maladie de marek : virulence des particules herpès

MALADIE DE MAREK : VIRULENCE DES
PARTICULES HERPÈS ENVELOPPÉES, APRÈS
ISOLEMENT ET PURIFICATION
L. Cauchy
To cite this version:
L. Cauchy.
MALADIE DE MAREK : VIRULENCE DES PARTICULES HERPÈS
ENVELOPPÉES, APRÈS ISOLEMENT ET PURIFICATION. Annales de Recherches
Vétérinaires, INRA Editions, 1974, 5 (2), pp.223-232. <hal-00900802>
HAL Id: hal-00900802
https://hal.archives-ouvertes.fr/hal-00900802
Submitted on 1 Jan 1974
HAL is a multi-disciplinary open access
archive for the deposit and dissemination of scientific research documents, whether they are published or not. The documents may come from
teaching and research institutions in France or
abroad, or from public or private research centers.
L’archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est
destinée au dépôt et à la diffusion de documents
scientifiques de niveau recherche, publiés ou non,
émanant des établissements d’enseignement et de
recherche français ou étrangers, des laboratoires
publics ou privés.
MALADIE DE MAREK :
VIRULENCE DES PARTICULES HERPÈS ENVELOPPÉES,
APRÈS ISOLEMENT ET PURIFICATION
L. CAUCHY
Station de Pathologie aviaire,
Centre de Recherches de Tours, I. N. R. A.,
Nouzilly B.P. 1, 3i380 Monnaie
RÉSUMÉ
Dans la maladie de Marek, les suspensions virales contiennent deux types de particules (enveet nues). Dans cette étude, les formes dites enveloppées, extraites des follicules plumeux,
sont traitées de manière à les isoler tout en conservant leur virulence sur poulets sensibles. Les
techniques de centrifugation différentielle et de centrifugation en milieux concentrés sont employées. La sédimentation de ces grosses particules peut s’effectuer à z
o t/mn pendant 15 mn.
00
4
La purification est la meilleure dans un gradient de saccharose où les particules enveloppées forment
. Les
après 2 heures une bande « lourde » dans les concentrations comprises entre 47 et 50 p. 100
particules isolées par ces procédés conservent leur virulence pour les poulets pendant 24 heures au
moins ; elles sont détruites en moins de 30 minutes par un détergent dilué. Ces propriétés des
virus enveloppés, comparées à celles d’autres virus du groupe Herpès, semblent particulières au
virus de la Maladie de Marek.
loppées
INTRODUCTION
La Maladie de Marek, provoquée par l’action d’un virus de groupe Herpès,
est une maladie très
contagieuse des volailles. Elle se traduit par une infection persisd’une
forte excrétion virale et par l’apparition de tumeurs lymaccompagnée
localisées
dans les nerfs périphériques et dans certains organes
phoïdes principalement
ou tissus. Dès que fut connu le rôle d’un virus Herpès dans l’étiologie de cette affection (C
GG 1
I
B
,
,S
HURCHILL
) les propriétés physico-chimiques du virus ont été
7
6
9
recherchées. Les études ont abouti à ce paradoxe apparent de trouver :i
tante
1°
des virus très fragiles (strictement associés
sang et des
tumeurs,
et dans
aux
les cultures cellulaires ;
cellules)
dans les cellules du
2! des virus très résistants dans les squames provenant des plumes, responsables
de la dissémination naturelle de la maladie. Les descriptions de l’agent virulent ont
montré que les particules virales nucléaires acquièrent une enveloppe pendant le
franchissement de la membrane nucléaire ; cette enveloppe est surtout facile à révéler
dans les cellules de l’épithélium folliculaire des plumes (N
, WiTTER, 1970
RIAN
>~
AZ
;§
a
ce
de
les
virions
de
Cnr,N>~x et al., o),
résistance,
qui
permis
que
grande
97
z
penser
agents de la maladie naturelle, sont justement ces formes enveloppées ou enrobées
). Les particules nucléaires non enveloppées sont rencontrées dans
(CAUCt!, 1970
les extraits cellulaires dont la virulence éphémère est liée à la survie des cellules.
catégories de particules a été recherché à partir de diffé;
(GI.ASER ! al., ig6
), les cultures infectées (LE
9
E
et al., 1971
N
E
H
C
et al., a;
ALNEK
et
97 LEE et al., 2),
z
97 les follicules plumeux et les plumes (C
z
s et al., I9!I).
