expérimentation pour les quatre variétés testées est de 160 explants. IV.2.2.6- Méthode d’évaluation : La réponse à l’induction hormonale a été évaluée par le comptage du nombre d’explants ayant évolué en formations différenciées ou non différenciées au bout d’un mois, et ce pour chaque type d’explants, chaque variété et chaque milieu (nombre d’explants ayant évolué en formations/ nombre totale d’explants = Taux de réponse à l’induction hormonale Les moyennes ont été reparties en trois classes : • 0% à 30% : réponse faible + • 30% à 70% : réponse moyenne ++ • 70% à 100% : réponse forte +++ 54 CHAPITRE IV MATERIEL ET METHODES IV.3- Deuxième expérience : Embryogenèse somatique et organogenèse directes à partir d’explants issues de jeunes plantules chez cinq variétés de tomate : IV.3.1- Condition de culture des plantes mère et obtention des explants : Les graines de tomate ont été stérilisées en suivant la même méthode utilisée lors de la première expérience. Ces graines vont germer sur deux milieux différents MSI et MSII à raison de 5 graines par boite pour produire des plantules d’où proviendront les explants. Les cinq variétés de tomate testée lors de cette expérience sont : Rio Grande, Marmande, Heinz 1350, Agora (hybride), Merveille des marchés. IV.3.2- Les explants : Les explants utilisés ont une surface moyenne de 5 mm², ils proviennent de jeunes plantes (10 jours) cultivées in vitro sur milieu MS additionné d’une cytokinine en conditions aseptiques. L’embryogenèse somatique est initiée par culture d’explants de cotylédons, d’hypocotyle et de méristème terminal sur le milieu de base enrichi de régulateurs de croissance (tableau 9). Tableau 10: Composition des différents milieux testés pour l’induction de l’embryogenèse somatique directe. Rôles germination des plantes mères. Milieux Abréviations MS + 60 micromoles de BAP MSI MS + 90 micromoles de BAP MSII Induction de l’embryogenèse somatique MS + 10 micromoles de BAP MS1 Milieu d’induction. MS + 20 micromoles de BAP MS2 MS + 25 micromoles de BAP MS3 MS + 0 hormone MS0 MS + 0,2 mg/l d’ANA MSA Maturation des embryons somatiques. Milieu de développement. Enracinements des pousses feuillées 55 CHAPITRE IV MATERIEL ET METHODES Tableau 11: Composition du milieu de MURASHIGE et SKOOG (M.S) en macro et microéléments. Macroéléments Microéléments mg.l-1 mg.l-1 KNO3 1900 H3BO3 6,2 MgSO4, 7H2O 370 MnSO4, 7H 2O 22,3 NH4NO3 1650 ZnSO4, 7H 2O 8,6 CaCl2, 2H2O 440 KI 0,83 KH2PO4 170 NaM0O4, 2H2O 0,25 CuSO4, 5H2O 0,025 CoCl2,6H2O 0,025 Na2-EDTA 37,3 FeSO4, 7H 2O 27,8 Tableau 12 : Solution de vitamines de MURASHIGE et SKOOG (M.S). Vitamines Concentrations Acide nicotinique 0,5 mg.l-1 Aneurine 0,1 mg.l-1 Pyridoxine 0,1 mg.l-1 IV.3.3- La mise en culture : Les explants réduits à la taille de 5 mm² sont introduits dans des boites de Pétri renfermant les milieux d’induction (MS1, MS2, MS3) à raison d’une plantule par boite (C1, C2, H1, H2, MT). Une fois la mise en culture terminée les boites de Pétri sont scellées avec du papier film étirable. Chaque boite porte des indications relatives à la date de la mise en culture, le nom de la variété introduite, le milieu de culture et le milieu de germination des plantes mères. 56 CHAPITRE IV MATERIEL ET METHODES IV.3.4- Le repiquage : Le repiquage des explants à lieu chaque mois après la mise en culture. Cette phase dite de démarrage dure 1 à 2 mois. Les formations globulaires produites sont ensuite transférées dans le milieu de développement, soit le milieu MS sans hormones et les parties végétatives formées sont transférés sur un milieu MS additionné d’auxine pour favoriser l’enracinement. Au stade régénération, les explants sont transférés dans des bocaux contenant 30 ml de milieu de culture MS0 afin de favoriser la croissance et l’allongement des vitroplants. Toutes les cultures ont été placées dans une salle à une température de 26 ± 1 °C, une photopériode de 16 h d’éclairement. IV.3.5- Dispositif de l’essai (tableau 13) : Explants C1 C2 H1 H2 MT Milieux Total explants MSIxMS1 5 5 5 5 5 25 MSIxMS2 5 5 5 5 5 25 MSIxMS3 5 5 5 5 5 25 MSIIxMS1 5 5 5 5 5 25 MSIIxMS2 5 5 5 5 5 25 MSIIxMS3 5 5 5 5 5 25 30 30 30 30 30 150 Total explants C : cotylédon, H : hypocotyle et MT : méristème terminal. Le nombre total des explants de l’expérimentation pour les cinq variétés testées est de 150 explants. 