Du gène à la fonction
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DES de pathologie : Pathologie moléculaire Du gène à la fonction Jean-François Emile, Service de pathologie & EA4340 Hôp. Ambroise Paré, APHP & Université de Versailles SQY Pathologie : historique • Pathologie : – Analyse des lésions associées à des symptomes • 3 phases évolutives – Lésions macroscopiques (depuis l’antiquité) – Lésions histologiques (depuis XIXe) – Lésions moléculaires (depuis 20 ans) Pathologie moléculaire : Une nouvelle spécialité • Des revues spécialisées : – Molecular Pathology – Diagnostic Molecular Pathology – Experimental and Molecular Pathology • De nombreux instituts • Des enseignements spécifiques • Indications de plus en plus nombreuses – Pathologies cancéreuses, infectieuses Pathologie moléculaire : Techniques d’analyse des acides nucléiques • Cytogénétique « classique », FISH, SKY • Hybridation in situ • CGH, Chromosome array • Southern (ADN) et northern (ARN) blot • PCR, RT-PCR, analyse de taille de fragments, séquençage, méthylation,… • PCR temps réelle, DNA arrays Pathologie moléculaire • Objectifs du cours : – Comprendre l’importance de la biologie moléculaire dans le diagnostic anatomopathologique, notamment en pathologie tumorale – Comprendre et critiquer des articles de pathologie moléculaire – Notions de base pour pouvoir s’impliquer dans une activité de pathologie moléculaire au sein d’un laboratoire Plan du cours • Chomosomes - ADN – Structure des chromosomes et de l'ADN – Réplication (ADN ADN) – Maintien de l'intégrité de l'ADN • Transcription - traduction – Transcription (ADN ARN) – Maturation de l'ARN messager – Traduction (ARN protéine) • De la protéine à sa fonction – Structure des protéines – Maturations post-traductionnelles – Trafic intra-cellulaire Vocabulaire de base • Base : – Adenine, Cytosine, Guanine, Thymidine, Uracil • Nucléotides : – (déoxy)adénosine, (déoxy)guanosine, (déoxy)cytidine, thymidine, Urididine • Acides nucléiques : – ADN – ARN • Code génétique : – codon de 3 nucléotides pour 1 acide aminé ADN : structure • Molécule de très grande taille • Structure en 2 brins anti-parallèles • Associations spécifiques des 2 brins base/base : A-T et G-C • Enroulement en double hélice • Super-enroulement plus complexe et en association avec des protéines spécifiques (histones) nucléosomes, chromosomes • Localisation nucléaire +++ et mitochondriales ADN humain: quelques chiffres • 3,2x109 paires de bases (x 2) • 46 Chromosomes : – 22 paires d'autosomes – 2 chromosomes sexuels • Environ 30 000 gènes • Environ 1,5% de l'ADN correspondent à des séquences codant pour des protéines • Chaque gène contient entre 1 et 178 exons Chromosome humain • 1 chromosome = 1 double brin d'ADN • 1 chromosome, 2 états : – C. mitotique : état condensé – C. inter-phasique : ADN déroulé • Chaque chromosome contient : – 1 centromère (site de fixation du kinétochore) – 2 télomères (séquences répétitives) – De multiples origines de réplication Appariement des nucléotides Structure des chromosomes • Chromatine = ADN + protéines (histones ou non) • Organisation en nucléosome : "perles" constituées par de l'ADN (#200bp) enroulé autour d'un octamère d'histone (H2A, H2B, H3, H4) et relié par l'ADN de liaison. • Dans la cellule inter-phasique : – Euchromatine : fibre de 30 nm reliées en boucles – Hétérochromatine : très compactée Condensation de l'ADN Structure des chromosomes d'après Alberts et al. ADN : Réplication • ADN = 2 brins anti-parallèles • ADN polymérases – Ajout de nucléotides sens 5'3' uniquement – Nécessité d'une matrice et d'une amorce • Donc fourche de réplication asymétrique – Brin "précoce" : ADN pol 5'3' (matrice – Brin "tardif" : Fragment d'Okazaki ARN (ADN primase), puis ADN pol puis ADN ligase ADN : Réplication d'après Alberts et al. ADN : Réplication • Pour maintenir l'ADN pol sur la matrice : – Protéines clamp – Protéines d'assemblage du clamp • L'ouverture de la fourche nécessite un désenroulement de l'ADN avec : – ADN hélicases : ouverture de l'hélice – Protéines SSB ; se fixent à l'ADN simple brin pour le maintenir ouvert en attendant l'ADNpol – ADN topo-isomérases : cassent les brins Cassure sur 1 brin (type I) ou les 2 (type II) ADN : Réplication d'après Alberts et al. ADN : initiation de la réplication • Origines de réplications : – Multiples chez l'homme – Séquences riches en A-T • Limitation dans le temps – Phase S uniquement ADN : réplication des extrèmités • • • • • Pas de fourche de réplication Séquence GGGTTA répétée sur 10000 bp