PACES CAHIER D'EXERCICES de B I O C H I M I E 2 0 1 3 -­‐ 2 0 1 4 Protéines -­‐ Biologie moléculaire Structure des glucides et des lipides Bioénergétique -­‐ Métabolisme Edité par le Département de Biologie http://aristote.datacenter.dsi.upmc.fr/disc/ Cahier d'Exercices de Biochimie / PACES 2013 2 CAHIER D'EXERCICES POUR PACES BIOCHIMIE SOMMAIRE Page Préambule : devenir des QCMs et annales de concours 3 I. Protéines 1. Techniques d'étude des protéines ................................ 2. Structure des protéines ........................................ 3. Fonction des protéines ........................................ 4. Enzymologie ................................................ 4.1 Généralités ............................................ 4.2 Enzyme Michaëlien ....................................... 4.3 Enzyme Allostérique ...................................... 5. Problèmes de révision ........................................ 4 6 8 10 10 11 13 13 II. Biologie moléculaire : l'étude des acides nucléiques 1. Transcription ................................................. 2. Traduction ................................................... 3. Réplication ................................................... 4. Problème de révision .......................................... ANNEXES I • Code génétique ........................................... II • Codes des acides aminés .................................. 19 20 22 24 27 27 III. Structure des glucides et des lipides 1. Glucides 2. Lipides ..................................................... ...................................................... 28 29 IV. Métabolisme énergétique 1. Glycolyse ................................................... 2. Cycle de Krebs ............................................... 3. Chaîne respiratoire mitochondriale ................................ 4. Exercices de synthèse ......................................... 32 33 34 36 V. Métabolisme glucido-lipidique 1. Métabolisme du glycogène ...................................... 2. Néoglucogenèse .............................................. 3. Métabolisme des lipides ......................................... 4. Régulations du métabolisme des glucides et des lipides en physiopathologie . . Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie 38 39 41 44 Cahier d'Exercices de Biochimie / PACES 2013 3 Préambule Devenir des QCMs et annales de concours Les cahiers d’exercices de biochimie des années passées contenaient des QCMs, qui pour la plupart étaient issues de sujets de concours des années passées. Depuis 3 ans, ces QCMs ont été mis en ligne sur MonUPMC, l’espace numérique de travail de la Faculté. Vous pouvez ainsi tester directement vos connaissances et surtout accéder aux corrections qui sont enrichies de commentaires justifiants les réponses. A l’issue du 1er trimestre, environ 15 jours avant les épreuves du concours, les sujets des 2 années précédentes seront proposés comme concours blanc en se mettant dans les conditions du concours, c'est-­‐à-­‐dire avec un temps de réponse limité. Cette année, vous ne trouverez plus ces QCMs dans le cahier d’exercices, le département d’enseignement ayant choisi de ne mettre ces QCMs à disposition que sur MonUPMC, accessible à tous. Pour y accéder : • Connectez-­‐vous sur votre espace personnel du Site MonUPMC : http://mon.upmc.fr • Rubrique cours : plateforme SAKAI • Rubrique PACES QCM • Cliquez dans le menu de gauche sur Test & Quiz • Choisissez le test que vous souhaitez faire. • Une fois que l'évaluation est terminée et enregistrée, vous pouvez alors accéder aux corrigés en cliquant sur l'évaluation dans les "Evaluations remises" (en 1ère page). Chaque évaluation peut être réalisée 3 fois. Une note indicative est enregistrée dans votre « carnet de notes ». Ceci peut servir de repère pour la progression personnelle mais n’a, bien sûr, aucun impact sur les épreuves et résultats du concours. Un tutoriel est disponible dans le module ePartage de PACES, qui contient l’ensemble des documents de cours et ED. Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie Cahier d'Exercices de Biochimie / PACES 2013 4 I . P R O T E I N ES Image de couverture : Structure d'un cristal de BRCA2, une protéine déficiente dans des formes héréditaires de cancer du sein (Science-13sep2002 : www.sciencemag.org) 1. TECHNIQUES D’ETUDE DES PROTEINES 1.1 Filtration sur gel En chromatographiant des protéines de poids moléculaires connus sur une colonne de gel filtration, on peut déterminer leur volume d’élution (Ve) et tracer une courbe d’étalonnage qui permet d’évaluer le poids moléculaire d’une protéine inconnue. Les données ci-­‐contre sont utilisées pour tracer la courbe d’étalonnage ci-­‐dessous. (* le bleu dextran est un polymère de haut PM) 210 bleu dextran* uréase aldolase sérum albumine ovalbumine chymotrypsinogène lysozyme PM ( kDa ) 1000 500 150 65 45 25 Ve ( mL ) 80 90 115 150 170 190 14 200 Volume d’élution 190 170 150 130 110 90 70 10 20 30 50 70 100 200 300 500 700 1000 PM (kDa) Une protéine X, chromatographiée dans les mêmes conditions expérimentales, est éluée à un volume d’élution de 130 ml. a. Justifier l’ordre d’élution des protéines de PM connus. b. Evaluer le PM de la protéine X. Cette protéine X est ensuite analysée par électrophorèse SDS-­‐PAGE, et on détecte une seule bande correspondant à un PM apparent de 25 kDa. Après traitement de la protéine X par un excès de β-­‐mercaptoéthanol, la même analyse par électrophorèse ne donne toujours qu’une seule bande à 25 kDa. c. Sur quel principe est basée la détermination du PM apparent mesuré par électrophorèse SDS-­‐ PAGE ? En quoi diffère-­‐t-­‐il de la chromatographie par gel filtration ? d. Proposer une structure schématique pour la protéine X Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie Cahier d'Exercices de Biochimie / PACES 2013 5 e. La protéine X est un enzyme dont le substrat est le glucose. Quel serait l’intérêt d’une colonne d’affinité glucose pour étudier un mélange de protéines contenant la protéine X ? f. La protéine X est associé à deux protéines Y et Z. Quelle stratégie pouvez vous proposer pour isoler le complexe protéique et les liaisons et intéractions éventuelles dans le complexe XYZ 1.2 Soit une protéine (A) oligomérique d’un poids moléculaire (PM) de 240 000 Daltons. Sa structure quaternaire est étudiée par la détermination des poids moléculaires à l’issue de divers traitements: a. Traitement par le β -­‐mercaptoéthanol 0,1M : donne uniquement des structures protéiques d’un PM de 120 000 Da. b. Traitement par l’urée 8M : donne uniquement des structures protéiques d’un PM de 80 000 Da. c. Traitement par le β-­‐mercaptoéthanol 0,1M et l’urée 8M : donne uniquement des structures protéiques d’un PM de 40 000 Da. • • • • • Quels sont les effets de ces différents traitements ? Ces résultats ont-­‐ils été obtenus par gel-­‐filtration ou SDS-­‐PAGE ? Proposer un volume d’élution en gel filtration sur la colonne de l’exercice 1.1 de la protéine (A) dans un tampon 0,1M β -­‐mercaptoéthanol. Proposer un schéma de migration de la protéine (A) en SDS-­‐PAGE. Quelle est la structure quaternaire de cette protéine ? 1.3 Expliquer et commenter ces affirmations. a. Pour une valeur de pH supérieure à son pI, une protéine porte toujours une charge négative et pour une valeur de pH inférieure à son pI, une protéine porte toujours une charge positive. Une solution contenant de l’albumine (pI= 4,6), de la β-­‐lactoglobuline (pI = 5,2) et du chymotrypsinogène (pI= 9,5) est chargée sur une colonne de DEAE cellulose à pH 5,4. (Le DEAE est une molécule chargée positivement) La colonne est éluée par un gradient de NaCl de concentration croissante. b. Proposer un ordre d’élution de la colonne pour ces protéines. 1.4 Influence du pH sur la conformation d’un peptide. Le squelette peptidique est flexible. Il se replie de manière adéquate pour associer les résidus chargés par des liaisons ioniques (dans cet exemple). Ce peptide possède des conformations variables en fonction du pH. A l’aide des valeurs de pKa des acides aminés données dans le tableau ci-­‐dessous, attribuer une des conformations proposées pour le peptide étudié, aux pH suivants : pH 2 -­‐ pH 5,5 -­‐ pH 7 -­‐ pH 11 -­‐ A pH 13 AA Asp chaîne latérale 3,9 Glu 4,1 His 6,0 Lys 10,5 Arg 11,5 pKa extrémité terminale B C C-terminal 4,2 N-terminal 10,6 D E Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie Cahier d'Exercices de Biochimie / PACES 2013 2. STRUCTURE DES PROTEINES 2.1 Citez le ou les acide(s) aminé(s) correspondant à chacune des propriétés suivantes : a. sa chaîne latérale possède un atome de soufre, mais pas de groupement thiol. b. possède un groupement α aminé substitué c. sa chaîne latérale est aromatique et phosphorylable. d. joue un rôle important dans le maintien de la structure des protéines par la capacité de sa chaîne latérale à établir des liaisons covalentes réversibles par oxydoréduction. e. est capable de former des liaisons H par l’intermédiaire de sa chaîne latérale. f. est capable de former des liaisons ioniques par l’intermédiaire de sa chaîne latérale. g. possède une chaîne latérale à fonction basique majoritairement non chargée à pH7. h. sa chaîne latérale contient une fonction amide. i. possède à pH7 un très fort excédent de charges (+). 2.2 Soient les peptides suivants : ( 1 ) V a l -­‐ L e u -­‐ M e t -­‐ T y r -­‐ P h e -­‐ G l y -­‐ L e u -­‐ A l a -­‐ T r p -­‐ G l y ( 2 ) A l a -­‐ V a l -­‐ G l u -­‐ A l a -­‐ L e u -­‐ A r g -­‐ I l e -­‐ V a l -­‐ G l u -­‐ S e r a. Lequel de ces deux peptides présente la plus forte probabilité d’adopter une conformation en hélice a? b. Dans le peptide (2), l’acide aminé numéro 6 est muté en proline : Quelles sont les conséquences pour la structure du peptide? c. Quelles sont les conséquences du traitement à l’urée de ces deux peptides ? d. Pourquoi les protéines transmembranaires ont-­‐elles une proportion importante de structure en hélice ? e. Le peptide (2) possède des propriétés amphiphiles. Pourquoi ? f. Ces peptides sont ils phosphorylables ? Justifiez votre réponse ? 