AN
., i97
al
o; £v
Partant de la constatation que les cellules de l’épithélium folliculaire des plumes
portent à la fois des particules nues dans leurs noyaux et des particules enveloppées
dans leur cytoplasme, les travaux rapportés ici soulignent que cette source de virus
peut être intéressante pour l’étude de la séparation des deux formes virales et de leur
L’isolement de
ces
deux
rents matériels : le sang
virulence.
MATERIELS
ET
TECHNIQUES
Le virus
Des poulets de type Leghorn d’un élevage indemne de Maladie de Marek (C
, 1970
AUCHY
)
sont infectés avec la souche HPRS 1
6 (B
, 19
IGGS
), entretenue par passages in vivo et stockée
7
6
dans l’azote liquide sous forme de sang additionné de diméthylsulfoxide. Chaque poulet reçoit
2 ml d’inoculum par voie intraabdominale, le jour suivant son éclosion. Ce virus déclenche
,
0
habituellement chez ces poulets des lésions histologiques des nerfs à partir du ile jour,des signes
e jour et la mort avant le 8o
6
e jour. Bien que l’excrétion virale par les plumes
cliniques à partir du 2
soit précoce en général (N
), les poulets donneurs de virus n’ont été sacrifiés
AZERIAN
et al., 1970
e au 49
que du 35
e jour, alors que les lésions sont habituellement les plus étendues à la fois sur
les nerfs et les viscères. Immédiatement après le sacrifice, les plumes des ptéryles pectorales sont
raccourcies par section des tuyaux, la peau qui les porte est découpée et stockée à o°C. Chaque
follicule est détaché aux ciseaux et la plume en est arrachée mais avec soin pour éviter l’entrainement de l’épithélium virulent auquel elle adhère. Les follicules sont découpés à nouveau et broyés
0 follicules pour 10 ml
dans un tube de Potter en présence de tampon PBS à pH 7
3 à raison de 8
,
de PBS.
Isolement par
centrifugations
successives
Il est réalisé par les étapes suivantes : une première centrifugation (
5 mn)
2 o0o t/mn pendant i
élimine les débris de follicules et les lipides libérés par l’extraction. Le liquide opalescent est alors
traité par une deuxième centrifugation à 0
5 mn (Spinco SW 39
4
r
o
0 t/mn pendant i
) ; le culot est
récolté car il contient les particules enveloppées ; le surnageant peut alors être centrifugé à
o t/mn pour rassembler les particules nues.
32 00
Purification
La purification des particules du culot après r
0o t/mn s’effectue par centrifugation dans
0
4
des solutions concentrées sous forme de gradients, soit de densité à l’équilibre (chlorure de césium)
soit de vélocité dans du saccharose. Au culot remis en suspension homogène avec du PBS, le chlorure de césium est ajouté de façon à obtenir une concentration correspondant à un indice de
o t/mn pendant 1
00
0
réfraction de .
6 heures à 5
3495 La centrifugation se fait à 6
,
1
C environ
0
(Spinco SW 6
). Des solutions de saccharose à diverses concentrations (poids sacch.(poids de solu5
tion) sont contrôlées au réfractomètre et le culot est ajouté soit à la surface d’un coussin à 6
5 p. roo,
soit mélangé à la fraction 6
, puis il est
5 p. 100 de façon à donner une concentration de 5
o p. 100
recouvert de volumes égaux (r ml) à 45
dans
ce
dernier cas est
, la centrifugation
, 30
, 25 p. 100
, 35
poursuivie pendant des temps variés (
5 ou 2 heures). Les bandes opaques apparaissent
8, i8, i
2
pendant les centrifugations, leur position est notée et des fractions aliquotes sont prélevées en
débutant par le fond.
Contrôle des
particules
Leur présence dans les culots, les surnageants et les bandes de purification, est vérifiée directement par microscopie électronique (coloration négative à l’acide phosphotungstique ou inclusion
du culot dans la résine Epon et coloration des coupes fines).
Contrôle de la virulence dans les fractions
La présence de virus est recherchée par inoculation intraabdominale à des poulets sensibles
de i jour et gardés en strict isolement pendant 11 semaines, les signes cliniques sont relevés,
les lésions anatomiques et histologiques caractéristiques sont notées à la mort ou au sacrifice à
la fin de la période d’observation.