57 CHAPITRE IV MATERIEL ET METHODES Photo 1 : Germination des graines de tomate sur milieu MS additionné de cytokinine. IV.4- Répétition de la deuxième expérience : Embryogenèse somatique et organogenèse directes à partir d’explants issues de jeunes plantules chez cinq variétés de tomate : IV.4.1- La mise en culture : Afin de diminuer le risque de contamination, mieux apprécier les résultats et faire une étude statistique plus précise, nous avons répété la même expérience en mettant un seul explant par boite. Une fois la mise en culture terminée les boites de Pétri sont scellées avec du papier film étirable. Chaque boite porte des indications relatives à la date de la mise en culture, le nom de la variété introduite, la nature de l’explant, le milieu de culture et le milieu de germination des plantes mères. Photo 2 : Repiquage d’explant de cotylédon sur milieu MS additionné de cytokinine Photo 3 : Repiquage d’explant d’hypocotyle sur milieu MS additionné de cytokinine 58 CHAPITRE IV MATERIEL ET METHODES IV.5- Troisième expérience : Embryogenèse somatique à partir d’embryons immatures IV.5.1- Condition de culture des plantes mère et obtention des explants : Les plantes ayant servi au prélèvement des explants d’embryons immatures ont été cultivées sur terreau et au bout de quatre mois, les plantules avaient atteint leur stade morphologique d’utilisation (formation des fleurs). IV.5.2- Les explants : Les explants utilisés dans cet essai consistaient exclusivement en embryons immatures. Les fleurs ont été prélevées environ 10 jours après la pollinisation. A ce stade les fruits immatures ont une taille moyenne de 4 mm. IV.5.3- Milieux et conditions de culture : Pour chaque variété les fruits ont été désinfectés par trois flambages successifs à l’alcool. Les embryons ont été prélevés strictement, sous loupe binoculaire à raison de 10 embryons par boite contenant les milieux dits d’induction (MS4, MS5, MS6, MS7). Chaque boite porte des indications relatives à la date de la mise en culture, le nom de la variété introduite et le milieu de culture. Une fois la mise en culture terminée les boites de Pétri sont scellées avec du papier film. Le repiquage des explants à lieu un mois après la mise en culture. Il peut être précoce si le milieu de culture est envahi par des composés phénoliques. Toutes les cultures ont été placées dans une salle à une température de 26 ± 1 °C, une photopériode de 16 h d’éclairement. Les régulateurs de croissance utilisés sont le 2,4D et la kinétine. Les formations produites sont ensuite transférés sur milieu de régénération, soit le milieu (MS8) avant leur transfert sur le milieu de développement (MS0). Tableau 14 : Composition des différents milieux testés Hormones Milieux 2,4D Kinétine MS0 0 0 MS4 10 µM 0 MS5 0,1 mg/l 0 MS6 0,2 mg/l 0 MS7 0,3 mg/l 0 MS8 1µM 1µM 59 CHAPITRE IV MATERIEL ET METHODES IV.5.4- Dispositif de l’essai (Tableau 15) : Nombre d’explants Total RG MMD MCH HZ AGO explants MS4 xMS8 10 10 10 10 10 50 MS5 xMS8 10 10 10 10 10 50 MS6 xMS8 10 10 10 10 10 50 MS7 x MS8 10 10 10 10 10 50 Total explants 40 40 40 40 40 200 Traitements Le nombre total des explants de l’expérimentation pour les cinq variétés testées est de 600 explants (trois répétitions). 60 CHAPITRE V : RESULTATS ET DISCUSSION Après l'étude bibliographique, nous sommes parvenus à établir un protocole de travail, qui prenait en compte les paramètres suivants : 1- Un milieu de culture, composé des sels minéraux et des vitamines de Murashige et Skoog, additionné de régulateurs de croissance, représentés essentiellement par le 2,4D, l’ANA (substance à effet auxinique), la BA et la kinétine (cytokinine) employées dans le milieu de culture seule et à différentes doses. 2- Des explants de nature et d'origines diverses (cotylédons, hypocotyles, méristème terminal et embryons immatures). 3- Des écotypes différents de tomate. Les explants sont prélevés à partir de plantules cultivée in vitro et dont l'âge varie de 10 à 15 jours (C1, C2, H1, H2, MT) et aussi sur des plantes cultivées en pots sur terreau âgées de quatre mois environ (embryons immatures). V.1- Première expérience : essai préliminaire V.1.1- Résultats obtenus : L’utilisation du 2,4 D à différentes concentrations induit la formation de cals à partir des deux types d’explants testés chez les quatre variétés de tomate. Après 10 jours de mise en culture on observe un phénomène de gonflement des explants et dans certain cas un début de callogenèse quel que soit le milieu testé. Cette prolifération cellulaire débute sur les cotylédons. Au plan morphologique, la nature des cals formés est différente selon l’explant. Dans le cas des cotylédons, les cals ont une couleur marron clair, un aspect nodulaire et une consistance compacte (Figure7), les cals issus des hypocotyles sont de couleur verte ou marron foncé à clair et ils ont un aspect turgescent de consistance friable. Après repiquage sur les mêmes milieux, le développement des cals est plus important avec quelque fois la disparition de l’explant. Les cotylédons sont plus réactifs au milieu de culture et présentent déjà des transformations morphologiques (gonflement et boursouflure). Après 10 jours de culture, seuls les cotylédons comparés aux autres explants expriment un pouvoir callogène. Les différents explants développent des cals après un mois de mise en culture. Une réactivité maximale, chez les trois variétés (HZ, RG, AGO) est obtenue sur le milieu I2 (0,5 mg/l de 2,4 D) (figure9, figure 10, figure 11), alors que c’est le milieu I3 (1mg/l de 2,4D) qui semble favorable à la formation des cals chez la variété Top 48 (figure12). 