maladie de marek : virulence des particules herpès

MALADIE DE MAREK : VIRULENCE DES
PARTICULES HERP` ES ENVELOPP´ EES, APR` ES
ISOLEMENT ET PURIFICATION
L. Cauchy
To cite this version:
L. Cauchy. MALADIE DE MAREK : VIRULENCE DES PARTICULES HERP` ES
ENVELOPP´ EES, APR` ES ISOLEMENT ET PURIFICATION. Annales de Recherches
V´et´erinaires, INRA Editions, 1974, 5 (2), pp.223-232. <hal-00900802>
HAL Id: hal-00900802
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Submitted on 1 Jan 1974
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MALADIE
DE MAREK :
VIRULENCE DES
PARTICULES
HERPÈS
ENVELOPPÉES,
APRÈS
ISOLEMENT ET
PURIFICATION
L.
CAUCHY
Station
de
Pathologie
aviaire,
Centre de Recherches de
Tours,
I.
N. R.
A.,
Nouzilly
B.P.
1,
3i380 Monnaie
RÉSUMÉ
Dans la maladie de
Marek,
les
suspensions
virales contiennent
deux
types
de
particules (enve-
loppées
et
nues).
Dans
cette
étude,
les
formes dites
enveloppées,
extraites
des follicules
plumeux,
sont
traitées de manière à les
isoler tout en
conservant leur virulence
sur poulets
sensibles.
Les
techniques
de
centrifugation
différentielle et
de
centrifugation
en
milieux
concentrés sont em-
ployées.
La sédimentation de ces
grosses particules
peut
s’effectuer à
z4 00 o t/mn
pendant
15
mn.
La
purification
est la
meilleure dans
un
gradient
de
saccharose où
les
particules
enveloppées
forment
après
2 heures une
bande « lourde
»
dans
les
concentrations
comprises
entre
47
et
50
p.
100 . Les
particules
isolées
par
ces
procédés
conservent leur virulence
pour
les
poulets pendant 24
heures au
moins ;
elles
sont détruites en
moins de
30
minutes
par
un
détergent
dilué. Ces
propriétés
des
virus
enveloppés, comparées
à celles d’autres
virus du
groupe
Herpès,
semblent
particulières
au
virus de la
Maladie de Marek.
INTRODUCTION
La
Maladie de
Marek,
provoquée par
l’action
d’un virus de
groupe Herpès,
est
une maladie très
contagieuse
des volailles.
Elle
se
traduit
par
une infection
persis-
tante
accompagnée
d’une forte
excrétion virale et
par
l’apparition
de
tumeurs
lym-
phoïdes
principalement
localisées dans
les nerfs
périphériques
et
dans
certains
organes
ou tissus. Dès
que
fut connu le rôle
d’un virus
Herpès
dans
l’étiologie
de
cette
affec-
tion
(C HURCHILL ,
BI GG S,
1967)
les
propriétés
physico-chimiques
du
virus
ont
été
recherchées.
Les
études ont
abouti
à ce
paradoxe
apparent
de
trouver : i
1°
des virus
très fragiles (strictement
associés aux
cellules)
dans les cellules
du
sang
et
des
tumeurs,
et
dans
les
cultures
cellulaires ;

2! des virus
très
résistants dans les
squames provenant
des
plumes,
responsables
de la dissémination naturelle de la maladie.
Les
descriptions
de
l’agent
virulent
ont
montré
que
les
particules
virales nucléaires
acquièrent
une
enveloppe
pendant
le
franchissement
de la membrane
nucléaire ;
cette
enveloppe
est surtout facile à
révéler
dans les cellules de
l’épithélium
folliculaire des
plumes (NAZ >~ RIAN ,
WiTTER,
1970 ;
§
Cnr,N>~x
et
al.,
z 97 o),
ce
qui
a
permis
de
penser
que
les virions de
grande
résistance,
agents
de
la maladie
naturelle,
sont
justement
ces formes
enveloppées
ou enrobées
(CAUCt!,
1970 ).