2.3 Dans une protéine globulaire hydrosoluble, quels acides aminés dans la liste suivante : méthionine, histidine, arginine, phénylalanine, valine, glutamine, acide glutamique, tyrosine pensez vous trouver : a. à la surface de la protéine ? b. à l’intérieur de la protéine ? 2.4 Le déroulement d'une hélice a s'accompagne d'une diminution de son pouvoir rotatoire. L'acide polyglutamique (Glu)n est en conformation d'hélice a à pH3. Quand le pH augmente, le pouvoir rotatoire diminue. De la même façon la polylysine (Lys)n est hélicoïdale à pH 10, mais son pouvoir rotatoire décroît à pH acide. Expliquez l'effet du pH sur la conformation de (Lys)n et (Glu)n. 2.5 On dispose de 3 tripeptides de séquences connues : 1 : Leu-­‐Asp-­‐Leu a b c 2 : Leu-­‐Lys-­‐Leu 3 : Asp-­‐Leu-­‐Lys. a-­‐ On dépose un mélange de ces 3 peptides sur un gel dépôt d’électrophorèse à pH 7 (sans SDS) et, après migration et révélation, on observe le schéma ci-­‐contre : Compte tenu de la polarité indiquée, à quels peptides correspondent les taches notées a, b et c ? Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie 6 Cahier d'Exercices de Biochimie / PACES 2013 7 b-­‐ Le même mélange est analysé sur un gradient allant de pH 3 à pH10. En utilisant une représentation similaire à la question précédente, indiquer la position relative de ces 3 peptides après migration, selon que le mélange est déposé aux extrémités droite ou gauche, ou bien au milieu du gel. (Préciser sur le schéma les zones acide et basique ainsi que la polarité des électrodes). 2.6 L’hydrolyse totale d’un octapeptide P8 permet d’identifier les acides amines suivants : Ala , Asp , Arg , 2 Gly , Phe , Ser et Val Il est possible, par action d’une aminopeptidase sur un peptide, d’identifier l’acide aminé qui est en position N-­‐terminale ; de même, une carboxypeptidase permet d’identifier l’acide aminé en position C-­‐terminale. L’action de la trypsine sur P8 fournit un tripeptide TP3 et un pentapeptide TP5 ; le traitement de P8 par la chymotrypsine fournit un tripeptide CP3 et un pentapeptide CP5. Tous ces peptides sont isolées et traités indépendamment par l’aminopeptidase et par la carboxypeptidase et les acides aminés ainsi mis en évidence sont indiqués dans le tableau suivant : Trypsine Chymotrypsine Aminopeptidase Carboxypeptidase P8 Ala Val TP3 Ser Val TP5 (non précisé) (non précisé) CP3 (non précisé) (non précisé) CP5 Asp Val A partir de ces indications, déduire la séquence du peptide P8. 2.7 Les mutations pathologiques de la protéine α 1-­‐antitrypsine par les méthodes de la protéomique. La protéine α 1-­‐antitrypsine est importante pour la régulation par inhibition de l’activité de plusieurs « sérine-­‐protéases ». En particulier lorsque l’α1-­‐anti-­‐trypsine est déficiente, la limitation dans le poumon de l’activité enzymatique de l’élastase n’est pas assurée et le développement d’un emphysème pulmonaire est accéléré. La détection de l’anomalie moléculaire devient alors nécessaire. On donne ci-­‐dessous la séquence primaire des 394 acides aminés de l’α1-­‐antitrypsine de type « sauvage » (Wt) : 1 31 61 91 121 151 181 211 241 271 301 331 361 391 E A F Q S E V D L I S K P P D E A I E E F Q M I V A P T P F M H G A A V K T L V E Q Q A L E L K L T Y K G H V K G F S G K K V T L F Q K K D S L F L Q N V G L L A F A L G Q V I Y K N E G V N A Y T E D N I V A N I L K Q R K L K D F P T E T T P K Q A L F Y F M A D K I F T L D R L V K M I R V D V D A T T E E G K F R F E F T H H L D K K R F S S K L S Q D N V G W L L A N G M H S E Q K T E G P S G T I H N I P K Q R M D L A E E D S L D L G P F E H D A Q Q T E S Y K F N G L L A N D N G Q H I E I K P S G T H I L L S V V Q L K G A K P F N Q E D K H Q L V M S T F F L A L D C H S T F P F S N T F V T K L I E L L N P L T T K E K E T E E F K V T G V E E L N G A A M I S E N N L E S E T P I G T I I G F D D S L Y L P K P A P L G R F W T D K M V N T E F D D H V H L L S V L A A L T T V L D K S I N On peut isoler chez des patients emphysémateux des protéines α1-­‐anti-­‐trypsine anormales présentant des mutations faux-­‐sens (substitution d’un aminoacide par un autre) : -­‐ mutation S : E (Glu) 264 → V (Val) -­‐ mutation Z : E Glu) 342 → K (Lys) -­‐ mutation JD : V (Val) 213 → A (Ala) Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie Cahier d'Exercices de Biochimie / PACES 2013 8 On connaît également une mutation Sarrebruck (Sarr) où les 19 aminoacides C-­‐terminaux sont tronqués (soulignement simple dans la séquence sauvage). a. Donner le nom de la technique de séparation classiquement utilisée dans le cadre de l’analyse protéomique, en indiquant succinctement son principe (technique I). b. Par quelle technique analytique complète-­‐t-­‐on habituellement cette technique de séparation ? c. Compléter le tableau suivant, de façon à prévoir comment vont se comporter les 4 protéines α1-­‐ anti-­‐trypsine anormales mentionnées par rapport à la protéine sauvage lorsque l’on appliquera la technique I et proposer un schéma des résultats attendus si on soumet un mélange composé de la protéine sauvage et des 4 protéines anormales à cette technique. aa Wt aa Mutant Conséquence sur la charge Conséquence sur la masse Mutant S Mutant Z Mutant JD Mutant Sarr d. On s’aperçoit que, avec cette technique I, deux de ces protéines migrent au même endroit et ne peuvent être distinguées. De quelles protéines s’agit-­‐il ? Quelle autre technique chromatographique peut-­‐on envisager pour les séparer et les isoler ? e. Le peptide 192-­‐217 (double souligné dans la séquence) est obtenu par hydrolyse ménagée de la protéine sauvage. Ce peptide est-­‐il phosphorylable ? Justifier. En cas de phosphorylation exhaustive, indiquer les modifications de masse et de charge électrique attendues et prévoir schématiquement comment ce peptide se comportera par rapport au peptide non phosphorylé si on lui applique la technique I (on précise que l’addition d’un groupement phosphate augmente le PM de 78 Da). (Rappel : H = 1 ; C = 12 ; N = 14 ; O = 16 ; P = 31 – Il est précisé que, dans les conditions expérimentales utilisées ici, le pouvoir de résolution de l’électrophorèse SDS-­‐PAGE est d’environ 300 Da : 2 peptides ou protéines ne conduiront à une migration significativement différente que si leur poids moléculaire diffère au moins de 300 Da) 3. FONCTIONS DES PROTEINES 3.1 Transport d'O2 Lorsque vous courrez, votre organisme réagit pour bien oxygéner vos muscles. a. Quelles protéines sont mises en jeu et dans quel compartiment de l’organisme ? b. Comment expliquez le transfert d’O2 des poumons vers les muscles ? c. Selon les différentes classifications des protéines (transformation , métabolisme,transport, stockage, réserve …), comment ces protéines seront-­‐elles définies ? d. Pourquoi les chaînes α et β de l’hémoglobine sont-­‐elles capables de s’associer alors que les chaînes de myoglobine ne le font pas ? e. Les acides aminés de ces protéines sont-­‐ils mis directement en jeu pour fixer l’O2 ? Comment ? f. La constante d’affinité de l’O2 pour les sites de fixation de l’O2 sur l’hémoglobine varie en fonction de la concentration d’O2. Comment nomme-­‐t-­‐on ce phénomène ? Comment l’explique-­‐t-­‐on au niveau moléculaire ? g. A haute altitude, la concentration en DPG (2,3-­‐diphospho glycérate) augmente de 50% (après 2 jours à 4000 m). Pourquoi ? Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie Cahier d'Exercices de Biochimie / PACES 2013 9 h. Par quel mécanisme l’oxyhémoglobine est elle capable de libérer plus de dioxygène dans les tissus à métabolisme rapide ? i. Du CO dégagé par un poêle mal réglé peut-­‐vous asphyxier en privant toutes vos cellules de l’apport d’O2. Pourquoi ? 3.2 Comparaison de l’hémoglobine fœtale et maternelle. a. Soient les courbes ci-­‐contre de saturation en O2 de l’hémoglobine fœtale et maternelle. Dans les conditions physiologiques, quelle est l’hémoglobine qui a la plus forte affinité pour O2 ? b. Quelle est la signification physiologique de ces différences d’affinité pour l’O2? c. Quand on supprime tout le 2,3 diphosphoglycérate (DPG) lié, les courbes se déplacent vers la gauche, supprimant la différence entre les 2 hémoglobines. • Quel est l’effet du DPG sur l’affinité des Hb pour l’O2 ? • Comment expliquer l’effet plus important sur l’HbA ? 3.3 Contraction musculaire Identifier sur le schéma ci-­‐dessous les protéines qui participent à ce mécanisme. a. Préciser la nature des interactions entre ces protéines. b. Classer ces protéines en protéines structurales et en protéines de régulation. Justifier votre réponse en décrivant brièvement le rôle de ces protéines. Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie Cahier d'Exercices de Biochimie / PACES 2013 10 3.4 Régulation de la contraction musculaire. Après un accident de ski, un patient suit une rééducation comprenant des séances de stimulation musculaire électrique externe : des électrodes parcourues par des pulsions régulières de courant très faible sont placées sur un muscle, ce qui conduit à des contractions musculaires successives. a. Décrire l’effet de cette stimulation musculaire électrique externe sur la contraction musculaire. b. Quelles protéines interagissent directement lors du raccourcissement du sarcomère ? Quel est le rôle de l’ATP dans ce phénomène ? c. La myasthénie est une maladie neuromusculaire chronique liée à un défaut de transmission entre le nerf et le muscle. La faiblesse musculaire augmente à l'effort et peut aboutir à une paralysie partielle du muscle concerné. Le repos améliore la force musculaire. -­‐ La myasthénie est-­‐elle une maladie auto-­‐immune ? Pourquoi ? -­‐ Quels anticorps faut-­‐il rechercher pour en faire le diagnostic ? 4. ENZYMOLOGIE 4.1 Généralités 4.1.1 4.1.2 Caractéristiques des enzymes. • Quelle est la fonction d’un enzyme ? • Quelle partie d'un enzyme est responsable de son activité ? de sa spécificité ? de son action de catalyseur? Expliquer. • Décrire les effets de la température ; de l’urée ; du β-­‐mercaptoéthanol ; des pH extrêmes sur l’activité d’un enzyme. L’absorption de la lumière (quantifiée par l’absorbance A) par un composé chromogène est proportionnelle à sa concentration et est maximale pour une longueur d’onde propre à ce chromogène. A Les spectres d’absorption de deux chromogènes, le NAD+ et le NADH,H+ sont donnés dans la figure ci-­‐contre. Donner les longueurs d’onde maximales d’absorption de ces deux chromogènes. Application : sachant que le lactate déshydrogénase catalyse la réaction : + + Pyruvate + NADH + H Lactate + NAD Proposer, compte tenu de ces résultats, une méthode de suivi de cette réaction. 