61 CHAPITRE V : RESULTATS ET DISCUSSION La lecture des différents résultats obtenus montre, qu’au 30 ème jour de culture, les différents milieux testés ont induit, chez les cotylédons, une multiplication cellulaire importante observée sur tous les milieux (figure13). Les explants d’hypocotyles expriment un pouvoir plus tardif et présentent toujours un aspect turgescent. Enfin et d’une manière générale les différents résultats montrent une variabilité des réponses des explants par rapport au milieu de culture, selon la variété étudiée et selon le type d’explant utilisé. Les quatre concentrations de 2,4 D testées ont orienté les explants mis en cultures vers la formation des cals, c’est le milieu I2 qui a favorisé le maximum de réactivité des explants et c’est les cotylédons de la variété HZ qui ont donné le plus grand taux de callogenèse (Figure13). Figure 7 : Cals formés chez la variété HZ sur Figure 8 : Formation de racines sur les cals milieu I2 après un mois de mise en culture. issus de cotylédons et d’hypocotyles d’Ago sur milieu I1 62 CHAPITRE V : RESULTATS ET DISCUSSION Tableau 16 : Pourcentage d’explants callogènes après 30 jours de mise en culture chez la variété AGO pour chaque milieu et chaque type d’explant. Milieux I1 I2 I3 I4 Hypocotyles 60% ++ 70% +++ 60% ++ 25% + Cotylédons 70% +++ 90% +++ 80% +++ 60% ++ Explants Figure 9 : Pourcentage d’explants callogènes chez la variété AGO après 30 jours de mise en culture sur le milieu I (MS + 2,4D). 63 CHAPITRE V : RESULTATS ET DISCUSSION Tableau 17: Pourcentage d’explants callogènes après 30 jours de mise en culture chez la variété RG pour chaque milieu et chaque type d’explant. Milieux I1 I2 I3 I4 Hypocotyles 20% + 80% +++ 20% + 40% ++ Cotylédons 40% ++ 90% +++ 40% ++ 40% ++ Explants Figure 10 : Pourcentage d’explants callogènes chez la variété RG après 30 jours de mise en culture sur le milieu I (MS + 2,4D). 64 CHAPITRE V : RESULTATS ET DISCUSSION Tableau 18: Pourcentage d’explants callogènes après 30 jours de mise en culture chez la variété HZ pour chaque milieu et chaque type d’explant. Milieux I1 I2 I3 I4 Hypocotyles 20% + 70% +++ 60% ++ 30% + Cotylédons 20% + 100% +++ 90% +++ 50% ++ Explants Figure 11 : Pourcentage d’explants callogènes chez la variété HZ après 30 jours de mise en culture sur le milieu I (MS + 2,4D). 65 CHAPITRE V : RESULTATS ET DISCUSSION Tableau 19: Pourcentage d’explants callogènes après 30 jours de mise en culture chez la variété Top 48 pour chaque milieu et chaque type d’explant. Milieux I1 I2 I3 I4 Hypocotyles 10% + 0% 10% + 0% Cotylédons 10% + 10% + 20% + 10% + Explants Figure 12: Pourcentage d’explants callogènes chez la variété Top 48 après 30 jours de mise en culture sur le milieu I (MS + 2,4D). 66 CHAPITRE V : RESULTATS ET DISCUSSION V1: AGO, V2: RG, V3: HZ, V4:Top48. Figure 13 : Pourcentage d’explants callogènes chez les quatre variétés testées après 30 jours de mise en culture sur le milieu I (MS + 2,4D). L’utilisation de l’ANA à différentes concentrations induit une réaction de rhizogénèse à partir des deux types d’explants testés chez les quatre variétés de tomate, après 10 jours de la mise en culture. Ainsi les explants de cotylédons sont plus réactifs au milieu de culture. En effet les meilleures réponses sont enregistrées sur le milieu II4 (2 mg/l d’ANA). Après un mois de mise en culture, les différents milieux testés ont induit, chez les variétés : Top 48, AGO et RG (figure 14) une rhizogénèse très importante avec absence de callogenèse à l’exception de la variété HZ qui a exprimé un pouvoir callogène plus ou moins important avec l’ANA (40%). 67 CHAPITRE V : RESULTATS ET DISCUSSION (RG MSII1, 1mois) Figure 14 : Formation de racines sur les cotylédons et les hypocotyles de la variété RG sur milieu II1. V.1.2- Discussion et conclusion : Les résultats obtenus permettent de conclure que la callogenèse est toujours précédée par une augmentation du volume des explants. Ces explants sont constitués de tissus différenciés et leur mise en culture dans le milieu MS additionné d’auxine a provoqué la dédifférenciation des cellules et l’acquisition d’un pouvoir mitotique qui a abouti dans un premier temps à la formation de cal. De nombreux méristèmes sont formés à partir de cellules différenciées sous l’influence de régulateur de croissance. Le programme mis en place est d’abord une dédifférenciation qui conduit des cellules à retrouver une activité mitotique ensuite une organisation spécifique. En effet les cellules somatiques spécialisées sont engagées dans une phase de dédifférenciation par réactivation sous l’effet des hormones de croissance (Gueye et al., 2008). Ces substances jouent directement ou indirectement un rôle inducteur en activant des séquences génétiques spécifiques à la morphogénèse. Il faut cependant souligner que la réponse des explants mis en culture varie en fonction de la variété, la nature et la concentration de l’hormone de croissance additionnée. Cette différence de réponse est probablement liée au fait qu’il existe des différences dans les 68 CHAPITRE V : RESULTATS ET DISCUSSION concentrations endogènes des régulateurs et à l’efficacité relative de leur systèmes enzymatiques de dégradation. Le suivi de la cinétique de croissance des cals nous a permis de mettre en évidence que la callogenèse est profondément influencée par