Les
particules
nucléaires non
enveloppées
sont rencontrées dans
les extraits cellulaires
dont la
virulence
éphémère
est liée à la
survie
des cellules.
L’isolement
de ces deux
catégories
de
particules
a été recherché
à
partir
de diffé-
rents matériels :
le
sang
(GI.ASER !
al.,
ig6 9 ),
les cultures infectées
(LE E et
al.,
1971 ;
CHEN et
al.,
z 97a;
LEE
et
al.,
z 97 2),
les follicules
plumeux
et les
plumes
(C ALNEK et
al.,
i97 o;
£vAN s et
al.,
I9!I).
Partant de la constatation
que
les cellules de
l’épithélium
folliculaire des
plumes
portent
à
la fois
des
particules
nues
dans
leurs
noyaux
et
des
particules enveloppées
dans
leur
cytoplasme,
les travaux
rapportés
ici
soulignent que
cette
source
de virus
peut
être intéressante
pour
l’étude de la
séparation
des deux formes virales et de leur
virulence.
MATERIELS
ET
TECHNIQUES
Le
virus
Des
poulets
de
type
Leghorn
d’un
élevage
indemne de Maladie de Marek
(C AUCHY , 1970 )
sont
infectés avec
la souche HPRS 16
(B IGGS ,
19 67 ),
entretenue
par passages
in
vivo et stockée
dans l’azote
liquide
sous
forme de sang additionné de
diméthylsulfoxide.
Chaque poulet reçoit
0,2
ml d’inoculum
par
voie
intraabdominale,
le
jour
suivant son
éclosion.
Ce virus
déclenche
habituellement
chez ces
poulets
des lésions
histologiques
des nerfs à
partir
du ile
jour,des signes
cliniques
à
partir
du 26e
jour
et
la mort avant le
8o e
jour.
Bien
que
l’excrétion virale
par
les
plumes
soit
précoce
en
général (N AZERIAN et
al.,
1970 ),
les
poulets
donneurs de virus n’ont été sacrifiés
que
du
35 e
au
49 e jour,
alors
que
les lésions sont habituellement les
plus
étendues
à
la fois sur
les nerfs et les viscères. Immédiatement
après
le
sacrifice,
les
plumes
des
ptéryles pectorales
sont
raccourcies
par
section
des
tuyaux,
la
peau qui
les
porte
est
découpée
et stockée à o°C.
Chaque
follicule est détaché aux
ciseaux
et
la
plume
en
est arrachée mais avec soin
pour
éviter l’entrai-
nement de
l’épithélium
virulent
auquel
elle adhère. Les follicules sont
découpés
à
nouveau
et
broyés
dans un tube
de Potter en
présence
de
tampon
PBS
à
pH 7,3
à
raison de 80 follicules
pour
10
ml
de
PBS.
Isolement
par centrifugations
successives
Il est réalisé
par
les
étapes
suivantes : une
première centrifugation (2
o0o
t/mn
pendant
i5
mn)
élimine les débris de
follicules et
les
lipides
libérés
par
l’extraction. Le
liquide
opalescent
est
alors
traité
par
une deuxième
centrifugation
à
r4 0 0o
t/mn pendant
i5
mn
(Spinco
SW
39 ) ;
le culot est
récolté car
il
contient
les
particules enveloppées ;
le
surnageant peut
alors être
centrifugé
à
32
00 o
t/mn pour
rassembler
les
particules
nues.
Purification
La
purification
des
particules
du
culot
après r4 0 0o t/mn
s’effectue
par centrifugation
dans
des solutions
concentrées sous forme de
gradients,
soit
de densité
à
l’équilibre (chlorure
de
césium)
soit de
vélocité dans du saccharose. Au culot
remis en
suspension homogène
avec du
PBS,
le chlo-
rure de césium est
ajouté
de
façon
à obtenir une concentration
correspondant
à
un indice de
réfraction de
1, 3495 .
La
centrifugation
se
fait à 60 00 o
t/mn pendant
16 heures à
50C
environ

(Spinco
SW
65 ).