4.1.3 Interprétez les différents effets immédiats du pH sur l’activité des 3 enzymes suivantes : papaïne, pepsine et trypsine. Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie 1 0,8 NAD 0,6 + NADH,H + 0,4 0,2 220 260 300 340 longueur d’onde (nm) 380 Cahier d'Exercices de Biochimie / PACES 2013 11 4.1.4 Qu'appelle-­‐t-­‐on protéolyse ménagée ? Donner un exemple en donnant les substrats et produits de la réaction : a. d'un enzyme pancréatique, b. d'une hormone peptidique 4.2 Enzyme Michaëlien 4.2.1 On étudie la variation de la vitesse d'une réaction en fonction de la concentration x d'enzyme. Tracer sur le même graphique : a. La courbe obtenue en présence d'une concentration 2x d'enzyme. b. La courbe obtenue en présence d'une même concentration x d'un enzyme qui aurait plus d'affinité pour le substrat. c. La courbe obtenue lorsque la réaction est effectuée à pH 1 à chaud (70°C). S 4.2.2 La constante de Michaelis de l’hexokinase pour le glucose est de 0,15 mM tandis quelle est de 1,5 mM pour le fructose avec des vitesses maximales pratiquement égales. a. Calculer pour chacun des deux oses les vitesses de réactions, exprimées en pourcentage de la vitesse maximale Vm, pour des concentrations initiales (c.à.d. au temps 0) de substrats égales à 0,15mM et 1,5mM. b. Lequel de ces deux oses présente l’affinité la plus grande pour l’hexokinase? c. Dessiner (en choisissant arbitrairement la vitesse maximale) les droites de Lineweaver-­‐Burke correspondant à chacun des deux oses. 4.2.3 L'addition d'un composé X dans une réaction enzymatique entraîne des modifications cinétiques responsables d'un déplacement de la courbe Vi = f(S ) selon le profil ci-­‐dessous (la flèche indique l'effet obtenu sous l'action de concentrations croissantes du composé X) Quelle est parmi les courbes présentées ci-­‐dessous (représentation de Lineweaver-­‐Burk) celle qui correspond à cette situation? Justifier votre réponse. Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie Cahier d'Exercices de Biochimie / PACES 2013 12 4.2.4 La succino-­‐déshydrogénase catalyse la réaction : -­‐ OOC-­‐CH2-­‐CH2-­‐COO-­‐ + FAD -­‐OOC-­‐CH=CH-­‐COO-­‐ + FADH2 succinate fumarate Pour étudier cette enzyme, on incube, à concentration constante d’enzyme, différentes concentrations de succinate et on mesure les vitesses initiales (exprimées en fumarate formé par unité de temps) en absence puis en présence de 2 effecteurs X1 et X2. Les résultats sont reportés dans le tableau et le graphique suivants : Succinate a. b. c. d. Vo ( µmol/l/min de fumarate) mmol/l sans effecteur effecteur X1 effecteur X2 1 3,3 1,75 2,0 2 5,0 3,00 3,0 4 6,6 4,5 4,0 8 8,0 6,30 4,75 Comment passe-­‐t-­‐on des valeurs du tableau à la représentation graphique ci-­‐dessus ? Déterminer graphiquement la valeur de Km et de Vmax en absence d’effecteur. A quel type d’effecteurs correspondent X1 et X2 ? Sachant que l’un des 2 effecteurs ajoutés est le malonate (qui diffère du succinate par un groupement CH2 : -­‐OOC-­‐CH2-­‐COO-­‐ ), indiquer lequel des 2 effecteurs X1 ou X2 peut correspondre au malonate. Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie Cahier d'Exercices de Biochimie / PACES 2013 13 4.3 Enzyme Allostérique 4.3.1 La phosphofructokinase (PFK) catalyse la réaction : Fructose 6P + ATP Fructose 1-­‐6 bisP + ADP L'activité de la PFK varie en fonction de la concentration en fructose 6P et en ATP de la manière suivante : • Quelle est la régulation par le fructose-­‐6P pour une concentration donnée d'ATP ? • Quel paramètre permet de caractériser la variation d'activité en fonction de la concentration en ATP ? • Quels sont les 2 rôles de l'ATP pour la PFK ? Vi Vm ATP faible ATP fort Fructose 6P 4.3.2 Soient trois enzymes différents E1, E2 et E3, qui sont activables dans certaines conditions : a. l’activation de E1 s’accompagne d’un changement de configuration quaternaire, sans changement de poids moléculaire ; b. l’activation de E2 s’accompagne d’une diminution de poids moléculaire de l’enzyme; c. l’activation de E3 est contrariée par l’addition d’une phosphatase. • Indiquer les modèles d’activation rendant compte de chacune de ces trois situations. • Donner un exemple de chacun des modèles. 5. 5.1 Problèmes de révision Purification d’une protéine On se propose de purifier, à partir de sérum humain, la protéine de transport plasmatique des hormones sexuelles, dénommée TEBG (testosterone estradiol binding globulin) » ou encore SBP (sex steroid binding protein). La TEBG présente la propriété de lier de façon non covalente et avec une forte affinité la testostérone et l’œstradiol. Cette propriété est mise à profit pour suivre les différentes étapes de la purification de la TEBG : après incubation du sérum avec de la testostérone radioactive qui joue le rôle de traceur, on suit le complexe TEBG-­‐testostérone radioactive en mesurant la radioactivité. Ces étapes sont résumées ci-­‐dessous : a. Traitement du sérum par du sulfate d’ammonium à 50% de saturation, ce qui provoque la précipitation de certaines protéines, tandis que d’autres restent solubles ; les protéines solubles et précipitées sont séparées par centrifugation. Quel est l’intérêt de ce traitement ? La radioactivité est mesurée dans le culot et dans le surnageant et on constate que seul le culot est radioactif : sur laquelle des fractions (culot ou surnageant) faut-­‐il poursuivre la purification ? b. La fraction choisie en (a) est placée dans du tampon phosphate 20 mM, pH 6, NaCl 50 mM. La solution ainsi obtenue est chromatographiée sur une résine échangeuse d’anions ; diverses protéines, dont une fraction radioactive, sont éluées par diminution progressive du pH jusqu’à 5. b.1 Sur quelle propriété des protéines est basée la chromatographie sur résine échangeuse d’ions ? b.2 Que peut-­‐on dire du pI de la TEBG ? Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie Cahier d'Exercices de Biochimie / PACES 2013 14 c. La fraction radioactive isolée en (b) est déposée sur une colonne de chromatographie par gel filtration (Sephadex G100) et éluée par un tampon phosphate 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7. Le profil d’élution est représenté sur le schéma ci-­‐dessous (DO = densité optique). La colonne de Sephadex G100 a été préalablement calibrée avec 4 protéines de masses moléculaires connues dont les volumes d’élution respectifs sont indiqués sur ce même schéma (flèches). DO 280 nm Radioactivité 94 kDA (10 ml) 10 68 kDA (30 ml) 20 30 43 kDA 60 ml) 40 50 60 30 kDA (80ml) 70 80 90 Ve (ml) c.1 Sur quelle propriété des protéines repose la filtration sur gel ? c.2 A quoi correspond la DO mesurée à 280 nm et que permet-­‐elle de suivre ? c.3 Peut-­‐on dire que la fraction radioactive isolée en (b) et chromatographiée ici était très pure ? c.4 Proposer une valeur de volume d’élution pour la TEBG. c.5 En utilisant la grille semi-­‐log ci-­‐dessous, donner une estimation du poids moléculaire de la TEBG. 100 PM (kDa) 70 50 30 20 10 0 10 20 30 40 50 Ve (ml) 60 70 80 90 d. Une aliquote de la fraction radioactive obtenue en (c) est analysée par électrophorèse en gel de polyacrylamide en conditions non dénaturantes (absence de SDS), à pH 7. Le gel ainsi obtenu est traité par le bleu de Coomassie (coloration spécifique des protéines) puis scanné dans un détecteur de radioactivité, ce qui permet de voir à quelle bande de l’électrophorèse est associée la radioactivité. Les résultats sont schématisés dans la figure ci-­‐dessous, A. d.1 Sur quelle propriété est basée l’électrophorèse utilisée ici ? Quelle est la différence avec l’électrophorèse pratiquée en présence de SDS ? d.2 Que peut-­‐on dire de la pureté de la fraction radioactive obtenue en (c) ? Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie Cahier d'Exercices de Biochimie / PACES 2013 15 e. Compte tenu des propriétés biologiques de liaison de la TEBG, proposer une technique de purification de cette protéine. f. On utilise la technique mentionnée en (e) et on obtient une nouvelle fraction radioactive que l’on analyse comme en (d) (figure ci-­‐dessous, B). Que peut-­‐on dire de cette dernière fraction obtenue, en terme de pureté ? A B Sens de migration dépôt + radioactivité Etape (d) + radioactivité Etape (f) g. Sur la fraction purifiée obtenue en (f) on étudie la structure quaternaire de la TEBG en utilisant la technique de filtration sur gel comme en (c), dans différentes conditions expérimentales : 1. dépôt dans des conditions natives. 2. dépôt après traitement par l’urée 8M. 3. dépôt après traitement par l’urée 8M et le mercaptoéthanol en excès. Les résultats sont résumés dans les figures suivantes : Proposer une interprétation de ces derniers résultats. 5.2 Caractérisation d’une enzyme. On s’intéresse à une enzyme E, ubiquitaire, dont on souhaite préciser les principales caractéristiques biochimiques. 5.2.1 On utilise comme source biologique du tissu musculaire obtenu par biopsie. Dans un premier temps l’échantillon est broyé et l’on obtient un lysat cellulaire. a. Ce lysat est centrifugé à basse vitesse (1000 x g). Le surnageant de cette première centrifugation est à nouveau centrifugé à 20000 x g. Que contient le culot de cette seconde centrifugation ? Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie Cahier d'Exercices de Biochimie / PACES 2013 16 b. On veut savoir si au moins l’un des organites ci-­‐dessus contient l’enzyme E. Pour cela, on détermine l’activité enzymatique du culot mentionné en (a) en présence d’un substrat spécifique de l’enzyme E. Les résultats des mesures sont représentés dans les 3 graphiques ci-­‐dessous : • Quelle est l’information apportée par chaque graphique ? c. Compte tenu de l’ensemble de vos connaissances et des données expérimentales, quel est, à votre avis, l’organite qui contient l’enzyme E ? 