âgés
Essais de stabilité de la virulence
Des préparations ont été gardées au froid (
°C) pendant des temps variés (jusqu’à 24 heures)
4
avant l’inoculation aux poussins. Des essais avec un détergent spécial ont été effectués de la façon
suivante : les culots (
0 t/mn) repris avec 0
14 o
5 ml de PBS sont traités avec 0
,
5 ml de Triton
,
X 100 (Alkyl phenoxy poly ethoxy ethanol, Roxns et ,
AAS Philadelphie, Pa) réalisant des diluH
tions de i p. ioo et i p. r ooo. Après io minutes, les tubes sont remplis avec du PBS et centrifugés
à 15 o0o t/mn pendant 15 minutes pour reconstituer des culots qui sont contrôlés directement et
indirectement pour la présence de particules et pour la virulence.
RÉSULTATS
La conservation de la virulence suivant les techniques d’isolement est étudiée
dans les expériences résumées dans le tableau 1
. La centrifugation des extraits de
follicules plumeux donne des particules munies d’enveloppe lorsque la vitesse est au
plus égale à 14 ooo t/mn pendant 15 mn. Le surnageant de cette préparation contient
surtout des particules sans enveloppe (nucléocapsides nues). Une variante de cette
technique qui utilise une première centrifugation à m ooo t/mn, puis une seconde
à 32 00
o t/mn ne donne que des particules nues. Ceci suggère que les particules enveloppées sont rapidement sédimentées et seront donc collectées avec les fractions
lourdes. La virulence des culots et fractions est constamment notée lors des essais
sur poulets, ce qui indique qu’elle accompagne régulièrement les formes virales enve-
loppées.
,
Les images de microscopie électronique des culots montrent l’aspect des particules récoltées à 14 o0o t/mn et à 32 ooo t/mn. En particulier, il a pu être noté une
assez forte densité des particules enveloppées, en apparence non altérées par les traitements
(fig. i).
Les essais de
6
1
purification
sur
gradients
de chlorure de césium
o t/mn
(6 00
0
pendant heures) ont donné les résultats rassemblés dans le tableau 2 et reproduits
sur la figure 2
. Les particules virales sont visibles dans les fractions i à 4 et absentes
dans les couches légères. La virulence in vivo se montre jusqu’aux fractions 6 et !.
Il est à noter une discontinuité dans cette réponse, la fraction 4 n’ayant pas réussi
à infecter un seul des 10 poulets. la comparaison avec la densité optique mesurée pendant la collecte montre un léger pic à la fraction 12 qui s’est trouvée virulente pour le
poulet ; la cause peut en être celle d’un entraînement du sédiment au passage de la
dernière fraction. De ces examens, on peut dire que la technique employée n’a pas
donné une convenable séparation mais une large dispersion virale dans la partie la
plus dense du gradient, confirmée par la conservation de la virulence dans les diverses
fractions.
Les essais de purification avec le saccharose ont conduit aux résultats suivants :
o t/mn dans une solution de saccharose à 20 p. 100
après dispersion du culot de 14 00
au-dessus d’un coussin à 6
8 heures
, la centrifugation à 32
5 p. 100
ooo t/mn pendant 1
donne une bande épaisse à la surface du coussin sans aucun aspect de purification. La
technique par flottation (mélange de virus et saccharose pour obtenir 50 p. 100 et
gradient discontinu de 45
, 25 p. 100
, 35
) donne régulièrement 3 bandes séparées.
o t/mn, la bande « lourde » est épaisse et très proche de la
8 heures à 32 00
Après 2
bande moyenne. Au contraire après 2 ou i
5 heures à 3
6 ooo t/mn, la bande « lourde »,
située dans la zone de 47 à 5
est
bien
fine,
0 p. ioo,
séparée des deux autres ; elle montre
des particules enveloppées (voir le profil de la fig. 3
). La virulence de la fraction corretrouvée
10 inoculés).
est
infectés
sur
respondante
10 poulets
(
I,a morphologie des particules virales en microscopie électronique et leur propriété d’infecter les poulets sont conservées pendant de nombreuses heures malgré
la force ionique élevée des solutions concentrées de saccharose et de chlorure de césium.
C’est ainsi que dans une expérience préliminaire antérieure à celle relatée au tableau 2
,
où le virus a été exposé pendant 2
6 heures à l’action du chlorure de césium, l’inoculation aux poulets a donné les résultats suivants :
Au contraire les particules enveloppées sont totalement détruites après 30 mn
(centrifugation comprise) de contact avec le triton X aux dilutions de i p. 100 (
2 essais)
et i p. i o00 (i essai) ainsi que le montre le comportement des poulets (o infecté sur
10 inoculés pour chacun des 3 essais). Les examens au microscope électronique, bien
qu’entravés par les difficultés de remise en suspension des culots après traitement,
n’ont pas permis de reconnaître une seule particule virale parmi les débris cellulaires.