le facteur génotypique. L'implication du facteur génotypique en callogenèse a été décrit par Brown et Meijer, (1987) sur la luzerne ; Saadi, (1991) sur le pois ; Kalamani et Ramasamy, (1998) sur le sorgho. Plusieurs travaux montrent que l’utilisation d’auxines et en particulier le 2,4D assure le déclenchement de cals chez un grand nombre d’espèces botaniques : le palmier à huile (Ahée et al., 1981) ; les kolatiers C. anomala et C. acuminate (Fotso et al., 2002) ; les bananiers (Stross et al., 2003) ; le cotonnier (Kouadio et al., 2004) ; l’absinthe (Zia et al., 2007) ; le palmier dattier (Sané et al., 2006 ; Asemota et al., 2007 et Gueye et al., 2008) et chez deux Sapotacées (Fotso et al.,2008). Concernant la rhizogenèse, les résultats de notre étude nous ont amené à confirmer une fois de plus le rôle essentiel que jouent les régulateurs de croissances. Cependant, on constate, que l'usage du 2,4D dans le milieu d'induction, s'est révélé incapable d'induire une rhizogenèse sur l'ensemble des explants testés sauf pour la variété hybride (AGORA). Par contre, l'addition de l’ANA au milieu d'induction, lui est très favorable quelque soit l’explant et l’écotype testé. Le remplacement du 2,4D par l’ANA qui est une auxine aussi a changé complètement la réponse des explants mis en culture. Seul le 2,4D a permit d’induire une callogenèse, l’ANA s’est montré inefficace. Pour une même dose, les réponses diffèrent en fonction du régulateur employé. L’emploi de l’ANA a permis d’induire une rhizogenèse, coïncidant avec les résultats signalés dans la littérature, cas d’un arbre fruitier de l’Afrique centrale le Safoutier (Youmbi et Benbadis, 2001) chez lequel différentes concentrations d’AIA, ANA, AIB stimulent la rhizogenèse, sur les explants d’hypocotyles et de cotylédons alors que le 2,4D a un effet uniquement callogène. L'emploi de l'ANA dans le milieu d'induction, se montre sans effet aucun sur l'embryogenèse somatique. Contrairement aux résultats signalés dans la littérature, d'autres auteurs utilisent l'ANA avec succès dans de nombreux travaux portant sur l'embryogenèse somatique : Laparra et al, (1997) chez le tournesol et Brar et al, (1998) chez le coton. Contrairement aux résultats obtenus dans notre expérience, un bon nombre d'auteurs parlent de l'importance de l'utilisation des auxines seules (en particulier celui du 2,4-D), pour l'obtention des embryons somatiques chez plusieurs espèces comme le Castanea sativa 69 CHAPITRE V : RESULTATS ET DISCUSSION (Piagnani et Eccher., 1990); le pois (Saadi, 1991); le sorgho (Patil et Kuruvinashetti, 1998); le Pinus sylvestris (Haggman et al., 1999) et le coton (Zhang et al., 2001). V.2- Embryogenèse somatique directe à partir d’explants issues de jeunes plantules chez cinq variétés de tomate : V.2.1- Résultats obtenus et discussion: Concernant l'embryogenèse somatique, les résultats préliminaires indiquent qu'elle est possible chez la tomate (figure16, figure 17). Cependant, elle reste tributaire, comme c'était le cas en callogenèse de plusieurs facteurs tels que : la nature de l'explant, le génotype et la composition hormonale du milieu. Les embryons somatiques obtenus suivent les mêmes stades de développement des embryons zygotiques (figure 15). Le présent travail, nous a aussi permis d'obtenir une organogenèse, avec formation de pousses feuillées directement sur les explants (organogenèse directe) (figure16, figure 17), des racines (rhizogenèse), et de régénérer des plantes entières de tomate (figure18). Les trois types d’explants testés (cotylédons, hypocotyles et méristème terminal) ont exprimé des potentialités embryogènes et organogènes mais seulement avec les génotypes Rio Grande, Marmande, Heinz 1350, Merveille des marchés. A la lumière des résultats obtenus au cours de l’essai préliminaire, et qui nous a permis de conclure que la régénération par organogenèse ou embryogenèse somatique est possible chez les quatre écotypes (Rio Grande, Marmande, Heinz 1350, Merveille des marchés). Nous avons lancé une deuxième série d'expérience, dans le but de voir l'éventualité de régénérer des plantes entières via l'organogenèse ou l'embryogenèse, autrement dit, tester la convertibilité des embryons somatique en plantes. Concernant l'embryogenèse somatique, l'impact des régulateurs de croissance apparaît une fois de plus essentiel dans les processus morphogènes. L'embryogenèse somatique varie considérablement en fonction de la dose du régulateur de croissance employé. L’usage des cytokinines seules dans le milieu d'induction est capable de conduire à une production d'embryons, ce qui fait nos résultats coïncident avec ceux signalés dans la littérature. Au cours de la phase d'induction, nos résultats montrent que l'embryogenèse somatique est sous la dépendance du génotype. En effet, parmi les génotypes que nous avons testé, la variété AGORA s’est montrée récalcitrante alors que d'autres comme : Rio Grande, Marmande, Heinz 1350, Merveille des marchés ont manifesté de bonnes aptitudes embryogènes. 