5.2.2. On répète la même expérience que celle réalisée dans le graphique B ci-­‐dessus en changeant quelques conditions : a. on diminue de moitié la quantité d’enzyme E. b. on réalise l’incubation après avoir chauffé le lysat cellulaire à 100°C pendant 30 minutes. c. on réalise l’incubation en présence d’un inhibiteur compétitif. Représenter les résultats attendus dans les 3 conditions sur les graphiques suivants : 0 10 20 30 40 Concentration du substrat Vitesse initiale Condition c Vitesse initiale Condition b Vitesse initiale Condition a 0 10 20 30 Concentration du substrat 40 0 10 20 30 40 Concentration du substrat NB : la courbe obtenue précédemment dans le graphique B (question 1) a été reproduite pour servir de comparaison. Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie Cahier d'Exercices de Biochimie / PACES 2013 17 5.2.3. On veut isoler la protéine responsable de cette activité enzymatique. Dans ce but on réalise une analyse biochimique de la fraction résultant de la centrifugation à moyenne vitesse. Le résultat est présenté dans la figure ci-­‐contre : pH3 pH10 a. Comment s’appelle cette analyse ? b. Sur quel critère sont séparées les protéines dans le sens horizontal ? c. Sur quel critère sont séparées les protéines dans le sens a b c vertical ? d. On découpe les spots notés de « a » à « g » et l’on mesure actin l’activité enzymatique spécifique de ces spots. Les résultats e d sont présentés sur le graphique suivant : f e • D’après ces résultats, quel est le spot qui contient l’enzyme E ? • Comment expliquer les résultats observés pour le spot g d ? 5.2.4. Pour vérifier l’hypothèse formulée ci-­‐dessus pour le spot « d », on réalise une expérience dans laquelle, la protéine contenue dans le spot « d » est soumise à plusieurs traitements dans des conditions standard de mesure de l’activité enzymatique : Traitement Résultat mesure de l’activité à pH 8 baisse d’activité incubation préalable avec une enzyme protéolytique forte augmentation d’activité incubation préalable avec de l’aspirine aucun effet Quelles conclusions pouvez-­‐vous en tirer ? Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie Cahier d'Exercices de Biochimie / PACES 2013 18 5.3 Transport d’O2. Des globules rouges (hématies) sont isolés à partir de sang de lapin et la fixation de l’oxygène à l’hémoglobine est mesurée à pH 7,2 en fonction de la pression partielle en oxygène. On obtient une courbe de saturation et on mesure une valeur de P50 égale à 26 mm Hg. Les hématies sont ensuite homogénéisées et la protéine hémoglobine est isolée et purifiée par différentes chromatographies. On étudie la fixation de l’oxygène sur la protéine purifiée et on observe une modification de la forme de la courbe de saturation sur les hématies intactes. a. Décrire cette modification. b. Quelle en est la cause ? c. La P50 est elle modifiée et si oui dans quel sens ? d. Les hématies intactes sont incubées à pH 7,6 et on mesure dans cette condition la courbe de saturation pour l’oxygène. Pour une pression partielle en oxygène de 26 mm Hg, le taux de saturation est-­‐t-­‐il supérieur ou inférieur à 50% ? e. A pH 7,2, on ajoute aux hématies du monoxyde de carbone de manière à obtenir une pression partielle en CO de 2,6 mm Hg. Quel est dans ces conditions le taux de saturation en oxygène pour une pression partielle en oxygène de 26 mm Hg ? Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie Cahier d'Exercices de Biochimie / PACES 2013 19 I I . B i o l o g i e m o l é c u l a i r e : é t u d e d e s a c i d e s n u c l é i q u e s Photographie en microscopie électronique d'une fourche de réplication déficiente chez un mutant de levure. Une anomalie lors de la réplication d'ADN serait l'un des mécanismes contribuant à l'instabilité génomique (Science-26 juil 2002 www.sciencemag.org) 1. TRANSCRIPTION 1.1 Déroulement de la transcription d’un gène. L’ADN génomique présenté ci-­‐dessous contient la totalité de la séquence d’un gène codant une protéine. Les segments nucléotidiques soulignés correspondent aux séquences d’ADN de ce gène retrouvées dans l’ARNm. 1 5’............................... CCTAGAGAAC TGTTCCTGGG GTCTGGGACC TTTGCGAAGG 3’............................... GGATCTCTTG ACAAGGACCC CAGACCCTGG AAACGCTTCC 41 CAAGGAAGGG GTAACAGGAT TTCGGGCAGT TGCCCCTGCA GGGCCAATCT AGGCAAGTCC CCTGCGCCAT GTTCCTTCCC CATTGTCCTA AAGCCCGTCA ACGGGGACGT CCCGGTTAGA TCCGTTCAGG GGACGCGGTA 111 GTCCCTTCGT CTCCTTCTTC CTATATACAG GCCTCCCTCC ACCTGTCTTC TCAGAGCAGG TATAGGCAAG CAGGGAAGCA GAGGAAGAAG GATATATGTC CGGAGGGAGG TGGACAGAAG AGTCTCTTCC ATATCCGTTC 181 CAGTGCTGCC GTGCTCACCT GGGCTATGGC TCTTCTTTCA GGTGGGTCTC CGACCCTGAC TTCAACGTGG GTCACGACGG CACGAGTGGA CCCGATACCG AGAAGAAAGT CCACCCAGAG GCTGGGACTG AAGTTGCACC 251 GGGTGTGGGT GGAGGCTGGC CAGAGGGCCC TGTCCACCCT GGGGGAGGAG AGCCCAGGCC CTGATTACCT CCCACACCCA CCTCCGACCG GTCTCCCGGG ACAGGTGGGA CCCCCTCCTC TCGGGTCCGG GACTAATGGA 321 AGTCCCTCTC CACAGCGTTT TCGGCCACCC AGGCACGGAA GGGCTTCTGG GACTACTTCA GCCAGACCAG TCAGGGAGAG GTGTCGCAAA AGCCGGTGGG TCCGTGCCTT CCCGAAGACC CTGATGAAGT CGGTCTGGTC 391 CGGGGACAAA GGCAGGGTTG AGCAGATCCA TCAGCAGAAG ATGGCTCGCG AGCCCGCGTG AGTGCCCAGG GCCCCTGTTT CCGTCCCAAC TAGTCTAGGT AGTCGTCTTC TACCGAGCGC TCGGGCGCAC TCACGGGTAA 461 GGAAGGGGTG TAGGCGAAGG GAGGAGACAG CTGGGCCATG CCATGATGAC CTGCCTCTGC TGCCTCAACC CCTTCCCCAC ATCCGCTTCC CTCCTCTGTC GACCCGGTAC GGTACTACTG GACGGAGACG ACGGAGTTGG 531 GAGGATCAGT GCGCGATGAC TTGGGGACAA AGGAGATGAT GGAGGCTAGC AGTCTGACGG CCTGGATATC CTCCTAGTCA CGCGCTACTG AACCCCTGTT TCCTCTACTA CCTCCGATCG TCAGACTGCC GGACCTATAG 601 TGTCCCCTTC TCCAGGACCC TGAAAGACAG GCTGCAGGCC CGTCTGGATG ACCTGTGGGA AGACATCACT ACAGGGGAAG AGGTCCTGGG ACTTTCTGTC CGACGTCCGG GCAGACCTAC TGGACACCCT TCTGTAGTGA 671 CACAGCCTTC ATGACCAGGG CCACAGCCAT CTGGGGGACC CCTGAGGATC TACCTGCCCA GGCCCATTCC GTGTCGGAAG TACTGGTCCC GGTGTCGGTA GACCCCCTGG GGACTCCTAG ATGGACGGGT CCGGGTAAGG 741 TCTGGGGAGC ATACTGTGTG CTCTCCCCAT CTCCAGCCCC TCCCTCTGGG TTCCCAAGTT GAAGCCTAGA AGACCCCTCG TATGACACAC GAGAGGGGTA GAGGTCGGGG AGGGAGACCC AAGGGTTCAA CTTCGGATCA 811 CTTCTGGAAT AAATGAAATA GATGTTTATG GCCTGGCGTG AGTATGTTTG ACTCTCATTT GGACCATGTC GAAGACCTTA TTTACTTTAT CTACAAATAC CGGACCGCAC TCATACAAAC TGAGAGTAAA CCTGGTACAG 881 TGAAAGCAGT GGCCTCACCA CTATCCCCAA AGCACACCCA TCACCCACTC CATTCCCTTG CTGCTCTTTC ACTTTCGTCA CCGGAGTGGT GATAGGGGTT TCGTGTGGGT AGTGGGTGAG GTAAGGGAAC GACGAGAAAG 951 GGTTAGAGCA CCACGCTCCC TGCTATGTGA CTGAGGTAGC ..............................3’ CCAATCTCGT GGTGCGAGGG ACGATACACT GACTCCATCG ..............................5’ a. b. c. d. Quelle est la définition d’un gène ? Quels sont les composants moléculaires nécessaires à la transcription ? Comment se fait l’initiation de la transcription ? Quelle partie de cette séquence peut participer à la régulation de l’expression d’un gène, notamment par un signal hormonal. ? Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie Cahier d'Exercices de Biochimie / PACES 2013 20 e. Parmi les « motifs » de cette séquence marqués en gras ( ggccaatct / tatata / gt / ag / aataaa / tatgtttg ) : -­‐ Quels sont ceux qui définissent l’orientation de la transcription ? En quoi définissent-­‐ils le brin sens, le brin matrice ? -­‐ Quels sont ceux qui définissent le début et la fin de la transcription ? -­‐ Quels sont ceux qui interviennent lors de la maturation du transcrit primaire ? -­‐ A quoi correspondent les segments soulignés dans cette séquence ? Quels « motifs » interviennent dans le processus qui permet de les réunir ? -­‐ Quel processus permet de retarder la dégradation en 3’ de l’ARN ? 1.2 1.3 La maturation des transcrits primaires d’ARN chez les Eucaryotes comporte un autre événement non évoqué dans l’exercice précédent : a. En quoi consiste-­‐t-­‐il ? b. Quelle est la particularité de la liaison ainsi établie ? c. Citez la ou les fonctions associées à cette modification. Un épissage alternatif à partir du site donneur de l’intron 2 d’un transcrit primaire contenant 7 exons (schématisé ci-­‐dessous) peut aboutir à plusieurs ARN messagers. exon 1 exon GU 2 A AG exon 3 exon 4 exon 5 exon 6 exon 7 . Quelles sont les différents ARNm qui peuvent être produits à partir de ce transcrit ? . Quelle est leur mode de formation ? . De façon générale, que permet l’épissage alternatif d’un gène pluri-­‐exoniques ? Au cours de l’excision-­‐épissage, une liaison phosphodiester se crée dans les introns libérés. . Précisez les caractéristiques de cette liaison : nucléotides et fonctions impliqués. 2. TRADUCTION 2.1 1 81 161 241 321 401 481 561 641 721 801 881 961 1041 1121 1201 1281 Expression du gène de l’apolipoprotéine E Séquence du gène codant pour l’Apolipoprotéine E humaine(allèle Epsilon 4). (Genbank : HUMAPOE4) GGAACTTGAT CAATTTGACT GGGAGGTGCT AAAACCCAGG CCAGCCGCCT ATCTCGGCTC CGCCCGCCAC TCCTGACCTT CCATCCCACT TTACATTCAT CTTGGCCCCC AAAGACCTCT GGGCTGCCCA AGTCCTACTC AGCTCAGGGG GGCTTGGGGA GACCCGCTAG GCTCAGAGAG CCAGAATCCT GGAATCTCAT TCCCATTTGC AGCCCCACTT ACTGTAACCT CACGCCTGGC AAGTGATTCG TCTGTCCAGC CCAGGCACAG AGAATGGAGG ATGCCCCACC GCCCGCCCTA AGCCCCAGCG CCTCTAGAAA GAGGAGGAGC AAGGTGGGGT GACAAGTCAT AACCTTAACC TTCACATGTG AAAGCCTCGA TCTTTTTTTT CCGCCTCCCG TAACTTTTGT CCCACTGTGG CCCCTAGCCC GAAAGGACAG AGGGTGTCTG TCCTTCCTCC TCCCTGGGGG GAGGTGAAGG GAGCTGGGAC GGGGGTGAGG GGGGAGAGCA Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie TTGCCCAAGG CAGAAGCACG GGGAGGGGGC CTTTTAGCAG CTTTTTTTGA GGTTCAAGCG ATTTTTAGTA CCTCCCAAAG TACTTTCTTT GGTCAGGAAA TATTACTGGG CTCTGCCCTG AGGGGGCGGG ACGTCCTTCC CCTGGGAAGC CAAGCAGCAG GCTGGACTGG TCACACAGCT GCTTCAAGCC TCCTGTGCTC GTGCATCATA GACAGTCTCC ATTCTCCTGC GAGATGGGGT TGCTGGGATT CTGGGATCCA GGAGGACTCT CGAGGTGTCC CTGTGCCTGG ACAGGGGGAG CCAGGAGCCG CCTGGCCTCC GGGACTGGAC GATGTAAGCC GGCAACTGGC CTGGAAACCA AAGGTCACAA CTGTTCCCAC CTCTTGCTGA CTCAGCCTCC TTCACCATGT ACAGGCGTGA GGAGTCCAGA GGGCGGCAGC TCCCTTCCTG GGCAGGGGGA CCCTATAATT GTGAGAAGCG AGGTAGTCTC CTGGGAAGGG ATAGCAGGAC AGACGAGATT CAATACCTGT CCAAAGAGGA CCCTCCCATC GGCTGGAGTG CAAGTAGCTA TGGCCAGGCT GCTACCGCCC TCCCCAGCCC CTCCACATTC GGGACTGTGG GAACAGCCCA GGACAAGTCT CAGTCGGGGG AGGAGAGCTA CTGGGCAGCA TCCACGAGTT CACGCCCTGG GGCAGCCAGG AGCTGTGATT CCACTTCTGT CAGTGGCGAG GGATTACAGG GGTCTCAAAC