Pascale MOSONI
publicité
Interaction in vivo entre trois espèces bactériennes fibrolytiques majeures du rumen Pascale Mosoni1, Carl Yeoman2, Pascale Lepercq1, Gérard Andant1, Bryan White2, Evelyne Forano1 1UR454, 2University Microbiologie, Clermont-Fd / Theix, France of Illinois, Urbana-Champaign, USA Le Rumen Ecosystème microbien complexe Anaérobie strict assure la digestion des fibres végétales ingérées par le ruminant Bactéries 1011 cell/ml Archaea 107 cell/ml Protozoaires 106 cell/ml Champignons 105 zoosp./ml Rôle essentiel des bactéries fibrolytiques Les bactéries fibrolytiques cultivables 109 – 1010 cell/ ml contenu ruminal 3 espèces bactériennes majeures Adhèrent aux fibres végétales et dégradent cellulose, hémicelluloses … et fermentent sucres Compétition entre ces 3 espèces dans l’adhésion et la croissance sur cellulose in vitro 1 . Fibrobacter succinogenes Gram - 2. Ruminococcus albus 3. Ruminococcus flavefaciens Gram + Interaction in vivo ? Les enzymes de la fibrolyse Cellulose (b1-4 Glucose)n Cellobiose GH3 … GH48 … Carbohydrate-Active Enzymes Glycoside Hydrolases GH5 – GH9 … Database Cazy http://www.cazy.org/ GH1 …GH129 Carbohydrate esterases CE1 …CE16 Polysaccharide lyases PL1 …PL22 Analyses génomiques GH94 GH95 GH116 GHnc 1 GH77 1 1 2 GH74 1 GH57 3 GH54 1 GH2 2 GH48 1 GH3 3 GH43 14 GH39 1 GH30 3 GH27 1 GH42 1 GH8 6 GH16 4 GH23 GH18 3 2 GH13 3 GH = 100 GH5 14 GH = 96 GH25 9 GH98GH105 GH113 1 1 1 GHnc GH124 1 1 GH4 GH2 1 GH3 3 5 GH94 2 GH77 GH95 1 1 GH51 GH73 1 1 GH53 1 GH67 GH74 1 2 GH5 13 GH44 1 GH39 1 GH43 7 GH9 8 GH36 3 GH31 1 GH30 GH10 6 GH24 1 GH18 1 GH16 GH13 5 4 GH11 11 R. flavefaciens FD1 GH8 1 GH = 100 Berg Miller et al. Plos One 2009 GH10 5 2 GH28 1 GH27 2 GH9 12 GH26 6 R. albus 7 GH48 1 F. succinogenes S85 GH2 2 GH31 1 GH10 8 GH11 4 GH43 10 GH36 1 GH9 9 GH26 5 GH105 1 GH3 6 GH44 2 GH5 12 GH45 4 GH44 1 http://www.cazy.org/ 1 GH53 GH51 2 2 GH97 GH77 GH95 2 1 GH94 1 1 GH53 1 GH74 1 GH26 8 GH25 5 GH23 1 GH13 5 GH16 2 GH11 5 GH = Glycoside Hydrolases Questions 1. Comment ces trois espèces interagissent-elles in vivo ? Compétition ? 2. Comment expriment-elles leur potentiel fibrolytique in vivo ? Régulations ? 3. Quelles sont les conséquences de ces interactions sur le métabolisme global de l’écosystème ruminal? Modèle animal à flore fibrolytique contrôlée Animal conventionnel Age Implantation de : Naissance Bactéries anaérobies facultatives / strictes 2 à 7 jours Bactéries fibrolytiques et archaea méthanogènes 7 à 10 jours Champignons 3 à 7 semaines Protozoaires Gerard FONTY studies Agneaux de 17h mis en isolateur stérile F. succinogenes S85 Methanobrevibacter sp. 5 10 R. albus 8 R. flavefaciens FD1 Cannulation 15 20 Euthanasie 30 25 semaines Animal en isolateur Periode 1 F. succinogenes seul Periode 2 Interaction + Deux agneaux en isolateur : n°421 and n°455 F. succinogenes seul Interaction Analyses Quantification (qPCR) des 3 espèces fibrolytiques et des bactéries totales Métagenomique / Métatranscriptomique / Métabolomique Illumina HiSeq / RNASeq GC-MS Questions 1. Comment ces trois espèces interagissent-elles in vivo ? Compétition ? 2. Comment expriment-elles leur potentiel fibrolytique in vivo ? Régulations ? 