70 CHAPITRE V : RESULTATS ET DISCUSSION Les rendements obtenus sont nuls pour la variété AGORA quelque soit le milieu de culture de la plante mère, moyens pour les génotypes RG et MMD, élevés pour les génotypes HZ et MCH (cas des plantes mères cultivées sur MSI) (figure 20), élevés pour les génotypes HZ et RG et moyens pour les génotypes MCH et MMD (cas des plantes mères cultivées sur MSII) (figure 21). Cette relation entre le génome et l'aptitude à l'embryogenèse somatique a déjà été reconnue par plusieurs auteurs, Saadi, (1991) ; Benchiekh et Gallais (1996) sur le pois ; et Carneiro, (1999) sur le café. Nos expériences ont permis de mettre en évidence une variabilité dans les aptitudes embryogènes, des différents types d'explants testés. En effet ce sont les explants cotylédons qui ont présenté les meilleures potentialités embryogènes. S'agissant de l’organogenèse, elle se trouve aussi conditionnée par l'action de divers facteurs. Les plus influents sont les facteurs que nous avons cités précédemment à savoir : la composition hormonale du milieu, le génotype et la nature de l'explant. L'effet de la composition hormonale intervient à la fois dans l'obtention des pousses feuillées et aussi dans l'enracinement des tiges régénérées (Walker et al., 1979; Margara, 1989) . Nous avons constaté que, l'usage de la BAP seules dans le milieu d'induction est favorable à l’organogenèse et à l'embryogenèse sur l'ensemble des explants et cela quelle que soit la concentration utilisée. Des résultats similaires aux nôtres, signalent tous l'intérêt que peuvent avoir les cytokinines, en l'occurrence la BA sur l’organogenèse. C'est le cas de Li et al (1986) sur Medicago inpulina L ; Vardi et al (1990) sur le Passiflora coerule ; Jadimath et al (1998) sur Guizotia scabra et Handro et Floh (2001) sur Melia azedarach. En organogenèse, le facteur génotypique s'impose comme étant un facteur essentiel. Les résultats, de notre étude, confirment cela. Les meilleures aptitudes organogènes sont exprimées par le génotype MCH et RG (cas des plantes mères cultivées sur MSI) (figure 22) et les génotypes RG et HZ (cas des plantes mères cultivées sur MSII) (figure 23). L'effet génotypique sur l’organogenèse n'est pas nouveau puisque de nombreux auteurs le signalent comme Foucault, (1994), sur le tabac ; Christophere et Rajam, (1996), sur le poivre et Tang et Guo, (2001) sur le pin. La totipotence de ces explants n'est pas toujours complète et s'exprime à des degrés divers allant d'une bonne aptitude à l'organogenèse ou à l'embryogenèse somatique jusqu'à l'inaptitude totale à la régénération selon leur nature. 71 CHAPITRE V : RESULTATS ET DISCUSSION La composition hormonale joue également un rôle déterminant sur le processus morphogène (organogenèse ou embryogenèse somatique). L'induction est favorisée par l’addition de cytokinine dans le milieu. Les meilleures réponses ont été enregistrées avec la BAP aux doses de 10 micromoles (MS1) pour l’organogenèse ainsi que pour l’embryogenèse somatique (cas des plantes mères cultivées sur MSI) (figure 20, figure 22) et 25 micromoles (MS3) pour l’organogenèse et l’embryogenèse somatique (cas des plantes mères cultivées sur MSII) (figure 21, figure 23). Le facteur génotype influence énormément la réponse morphogène mais d'une manière générale c’est la variété HZ qui expriment les meilleures réponses aussi bien pour l’organogenèse que l'embryogenèse somatique. Au terme de ce travail, on peut dire que la régénération chez la tomate via l'organogenèse et l'embryogenèse somatique est donc possible. Mais il reste de nombreux problèmes à résoudre, pour que la technique soit exploitable en sélection végétale. Figure 15 : Différents stades de développement des embryons somatiques : a : globulaire ; b : torpille ; c : cotylédonaire ; d : embryon somatique en germination. 72 CHAPITRE V : RESULTATS ET DISCUSSION Embryogenèse somatique (MCH MS2, 1 mois) Organogénèse Organogénèse Embryogénèse somatique (MCH MS3, 1 mois) Figure 16 : Explants de cotylédons exprimant à la fois une réponse d’organogénèse et d’embryogénèse somatique chez la variété MCH. 73 CHAPITRE V : RESULTATS ET DISCUSSION Organogenèse s Embryogenèse sese Cotylédon (HZ MS2, 1 mois) Organogenèse s Embryogenèse Cotylédon (RG MS1, 1 mois) Figure 17 : Explants de cotylédons exprimant à la fois une réponse d’organogénèse et d’embryogénèse somatique chez les variétés HZ et RG. 74 CHAPITRE V : RESULTATS ET DISCUSSION Vitroplants Cotylédon (HZ MS1, 3 mois) Hypocotyle (MMD MS2, 3 mois) Figure 18 : Vitroplants régénérés par organogénese. Cotylédons (HZ MS2, 2 mois) Figure 19 : Vitroplants régénérés par embryogenèse somatique. 