GG cours 1

Génie génétique 1
Préparation d’ADN génomique :
1- Méthodes pour casser la membrane : utilisation des détergents qui sont de 2 types majoritairement : le SDS (Sodium
Dodécyl Sulfate) ou bien le Triton. En fonction de leur composition, on va doser la concentration de détergent. Les lipides
vont se mettre en micelles et on va avoir accès au contenu de la cellule.
2- Séparation de l’ADN des protéines : l’ADN est une molécule hydrophile, la technique qu’on utilise est une extraction
phénolique. On agite puis on centrifuge. Les molécules d’acide nucléiques qui sont hydrophiles se trouveront dans la phase
aqueuse (ADN, ARN), dans la phase phénolique on retrouvera les lipides et à l’interphase, vont venir se positionner les
protéines. A ce stade l’ADN est peu pur.
3- Précipitation alcoolique ou précipitation éthanol. A cette phase aqueuse on va ajouter du sel pour une salinité favorable à
la précipitation puis on ajoute 2 à 2,5 volumes d’éthanol à cette concentration saline. L’éthanol va piéger les molécules
d’eau. L’ADN, à cette concentration, est donc privé de molécules d’eau, il se compacte sur lui-même. Il ne reste plus qu’à
centrifuger cette préparation pour récupérer le culot, ensuite on resuspend cet ADN dans 1mL d’eau. On va enfin pouvoir le
manipuler.
A ce stade :
 L’ADNg obtenu est sous forme de longue molécule
 Pour le visualiser sur un gel, il faut le fragmenter
Il existe une différence fondamentale entre ADNg des eucaryotes et des procaryotes :
ADNg des procaryotes est colinéaire à l’ARNm. A l’intérieur de l’ARN on peut définir la région codante caractérisée par un
codon initiateur (AUG) suivi d’un codon STOP (UAA, UAG, UGA). Chez les eucaryotes sauf la levure, l’ADNg et ARNm ne sont
pas colinéaires.
Il n’y a pas d’intron chez les procaryotes contrairement aux eucaryotes. Chez les eucaryotes les ARNm résultent d’un
mécanisme d’épissage et de maturation.
Préparation d’un ADNc (complémentaire)
Copie en ADNdb d’un ARNm
 Préparer ARNm
 Reverse transcription avec reverse transcriptase (RT), fabrique de l’ADN en présence d’ARN (ARN dépendant)
 Passage à l’ADNdb
Pour transformer l’ARN en ADN c, on met l’enzyme, du magnésium, du désoxyrubinucléotide et une amorce (un polyT).
Toutes les conditions sont réunies pour que la synthèse démarre. La synthèse se fait du 5’ vers le 3’. A ce stade on a un hybride
ADN – ARN. Mais on veut de l’ADNdb, on utilise alors la RNase H pour introduire des cassures dans l’ARN qui libèrera une
extrémité 3’OH et une extrémité 5’ P.
Il faut une DNA polymérase classique qui puisse dégrader au fur et à mesure qu’elle synthétise le second brin d’ADN : c’est la
DNA polymérase I qui a comme amorce l’ADN comme l’ARN et elle a 2 autres activités exonucléase, elle grignote du simple brin,
elle fonctionne de 3’ vers 5’ aussi bien que de 5’ vers 3’. A partir de cette matrice, les molécules de DNA pol I vont se positionner au
niveau de chaque extrémité OH libre, en présence de DXTP et de magnésium elles vont commencer la synthèse. Au final on obtient
un ADNdb correspondant à l’ARNm. Ce qui reste c’est une petite amorce ADN. Cette copie conforme s’appelle l’ADNc.
Comment manipuler d’ADN ?
 Le but est de travailler sur un fragment d’ADN défini, de façon reproductible
 Il faut donc être capable de fragmenter l’ADN de façon reproductible
 Les enzymes capables de fragmenter l’ADN en des sites spécifiques sont nommés enzyme de restriction
Il existe des enzymes qui coupent de manière définies, ce sont des enzymes de restrictions.