Des solutions
de saccharose à diverses concentrations
(poids sacch.(poids
de solu-
tion)
sont
contrôlées au réfractomètre et le culot est
ajouté
soit à la surface d’un coussin
à
65
p.
roo,
soit
mélangé
à
la fraction
65
p.
100 de
façon
à donner une concentration
de
5o
p.
100 ,
puis
il est
recouvert de
volumes
égaux
(r
ml)
à
45 ,
35 , 30 , 25
p.
100 ,
la
centrifugation
dans ce
dernier
cas est
poursuivie
pendant
des
temps
variés
(2 8,
i8,
i5
ou 2
heures).
Les bandes
opaques apparaissent
pendant
les
centrifugations,
leur
position
est notée et des fractions
aliquotes
sont
prélevées
en
débutant
par
le
fond.
Contrôle des
particules
Leur
présence
dans les
culots,
les
surnageants
et
les bandes de
purification,
est
vérifiée
direc-
tement
par
microscopie électronique (coloration négative
à l’acide
phosphotungstique
ou
inclusion
du
culot dans la
résine
Epon
et coloration
des
coupes
fines).
Contrôle
de la
virulence dans
les
fractions
La
présence
de virus est
recherchée
par
inoculation intraabdominale
à
des
poulets
sensibles
âgés
de i
jour
et
gardés
en
strict isolement
pendant
11
semaines,
les
signes cliniques sont
relevés,
les lésions
anatomiques
et
histologiques caractéristiques
sont
notées à
la
mort ou au sacrifice à
la fin
de la
période
d’observation.
Essais de
stabilité
de la virulence
Des
préparations
ont été
gardées
au
froid
(4 °C)
pendant
des
temps
variés
(jusqu’à
24 heures)
avant
l’inoculation aux
poussins.
Des essais
avec un
détergent spécial
ont été effectués
de la
façon
suivante : les
culots
( 14
o0o
t/mn) repris
avec
0,5
ml de PBS sont traités avec
0,5
ml
de
Triton
X
100
(Alkyl
phenoxy poly ethoxy
ethanol,
Roxns et
H AAS ,
Philadelphie,
Pa)
réalisant
des dilu-
tions
de i
p.
ioo et i
p.
r
ooo.
Après
io
minutes,
les
tubes sont
remplis
avec
du
PBS et
centrifugés
à
15
o0o
t/mn pendant
15
minutes
pour
reconstituer des culots
qui
sont contrôlés directement
et
indirectement
pour
la
présence
de
particules
et
pour
la
virulence.
RÉSULTATS
La
conservation de la
virulence suivant les
techniques
d’isolement est étudiée
dans les
expériences
résumées dans le tableau 1.
La
centrifugation
des
extraits de
follicules
plumeux
donne des
particules
munies
d’enveloppe lorsque
la vitesse
est au
plus
égale
à
14
ooo
t/mn
pendant
15
mn.
Le
surnageant
de cette
préparation
contient
surtout des
particules
sans
enveloppe
(nucléocapsides nues).
Une variante de cette
technique qui
utilise une
première centrifugation
à m ooo
t/mn,
puis
une seconde
à
32
00 o
t/mn
ne
donne
que
des
particules
nues. Ceci
suggère que
les
particules
enve-
loppées
sont
rapidement
sédimentées et seront donc collectées avec
les fractions
lourdes.
La
virulence
des culots et fractions est constamment notée lors des essais
sur
poulets,
ce
qui indique qu’elle
accompagne régulièrement
les formes virales enve-
loppées.
,
Les
images
de
microscopie
électronique
des culots montrent
l’aspect
des
parti-
cules
récoltées à 14 o0o
t/mn
et à
32
ooo
t/mn.
En
particulier,
il a
pu
être
noté
une
assez
forte
densité des
particules
enveloppées,
en
apparence
non altérées
par
les traite-
ments
(fig.
i).
Les
essais de
purification
sur
gradients
de chlorure de césium
(6 0
00 o
t/mn
pendant
16
heures)
ont donné les
résultats rassemblés
dans
le
tableau 2 et
reproduits
sur
la
figure
2.
Les
particules
virales sont
visibles dans
les
fractions
i à
4
et absentes