75 CHAPITRE V : RESULTATS ET DISCUSSION Tableau20: Pourcentage d’explants embryogenèses chez les cinq variétés testées après deux mois de mise en culture sur les milieux MS1, MS2, MS3 pour les plantes mères cultivées sur milieu MSI Milieux MS1 Explants V1 V2 MS2 MS3 V3 V4 V5 V1 V2 V3 V4 V5 V1 V2 50 0 50 68 0 0 V3 V4 V5 50 0 0 0 Hypocotyles 0 5 68 0 0 Cotylédons 0 68 90 68 80 0 0 68 76 90 0 0 0 80 0 Méristème 0 0 50 0 50 0 0 0 0 50 0 0 0 50 50 terminal V1: AGO, V2: RG, V3: HZ, V4: MCH, V5: MMD V1: AGO, V2: RG, V3: HZ, V4: MCH, V5: MMD Figure 20 : Pourcentage d’explants embryogenèses chez les cinq variétés testées après deux mois de mise en culture sur les milieux MS1, MS2, MS3 pour les plantes mères cultivées sur milieu MSI. 76 CHAPITRE V : RESULTATS ET DISCUSSION Tableau 21 : Pourcentage d’explants embryogenèses chez les cinq variétés testées après deux mois de mise en culture sur les milieux MS1, MS2, MS3 pour les plantes mères cultivées sur milieu MSII Milieux MS1 Explants V1 V2 MS2 V3 V4 V5 V1 V2 MS3 V3 V4 V5 V1 V2 V3 V4 V5 Hypocotyles 0 80 0 0 0 0 20 0 0 10 0 10 80 50 0 Cotylédons 0 66 80 0 0 0 15 66 25 76 0 55 66 68 25 Méristème 0 76 0 0 0 0 0 0 76 00 0 0 76 0 0 terminal V1: AGO, V2: RG, V3: HZ, V4: MCH, V5: MMD V1: AGO, V2: RG, V3: HZ, V4: MCH, V5: MMD Figure 21 : Pourcentage d’explants embryogenèses chez les cinq variétés testées après deux mois de mise en culture sur les milieux MS1, MS2, MS3 pour les plantes mères cultivées sur milieu MSII. 77 CHAPITRE V : RESULTATS ET DISCUSSION Tableau22 : Pourcentage d’explants organogènes chez les cinq variétés testées après deux mois de mise en culture sur les milieux MS1, MS2, MS3 pour les plantes mères cultivées sur milieu MSI Milieux MS1 Explants V1 V2 MS2 V3 V4 V5 V1 V2 MS3 V3 V4 V5 V1 V2 V3 V4 V5 Hypocotyles 0 0 0 0 0 0 50 0 0 20 0 50 0 0 0 Cotylédons 0 76 50 20 0 0 0 0 0 0 0 0 0 50 0 Méristème 0 50 50 20 68 0 0 20 68 20 0 50 68 50 20 terminal V1: AGO, V2: RG, V3: HZ, V4: MCH, V5: MMD V1: AGO, V2: RG, V3: HZ, V4: MCH, V5: MMD Figure 22 : Pourcentage d’explants organogènes chez les cinq variétés testées après deux mois de mise en culture sur les milieux MS1, MS2, MS3 pour les plantes mères cultivées sur milieu MSI. 78 CHAPITRE V : RESULTATS ET DISCUSSION Tableau23 : Pourcentage d’explants organogènes chez les cinq variétés testées après deux mois de mise en culture sur les milieux MS1, MS2, MS3 pour les plantes mères cultivées sur milieu MSII. Milieux MS1 Explants V1 V2 MS2 V3 V4 V5 V1 V2 MS3 V3 V4 V5 V1 V2 V3 V4 V5 Hypocotyles 0 0 50 0 0 0 0 0 0 30 0 0 0 0 0 Cotylédons 0 0 30 0 0 0 30 50 0 0 0 30 0 50 0 Méristème 0 50 50 0 68 0 50 68 50 0 50 68 50 50 30 terminal V1: AGO, V2: RG, V3: HZ, V4: MCH, V5: MMD V1: AGO, V2: RG, V3: HZ, V4: MCH, V5: MMD Figure 23: Pourcentage d’explants organogènes chez les cinq variétés testées après deux mois de mise en culture sur les milieux MS1, MS2, MS3 pour les plantes mères cultivées sur milieu MSII. 79 CHAPITRE V : RESULTATS ET DISCUSSION V.3- Embryogenèse somatique à partir d’embryons immatures chez cinq variétés de tomate : V.3.1- Résultats obtenus et discussion : L’utilisation du 2,4 D à différentes concentrations induit la formation de cals à partir des explants testés chez les cinq variétés de tomate. Après 25 jours de mise en culture on observe un phénomène de gonflement des explants et dans certains cas un début de callogenèse quel que soit le milieu testé. Ces cals continuent à proliférer, prennent un aspect granuleux et deviennent chlorophylliens (figure24, figure25). Les différents explants développent des cals après 2 mois de mise en culture. Une réactivité maximale, chez les trois variétés (HZ, MMD, AGO) est obtenue sur les milieux d’induction MS4 et MS5 (10 µM et 0,1 mg/l de 2,4 D). Après repiquage sur les mêmes milieux, le développement des cals est plus important. Enfin et d’une manière générale les différents résultats montrent une variabilité des réponses des explants par rapport au milieu de culture et selon la variété étudiée. Les quatre concentrations de 2,4 D testées ont orienté les explants mis en culture vers la formation de cals, c’est le milieu d’induction MS4 qui a favorisé le maximum de réactivité des explants et c’est les variétés HZ, MMD et AGORA qui ont donné le plus grand taux de callogenèse. En effet, nous observons 75% d’explants avec cal sur le milieu d’induction MS5 et 80% d’explants avec cal sur le milieu d’induction MS4. Cependant, les cals formés sur les autres milieux d’induction se sont avérés moins volumineux et plus pâles avec seulement quelques points verts. Les traitements de développement et de maturation n’ont pas apporté d’importants changements au niveau des structures présentes dans les cals. Nous avons observé plus de formations globulaires bien délimitées mais aucun embryon somatique en développement n’a été observé. Contrairement aux résultats obtenus dans notre expérience, un bon nombre d'auteurs signalent qu’une cytokinine (BAP ou K) est nécessaire au développement des embryons jusqu’au stade cotylédonaires (Rajasckaran et Mullins, 1985). Cette constatation est confirmée par Féraud- Keller et Espagnac (1988) pour le chêne vert. Lorsque les cals sont transférés sur le milieu de régénération MS8, on constate après trois semaines de culture une prolifération plus ou moins rapide des formations globulaires probablement des embryons somatiques au stade globulaire. Ceux-ci verdissent et leur contour devient plus régulier vers la quatrième semaine de culture (Figure 25). Au bout de la quatrième semaine nous remarquons que la combinaison hormonale 2,4D (1 µM) + Kinetine 80 CHAPITRE V : RESULTATS