Télomèrase Synthèse 5'3' grâce à une matrice d'ARN Les télomèrases sont inactives dans les tissus adultes, donc raccourcissement progressif du télomère jusqu'à ce que la réplication ne soit plus possible (sénescence cellulaire). ADN : Correction des mésappariements pdt la synthèse • Activité 3'-exonucléotidase de l'ADN pol : avant d'ajouter le nucléotide suivant • MMR (mismatch repair) : – Identification du brin néo-synthétisé par les cassures simple brin – Excision, réparation Altérations de l'ADN • Dégradation spontanée dépurination, désamination • Mutagènes environnementaux • Erreurs de réplication, télomères • Evènements génétiques – Recombinaison générale – Recombinaison spécifique de site Réparation de l'ADN • Altération d'une base : – Identification et marquage de la base altérée par une ADN glycosidase – Excision par l'AP endonucléase – Remplacement par ADN pol – Fermeture par ADN ligase • Altération de 2 ou qq bases – – – – Coupure de part et d'autre par endonucléase Excision par hélicase Remplacement par ADN pol Fermeture par ADN ligase • Cassure double brin – Réparation par jonction non-homologue (mutagène) – Réparation par la voie de recombinaison homologue Crossing over par recombinaison homologue • Il existe plusieurs recombinases (ex : Rad51), qui fonctionnent avec des protéines accessoires (ex : Brca1 et Brca2). • Effets génétiques de la RH pdt la méiose – Crossing over – Conversion Rétrotransposon • Transposition = cassure puis insertion au hasard • Rétrotransposon – Type rétroviral (flanqué de séquence LTR) – Type non rétroviral (ex : séquence LINE) • Mécanisme : – ARNpolARN – transcriptase inverseADN – ligaseinsertion Plan du cours • Chomosomes - ADN – Structure des chromosomes et de l'ADN – Réplication (ADN ADN) – Maintien de l'intégrité de l'ADN • Transcription - traduction – Transcription (ADN ARN) – Maturation de l'ARN messager – Traduction (ARN protéine) • De la protéine à sa fonction – Structure des protéines – Maturations post-traductionnelles – Trafic intra-cellulaire Le code génétique • ADN = support de l’information génétique • Code génétique : 3 bases 1 acide aminé • 1 gène 1 protéine (mais isoformes…) • 1 gène = exons (codants) et introns • 2n chromosomes 2 allèles/gène Epigénétique = caractéristique transmissible non liée à la séquence primaire de l'ADN Le code génétique (eucaryotes) Les familles d'ARN • ARNm (messagers) – Intermédiaires entre ADN et protéines – Adressage cytoplasmique – Epissage (excision des introns +/- qq exons) • ARNr (ribosomaux) • ARNt (de transfert) • Petits ARN (miRNA) – ARNsno (nucléolaire) – ARNsn • Autres ARN non codants Régions fonctionnelles de l'ADN • Unité de transcription (Exons, Introns et UTR) • Promoteur (TATA box, CCAAT box, AUG,…) • Séquences régulatrices d'après Alberts et al. Transcription des séquences codantes • ARN pol II (les I et III transcrivent les ARN non codants) • Séquences du promoteur permettent la fixation du complexe d'après Alberts et al. Modifications de l'ARNm • Commencent pendant la transcription • Modifications 5' et 3' • Epissage par le Splicéosome • Exportation à travers les pores nucléaires d'après Alberts et al. Régulation de la transcription • Cf cours Pr T Molina Méthylation de l'ADN • Sur une cytosine d'un -CG• Permet l'inactivation d'un gène • Impliqué dans des phénomènes d'empreinte parentale (épigénétique) • Epigénétique = caractéristique transmissible non liée à la séquence primaire de l'ADN Régulations post-transcriptionnelles • Atténuation transcriptionnelle • Epissage alternatif • Variation du site de poly adénylation (ex : Ig membranaires ou sécrétées) • Dégradation intra-nucléaire par l'exosome • Régulation du transport intra-nucléaire Traduction • • • • • • ARNm Ribosome (su 28S et 18S) ARNt Débute sur un codon AUG Fin codon stop UAA, UAG, UGA Repliement pdt la synthèse (spontané ou protéine chaperone) • Dégradation éventuelle par le protéasome, qui découpe en plusieurs petits peptides les protéines marquées par de multiple copies d'ubiquitine. traduction d'après Alberts et al. Traduction de l'ARN • Rôle du complex ribosomal • Principalement au niveau du réticulum endoplasmique • Passage d'une séquence de bases nucléotidiques à une séquence d'acides aminés Régulation de la traduction • • • • Fixation de protéines régulatrice en 5' Initiation sur différents AUG Séquences IRES d'entrée dans le ribosome Dégradation de ARNm – Racourcissement du polyA, décaping, dégradation – Endonucléases spécifiques • Dégradation des ARNm non sens • RNA interférence Variants