DISCUSSION
Les techniques d’isolement et de purification rapportées dans ce travail permetprocédure donnant avec le plus de sûreté des particules enveloppées
virulentes. Compte tenu de la pauvreté habituelle en particules virales des préparatent de choisir la
tions venant du poulet, la technique de recherche directe par microscopie électronique
s’avère moins sensible que l’inoculation au poulet (tabl. 2
). Les particules enveloppées
sont collectées par la centrifugation primaire à vitesse modérée (r
4 ooo t/mn pendant
15 mn), à l’exclusion des nucléocapsides nues. Mais celles-ci n’ont pas pu être obtenues sans contamination par des éléments lourds, et par conséquent leur virulence
n’a pas été clairement établie faute d’un isolement correct. Les débris cellulaires qui
accompagnent les grosses particules peuvent être éliminés en partie par centrifugation dans des gradients de solutions concentrées. Le chlorure de césium et le saccharose ne détruisent pas la virulence des particules enveloppées ce qui est compatible
avec la stabilité rapportée dans d’autres études (C
ALNEK
et al., 1970
) pour le virus
de la Maladie de Marek.
Un grand nombre de fractions obtenues du gradient à chlorure de césium se
montrent virulentes pour le poulet bien que les particules ne soient pas détectées
directement ; ceci peut être dû, soit à la forte sensibilité de certains poulets à un petit
nombre de particules, soit à la présence d’ADN viral dispersé au cours de l’extraction
comme cela a été observé pour d’autres virus Herpès (R
, i
OIZMAN
6g).
9
o t/mn ont été vus sans nucléocapsides
Les virus enveloppés récoltés à 14 00
nues au cours des contrôles microscopiques et leur virulence a été chaque fois retrouvée. Ceci renforce l’idée qu’ils ne sont pas des éléments dégradés au cours de leur
franchissement du cytoplasme mais qu’ils sont les virions résistants responsables
de la contamination naturelle.
L’addition de détergent à faibles concentrations a entraîné la destruction complète
des virus enveloppés : ceci est à opposer à la très forte résistance de ces virus vis-à-vis
de certains agents physiques de destruction (chaleur, humidité) et à comparer avec
leur sensibilité à la formaldéhyde employée comme désinfectant. La stabilité de la
virulence des particules responsables de la maladie naturelle peut donc être éprouvée
par des techniques analogues à celles rapportées, dans le but de trouver d’autres procédés efficaces de désinfection.
Il est possible de comparer ces résultats avec ceux rapportés pour d’autres virus
du groupe Herpès. L
HEN et al. (ig
Eet
E al. ),
7I C
g
I
(
2), à partir de fibroblastes d’em7
de
canard
infectés
ek (souche JM), traitent
y
bryons
par le virus de la Maladie de Ma
les surnageants et extraits par centrifugation dans un gradient de saccharose allant
de i2 à 5
, et obtiennent des particules enveloppées et des nucléocapsides nues
0 p. 100
dans deux bandes discrètes de la zone dense. Leur étude portant sur les protéines
structurales du virus, la virulence n’est pas notée. Avec Herpes simplex, M
OIZ
R
A
N
(ig6g) rapporte que la purification en chlorure de césium à des densités de 1
,255 à
8o conduit à la dégradation de la virulence. Les résultats varient avec les mutants
2
,
I
dont la composition de l’enveloppe s’est trouvée modifiée. Rus!rrs2W rr et al. (ig
2),
7
par centrifugation en gradient de saccharose (
6 p. ioo), obtiennent g
15 à 3
5 p. 100 de
formes enveloppées portant les activités enzymatiques et la virulence. Avec le virus
de l’avortement équin, E
BODE
A
L
el
V al. (ig
o) récoltent par filtration à o,20 y les
7
particules du sérum infecté et séparent les deux formes virales en gradient de saccharose. Les virus migrent dans la couche à
40 p. 100 (poids/poids) pour les particules
et
dans
la
couche
à
100
enveloppées
8 p.
4
pour les virus nus plus lourds, ce qui est le
contraire de nos observations pour le virus de la Maladie de Marek où les formes enveloppées sont toujours les plus lourdes. Dans le groupe des virus Herpès, les différences
relatives à la taille des enveloppes, leur degré de maturation et probablement leur
composition modulent leur résistance aux facteurs physicochimiques mis en jeu au
cours de leur purification, bien que la virulence soit
généralement associée aux formes
enveloppées. Il est probable que ces propriétés sont dépendantes des substances cellulaires qui ont permis la replication virale et la constitution des enveloppes.