ET DISCUSSION (1µM) permet d'optimiser le nombre moyen des structures globulaires apparaissant par cal. Cette balance hormonale offre un meilleur compromis entre la croissance des cals et la prolifération des formations globulaires. L'étape de la callogenèse, qui correspond généralement à la phase la plus longue du processus de régénération (Verdeil, 1993), montre que les tissus utilisés sont très sensibles au 2,4-D et ne nécessitent pas des niveaux d'auxine élevés. La phase de croissance cellulaire, liée à la sensibilité au 2,4-D des tissus survient dès la deuxième semaine de culture. La multiplication des cellules débuterait au cours de la callogenèse, par une hyperpolarisation de certains polypeptides membranaires sous l'action de l'auxine (Barbier-Bryggoo et al., 1989). Cette hyperpolarisation est expliquée par Goldsworthy et Rathore (1991) comme étant la conséquence d'une déstabilisation de la polarité des champs électriques cellulaires qui serait à l'origine de la croissance désorganisée observée en présence du 2,4-D au cours de la callogenèse. Cette étude montre, en outre, que l'apport de cytokinines exogènes, permet d'optimiser la fréquence d'apparition de cals organisées (probablement embryogènes) à partir des explants d’embryons immatures de tomate. En effet, en agissant de façon synergique avec le 2,4-D (Branton et Blake, 1984 ; Sané, 1998), les cytokinines en particulier la BAP stimuleraient davantage la sensibilité des tissus, en particulier celle des cellules compétentes, pendant la phase de la callogenèse. La prolifération des structures globulaires à partir des cals des cinq variétés testées de tomate nécessite leur transfert sur un milieu de cultures contenant une cytokinine. La nécessité d'effectuer un tel rééquilibrage de la balance hormonale, pendant la phase d'expression de I'embryogenèse somatique, a été démontrée chez d'autres espèces comme le bananier (Dhed'A et al., 1991) ou le cocotier (Verdeil, 1993). Ainsi, il apparaît que les cytokinines notamment la BAP jouent un rôle déterminant au cours du processus d'embryogenèse chez A. raddiana grâce, en particulier, à son action sur l'initiation de la proembryogenèse et la prolifération des globules embryogènes à la surface des cals. V.3.2- Conclusion : La callogenèse s’est manifestée pour chaque variété et pour chaque concentration de 2.4-D, après un transfert dans un milieu additionné de cytokinine et de 2.4-D, les cals se sont révélés plus organisés. Tenning et al. (1992) ont mis en évidence l’influence négative de l’âge de l’embryon zygotique en tant qu’explant pour l’embryogenèse somatique directe chez la betterave et chez le chêne liège et le chêne pubescent. Féraud-Keller et al. (1989) ont 81 CHAPITRE V : montré que RESULTATS ET DISCUSSION les embryons zygotiques prélevés à des stades très précoces de leur développement se nécrosent totalement. Prélevés au contraire à un stade proche de la maturité, ils poursuivent leur développement normal en une jeune plantule. Au stade intermédiaire, ils produisent des embryons somatiques. Nous pouvons donc envisager un nouvel essai d’embryogenèse somatique directe avec des embryons immatures sur différentes époques de prélèvement. La présence de formations organisées dans les cals d’embryons immatures révèle que ces masses pourraient avoir un potentiel embryogène. Dans ce cas, on s’approche plutôt du contexte embryogenèse somatique indirecte. Les cals induits sur un milieu enrichi en 2.4-D, ont tous produit des formations globulaires bien délimitées. Cependant, nous ne possédons pas encore assez de preuves pour affirmer le caractère embryogène de ces cals. Les milieux de développement et de maturation ont à nouveau provoqué l’apparition de masses vertes, compactes à la surface ou au sein du cal qui n’ont pas abouti à une organogenèse caulinaire. Ces masses vertes pourraient indiquer une capacité organogène ou embryogène du cal. Si les formations globulaires présentes au sein des cals sont véritablement embryogène, il est donc évident que ce sont les étapes de développement et de maturation des embryons somatiques qui sont limitantes. Pour contourner cet obstacle, le transfert sur un milieu dépourvu de régulateurs de croissance en fin d’étape d’induction pourrait être plus favorable au développement des masses pro- embryonnaires qu’un milieu contenant de la Kinétine, étant donné que ce premier se retrouve dans de nombreux protocoles d’embryogenèse somatique. Une autre possibilité serait d’augmenter le rapport cytokinine/auxine (George, 1993/1996). La capacité embryogène d’un cal dépend souvent du génotype (Brown et al., 1995). L’effet du génotype peut aussi inter réagir avec le milieu ou les conditions environnementales de la culture (Brown et al. 1995). 82 CHAPITRE V : RESULTATS ET DISCUSSION Figure 24 : Cals formés à partir d’embryons immatures chez deux variétés de tomates (HZ et MMD) après deux mois de mise en culture sur milieux d’initiations. Figure 25 : Structures Globulaires apparaissant par cal après repiquage sur milieu de régénération MS8. 