Les enzymes de restrictions ont été initialement identifiées car elles sont produites par les bactéries pour se défendre contre les phages
Les sites de restriction :
Sont les zones de l’ADN reconnues et coupées par des enzymes de restriction
Sont des palindromes : quand on lit sur un brin ou sur l’autre, on lit la même chose
- Séquences identiques lorsqu’elles sont lues de gauche à droite sur l’un des brins de l’ADN et de droite à gauche sur l’autre
5’ GAATTC3’
3’CTTAAG5’
- Qui sont spécifiques de chaque enzyme
3 grands types de coupures possibles générées par les enzymes de
restriction : dans tous les cas elles se font sur les 2 brins
- Au même endroit sur les 2 brins : coupure franche
- Coupure générant des extrémités cohésive (non franches) : Coupure de
façon décalée sur les brins
o 5’ sortantes
o 3’ sortantes
Remettre les sites cohésifs de façon à pouvoir les relier entre ça veut
dire remettre à proximité immédiate un phosphate sur 5’et un OH sur 3’. L’autre
enzyme la ligase sera capable de recréer la liaison Phosphodiester. Elle a besoin d’ATP. Les polymérases peuvent rajouter un
nucléotide.
Comment modifier les extrémités obtenues après digestion par enzyme de restriction?
 Les phosphatases: enlèvent un Phosphate.
– Plus de formation possible d’une liaison phospho-diester
 L’enzyme Klenow (sous fragment de la DNA polymérase I): remplissage 5’ vers 3’ en
présence de dXTP ou exonucléase 3’-5’ en absence de dXTP
Une extrémité 5’ sortante peut être rendue franche
 La DNA Polymérase I : exonucléase 3’-5’ et/ou exonucléase 3’-5’ en absence de dXTP
Une extrémité 5’ ou 3’ sortante peut être rendue franche
Après toutes ces manipulations, il faut maintenant isoler le fragment que l’on souhaite étudier des
autres fragments et en obtenir une quantité suffisante pour travailler avec.
Pour cela, Chaque fragment est inséré dans un vecteur grâce à une ligase (ligation). Chaque vecteur « recombinant » obtenu est
introduit dans une bactérie (transformation) puis chaque bactérie est isolée et mise à pousser séparément des autres. Chaque fois que
la bactérie se divise, elle permet la multiplication du vecteur « recombinant » (amplification). L’ensemble de ces trois étapes constitue
le clonage moléculaire.
Les vecteurs doivent obligatoirement être composés d’ADN, être capable de se répliquer, y compris si on modifie leur taille, et
posséder une caractéristique qui permette de distinguer les bactéries les ayant reçu des autres bactéries: caractère sélectif.
Les éléments ADN extra-chromosomiques
 Les plasmides
Trouvées dans la plupart des bactéries, ces molécules d’ADN portent des gènes jouant des rôles significatifs dans l’adaptation et
l’évolution de la bactérie. Elles peuvent entre autre conférer une résistance à un antibiotique comme
caractère sélectif. En général circulaire, le nombre de copies par cellule peut varier de 1 à quelques
centaines. Les plasmides possèdent une origine de réplication et leur mode de réplication est
indépendant du chromosome. Leur spectre d’hôte est variable.
Améliorations nécessaires (1)
Il existe très peu de sites de restriction utilisables pour la ligation du fragment d’intérêt: est-il
possible d’améliorer cela?
Le polylinker ou site multiple de clonage (MCS), permet l’insertion des fragments, y compris
de façon orientée et permet de cibler cette insertion dans le vecteur (suppression d’une résistance,
interruption d’un gène de sélection, …)
Améliorations nécessaires (2)
Toute bactérie ayant reçu un vecteur qu’il contienne ou non le fragment d’intérêt aura acquis le caractère sélectif. Comment
résoudre ce problème?
L’interruption du gène Lac Z par un fragment d’ADN interrompt la phase de lecture codant pour la ß galactosidase
 le gène Lac Z possède un promoteur inductible par le lactose ou un analogue du lactose l’IPTG
 La ß galactosidase est capable de cliver le X-gal, molécule incolore. Le produit du clivage produit une coloration bleue.
En Présence d’IPTG et de X-gal les colonies ayant un vecteur vide seront bleues et celles contenant un vecteur recombinant
seront blanches.
L’étape de ligation
• Les extrémités des fragments à liguer doivent être compatibles
• La présence d’un groupement phosphate est obligatoire pour l’étape de ligation
• La ligation est une réaction nécessitant la présence d’ATP
La déphosphorylation du vecteur empêche la re-circularisation
La Transformation
Processus permettant la capture d’ADN exogène nu par une bactérie
La capacité à transformer est en général transitoire. L’état physiologique permettant à la bactérie de capter l’ADN est appelé état
de compétence.
Par choc thermique ou par électroporation.