CCAGCCCCTC CCTCTCCAGA CCCTTCCACG GGGGTGGTCA CCTCGTGACT GGGATCCTTG CACGGGGATG CTCGGGGTCG GAGACGACCC GTCACTATCA 80 160 240 320 400 480 560 640 720 800 880 960 1040 1120 1200 1280 1360 Cahier d'Exercices de Biochimie / PACES 2013 1361 1441 1521 1601 1681 1761 1841 1921 2001 2081 2161 2241 2321 2401 2481 2561 2641 2721 2801 2881 2961 3041 3121 3201 3281 3361 3441 3521 3601 3681 3761 3841 3921 4001 4081 4161 4241 4321 4401 4481 4561 4641 4721 4801 4881 4961 5041 5121 5201 5281 5361 5441 TTATCGAGCA CCGTCGATTG AGAATGTGAA TTGAACCCCG TTAAATAGGG GGCTAACCTG TCCCCAGACT GGCGGGGCTT GGCCCCCTCT TCCTTGAGAT CTGTCGCCCA CTCAGCCTCC GTTTCACCAT TTACAGGCGT GGGCAGCTGT CGCTGGGCCG ACACCAGCCT GCTCTCAGCT CGCTGCACTC CCCTCACCCT CGGGGTCAGA AGAGCCGGAG ATTACCTGCG TGAGTGTCCC GCTAAGTCTT ATTCTCTCTC CCCTAGCTCT GATCCTCCCG TCTGCCTCTG TCTTGGGTCT TCCCGCCCTC ACTGACCCCG TGGAGGACGT GTGCGCCTCG GTACCAGGCC GCCGCGTGCG CGCGCGCGGA CAAGCTGGAG TGGTGGAAGA CCCAGCGACA GCAGCGGGAG ATCTGCTGGC CAGCCCCCTC CACCCAGGCT GTAGCTGGGA CCAGGCAGGT TGCCCGGCCT GCCTCCACCT CTAGGATTAA CTCAAGCGAT TTTGTAGAGA CAAAGTGCTG CCTACTGGGT GAGAACTTTA GGGAGAATGA GGAGAGGAAG AATGGGTTGG GGGTGAGGCC GGCCAATCAC GCTCGGTTCC TCTGAGGCTT AGGAGTTAGA GGCTGGAGTG CAAGTAGCTG GTTGGCCAGG GAGCCACCGC GATCTTTATT GTGGCTCACC GGGCAACATA ACTCAGGAGG CAGCCTGGGT GCCCACCATG AGGACCCTGA CCCGAGCTGC CTGGGTGCAG CATCCTGGCC GGGGGGCCTG TCAGCTTTGT TTTATATAGA CCTCGGCCTC CCCTCTGCAT CTCTGGCTCA TCGGCCGCAG GTGGCGGAGG GCGCGGCCGC CCTCCCACCT GGGGCCCGCG GGCCGCCACT TGGAGGAGAT GAGCAGGCCC CATGCAGCGC ATCACTGAAC ACCCTGTCCC CTCCCCCTGT CTCTCCATCT AGAGTGCAGT TTACAGGCTC CTCAAACTCC CTGCCCCTCT CCTGGACTCA TTTGGGGGGG ACTCCCACCT CAAGGTCTCA GGATTCCAGG GTCCCCAGTG AAATGAGGAC GGAATGCGAG ATGGAATTTT GGGCGGCTTG GGGTTGGGGG AGGCAGGAAG CCCCGCTCCT CTGTGCTGCT AGTTGTTTTG CAGTGGCGGG GGACTACAGG CTGGTCTGGA ACCTGGCTGG CTCCATCACC CCTGTAATCC GTGAGACCCT CTGAGGCAGG GACAGAGCAA GCTCCAAAGA CCCGACCTTG GCCAGCAGAC ACACTGTCTG CTTGACCCTC GGTCTCTGCT CTCTCTCTCT GACAGAGAGA CCAAAGTGCT CTGCTCTCTG TCCCCATCTC GGCGCTGATG AGACGCGGGC CTGGTGCAGT GCGCAAGCTG AGGGCGCCGA GTGGGCTCCC GGGCAGCCGG AGCAGATACG CAGTGGGCCG GCCGAAGCCT CGCCCCAGCC GATTTCCTCT GTGTCTGTGT GGCACGATCT ACACCACCAC TGACCAAGTG TTCTTTTTTA AGTGATAAGT GGTGGTGTGT TGGCCTCCTG ATATGTTGCC CATGGGCTCC 21 TCCTCAGATC TGAATTAGCT ACTGGGACTG CTATGGAGGC GTAAATGTGC CGCTGGGGGT ATGAAGGTTC CCCCCTCTCA TCCTGGCTCT TTGTTGTTGT ATCTCGGCTC CACATGCCAC ACTCCTGACC GAGTTAGAGG CCCACACAGC CAGCACTTTG GTCTCTACTA AGGATCGCTT GACCCTGTTT AGCATTTGTG AACTTGTTCC CGAGTGGCAG AGCAGGTGCA CTGGTGGGCG GGTTCTAGCT TCCCTTCTGA TGGGGTCTCA GGGATTAGAG CATCTGTCTC GCCCGCCCCA GACGAGACCA ACGGCTGTCC ACCGCGGCGA CGTAAGCGGC GCGCGGCCTC TGGCCGGCCA ACCCGCGACC CCTGCAGGCC GGCTGGTGGA GCAGCCATGC GTCCTCCTGG AAGCCCCAGC GTATCTTTCT TGGCTCACTG ACCCGGCTAA ATCCACCCGC GGGGGCAGGG GATCCTCCCG GTGGAGATGG AGTAGCTGAG CAGGCTAGTC GAGCGGCCTG TCCATAACTG CATAAATGGA AGATGGAACC CGACCTGGGG TGGGATTAGG GGGAGGAGTC TGTGGGCTGC TCCTCACCTC GAACAGCGAT TTGTTGTTGT ACTGCAAGCT CACACCCGAC TCAGGTGATC TTTCTAATGC CCTGCCTGGG GGAGGCCAAG AAAATACAAA GAGCCCAGAA ATAAATACAT GAGCACCTTC ACACAGGATG AGCGGCCAGC GGAGGAGCTG GCTATACCTC TCCTCTTCCC CTCAGTCTCT CTGTGTTGCC GCATGAGCAC TGTCTCCTTC TCCCAGCCCT TGAAGGAGTT AAGGAGCTGC GGTGCAGGCC TCCTCCGCGA AGCGCCATCC GCCGCTACAG GCCTGGACGA GAGGCCTTCC GAAGGTGCAG GACCCCACGC GGTGGACCCT CTCAGTTTCT CTCTGCCCTT CAACCTCTGC TTTTTGTATT CGGCCTCCCA AAAGGTCTCA CCTCAGCCTT GGTCTGGCTT ACTACTGGCT TCAAACCCCT CCCAACTTAA GGGAGCCAGG ACACGGCGCT GGCGGTGGGG ATGGGGAGAT CTGTTGCAGA CTCACTGGCG GTTGCTGGTC AACCTCCTGG TTGACGCTCT TGTTTTGTTT CCGCCTCCCA TAACTTTTTT TGCCCGTTTC ATTGCAGGCA GCACACAAGG GTGGGAGGAT AATTAGCCAG GGTCAAGGTT AATGCTTTCC TGTGTGCCCC CCAGGCCAAG GCTGGGAACT CTCAGCTCCC CCCAGGTCCA ATTTCTGACT CACACTCGTC CAGGCTGGTC CTTGCCCGGC TCTCGGCCTC TCTCCCCCGC GAAGGCCTAC AGGCGGCGCA ATGCTCGGCC TGCCGATGAC GCGAGCGCCT GAGCGGGCCC GGTGAAGGAG AGGCCCGCCT GCTGCCGTGG CACCCCGTGC AGTTTAATAA CTTTCTGCCC TTTTTTTTTT CTCTTGGGTT TTTAGTAGAG AAGTGCTGAG CCCTGTCACC TCCAGTAGCT TGTTGGCCAG AGCACCACCA GGCTCAAGAG TAATATTGTT GGCAGCGACA TAACTGTGAG AGGGGGTGGG AAGAGAAGAC TAATGCAACA GTTGATTGAC ACATTCCTGG CCCCATTCAG CTGGGCCTCG TTTTGAGATG GGTCCACGCC GTATTTTCAG GATCTCCCAA GATAGTGAAT ACACTCAATA CACTTGAGCC GCATGGTGCC GCAGTGAACC AAGTGATTAA TAGGTAGCTA GTGGAGCAAG GGCACTGGGT AGGTCACCCA GGTTTCATTC CCTGGCTTTA CTGGCTCTGT TTGAACTTCT CTCCTAGCTC TGCCCCGTTC CTCCCCACTG AAATCGGAAC GGCCCGGCTG AGAGCACCGA CTGCAGAAGC GGGGCCCCTG AGGCCTGGGG CAGGTGGCGG CAAGAGCTGG GCACCAGCGC CTCCTGCCTC AGATTCACCA ACATACTGCC TAGACGGAGT CAAGCGATTC ACGAGCTTTC ATTACAGGCC CGCCATCACA GAGACTACAG GCTGATGTGG CACCCAGCTT ATCCTCCGCC CCTAGAGTTG CGGTAGCTAG GTTGGAGCTT GGGATGGAAT CAGGAGGGAG AGGCTTGGAA AGTTTCTCCT CAGGTATGGG ACAGACCCTG GTTTCCCCCA AAGTCTCGCT ATTCTCCTGC TAGAGACGGG AGTGCTGGGA ACCAGACACG CATGCTTTTC CAGGAGTTCA ACACACCTGT ATGTTCAGGC ACCGACTCCC GATGCCTGGA CGGTGGAGAC CGCTTTTGGG GGAACTGAGG TGCCCCTGTC GCTCTCTGGA CTCTGTCCTT GGGCTCAAGC CTTCTTCGTC CTTCTCTCCC TGCGACACCC TGGAGGAACA GGCGCGGACA GGAGCTGCGG GCCTGGCAGT GTGGAACAGG CGAGCGGCTG AGGTGCGCGC TTCGAGCCCC CGCCCCTGTG CGCGCAGCCT AGTTTCACGC ACACAATTCT CTGGCTCTGT TGCTGCCTCA ACCATGTTGG TGAGCCACCA GCTCACTGCA GCGCATACCA AATTCCTGGG TTTATTATTA ATCGGCCTCC CACTC 1440 1520 1600 1680 1760 1840 1920 2000 2080 2160 2240 2320 2400 2480 2560 2640 2720 2800 2880 2960 3040 3120 3200 3280 3360 3440 3520 3600 3680 3760 3840 3920 4000 4080 4160 4240 4320 4400 4480 4560 4640 4720 4800 4880 4960 5040 5120 5200 5280 5360 5440 5515 La séquence ci-­‐jointe est celle du brin sens du gène de l'apolipoprotéine E humaine, allèle e4. Le dernier nucléotide de chaque ligne est numéroté sur la droite (n° de position). 2.1.1 Certaines parties de cette séquence ont été soulignées d'un trait simple; examinez avec soin le début et la fin des séquences qui sont situées entre ces séquences soulignées : à quoi correspondent les séquences soulignées ? 2.1.2 Quelles sont les fonctions (rôles) des protéines qui se fixent en premier sur ce gène dans la région allant du nucléotide 975 au nucléotide 1046 ? 2.1.3 Quel est le rôle du triplet de nucléotides en 1871-­‐1873 ? 2.1.4 Quelle est la traduction de la séquence 1847-­‐1913 de ce gène ? 2.1.5 Le nucléotide en position 1913 est un G qui fait partie de la séquence traduite : quelle est sa position dans le cadre de lecture : N1, N2 ou N3 ? 2.1.6 Le nucléotide en position 3007 est un G qui fait partie de la séquence traduite : quelle est a position dans le cadre de lecture : N1, N2 ou N3 ? Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie Cahier d'Exercices de Biochimie / PACES 2013 22 2.1.7 Quelle sera la longueur après transcription et maturation (comprenant l'addition de 1000 AMP du côté 3'-­‐OH) de l'ARN messager de l'apolipoprotéine E ? 2.1.8 Quel est le rôle du codon (souligné deux fois) TGA en 4496 ? 2.1.9 Quels sont les numéros des nucléotides de la boîte de polyadénylation ? 2.1.10 La sécrétion de la protéine hors des cellules nécessite l'hydrolyse d'un peptide de 18 acides aminés du côté N-­‐terminal. Quel est le rôle de ce peptide ? 2.1.11 De combien d'acides aminés se compose l'apolipoprotéine E mature ? 3ʼ Soit le schéma ci-­‐contre représentant un ARNt (avec son anticodon). 2.2 a. Quel est le nom de l'acide aminé transporté par cet ARNt ? b. Quel est le nom du nucléotide situé à l'extrémité 3' de cet ARNt ? c. Par quel type de liaison l'acide aminé sera-­‐t-­‐il lié à cet ARNt ? 5ʼ U A C 2.3 TRADUCTION Au cours de l’élongation du début de la protéine, un ribosome se trouve successivement dans les deux états ci-­‐dessous : -­‐ A gauche avant la synthèse de la liaison peptidique, le site P porte un ARNt lié au peptide Met-­‐Ala-­‐ Val. Le ribosome vient de recruter un ARNt chargé. -­‐ A droite, après la synthèse de la liaison peptidique, les 2 ARNt sont encore fixés aux sites P et A. Précisez les éléments présents aux sites P et A à ce stade du processus. 2.4 Combien de liaisons phosphates riches en énergie sont consommées dans la synthèse d'une protéine de 75 résidus d’acide aminé ? Justifiez votre réponse. 3. REPLICATION 3.1 La réplication La figure ci-­‐contre schématise la mise en place du processus de réplication d’un chromosome : en a est représenté une portion d’ADN bicaténaire et en b ce même ADN au tout début de la réplication. 1. A quoi correspondent les 2 flèches indiquées en a ? 2. A quoi correspondent les structures semi-­‐circulaires représentées en b ? Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie Cahier d'Exercices de Biochimie / PACES 2013 23 3. Quelles protéines enzymatiques interviennent pour générer ces structures semi-­‐circulaires et comment agissent-­‐elles ? 4. Quel est l’avantage pour la cellule de générer plusieurs de ces structures semi-­‐circulaires sur un même chromosome ? La progression de la réplication est schématisée en c et d : 5. Repérer en c les brins parentaux et les brins néo synthétisés d’ADN. 6. Dans cette représentation, avez-­‐vous un argument pour assigner une orientation 5’-­‐>3’ à l’un des brins parentaux ? 7. Proposer en e une représentation schématique du stade suivant de la réplication. 8. Nommer la partie encadrée de la figure c ? Cette partie encadrée est agrandie dans la figure ci-­‐dessous. 3’ 1 2 7 5 6 4 3 8 5’ 9. Sur Identifier dans la liste suivante les éléments de légende 1 à 8 : -­‐ Amorce -­‐ ADN polymérase δ -­‐ Brin direct (ou avancé) -­‐ Brin retardé -­‐ Fragment d’Okazaki -­‐ Primase + ADN polymérase α -­‐ Protéine SSB -­‐ Topoisomérase + hélicase 5’ 3 10. Sur ce schéma, dans quelle direction progresse la réplication ? 11. Quels sont les substrats de la primase ? de l’ADN polymérase α ? 12. Y a-­‐t-­‐il nécessité d’amorcer la synthèse d’ADN sur le brin direct ? 13. Pourquoi faut-­‐il plusieurs amorces pour la synthèse du brin retardé ? 14. Quelles sont les réactions catalysées par l’ADN polymérase δ ? 15. Le sens de lecture du brin parental par l’ADN polymérase δ est-­‐il le même sur les 2 brins de l’ADN à répliquer ? 16. Le brin direct est-­‐il toujours le même sur toute la longueur du chromosome ? Sur la figure, on a représenté 2 petits encadrés : ils délimitent 2 zones du brin néo synthétisé qui ont été le siège de réactions très précises ne laissant aucune de trace sur l’ADN final : 17. De quelles réactions s’agit-­‐il ? Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie Cahier d'Exercices de Biochimie / PACES 2013 24 3.2 Quel problème se pose lors de la réplication de l’extrémité des chromosomes ? Quelle activité enzymatique spécifique permet d’y répondre ? Quelle particularité structurale présente cette enzyme ? 4. PROBLEME DE REVISION: SEQUENCE, TRANSCRIPTION ET TRADUCTION DU GENE SPO II G. Cet exercice est organisé autour de l’exploitation d’une séquence nucléotidique. On se propose d’analyser cette séquence en vue d’étudier successivement : - le sens de transcription, - le cadre de lecture - l’enchaînement des acides aminés - une propriété biologique de la protéine, La séquence d’ADN représentée ci-­‐dessous est celle d’un fragment de 120 paires de bases entièrement contenu dans la partie traduite du gène spo II G de la bactérie Bacillus subtilis. 5’P 1 11 21 31 GAAAAAACTG AAATTACGGT TGACGCACCT CTGGTATAAG 41 51 CTGCTGATGA AACTTGGGCT GAAAAGTGAT GAAGTCTATT 81 91 ACATAGGCGG G A G T G A A G C C C T G C C G C C T CC A T T A T C T A A 61 71 101 111 3’ OH 1. Le sens de transcription a. Sachant que la séquence donnée est celle du brin sens, indiquer par une flèche sur la séquence ci-­‐dessous le sens de progression de la transcription. Justifier. G A A A A A A C T G A A A T T A C G G T...............G C C C T G C C G C C T C C A T T A T C T A A 1 11 101 111 2. Le cadre de lecture a. Théoriquement l’information génétique portée par l’ARNm peut être traduite de trois façons différentes. Pourquoi ? b. Donner dans le tableau I ci-­‐dessous les différentes séquences prises par les trois codons stop au niveau des trois brins d’acide nucléique. TABLEAU I 5’ P ➜ 3’ OH Séquences des codons non-sens 1er type ARNm brin d’ADN sens brin d’ADN transcrit Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie 2ème type 3ème type Cahier d'Exercices de Biochimie / PACES 2013 25 c. Avec des barres verticales, définir les trois cadres de lecture potentiels de la séquence étudiée. Dans chaque cas encadrer les codons stop. 1er CADRE DE LECTURE POTENTIEL 1 11 21 31 GAAAAAACTG AAATTACGGT TGACGCACCT CTGGTATAAG 41 51 CTGCTGATGA AACTTGGGCT GAAAAGTGAT GAAGTCTATT 81 91 ACATAGGCGG GAGTGAAGCC CTGCCGCCTC CATTATCTAA 61 71 101 111 2ème CADRE DE LECTURE POTENTIEL 1 11 21 31 GAAAAAACTG AAATTACGGT TGACGCACCT CTGGTATAAG 41 51 CTGCTGATGA AACTTGGGCT GAAAAGTGAT GAAGTCTATT 81 91 ACATAGGCGG GAGTGAAGCC CTGCCGCCTC CATTATCTAA 61 71 101 111 3ème CADRE DE LECTURE POTENTIEL 1 11 21 31 GAAAAAACTG AAATTACGGT TGACGCACCT CTGGTATAAG 41 51 CTGCTGATGA AACTTGGGCT GAAAAGTGAT GAAGTCTATT 81 91 ACATAGGCGG G A G T G A A G C C C T G C C G C C T CC A T T A T C T A A 61 71 101 111 d. Quel est le cadre de lecture effectivement utilisé pour la synthèse de la protéine ? e. Si au cours d’une expérience préliminaire on établit la séquence d’un seul brin d’un fragment d’ADN que l’on sait être interne à un gène, il est possible, au moins en théorie de déterminer le sens de la transcription. Comment ? 3. L’enchaînement des acides aminés Identifier sur la séquence ci-­‐dessous l’extrémité qui code pour la région N-­‐terminale du fragment protéique. Justifier. 1 11 111 GAAAAAACTG AAAT ................................CCTC CATTATCTAA Une propriété biologique de la protéine Le tableau II présente la composition en acides aminés du fragment protéique analysé. TABLEAU II Acide Ala Arg Asp Glu Gly His Ile Leu Lys Met Pro Ser Thr Trp Tyr Val 1 1 1 2 3 1 1 10 6 1 3 3 1 1 3 1 aminé Nombre Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie Cahier d'Exercices de Biochimie / PACES 2013 26 La protéine codée par le gène spo II G interagit avec l’ADN. Ce fait est-­‐il compatible avec la composition en acides aminés du fragment analysé ? Pourquoi ? 5. SOIT UNE SEQUENCE CODANTE DE 18 NUCLEOTIDES ADN ... CAT ... ATA DOUBLE -BRIN ... ARNm ... ANTICODON ... GAA ... GUC CAG des ARNt ACIDE lys trp AMINE a. Déterminer le sens de transcription. Justifier. b. Orienter l’ARNm, les deux brins de la molécule d’ADN et compléter le tableau. c. Orienter la chaîne polypeptidique en précisant les extrémités NH2 et COOH-­‐terminales. Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie Cahier d'Exercices de Biochimie / PACES 2013 27 ANNEXE I. CODE GENETIQUE 1er Nucléotide U C A G 2ème Nucléotide C A U G 3ème Nucléotide Phe Ser Tyr Cys U Phe Ser Tyr Cys C Leu Ser Stop Stop A Leu Ser Stop Trp G Leu Pro His Arg U Leu Pro His Arg C Leu Pro Gln Arg A Leu Pro Gln Arg G Ileu Thr Asn Ser U Ileu Thr Asn Ser C Ileu Thr Lys Arg A Met Thr Lys Arg G Val Ala Asp Gly U Val Ala Asp Gly C Val Ala Glu Gly A Val Ala Glu Gly G ANNEXE II. -­‐ Codes des acides aminés A : ala F : phe K : lys P : pro T : thr C : cys G : gly L : leu Q : gln V : val D : asp H : his M : met R : arg W : trp E : glu I : ile N : asn S : ser Y : tyr Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie Cahier d'Exercices de Biochimie / PACES 2013 28 I I I . S t r u c t u r e d e s g l u c i d e s e t d e s l i p i d e s 1. GLUCIDES Structure 3D du β-D-Glucose 1.1 Soit l’α-­‐D-­‐Glucose : a. Citer un énantiomère, un de ses épimères et un cétose correspondant à ce glucide. b. Quand cet ose est mis en solution dans l’eau, le pouvoir rotatoire est modifié, ce qui traduit l’existence d’une seconde forme du glucose. Expliquer. c. Comment peut-­‐on bloquer l’apparition du phénomène précédemment observé ? d. Est-­‐il capable de former des polymères ? Donner un exemple. e. L’oxydation du glucose peut conduire à différents acides. Indiquer leurs noms et leurs formules. f. Comment peut-­‐on mesurer la concentration de glucose dans le sang (glycémie) ? 1.2 Soient les glucides suivants : D-­‐glucose, L-­‐glucose, D-­‐glucosamine, D-­‐galactose, L-­‐mannose et D-­‐fructose. On demande à leur propos : a. le nom de ceux qui sont isomères optiques, b. le nom de ceux qui sont épimères , c. le nom de celui (ceux) qui possède(nt) un pouvoir réducteur 1.3 Les disaccharides les plus abondants sont le saccharose, le lactose et le maltose. a. Quelle est la composition en oses de ces sucres ? b. Comment appelle-­‐t-­‐on la liaison qui permet la formation d’un disaccharide et en quoi consiste-­‐t-­‐ elle ? c. Quelles osidases spécifiques permettent leur hydrolyse ? 1.4 Soit le β -­‐D-­‐fructofuranosyl(2-­‐1)α-­‐D-­‐glucopyranoside a. Ecrire sa formule développée. b. Par quelle enzyme ce sucre est-­‐il hydrolysé ? c. Comment peut-­‐on mesurer la concentration d’aldose obtenue après action de cette enzyme ? 1.5 Glycogène : a. Quelle est la nature du (ou des) ose(s) constitutifs ? b. Décrire les différents types de liaisons osidiques rencontrées dans cette molécule. c. Donner le nom et les caractéristiques spécifiques des enzymes digestives capables de dégrader le glycogène chez l’homme. d. Dans quels tissus ou organes du corps humain trouve-­‐t-­‐on des quantités importantes de glycogène ? Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie Cahier d'Exercices de Biochimie / PACES 2013 29 1.6 Décrire les analogies et les différences existant entre la structure de l'amidon et de la cellulose. a. Quelles enzymes spécifiques peuvent hydrolyser ces composés ? b. Quels sont les produits de digestion de l’amidon ? c. Pourquoi la cellulose n’est-­‐elle pas dégradée dans le tube digestif de l’homme ? 1.7 Soit le composé suivant (polymère où n = 1500) : a. De quels oses ou dérivés d’oses est-­‐elle constituée ? COO- b. A quelle classe de molécules appartient-­‐elle ? c. Citer les propriétés physicochimiques et biologiques de cette molécule. CH2OH O O O O OH d. Quel est le nom de l’enzyme qui hydrolyse cette molécule au niveau de la flèche ? HO NH OH CO-CH3 1.8 Soit le composé ci-­‐contre : a. Donner son nom. b. Pourquoi peut-­‐on parler de vitamine à son propos ? c. Donner son rôle physiologique. e. Quelle réaction réversible peut-­‐il subir dans l'organisme, réaction qui intervient dans son mécanisme d'action? CH2OH CHOH O O OH OH B. LIPIDES Structure 3D d’un exemple de triglycéride 2.1 Qu’est-­‐ce qu’une molécule amphipathique (amphiphile)? a. Pourquoi le pH a-­‐t-­‐il un influence sur l’hydrophilie des acides gras libres ? b. Cette influence est-­‐elle la même si l’acide gras estérifie du glycérol ? 2.2 Soient les acides gras suivants : C16 : 0 , C18 : 0, C18 : 1 (ω9) , C18 : 2 (ω6), C20 : 4 (ω6) et les points de fusion : -­‐ 43,5°C, -­‐ 5°C, 13°C, 63°C, 70°C a. Donner le nom des différents acides gras. Nos cellules peuvent-­‐elles tous les synthétiser ? b. Apparier acides gras et points de fusion. c. Quel aspect structural de ces acides gras peut-­‐être corrélé aux variations des points de fusion ? 2.3 Soit le 1-­‐palmitoyl-­‐2 linoléyl-­‐3 stéaroyl-­‐glycérol : a. Ecrire sa formule complète. Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie n Cahier d'Exercices de Biochimie / PACES 2013 30 b. A quelle classe de composés appartient-­‐il ? c. Est-­‐il un lipide de réserve ou de structure ? d. Quelle enzyme digestive est capable de l'hydrolyser ? e. Quels sont les produits finaux de cette dégradation ? 2.4 A quels types de lipides complexes appartiennent les deux composés ci-­‐dessous ? a. Expliquer leurs fonctions et comparer leurs propriétés. b. Quels constituants obtient-­‐on après actions enzymatiques spécifiques ? c. Quels éléments structuraux de ces lipides peut-­‐on retrouver dans les gangliosides ? 2.5 Donner la structure d'un glycérophospholipide estérifié en 1 par l’acide stéarique, en 2 par l’acide arachidonique et dont le composé en position 3 est un phosphoryl-­‐inositol. Citer les trois enzymes capables de l'hydrolyser et dont les produits d'hydrolyse sont à l'origine de "médiateurs" à activité biologique essentielle pour la cellule. 2.6 Soit le composé suivant : O OH CH2OH CH2OH HO CH2OH O OH NH OH O O OH O-CH2 -CH- CH-CH=CH-(CH2)12-CH 3 CO- (CH 2)22-CH3 O OH 3 a. A quelle classe appartient-­‐il NH-CO-CH ? OH b. Quelle est la nature de la liaison entre l’oligosaccharide et le reste de la molécule ? c. Comment ce composé est-­‐il orienté dans la membrane plasmique ? d. Quelles propriétés physico-­‐chimiques et biologiques peut-­‐on attribuer à la partie glucidique de ce composé ? e. Citer les produits obtenus à partir de ce composé par l’action d’une β glucosidase ? Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie Cahier d'Exercices de Biochimie / PACES 2013 31 2.7 Stérols a. Parmi les composés suivants, identifier : • le cholestérol • le 7-­‐dehydrocholestérol • la vitamine D3 b. Donner quelques caractéristiques de la structure du cholestérol en signalant les parties polaires et apolaires. 2.8 Soit le 1,25 dihydroxycholécalciférol. a. Ecrire sa formule (à partir d’une des molécules représentées dans l’exercice 2.7 b. Quel est son stérol précurseur dans la peau ? c. Comment ce précurseur se transforme-­‐t-­‐il en 1,25 dihydroxycholécalciférol ? d. Donner un autre nom du 1,25 dihydroxycholécalciférol. Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie Cahier d'Exercices de Biochimie / PACES 2013 32 I V . M é t a b o l i s m e é n e r g é t i q u e Image de couverture: Schéma fonctionnel de l'ATP synthase (Prix Nobel de chimie 1997: schéma tiré de http://www.nobel.se/chemistry/laureates/1997/illpres ) 1. GLYCOLYSE 1.1 Au cours de la glycolyse, le glucose (C6) est transformé en pyruvate (C3). a. Quelle enzyme est responsable de la scission de la molécule à 6 carbones en molécules à 3 carbones ? b. Quelles sont les caractéristiques de ces molécules à 3 carbones ? c. Cette préparation pour l'hydrolyse a nécessité quel(s) type(s) de modification du glucose ? d. Une seule de ces molécules à 3C poursuit directement sa transformation dans la voie métabolique pour être convertie en pyruvate. • Laquelle ? • Quel est le devenir de la deuxième ? e. Quel est le bilan énergétique de cette première phase de la glycolyse, dite phase préparatoire ? 1.2 a. Quelles sont les étapes irréversibles de la glycolyse ? b. Quelles sont les transformations métaboliques possibles du pyruvate produit lors de la glycolyse en conditions aérobie et anaérobie ? Comment varie la consommation de glucose dans l'un et l’autre cas ? c. Pourquoi pour mesurer le glucose sanguin (glycémie) ajoute t-­‐on du fluorure de sodium dans les tubes de prélèvement ? 1.3 On considère la voie métabolique partielle suivante : Donner le nom du composé (a). Compléter la formule de l’intermédiaire (d) et donner son nom Compléter les cadres (b), (c), (e) et (f) Donner le nom des enzymes Enz1 et Enz2 et préciser si l’ensemble de cette voie partielle est réversible ou non. e. Où et comment le composé du cadre (c) peut-­‐il fournir de l’énergie ? a. b. c. d. Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie Cahier d'Exercices de Biochimie / PACES 2013 33 1.4 On se propose de synthétiser in vivo de l’ATP radioactif marqué en position γ par du 32[P], isotope radioactif du phosphore. A cette fin, on dispose de phosphate de sodium marqué par du 32[P] et d’ADP non radioactif. a. Ecrire la formule simplifiée du produit radiomarqué. b. Quelle(s) réaction(s) de la glycolyse peuvent être choisie(s) pour obtenir de l’ATP radiomarqué ? c. Pour chaque réaction choisie préciser les substrats et coenzymes nécessaires 1.5 Soient les réactions suivantes : Sachant que les enzymes catalysant les réactions a et b ne sont pas identiques, • Ecrire la formule de X • Donner les noms des coenzymes intervenant dans les réactions a et b. • Donnez le nom et la localisation cellulaire des enzymes catalysant les réactions a et b. Que permettent ces réactions dans le métabolisme énergétique ? 2. CYCLE DE KREBS 2.1 Des acides α cétoniques peuvent subir une décarboxylation oxydative catalysée par des complexes multienzymatiques. Donner le nom du complexe O multienzymatique correspondant à la (a) CH -C-COOH CO2 3 voie métabolique représentée ci-­‐ OH contre. CH3 -C-H a. Donner les noms des composés (a) E TPP E TPP 1 1 et (b) b. Donner les noms des métabolites O attendus dans les cases S CH3 -C ~ S rectangulaires S H-S Préciser sur ce schéma : E2 E2 -­‐ les composés qui sont consommés. HSCoA E3 FADH2 NAD+ H-S O -­‐ le composées qui sont produits. H-S (b) E3 FAD CH3 - C ~S CoA NADH2 -­‐ les composés qui sont régénérés. E2 2.2 Le cycle de Krebs utilise 8 enzymes pour cataboliser l'acétyl CoA. a. Citez, sans les décrire, les 5 enzymes importantes pour la production d'énergie dans l'ordre de leur mise en jeu au cours de ce cycle. Citez aussi les substrats, les produits et le type de réaction catalysée (décarboxylation, oxydation, ...) par chacune de ces 5 enzymes. b. Ecrire une réaction nette équilibrée pour le catabolisme de l'acétyl-­‐CoA en CO2. Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie Cahier d'Exercices de Biochimie / PACES 2013 34 3. CHAINE RESPIRATOIRE MITOCHONDRIALE 3.1 Une préparation mitochondriale est incubée en présence de NADH, d'oxygène, d'ADP et de phosphate en concentrations non limitantes. On suit la consommation d'oxygène et la formation d'ATP, dans différentes conditions expérimentales. a. Ecrire la réaction globale d’oxydation du NADH, H+ par l’oxygène. i. Entre les 2 couples conjugués d'oxydo-­‐réduction, lequel à la tendance la plus grande à perdre ses électrons ? Pourquoi ? ii. Calculer la valeur de la variation du potentiel standard d'oxydo-­‐réduction ∆Eo' pour cette réaction de transfert d'électrons mitochondrial. iii. Calculer la variation d'énergie libre standard ∆Go' associée à cette réaction. iv. Combien de molécules d'ATP pourraient en théorie être formées par molécule de NADH oxydée au cours de cette réaction, si l'on prend l'énergie libre standard de synthèse d'ATP à partir d’ADP, égale à 30,5 kJ/mole ? v. Combien de molécules d'ATP sont synthétisées dans les cellules en temps ordinaire ? Quel est donc le rendement de conservation d'énergie au cours de ces réactions ? On donne : T = température absolue = 273°K + valeur °C ; R = 8,31 Joules/mole ; E°’ du couple NAD +/NADH+H+= -­‐ 0,32 volt ; E°’ du couple 1/2 O2 / H2O= + 0,81 volt • ∆Go' = -­‐nF ∆Eo' avec n = nombre d’électrons, F = constante de Faraday (96 KJ/volt/mole) b. Citer les 3 complexes d’oxydo-­‐réduction et les 2 transporteurs mobiles intervenant dans cette réaction. c. La chaîne des transporteurs d’électrons comprend un quatrième complexe qui n’intervient pas dans la séquence envisagée ici. Quel est ce complexe et pourquoi n’intervient-­‐il pas ? d. Etablir le bilan en moles d'ATP synthétisé et en oxygène consommé résultant de l'oxydation d'une mole de NADH. On incube cette même préparation en absence soit de NADH, soit d'oxygène, soit d'ADP, les autres constituants restant en concentrations non limitantes. e. En absence de NADH, H+ ou d'oxygène, indiquer dans quel état (oxydé ou réduit) vont se trouver les transporteurs d'électrons. f. Que se passe-­‐t-­‐il en absence d'ADP ? On répète cette incubation avec tous les substrats en concentrations non limitantes et en ajoutant l'un ou l'autre des effecteurs suivants : 1-­‐ amytal 2-­‐ antimycine 3-­‐ cyanure 4-­‐ atractyloside g. Préciser l'effet de ces effecteurs h. Etablir, comme dans la question d, le bilan en ATP et en oxygène. L'incubation est réalisée avec tous les substrats en concentrations non limitantes et en présence d'oligomycine. i. Quel est l'effet de l'oligomicyne et que devient alors le bilan en ATP et en oxygène. j. Que se passe-­‐t-­‐il si, en présence d'oligomycine, on ajoute du dinitrophénol dans le milieu d'incubation ? k. Localiser sur le schéma ci-­‐dessous de la chaîne respiratoire les différents éléments mentionnés tout au long de cet exercice Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie Cahier d'Exercices de Biochimie / PACES 2013 35 3.2 Quelle va être la destinée finale des hydrogènes provenant de l’oxydation du phosphoglycéraldéhyde par la phosphoglycéraldéhyde deshydrogénase: a. dans des conditions d’anaérobiose. b. dans des conditions d’aérobiose. 3.3 Au cours d'un tour de cycle de Krebs, la mise en jeu de certaines enzymes permet la production de 12 molécules d'ATP. Justifiez ce bilan en expliquant brièvement pour chacune des étapes le mécanisme de production d'ATP et la quantité de molécules d'ATP produite. 3.4 Le fonctionnement du Cycle de Krebs est dépendant d'un bon fonctionnement de la chaîne respiratoire mitochondriale. • Quelles sont les molécules solubles impliquées dans cette dépendance ? • Quelles sont les réactions du Cycle qui produisent ces intermédiaires ? • Si la chaîne respiratoire était inhibée, quelle serait la production de liaisons dites riches en énergie par le Cycle de Krebs ? Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie Cahier d'Exercices de Biochimie / PACES 2013 36 4. EXERCICES DE SYNTHESE 4.1 Au cours de la glycolyse intervient une étape d’oxydo-­‐réduction impliquant le NAD+/NADH,H+. a. Quelle est l’enzyme qui catalyse cette réaction d’oxydo réduction ? b. Indiquer dans la case (a), du schéma ci-­‐dessous, les substrats de cette réaction. Le NADH,H+ formé à cette étape peut être réoxydé selon 3 processus, qui dépendent des tissus concernés et des conditions physiologiques ; ils sont schématisés ci-­‐dessous, sous les accolades A, B et C. c. Pourquoi la réoxydation du NADH,H+ est-­‐elle indispensable ? d. Préciser les noms des compartiments cellulaires 1, 2 et 3. Répondre aux questions suivantes concernant chaque processus : e. Processus A - Comment appelle-­‐t-­‐on cette modalité de réoxydation du NADH,H+ ? - Indiquer les composés attendus dans les cases (b) et (c). - Une transformation enzymatique, non décrite ici, conduit à un intermédiaire dans les cases (d) : préciser le nom de cet intermédiaire. f. Processus B - Comment appelle-­‐t-­‐on cette modalité de réoxydation du NADH,H+ ? - Donner le nom et la formule du composé case (e) g. Processus C - Indiquer dans quels tissus et dans quel contexte physiologique intervient cette voie. - Donner le nom de l’enzyme qui catalyse cette réaction. h. Quel est le devenir de composé (c) et du FADH2 ? i. Comparer, sur le plan énergétique (en termes d’ATP formé) ces 3 processus de réoxydation. Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie Cahier d'Exercices de Biochimie / PACES 2013 37 4.2 Indiquer sur le tableau suivant les effets de l'absence d'oxygène, de la présence de dinitrophénol (DNP), de l'ajout d'amytal ou du déficit en isocitrate déshydrogénase sur la vitesse de la glycolyse, du cycle de Krebs, de la chaîne respiratoire, sur la consommation d'oxygène et sur la concentration sanguine de lactate Cycle de Krebs Glycolyse Chaîne respiratoire Consommation d'O2 [lactate] - O2 + DNP + amytal - isocitrate déshydrogénase 4.3 Chez un jeune enfant présentant des troubles neurologiques importants, on trouve une quantité abondante de fumarate dans les urines. Le dosage de certains enzymes du tissu hépatique donne les résultats suivants activité enzymatique en nmol/min/mg de protéines patient sujet normal fumarase 0.12 70- 90 citrate synthase 125 100- 150 succinate déshydrogénase 33 20-60 1300 900-1600 lactate déshydrogénase 1-­‐ Quelle activité enzymatique hépatique est déficiente chez ce patient? 2-­‐ Ces résultats permettent-­‐ils d'expliquer l'augmentation de fumarate dans les urines ? 3-­‐ Dans quelle voie métabolique est formé le fumarate? 4-­‐ Quel est le nom de l'enzyme qui synthétise le fumarate? 5-­‐ Quel(s) type (s) de réaction catalyse cet enzyme? (entourer la ou les bonne(s) réponse(s) a-­‐ une décarboxylation b-­‐ une déshydrogénation c-­‐ une oxydoréduction d-­‐ une isomérisation e-­‐ une phosphorylation 6-­‐ Dans quel compartiment cellulaire se trouve cet enzyme? 7-­‐ Quel est le coenzyme nécessaire à cet enzyme? 8-­‐ On mesure une quantité importante de lactate dans le sang de ce patient. On considère que cette augmentation de lactate est due à la déficience enzymatique constatée chez ce patient. Donner les conséquences de cette déficience sur le fonctionnement : ralentissement accélération - du cycle de Krebs - de la chaine respiratoire - de la glycolyse • • Quel enzyme est responsable de la production de lactate ? Pourquoi le taux de lactate augmente-­‐ t-­‐il chez ce patient ? Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie inchangé Cahier d'Exercices de Biochimie / PACES 2013 38 V . M é t a b ol i s m e g l u c i do -­‐ l i pi d i q u e 1. METABOLISME DU GLYCOGENE 1.1 Le glucose présent dans la lumière intestinale après un repas va être en grande partie stocké dans les cellules hépatiques et musculaires (sous forme de glycogène). a. Indiquer les protéines membranaires que vous connaissez qui sont directement mises en jeu dans le transport du glucose en précisant pour chacune d’elle sa localisation tissulaire et éventuellement cellulaire et les caractéristiques du transport. b. L’élévation de la glycémie résultant de cette absorption digestive de glucose va favoriser indirectement son stockage sous forme de glycogène : • indiquez par quels mécanismes 1.2 a. Décrire les étapes enzymatiques de la dégradation d’une unité glucose engagée dans une liaison α 1-­‐4 du glycogène en acide lactique. b. Quel est le bilan énergétique de cette dégradation ? c. Mêmes questions pour une unité glucose liée en α 1-­‐6. 1.3 Un patient présente une fatigue musculaire lors d’exercices intenses. L’activité de la glycogène-­‐ phosphorylase en réponse aux ions calcium est mesurée dans un extrait cellulaire de muscle et les résultats figurent ci-­‐dessous : Expliquez brièvement au vu de ces résultats les signes cliniques observés chez ce patient. Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie Cahier d'Exercices de Biochimie / PACES 2013 39 2. NEOGLUCOGENESE 2.1 Néoglucogenèse à partir du pyruvate. a. Compléter le schéma ci-­‐dessous au niveau des substrats et des enzymes manquants. b. Quelles sont les étapes spécifiques de la néoglucogenèse permettant de transformer le PEP en glucose ? c. Quels sont les autres substrats de la néoglucogenèse? d. Cette voie est fortement régulée par l’état nutritionnel, notamment pour l’expression de l’enzyme catalysant la formation de phosphoénol-­‐pyruvate. Quelles sont les hormones concernées et les conséquences sur le métabolisme glucidique ? Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie Cahier d'Exercices de Biochimie / PACES 2013 2.2 40 Régulation de la Glycolyse et de la Néoglucogenèse. La concentration de fructose-­‐6P est régulée principalement par l’action de la phosphofructokinase-­‐1 (PFK-­‐1) et de la fructose 1,6 bisphosphatase (FBPase), par les réactions suivantes : Fructose-­‐6P + ATP Fructose-­‐1,6 bisphosphate + ADP Fructose-­‐1,6 bisphosphate + H2O Fructose-­‐6P + Pi L’effet du Fructose 2,6 bisphosphate est testée sur l’activité de ces deux enzymes : a. Interpréter les résultats obtenus. Que pouvez-­‐vous en conclure ? b. Quelles sont les autres constituants moléculaires pouvant intervenir dans la régulation de l’activité de ces 2 enzymes ? c. Quelle est la régulation de la synthèse du Fructose 2,6 bisphosphate dans le foie ? d. Indiquer la signification métabolique de chacun des ligands allostériques de la PhosphoFructoKinase 1. Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie 4 Lactate (mM) 2.3 Variation du lactate sanguin lors d’un exercice intense. Les concentrations de lactate dans le plasma sanguin avant, pendant, et après un sprint de 400 m sont représentées sur le graphe ci-­‐contre : a. Pourquoi existe-­‐t-­‐il une augmentation rapide de la concentration de lactate dans le sang ? Quelle est son origine ? b. Quelle est la cause de la chute de la concentration de lactate après la fin de la course ? Que devient-­‐il ? c. Pourquoi la concentration de lactate sanguin n’est-­‐elle pas nulle en dehors des périodes d’exercice musculaire intense ? 3 2 1 Cahier d'Exercices de Biochimie / PACES 2013 41 3. METABOLISME DES LIPIDES 3.1 Destinée des triglycérides alimentaires. Compléter le schéma ci-­‐dessous au niveau du texte et des réactions des voies métaboliques empruntées. Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie Cahier d'Exercices de Biochimie / PACES 2013 42 Synthèse et destinée des triglycérides dans le foie et dans le tissu adipeux 3.2 a. La synthèse des triglycérides nécessite l’activation des acides gras R-­‐COOH : écrire cette réaction d’activation, en indiquant tous les substrats et produits impliqués ainsi que le nom de l’enzyme qui catalyse la réaction. b. Les acides gras ainsi activés réagissent avec le glycérol phosphate. - Dans le foie, deux substrats peuvent conduire au glycérol phosphate : quels sont ces substrats, d’où proviennent-­‐ils et comment donnent-­‐ils du glycérol phosphate ? - Dans le tissu adipeux la formation de glycérol phosphate est-­‐elle identique à celle qui a lieu dans le foie ? Commenter. c. Préciser la destinée des triglycérides -­‐ dans le foie ; -­‐ dans le tissu adipeux. 3.3 Quelle est l’origine principale des acides gras utilisés comme source d’énergie par les muscles ? • Quel(s) enzyme(s) est impliqué ? • Ce(s) enzyme(s) sont-­‐ils régulés ? 3.4 3.5 Quel est le rôle de la carnitine dans le métabolisme des acides gras ? La β oxydation des acides gras : a. Indiquez sa localisation dans la cellule. b. Compléter le schéma ci-­‐contre: c. Quelles sont les autres sources d’acétyl-­‐ CoA pour une cellule en fonction des conditions nutritionnelles ? Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie Cahier d'Exercices de Biochimie / PACES 2013 3.6 43 La dégradation complète du radical palmityl du palmitoyl-­‐CoA est effectuée avec des mitochondries de cœur dans un milieu tamponné approprié. a. Combien de tours sont-­‐ils nécessaires pour l’oxydation complète ? b. Quel sera le rendement théorique maximum en liaisons « riches en énergie » en l’absence et en présence de dinitrophénol (chiffre rapporté à 1 mole de palmitoyl-­‐CoA) ? c. Que se passe t-­‐il en absence d’oxygène ? Justifier brièvement votre réponse. 3.7 Synthèse des acides gras a. Quel est le substrat de la lipogenèse? b. D’où provient-­‐il? c. Remplir les cases du schéma ci-­‐dessous : • Donner le nom des enzymes 1, 2 et 3. Citer leur(s) coenzyme(s) d. Quelle la régulation de l’enzyme 2 ? e. Quel est le devenir du produit de l’enzyme 2? f. Si la sérine de l’acétyl-­‐CoA carboxylase qui est la cible de la phosphorylation par la protéine kinase A (PKA), est mutée en alanine, quelles sont les conséquences attendues sur le métabolisme des acides gras ? Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie Cahier d'Exercices de Biochimie / PACES 2013 44 4. REGULATION DU METABOLISME DES GLUCIDES ET DES LIPIDES EN PHYSIOPATHOLOGIE 4.1 Interrelations des voies métaboliques dans le foie Renseigner dans le schéma ci-­‐dessous les noms des voies métaboliques (dans les ellipses) et les noms des enzymes impliquées (dans les rectangles). 4.2 Quelles sont les voies métaboliques mises en jeu au moment de la néoglucogenèse ? • Dans quels tissus sont-­‐elles localisées ? • Quels sont les substrats et les produits de ces voies ? 4.3 Quelle est l’origine des acides gras utilisés comme substrats énergétiques par la cellule musculaire ? • Quel type de muscle est concerné ? • Dans quelles conditions physiologiques la cellule musculaire utilise-­‐t-­‐elle des acides gras ? • Ce muscle a-­‐t-­‐il d’autres sources énergétiques : lesquelles ? Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie Cahier d'Exercices de Biochimie / PACES 2013 4.4 45 Les individus ayant des problèmes de surcharge pondérale, doivent faire attention non seulement à leur alimentation lipidique (TG) mais aussi à leur alimentation glucidique. Bien que le glucose soit stocké sous forme de glycogène, seules 5 % des réserves énergétiques le sont sous cette forme. Que se passe-­‐t-­‐il quand l’alimentation contient un excédent glucidique ? 4.5 Que se passe-­‐t-­‐il en l’absence de carnityl palmitoyl transférase (CPT 1) ? Justifier votre réponse. • Existe-­‐t-­‐il dans la cellule un inhibiteur physiologique de la CPT 1 ? Si oui, citer le et dire dans quelle circonstance physiologique ses effets seront sensibles. 4.6 β -­‐hydroxybutyrate a. Dans quel(s) organe(s), compartiment cellulaire et circonstance a lieu sa synthèse ? b. Compléter les cases vides du schéma c. Dans quels tissus et dans quel compartiment de la cellule a lieu cette série de réactions ? d. Quelle est l’origine métabolique du co-­‐substrat de la réaction 2 ? ! Hydroxybutyrate Enz.1 : déshydrogénase 1 Enz.2 : CoA transférase 2 Enz.3 : 3 Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie Coenzyme A 2 Acétyl-CoA