83 CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES : L'objectif essentiel visé par ce travail consiste à essayer de régénérer in-vitro des plantes entières de tomate via l'organogenèse et l'embryogenèse somatique directe. Pour parvenir à cela, nous avons testé trois principaux facteurs susceptibles d'influencer la régénération qui sont le milieu de culture, la nature de l'explant et le génotype. Concernant la callogenèse, on constate que la composition hormonale influence considérablement la taille et la texture des cals produits. Ainsi l'usage du 2,4D, seul dans le milieu de culture, s'est révélé capable d'induire une callogenèse sur l'ensemble des explants testés et cela quelle que soient leurs origines. A ce sujet, de nombreux travaux rapportent l'efficacité du 2,4-D, employé seul ou en association avec une cytokinine, vis à vis de la callogenèse (Sanghamitra et Sumitra, 1998 ; Jayasree, 2001). L'importance de la callogenèse ne dépend pas seulement de la nature du régulateur de croissance mais aussi de sa concentration. Il faut une dose minimale de 0,1 mg/l de 2,4-D pour pouvoir obtenir une induction callogène. En plus de l'effet hormonal, la nature de l'explant peut avoir une incidence considérable sur la callogenèse. En effet, les explants d'hypocotyles et de cotylédons semblent présenter de bonnes aptitudes. Le suivi de la cinétique de croissance des cals nous a permis de mettre en évidence que la callogenèse est profondément influencée par le facteur génotypique. Ainsi, nous constatons que l'ensemble des génotypes Ago, RG, HZ réagissent mieux à la callogenèse que la variété hybride Top48. Concernant la rhizogenèse, les résultats de notre étude nous ont amené à confirmer une fois de plus le rôle essentiel que jouent les régulateurs de croissances. Cependant, on constate, que l'usage du 2,4D, s'est révélé incapable d'induire une rhizogenèse sur l'ensemble des explants testés et cela quel que soit le génotype utilisé. Par contre, l'addition de l’ANA au milieu d'induction, lui est très favorable. En effet les meilleures réponses sont enregistrées sur le milieu II4 (2 mg/l d’ANA). Le présent travail, nous a aussi permis d'obtenir une organogenèse directe, avec une production de pousses feuillées directement sur les explants et de racines (rhizogenèse), ainsi qu’ une embryogenèse somatique directe, les deux conduisant à la régénération des plantes entières de tomate. 84 CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES S'agissant de l’organogenèse et l’embryogenèse somatique elles se trouvent aussi conditionnées par l'action de divers facteurs. Les plus influents sont les facteurs que nous avons cité précédemment à savoir : la composition hormonale du milieu, le génotype et la nature de l'explant. Au cours de cette étude, nous nous sommes confrontés à plusieurs problèmes ; le plus important parmi eux est celui relatif au taux de conversion des embryons somatiques en plantes entières. Dans cette phase, l'échec était presque total puisque le taux de conversion n'a pas dépassé les 5 %. Cela est du, en partie, aux expériences limitées, conduites lors de cette étude et qui nous semble très insuffisantes pour résoudre une telle problématique. Les problèmes de germination des embryons peuvent être attribués soit aux malformations des embryons (le méristème racinaires ou caulinaire étant inexistant), soit aux techniques de transferts, des embryons vers les milieux de germinations. Sur ce dernier point, Svobodova et al., (1999) précisent que les dommages causés durant les procédures de transfert affectent considérablement la conversion des embryons en plantes entières. En résumé ce travail nous a permis de réaliser en grande partie les objectifs que nous avions fixés au départ à savoir l'obtention d'embryons somatiques, l'optimisation de la production et la régénération de plantes entières. Concernant l'embryogenèse somatique, le rendement et la qualité des embryons somatique doivent être améliorés d'avantage et devraient conduire à l'amélioration de la germination. Une autre voie de recherche très prometteuse devra se porter sur la maîtrise de l'enracinement des embryons et la résolution du problème de l'acclimatation qui reste une des étapes les plus réfractaires à réaliser. La phase de sevrage des plantes (passage des plantules des tubes à essais aux pots dans la mini serre) n'a pas été réussie probablement à cause d'une part de la fragilité des plantules et de leur système radiculaire manquant toujours de vigueur et d’autre part des conditions de sevrage mal adaptées à notre expérimentation. Les résultats auxquels nous sommes parvenus sont encourageants. Ce travail mérite d'être poursuivi pour mieux maîtriser la régénération chez la tomate. Notre motivation ne serait que plus grande quand on sait qu’un kilogramme de semence hybride de tomate a un prix fluctuant selon les variétés entre trois cent milles dinars et deux millions de dinars. 85 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES - Abrie, A.L., et Staden, J.V. (2001). Micropropagation of the endangered Aloe polyphylla. 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