d’épissage des ARN • A partir d’un même gène, possibilité de produire plusieurs variants d’ARN (et donc de protéines), en fonction des sites d’épissage. • Les variants peuvent avoir des fonctions différentes. Plan du cours • Chomosomes - ADN – Structure des chromosomes et de l'ADN – Réplication (ADN ADN) – Maintien de l'intégrité de l'ADN • Transcription - traduction – Transcription (ADN ARN) – Maturation de l'ARN messager – Traduction (ARN protéine) • De la protéine à sa fonction – Structure des protéines – Maturations post-traductionnelles – Trafic intra-cellulaire Structure des protéines • Acides aminés • Structure primaire • Agencement spatial – Structure IIaire, IIIaire, IVaire – Localisation cellulaire – Soluble / membranaire Rôles des modifications protéiques post-traductionnelles • adressage pour qu'elles se rendent au bon endroit dans la cellule • ancrage dans une membrane • étiquettage pour qu'elles soient reconnues par des partenaires métaboliques ou par des systèmes de dégradation • régulation de l'activité des protéines Modifications protéiques post-traductionnelles : Ajout ou retrait de divers petits groupements • • • • • • • • acétylation (ex : histones) amidation (ex : gastrine) biotinylation (ex : pyruvate carboxylase) carboxylation (ex : prothrombine) hydroxylation (ex : collagène) méthylation (ex : calmoduline, cytochrome C) phosphorylation (ex : récepteur tyrosine kinase) sulfatage (ex : thyroglubine) Modifications protéiques post-traductionnelles : Acylation, ou ajout d'acides gras divers • Glypiation: liaison entre une protéine destinée à la surface extracellulaire et une ancre de glycophosphatidylinositol (ou GPI). • Isoprénylation: liaison entre un résidu cystéine C-terminal et l'un de deux composés isoprènes, le farnésyl ou le géranylgéranyl (ex : RAS) • S-ou O-acylation: liaison avec acide gras (acide palmitique ou acide myristique). S-acylation sur cystéine, ou O-acylation sur sérine • Myristoylation N-terminale: Modification co-traductionnelle d'une glycine N-terminale par formation d'un lien amide amide avec l'acide myristique sous forme de myristoyl-CoA (ex : cytochrome b5) • Ancrage à la membrane par protéolyse contrôlée et ajout de cholestérol Modifications protéiques post-traductionnelles : Ajout polypeptides, de glucides • Polypeptides: – ubiquitination (couplage à l'ubiquitine) : histones, et toute protéine appelée à être dégradée par la voie du protéasome. – sumoylation (couplage du small ubiquitin-like modifier, ou SUMO • Glucides, simples ou complexes: – c-mannosylation - poly-ADP-ribosylation – acétylglucosamination chez p53, I?B?, PML; sur une lysine). Modifications protéiques post-traductionnelles : Glycosylation Les glycoprotéines sont composées de protéines liées de façon covalente à des sucres. La plupart des protéines sécrétées ou attachées à la membrane plasmique sont glycosylées. Les chaînes glucidiques sont dites liées en N ou en O selon leur site d'ancrage. • La glycosylation en N – Commence avec la traduction, dans le réticulum endoplasmique, et se continue jusque dans le Golgi. – Sucres ancrés sur l'azote du groupement amide de l'asparagine. – Les chaînes en N peuvent former de véritables arborisations. Selon la nature de ces autres glucides, on divise les arborisations glucidiques liées en N en trois familles : riche en mannose, hybride, et complexe, qui ressemble au type hybride mais contient aussi de l'acide N-acétylneuraminique (NANA). • La glycosylation en O – Commence dans le Golgi. – Sucres ancrés sur l'oxygène du groupement hydroxyl la sérine ou la thréonine – Les chaînes liées en O sont plus courtes et plus variables que celles en N, et ne contiennent la plupart du temps qu'un, deux ou trois résidus glucidiques. Modifications protéiques post-traductionnelles : Maturation protéolytique, dégradation • Maturation protéolytique (ex : Proinsuline insuline) • Dégradation – Le protéasome : gros complexe protéique ressemblant à l'empilement de quatre anneaux, contenant plusieurs protéases. L'unité régulatrice reconnaît les chaînes d'ubiquitine (et donc les protéines marquées pour la destruction par ce système). – Les lysosomes : vésicules d'origine golgienne à contenu à pH acide avec une grande variété d'enzyme de dégradation. Les enzymes lysosomiques sont glycolsylés et portent un mannose-6phosphate, qui est reconnu à la surface interne du réticulum trans golgien par un récepteur qui dirige ces enzymes vers les lysosomes en maturation. Traffic intra-cellulaire des protéines • Voir article Tabone-Eglinger et al.