3. Quelles sont les conséquences de ces interactions sur le métabolisme global de l’écosystème ruminal? qPCR (Sybr green, ADNr 16S) - Agneau 421 F. Succinogenes seul Après inoculation de R. albus + R. flavefaciens Période 1 Log copies rrs / g contenu ruminal Période 2 Bactéries totales F. succinogenes R. albus R. flavefaciens Semaines Compétition in vivo entre F. succinogenes S85 et les deux ruminocoques, surtout R. albus 8 Métagenome - Agneau 421 F. Succinogenes seul Total nt binned (Gb): 2.61 4.5 4.7 Copies génomes / Gb métagénome Periode 2 Log copies rrs / g contenu ruminal Periode 1 Après inoculation de R. albus + R. flavefaciens Bactéries totales F. succinogenes R. albus R. flavefaciens Semaines Profondeur suffisante pour capturer les génomes entiers des bactéries inoculées Bonne couverture de génome (entre 30x et 109x) Quantification métagenomique reflète l’abondance des espèces mesurée par qPCR Questions 1. Comment ces trois espèces interagissent-elles in vivo ? Compétition ? Oui 2. Comment expriment-elles leur potentiel fibrolytique in vivo ? Régulations ? 3. Quelles sont les conséquences de ces interactions sur le métabolisme global de l’écosystème ruminal? F. succinogenes R. albus + R. flav. + F. succ Métatranscriptome / cellulases - Agneau 421 Période 1 F. succinogenes seul Métatranscriptome Cellulases 9384 lectures 33 Période 2 R. albus + R. flav. + F. succ Métatranscriptome Cellulases 121276 lectures (x3) 82 1. GH5 16% 1. CBM4_9 - GH9 29% 2. GH9 – Fn3 (CBP1) 13% 2. GH48 (Cel48A) 24% 3. GH9 – Fn3 12% 3. GH5 4.6% Total 41% 8. GH5 - Doc1 2.5% Total 60% Cellulases (génome) GH5 GH9 GH48 F. succinogenes S85 12 9 0 R. albus 7 13 8 1 R. flavefaciens FD1 14 12 1 GH = Glycoside Hydrolases Augmentation des transcrits « cellulase » en période 2 Les trois espèces fibrolytiques régulent l’expression de leur potentiel cellulolytique in vivo Questions 1. Comment ces trois espèces interagissent-elles in vivo ? Compétition ? Oui 2. Comment expriment-elles leur potentiel fibrolytique in vivo ? Régulations ? Oui 3. Quelles sont les conséquences de ces interactions sur le métabolisme global de l’écosystème ruminal? Profils métaboliques Agneaux 421 - 455 Bas Haut F. su. I II III 455-Sem.27 421-Sem.27 F. su. + R. alb. + R. flav R. alb + R. flav. + F. su 421-Sem.31 455-Sem.29 421-Sem.33 455-Sem.33 >150 métabolites: La composition de la communauté fibrolytique impacte le métabolisme global de l’écosystème Questions / Réponses 1. Comment ces trois espèces interagissent-elles in vivo ? Compétition in vivo au sein de la communauté fibrolytique (F. succinogenes dominé par Ruminocoques) 2. Comment expriment-elles leur potentiel fibrolytique in vivo ? Régulations ? Nombre limité de gènes GH exprimés par les trois souches – Régulations in vivo 3. Quelles sont les conséquences de ces interactions sur le métabolisme global de l’écosystème ruminal? Shift du métabolisme global de l’écosystème en réponse à la composition de la communauté fibrolytique Remerciements France Evelyne Forano Pascale Lepercq (qPCRs) Gerard Andant (Analyses bioch.) Univ. Illinois (Méta-omiques) Carl Yeoman Bryan White Gerard Vert (Exp. animale)