Ces travaux confirment la possibilité de préparer des suspensions relativement
pures de particules enveloppées non associées aux cellules, et montrent que leur
propriété de provoquer la Maladie de Marek chez le Poulet est suffisamment bien
conservée pour permettre l’étude de leur résistance aux agents physicochimiques. La
procédure n’est pas applicable à la purification des particules non enveloppées.
Reçu pouv !ublication
en
février 1971.
REMERCIEMENTS
APORTE et J. CoxErr
J. L
aide et leurs conseils.
(Station
de Virologie, I. N. R. A.,
Grignon)
sont remerciés pour leur
SUMMARY
MAREK’S
DISEAS! : PATHOG!NICITY
OF THE ENVELOPED HERPES VIRUS AFTER ISOLATION AND’ PURIFICATION
In Marek’s disease, viral suspension contains two types of
organism (enveloped and free).
In this study the so-called enveloped forms are extracted from feather follicles and isolated so
that they retain their virulence to susceptible chickens. The techniques of differential centri-
fugation and of centrifugation in concentrated media are used. Sedimentation of these large
particles is made at 14 00
o r.p.m. for 15 minutes. Purification is best in a saccharose gradient where
the enveloped particles form a « heavy » band after two hours in 47
50 p. 100 saccharose concentrations. The virus isolated by these procedures retains its pathogenicity for the chicken for
at least 24 hours : it is destroyed by dilute detergent within 30 minutes. The properties are peculiar to the enveloped virus of Marek’s disease when compared with other groups of Herpes
virus.
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ANDALL C. C., 1970
R. A., L
wsoN L. A., R
A
. Morphology and entry of enveloped and
I
5
5
23
3
deenveloped equine abortion (Herpes) virus. J. Virol., 5, .
ALNEK B. W., A
C
DLDINGER H. K., K
AHN D. E., 1970
. Feather follicle epithelium : a source of envefrom
Marek’s disease. Avian Dis., 14, 2I
loped and infectious cell-free Herpes virus
.
233
gALNEK B. W., H
C
DLDINGER H. K., .
ITCHNER S. B., A
70 Lyophilization of cell-free Marek’s disease
g
I
Herpesvirus and a Herpesvirus from turkeys. Appl. Microbiol., 20, -7
2.
7
6
2
3
AUCHY L.,
C
o. Recherches vi
I97
ologlques, expérimentales et infrastructurales sur une néoplasie : la Maladie
y
de Marek, 7
g p. Thèse, Sci. nat., Paris.
HEN J. H., L
C
EE L. F., N
AZERIAN K., B
URMESTER B. R., 1972
. Structural proteins of Marek’s
disease virus. Virology, 47, 434-443.
HURCHILL A. E., B
C
IGGS P. M., 19
8. Agent of Marek’s disease in tissue culture. !Vature, 215, 52
7
6
BODEELY
A
.
0
53
EvANs
J. N., I97I
. Pathological response of the chicken embryo
(Marek’s disease). Appl. Microbiol., 21, 6.
32
321
LASER URKE
G
UGINBUHL R. E., ig6g. Virus-like particles observed
R., B REDRICKSON
C. N., F T. N., L
in plasma and white blood cells from birds with Marek’s disease. Avian Dis., 13, 2
.
7
1
6
EE L. F., K
L
IEFF E. D., BACH
R S. L., R
ENHEIME
IZMAN B., SPEA
O
R P. G., BURMEST
R B. R.,
E
AZERIAN K., 1971
N
. Size and composition of Marek’s disease virus deoxyribonucleic acid. J. Virol.,
7, 289-294.
EE L. F., N
L
URMESTER B. R., .
AZERIAN K., P
URCHASE H. G., B
73 Released and extracted
g
I
virions of Marek’s disease virus. Avian Dis., 17, 838-8
6.
4
to
an
D.
L.,
ATTERSON
P
agent which
causes
L.
T.,
EASLEY
B
acute leukosis
ITTER R. L., o.
97 Cell-free transmission and in vivo replication of Marek’s disease
i
K., W
virus. J. Vi
ol., 5, 3
y
88-397.
Curr. Topics Microa biochemical definition of the group.
Roiznznh B., 19
. The herpesviruses
9
6
biol. Immunol., 49, 9
-7
1
.
ARL1NGTON R., 1972
RAVELL M., D
UBENSTEIN A. S., G
R
. Protein kinase in enveloped Herpes simplex
virions. Virology, 50, 290
872
.
A
N
R
E
IAN
Z
-